UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS E PROCESSOS DISPLÁSICOS DO
COLO DO ÚTERO E SUA RELAÇÃO COM O PAPILOMAVÍRUS
HUMANO (HPV) EM ADOLESCENTES E MULHERES JOVENS
Roberta Grain Barreto
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção
do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de
concentração: Biologia Molecular
a
Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Martins Carneiro
Co-orientador: Prof. Dr. Elio Hideo Babá
Ouro Preto, março de 2007
Roberta Grain Barreto
ALTERAÇÕES INFLAMATÓRIAS E PROCESSOS DISPLÁSICOS DO
COLO DO ÚTERO E SUA RELAÇÃO COM O PAPILOMAVÍRUS
HUMANO (HPV) EM ADOLESCENTES E MULHERES JOVENS
Ouro Preto, março de 2007
TÍTULO
BARRETO, R.G.
Dedicatória
Dedico este trabalho....
Aos meus pais, Roberto e Vilma, pelo exemplo de família
e que com muito amor, carinho, estímulo constante e fé,
deram-me tudo de que necessitei para chegar até aqui;
À minha irmã, Fernanda, pela sua amizade, companheirismo
e por sempre acreditar em mim;
Ao Danilo, pelo amor e compreensão em todos os momentos.
i
BARRETO, R.G.
Agradecimentos
A Deus, o maestro da vida, pois sem Ele nada é possível;
À Professora Cláudia Martins Carneiro por ter me ensinado as maravilhas da Citologia
Ginecológica e, principalmente, por aceitar ser minha orientadora, mostrando-se uma
verdadeira mestra, com brilhantismo, competência, disponibilidade e dinamismo;
Ao Professor Elio Hideo Babá pela co-orientação e auxílio nesse trabalho;
Ao Professor Luiz Fernando de Medeiros Teixeira pelos ensinamentos de Microbiologia;
À Professora Renata Guerra de Sá pela colaboração durante a realização das PCRs;
Aos Professores Elísio Evangelista e Maria Lúcia Pedrosa pela harmoniosa convivência
no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular;
Aos Professores do NUPEB, que muito me ensinaram durante esses anos;
Aos amigos do mestrado pelo constante apoio, em especial a Lizziani, Cláudia, Yara e
Girley;
Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular pelo carinho, convívio
repleto de aprendizado e valiosa ajuda na realização das PCRs;
Ao Ezequiel Pereira, que com muito carinho cuida do Laboratório de Bioquímica e
Biologia Molecular;
A Cida, secretária do NUPEB, pela amizade e competência no auxílio aos alunos;
ii
BARRETO, R.G.
Agradecimentos
Aos funcionários da Escola de Farmácia, em especial ao Maurício Guimarães, pelo auxílio
e cooperação;
À Dra Maria Dalva Gonçalves e demais funcionários do Centro de Apoio à Saúde do
Adolescente pela disposição e colaboração inestimáveis;
Ao Juber Pereira de Souza pela ajuda no início deste trabalho;
Aos meus familiares pelas orações e palavras de ânimo durante essa jornada;
A Théa Nobre Pereira pela amizade e oportunidades de aprendizado em Citologia
Ginecológica;
Aos queridos amigos, Amanda, Michela, Diogo, Luiz Fernando, Flávia, Edson, Aluir e
Felipe, que apesar de distantes, nunca deixaram de me incentivar;
À “família” Pronto Socorro por dividir comigo momentos especiais;
Ao José Padula, Lurdinha e familiares pela acolhida em Ouro Preto.
.............e com carinho, às adolescentes que permitiram que os exames e as informações dos
seus prontuários se transformassem nesta obra.
Muito obrigada!
iii
BARRETO, R.G.
Lista de Figuras
Figura 1 - Representação esquemática do genoma do HPV..................................... 11
Figura 2 - A) Fosforilação da proteína Rb pelo complexo ciclina/cdk inibindo a
atividade repressora de pRb. A oncoproteína E7 liga-se à forma
hipofosforilada da proteína Rb, o que interrompe o complexo formado
por pRb e o fator E2F, liberando esse fator o que leva a célula à fase S
do ciclo celular. B) Dano ao DNA induz a ativação da p53 levando à
interrupção no ciclo celular para reparo do DNA ou à apoptose. A
oncoproteína E6 liga-se à E6AP mediando ubiquitinação e rápida
degradação via proteassoma da proteína p53. .......................................... 12
Figura 3 - Relação entre incidências de infecção pelo HPV, lesões précancerosas e câncer. ............................................................................ 16
Figura 4 - Seqüência do gene L1 do HPV 16 (sentido 5′ → 3′). Região de anelamento do par de primers MY09 e MY11............................................. 31
Figura 5 - Fotomicrografias dos esfregaços de Papanicolaou confeccionados de
acordo com a técnica convencional. A - Inflamatório; B - Células atípicas
de significado indeterminado (ASC-US); C a H - Lesão intraepitelial
escamosa de baixo grau (LSIL). Papanicoloau, 1000X. ........................... 43
Figura 6 - Fotomicrografias dos esfregaços de Papanicolaou confeccionados a
partir de material colhido em meio líquido. A - Normal; B - Células
atípicas de significado indeterminado (ASC-US); C a F - Lesão
intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL). Papanicolaou, 1000X...... 44
Figura 7 - Gel de agarose representativo da padronização da reação de PCR.
Análise das reações de PCR: conforme descrito em materiais e
métodos, 20µL das amostras foram analisados em gel de agarose a
1,5%, corado com brometo de etídio. Canaleta 1: Padrão de Peso
Molecular (bandas variam de 100 em 100 pb). Canaletas 2, 4, 6, 8 e 12:
Ausência de banda do HPV. Canaletas 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15: Banda da
β-actina (390pb). Canaletas 10 e 14: Banda do HPV (449pb). Canaleta
16: Ausência de banda no controle negativo. ............................................. 51
Figura 8 - A - Gel de agarose representativo de cinco amostras (1, 3 e 5: HPV
negativo; 2, 4, 6 e 8: β-actina positivo; 7: HPV positivo; 9 e 10: amostra
insatisfatória); B - Gel de agarose de cinco amostras (1: HPV negativo;
2, 4, 6, 8 e 10: β-actina positivo; 3, 5, 7 e 9: HPV positivo); C - Média da
razão das densitometrias (HPV/β-actina) nas amostras negativas ou
positivas para lesões na citologia convencional......................................... 54
iv
BARRETO, R.G.
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Seqüências dos primers para detecção do HPV e da β-actina. ............. 31
Tabela 2 - Distribuição das mulheres por idade cronológica e idade ao início
da atividade sexual, em anos. ....................................................................... 37
Tabela 3 - Distribuição das mulheres por idade cronológica e tempo de
atividade sexual, em anos. ............................................................................ 38
Tabela 4 - Distribuição das mulheres de acordo com as características
ginecológicas.................................................................................................... 39
Tabela 5 - Distribuição das mulheres de acordo com a citologia convencional
e em meio líquido. ........................................................................................ 42
Tabela 6 - Distribuição das mulheres segundo o resultado da avaliação
microbiológica na citologia convencional e em meio líquido. ........... 46
Tabela 7 - Resultados do exame a fresco do conteúdo vaginal obtido ao exame
especular........................................................................................................... 47
Tabela 8 - Resultados do exame corado pelo Gram do conteúdo vaginal obtido ao
exame especular.............................................................................................. 48
Tabela 9 - Concordância entre os diagnósticos de vaginose bacteriana, candidíase
vaginal e tricomoníase pelo Gram frente ao exame a fresco, citologia
convencional e em meio líquido. ................................................................... 49
Tabela 10 - Sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos (VPP) e
negativos (VPN) dos diagnósticos de vaginose bacteriana, candidíase
vaginal e tricomoníase pelo Gram frente ao exame a fresco, citologia
convencional e em meio líquido. ................................................................... 50
Tabela 11 - Distribuição das mulheres segundo a detecção do DNA-HPV pela
técnica da PCR de acordo com os resultados citopatológicos obtidos na
avaliação da citologia convencional e em meio líquido............................. 53
Tabela 12 - Prevalência de infecção pelo HPV de acordo com as características
ginecológicas.................................................................................................... 56
v
BARRETO, R.G.
Lista de Abreviaturas
AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ASCUS: Atypical Squamous Cells Undetermined Significance (Células Escamosas
Atípicas de Significado Indeterminado)
CASA: Centro de Apoio à Saúde do Adolescente
CC: Citologia Convencional
CDC: Center of Disease Control and Prevention
CML: Citologia em Meio Líquido
DIP: Doença Inflamatória Pélvica
E: Early Region (Região Precoce)
HPV: Papilomavírus Humano
HSIL: High Grade Squamous Intra-epitelial Lesion (Lesão Intra-epitelial Escamosa
de Alto Grau)
HSV-1: Vírus Herpes Simples Tipo 1
HSV-2: Vírus Herpes Simples Tipo 2
IARC: International Agency for Research on Cancer
IC: Intervalo de Confiança
IST: Infecção Sexualmente Transmissível
JEC: Junção Escamo-Colunar
L: Late Region (Região Tardia)
LCR: Long Control Region (Região Reguladora)
LSIL: Low Grade Squamous Intra-epitelial Lesion (Lesão Intra-epitelial Escamosa
de Baixo Grau)
NIC: Neoplasia Intra-epitelial Cervical
NIC 1: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau 1
NIC 2: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau 2
NIC 3: Neoplasia Intra-epitelial Cervical Grau 3
ORF: Open Reading Frame
pb: Pares de Bases
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
SIL: Squamous Intra-epitelial Lesion (Lesão Intra-epitelial Escamosa)
Taq: Thermophilus Aquaticus
TE: Tris EDTA
VB: Vaginose Bacteriana
WHO: World Health Organization
vi
BARRETO, R.G.
Sumário
1 - INTRODUÇÃO...................................................................................................................................... 1
1.1 - CÂNCER DO COLO DO ÚTERO E SUA PREVENÇÃO ............................................................................. 2
1.2 - INFECÇÕES SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS E OUTRAS INFECÇÕES DO TRATO
GENITAL FEMININO INFERIOR ............................................................................................................. 5
1.3 - CARACTERÍSTICAS GERAIS DO HPV E SUA PARTICIPAÇÃO NA CARCINOGÊNESE CERVICAL....... 10
2 - JUSTIFICATIVA................................................................................................................................ 20
3 - OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 23
3.1 - OBJETIVO GERAL .............................................................................................................................. 24
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 24
4 - METODOLOGIA................................................................................................................................. 25
4.1 - CASUÍSTICA ...................................................................................................................................... 26
4.1.1 - Critérios de inclusão......................................................................................................... 27
4.1.2 - Critérios de exclusão........................................................................................................ 27
4.2 - COLETA DE DADOS E PROCEDIMENTOS .......................................................................................... 27
4.2.1 - Colpocitologia ..................................................................................................................... 28
4.2.1.1 - Convencional ............................................................................................................................... 28
4.2.1.2 - Meio líquido.................................................................................................................................. 28
4.2.1.3 - Avaliação citopatológica .......................................................................................................... 29
4.2.2 - Exame a fresco................................................................................................................... 29
4.2.3 - Gram ...................................................................................................................................... 29
4.2.4 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) .................................................................. 30
4.2.4.1
4.2.4.2
4.2.4.3
4.2.4.4
4.2.4.5
4.2.4.6
-
Coleta das amostras ................................................................................................................. 30
Seleção dos primers ................................................................................................................. 30
Padronização das condições da PCR................................................................................... 31
Preparo das amostras após padronização........................................................................ 32
Amplificação do DNA-HPV e da β-actina ........................................................................... 33
Análise da reação de PCR ....................................................................................................... 33
5 - RESULTADOS..................................................................................................................................... 35
5.1- CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA....................................................................................................... 36
5.2 - EXAME CITOLÓGICO: CONVENCIONAL E MEIO LÍQUIDO ................................................................ 40
5.3 - EXAME A FRESCO.............................................................................................................................. 47
5.4 - GRAM ................................................................................................................................................ 48
5.5 - CONCORDÂNCIA DOS DIAGNÓSTICOS MICROBIOLÓGICOS ........................................................... 49
5.6 - DETECÇÃO DO DNA-HPV PELA PCR............................................................................................. 51
5.7 - TAXA DE DETECÇÃO DO DNA-HPV E AS ALTERAÇÕES CELULARES SEGUNDO ALGUMAS
CARACTERÍSTICAS GINECOLÓGICAS ................................................................................................ 55
6 - DISCUSSÃO ........................................................................................................................................ 58
6.1 - EXAME DE PAPANICOLAOU .............................................................................................................. 59
6.2 - DIAGNÓSTICO CITOPATOLÓGICO .................................................................................................... 60
6.3 - ACHADOS CITOPATOLÓGICOS ......................................................................................................... 61
6.4 - ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS ........................................................................................................ 62
6.5 - DIAGNÓSTICO MOLECULAR DO VÍRUS HPV ................................................................................... 65
6.6 - CARACTERÍSTICAS GINECOLÓGICAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DO HPV ............................... 67
7 - CONCLUSÕES .................................................................................................................................... 69
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................... 71
9 - ANEXOS ................................................................................................................................................ 90
vii
BARRETO, R.G.
Sumário
vii
BARRETO, R.G.
Resumo
Este trabalho teve como objetivo determinar a prevalência da infecção genital por
Papilomavírus Humano (HPV) e das anormalidades citológicas cervicais em
adolescentes e mulheres jovens e investigar a associação entre fatores
ginecológicos e a detecção do DNA-HPV. Foram avaliadas 166 mulheres de 14 a
23 anos de idade, atendidas pelo Centro de Apoio à Saúde do Adolescente
(CASA), sediado em Itabirito, Minas Gerais, caracterizando amostragem por
conveniência. Todas as mulheres responderam a um questionário referente às
características ginecológicas e assinaram termo de consentimento livre e
esclarecido. A seguir, foram submetidas a exame clínico e ginecológico. Amostras
cervicais foram coletadas para a realização do exame a fresco, Gram, citologia
convencional (CC) e citologia em meio líquido (CML) e para a detecção do DNAHPV através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A qualidade dos
esfregaços da CC foi melhor quando comparada à CML sendo a detecção de
esfregaços normais e inflamatórios semelhante entre os dois métodos. Por outro
lado, a detecção de lesões intra-epiteliais escamosas foi superior na CC. A
infecção cérvico-vaginal de maior prevalência foi a vaginose bacteriana (21,7%),
seguida pela candidíase (7,2%) e tricomoníase (1,8%). A prevalência do
diagnóstico de lactobacilos e de Candida sp foi superior na CC. Não houve
diferença entre as duas técnicas para o diagnóstico de cocos, bacilos, Gardnerella
vaginalis e Trichomonas vaginalis. A concordância entre os diagnósticos
microbiológicos no exame a fresco, Gram, CC e CML, tendo como padrão-ouro o
Gram, variou de boa a muito boa, com alta especificidade e alto valor preditivo
positivo. A sensibilidade variou de 80,5% a 100%, com exceção do diagnóstico de
Candida sp realizado pela CML em que a sensibilidade foi de 61,5%. A
prevalência de DNA-HPV na população estudada foi de 20,1%, sendo 16,5%
associados a esfregaços normais ou inflamatórios e 3,6% associados a células
escamosas atípicas de significado indeterminado e lesões intra-epiteliais
escamosas de baixo grau, detectadas pela CC. A idade de início, bem como o
tempo de atividade sexual e o uso de anticoncepcional foram associados à
presença do DNA-HPV.
viii
BARRETO, R.G.
Abstract
The prevalence of Human Papillomavirus (HPV) and cervical cytological
abnormalities in adolescents and young women and the association between
gynecological factors and HPV-DNA detection were investigated. After inclusion
and exclusion criteria, 166 women from 14 to 23 years old were included in this
project. The general personal information and medical history was completed by
questionaire folder. The cervical samples were collected to perfomed wet smear,
Gram stain, conventional (CC) and liquid based cytopathology (LBC) and HPV
DNA PCR detection. Descriptive analysis was made for the association between
HPV-DNA and cytology results. CC smears was better when compared to CML to
detect normal/inflammatory smears and low scamous intraepithelial lesion (LSIL).
The main prevalence of cervicovaginal infection was from bacterial vaginosis
(21.7%), followed by Candida sp (7.2%) and Trichomonas vaginalis (1.8%). The
prevalence of lactobacillus and Candida sp was higher in CC than LBC. No
difference was observed between CC and LBC to detect cocos, bacillus,
Gardnerella and Trichomonas. The concordance among Gram stain and others
microbiological detection varied of good to very good, with high specificity and high
positive preditive value. The sensitivity was from 80,5 to 100%, with exception of
the diagnosis of Candida sp that sensitivity was 61,5% when performed by CML.
HPV-DNA has been detected in 20,1% of the patients, which 16.5% was
associated to normal or inflammatory smears and 3.6% to atypical scamous cells
and LSIL, detected by the CC. The age of the first sexual intercourse as well as
period of time of sexual activity, and the use of oral contraceptive had been
associated to the presence of the DNA-HPV.
ix
BARRETO, R.G.
Abstract
ix
xi
1 - Introdução
BARRETO, R.G.
Introdução
1.1 - Câncer do colo do útero e sua prevenção
O câncer é, ainda hoje, um problema de saúde pública mundial sendo,
atualmente, a segunda causa de morte por doença na maioria dos países, depois,
apenas, das causas cardiovasculares. O câncer do colo do útero é o segundo
mais comum entre mulheres no mundo (cerca de 500 mil casos novos) e o risco
de sua incidência aumenta, progressivamente, até atingir seu pico, geralmente, na
faixa etária de 45 a 49 anos. Quase 90% dos casos novos ocorrem em países em
desenvolvimento onde, em algumas regiões, é o câncer mais comum entre as
mulheres (WHO, 2005a).
A mortalidade pelo câncer do colo do útero é, substancialmente, menor do
que a incidência. Em países desenvolvidos, a sobrevida média estimada em cinco
anos, varia de 59% a 69%. Nos países em desenvolvimento, os casos são
encontrados em estágios avançados e, conseqüentemente, a sobrevida média é
de cerca de 49% após cinco anos (Ferlay et al., 2001; BRASIL, 2005).
O número de casos novos de câncer do colo do útero esperado para o
Brasil em 2006 era de 19.260, com um risco estimado de 22 casos a cada 100 mil
mulheres. Sem considerar os tumores de pele não melanoma, o câncer do colo do
útero é o mais incidente na região Norte (23/100.000). Nas regiões Sul
(31/100.000), Centro-Oeste (23/100.000), Sudeste (22/100.000) e Nordeste
(18/100.000) representa o segundo tumor mais incidente (BRASIL, 2005). É a
terceira neoplasia maligna mais comum entre as mulheres e a quarta causa de
morte por câncer em mulheres, causando sérios reflexos socioeconômicos
decorrentes de sua expressiva morbidade e mortalidade em nosso meio. Tal
problema adquire mais relevância quando se considera tratar de um tipo de câncer
evitável e curável e, portanto, com grandes chances de êxito de seu controle
(Kligerman, 1998).
Frente à importância do câncer do colo do útero para a saúde da mulher,
essa neoplasia tem sido objeto de inúmeros estudos, que procuram elucidar a sua
história natural, bem como testar medidas preventivas e novas alternativas
terapêuticas.
2
BARRETO, R.G.
Introdução
Um marco importante no conhecimento da história natural desse tipo de
câncer foi o estudo de Papanicolaou e Traut (1941), que analisando esfregaços
citológicos cérvico-vaginais, demonstraram a presença de células atípicas sem
características evidentes de malignidade, mas que julgaram ser modificações
malignas incipientes. A partir desse momento, foi possível estabelecer o
diagnóstico e o estudo das formas iniciais da neoplasia do colo do útero, uma vez
que, até aquele momento, praticamente, só se diagnosticava o carcinoma invasor
clinicamente manifesto.
A origem dessa neoplasia é no epitélio da cérvice uterina, que apresenta
alterações citológicas características que, eventualmente, podem evoluir de forma
progressiva e silenciosa até o carcinoma invasor. Segundo o estudo de Östör
(1993), a proporção de evolução para a invasão é de 1% para as neoplasias intraepiteliais cervicais de grau 1 (NIC 1, atualmente, LSIL: lesão intra-epitelial
escamosa de baixo grau); 5% para as neoplasias intra-epiteliais cervicais de grau
2 (NIC 2, atualmente, HSIL: lesão intra-epitelial escamosa de alto grau) e cerca de
12% para as neoplasias intra-epiteliais cervicais de grau 3 (NIC 3, atualmente,
HSIL: lesão intra-epitelial escamosa de alto grau).
A ectocérvice é a parte do colo do útero que tem como limites laterais as
paredes vaginais e como limite medial o orifício externo do colo e está revestida
por epitélio escamoso estratificado não-ceratinizado. A endocérvice ou canal
cervical é revestida por um epitélio cilíndrico, simples, mucossecretor. A junção
desses epitélios é conhecida como junção escamo-colunar (JEC).
A localização da JEC depende da idade e das condições hormonais,
paridade, cervicites e outras variáveis. A mucosa constituída pelo epitélio
cilíndrico, quando localizada na ectocérvice, fica exposta a um meio ácido e
séptico. Essa exposição, freqüentemente, acarreta uma série de alterações
celulares decorrentes dos processos adaptativos, que podem originar a
metaplasia, constituindo a zona de transformação, de importância na rotina de
prevenção do câncer do colo do útero, uma vez que a maioria das lesões
neoplásicas é originada nessa região (Burghardt & Östör, 1983).
3
BARRETO, R.G.
Introdução
Estudos epidemiológicos mostraram que as lesões precursoras e as lesões
invasoras desenvolvem-se no mesmo ambiente e possuem fatores de risco
semelhantes (Syrjänen, 1997; Syrjänen & Syrjanen, 1999). Portanto, torna-se
evidente a necessidade da detecção precoce dessas lesões.
Em países onde os programas de rastreamento são bem estruturados,
notou-se uma queda na incidência do câncer invasor do colo do útero de 70 a
90%, com a utilização do método de Papanicolaou (Papanicolaou, 1963; Elovainio,
Nieminen & Miller, 1997; Liu et al., 2001). Esse fato, aliado à praticidade do
exame, tanto na coleta quanto na execução e leitura dos achados, proporcionou
seu status internacional como método preventivo (Papanicolaou & Traut, 1941;
Sigurdsson, 1999).
Apesar da importância do exame de Papanicolaou para a prevenção do
câncer cervical, ele apresenta limitações como: a qualidade da distribuição do
material colhido sobre a lâmina e a presença de vários elementos no esfregaço,
que podem prejudicar a avaliação celular, como: leucócitos, muco, sangue e,
principalmente, a sua baixa sensibilidade. Em um estudo de metanálise realizado
por Mccrory et al. (1999), a especificidade encontrada para a citologia oncótica foi
de 98% e a sensibilidade de 51% para a detecção de qualquer NIC. Para as
lesões de alto grau, a sensibilidade seria maior, atingindo 70% a 80% (Schroeder,
2003).
Essas
limitações
da
citologia
convencional
(CC)
estimularam
o
desenvolvimento de novas tecnologias para a prevenção do câncer cervical, entre
elas, a citologia em meio líquido (CML). Na CML, a escova utilizada para a coleta
da amostra cervical é colocada em um líquido conservante, obtendo-se, assim,
uma suspensão de células. Essa suspensão é, posteriormente, utilizada para o
preparo da lâmina, que pode ser feito através de diferentes processos, de acordo
com o sistema utilizado. Entre as vantagens descritas para a CML incluem-se
esfregaços cervicais de melhor qualidade, que conteriam uma amostra mais
representativa dos epitélios em estudo, células melhor preservadas, menor
sobreposição celular e menor contaminação com sangue, leucócitos e muco. Além
disso, a suspensão de células permite a realização de lâminas adicionais e pode
4
BARRETO, R.G.
Introdução
ser utilizada para testes moleculares, otimizando os recursos para a avaliação de
agentes infecciosos como o Papilomavírus Humano (HPV), Chlamydia trachomatis
e gonococos. Em relação ao desempenho da CML, tem-se observado que essa
metodologia parece diminuir a freqüência de amostras insatisfatórias, apresentar
maior sensibilidade na detecção das lesões intra-epiteliais escamosas (SIL) e
diminuir o tempo necessário para a interpretação da citologia. Por outro lado, é
uma metodologia de custo elevado, que exige treinamento técnico e citológico
adequados, não sendo conhecido, até o momento, o impacto de sua utilização na
detecção das lesões pré-neoplásicas e neoplásicas da cérvice uterina (Payne et
al., 2000; BRASIL, 2005).
Muito
embora
o
teste
de
Papanicolaou
tenha
sido
preconizado,
fundamentalmente, para o reconhecimento das alterações epiteliais neoplásicas
ou pré-neoplásicas do colo do útero, por meio dele, apesar de não ser o ideal,
pode-se sugerir a presença de certos agentes infecciosos com alta correlação aos
testes considerados como padrão-ouro. Dessa forma, a identificação morfológica
ou a suspeita diagnóstica de determinados vírus, bactérias, fungos e protozoários
são informes adicionais do exame citopatológico (Adad et al., 2001).
1.2 - Infecções sexualmente transmissíveis e outras infecções do trato
genital feminino inferior
As infecções sexualmente transmissíveis (ISTs) são processos infecciosos
causados por um grupo heterogêneo de agentes, agrupadas devido à significância
epidemiológica do contato sexual, embora esse não seja, necessariamente, o
único meio de transmissão (Reese & Betts, 1991). Entre as ISTs consideradas
pela Organização Mundial da Saúde como de transmissão essencialmente sexual
estão: gonorréia, sífilis, cancro mole e linfogranuloma venéreo e as de freqüente
transmissão: donovanose, herpes genital, condiloma acuminado, tricomoníase,
candidíase, uretrite não-gonocócica, uretrite e endocervicite causadas por C.
trachomatis, hepatite B, pitiríase, pediculose e Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida (AIDS) (WHO, 2005b).
5
BARRETO, R.G.
Introdução
De acordo com a WHO, dez a 12 milhões de brasileiros contraem alguma
IST a cada ano, comprovando que o combate a essas doenças continua sendo um
desafio real para as políticas de saúde no Brasil. Porém, o número de casos
notificados está muito abaixo da estimativa, compreendendo cerca de 200 mil
casos/ano. Esse fato pode ser explicado pela notificação das ISTs não ser
compulsória (exceto AIDS e sífilis congênita) e como a maioria das pessoas busca
tratamentos em farmácias e outros estabelecimentos não-oficiais, essas doenças
são sub-notificadas.
Tão importante quanto diagnosticar e tratar, precocemente, os portadores
sintomáticos das ISTs é realizar a detecção dos portadores assintomáticos, haja
vista que esses se comportam como elos fundamentais na cadeia de transmissão
dos agentes infecciosos. Além disso, aumentam a chance de contaminação pelo
HIV em pelo menos dez vezes (Carret et al., 2004). As mulheres têm risco duas
vezes maior do que os homens de adquirir alguma IST de um parceiro infectado
do que o inverso. Assim, os efeitos dessas doenças nas mulheres são muito mais
severos e as seqüelas resultantes dessas infecções são, significativamente, mais
sérias (Sciarra, 1997). Classicamente, as vulvovaginites encontram-se entre as
causas mais freqüentes que motivam as mulheres às consultas ginecológicas
(Telles, 1994, Simões, 1995). A candidíase, a vaginose bacteriana (VB) e a
tricomoníase são responsáveis por mais de 90% dos casos de vulvovaginites
infecciosas (Linhares, Bagnoli & Halbe, 1993). Essas vulvovaginites geram
sintomas como: corrimento, prurido, dispareunia, disúria, desconforto vaginal e
vulvar, entre outros, levando, freqüentemente, à necessidade do tratamento das
mulheres com antimicrobianos e antifúngicos (Sobel, 1990; Aldrighi & Bueno,
1996). As vulvovaginites podem estar associadas a outros estados inflamatórios
ginecológicos decorrentes de diversas causas, como: infecções inespecíficas,
irritações, alergias e doenças sistêmicas.
Os efeitos de vários fatores (idade, paridade, idade precoce ao início da
atividade sexual, número de parceiros sexuais, infecções prévias) sobre o risco de
desenvolvimento das várias ISTs variam segundo os estudos e as regiões
geográficas, gerando perfis epidemiológicos diversificados para as pacientes com
6
BARRETO, R.G.
Introdução
ISTs (Koutsky et al., 1992; Becker et al., 1994; Bornstein et al., 1995). O número
de parceiros sexuais e a idade precoce ao início da atividade sexual são dois
fatores de risco que medem, indiretamente, a exposição aos agentes de
transmissão
sexual.
Isso
é,
especialmente,
importante
no
período
da
adolescência, quando a primeira metaplasia cervical ocorre, aumentando a
vulnerabilidade do epitélio cervical a agentes oncogênicos (Bornstein et al., 1995).
A tricomoníase é causada pelo Trichomonas vaginalis, um protozoário
flagelado, unicelular, oval ou piriforme, que infecta o trato geniturinário tanto das
mulheres quanto o dos homens. Os homens com tricomoníase não manifestam,
habitualmente, sintomas e entre as mulheres, cerca de metade dessas infecções
são assintomáticas. Quando presentes, o sintoma mais comum nas mulheres é a
secreção vaginal bolhosa de cor amarela ou esverdeada e de odor fétido. Disúria,
prurido, ardor e irritação da mucosa também são freqüentes. O exame clínico dos
epitélios vaginal e cervical evidencia pequenas hemorragias puntiformes, as quais
produzem o aspecto em “morango” desses epitélios (Schwebke & Burgess, 2004).
Embora a cultura seja o método mais sensível de diagnóstico, é o mais
dispendioso. O mais prático é o exame a fresco com adição de soro fisiológico a
0,95% a uma alíquota de fluxo vaginal homogeneizada entre lâmina e lamínula e
vista ao microscópio, procurando-se identificar o T. vaginalis. Esse teste apresenta
sensibilidade de 50% a 75% e especificidade superior a 99% (Lewis, 1997).
Nos esfregaços cérvico-vaginais, o T. vaginalis pode ser identificado como
uma estrutura arredondada ou ovalada, muitas vezes de forma irregular. Um
pequeno núcleo excêntrico é visível nos parasitas bem preservados, sendo
fundamental para o diagnóstico citopatológico (Hillier & Arko, 1997; Nazário et al.,
1997; Iglesias et al., 2000; WHO, 2000).
A Candida albicans é o fungo que mais produz quadros infecciosos na
vulva, vagina e, raramente, no colo do útero, ocorrendo em geral, em pacientes
predispostas a um crescimento exacerbado da sua própria flora cérvico-vaginal.
Esse fungo é responsável por cerca de 85% das infecções, sendo que o restante,
deve-se, principalmente, à C. glabrata e, em menor freqüência, a outras espécies
como a C. tropicalis e C. krusei (WHO, 2000).
7
BARRETO, R.G.
Introdução
A C. albicans ocorre em forma de levedura e de micélio. As leveduras são
ovais e em amostras vaginais reproduzem-se assexuadamente, formando brotos.
Esses, continuando a se formar e alongar, sem se desprender entre si, formam as
pseudo-hifas.
Em aproximadamente 20% das mulheres, a simples presença do fungo não
produz sintomas. Nas sintomáticas, o prurido é o sintoma mais relatado, seguido
de secreção espessa branca e sem odor, hiperemia da mucosa cérvico-vaginal,
disúria e dispareunia.
O diagnóstico da candidíase, freqüentemente, é feito em microscopia a
fresco com adição de hidróxido de potássio a 10%, ou através da coloração, pelo
método de Gram, do fluido cérvico-vaginal e são os diagnósticos mais sensíveis. A
cultura, também, é um método bastante sensível e pode ser muito útil para os
casos em que há sintomas e a microscopia é negativa ou ainda nos casos de
candidíase recidivante (Hillier & Arko, 1997; Iglesias et al., 2000; WHO, 2000).
O herpes genital, na maior parte dos casos, é ocasionado pelo HSV-2,
sendo 15% das infecções produzidas pelo HSV-1. A infecção primária pode ser
assintomática ou originar febre, mialgia e cefaléia, precedendo o aparecimento
das lesões.
As lesões cutâneo-mucosas aparecem de dois a sete dias após a
exposição, com dor local e prurido e, geralmente, são múltiplas. Começam com
vesículas ou pápulas que se difundem, rapidamente, e após a ruptura dessas
vesículas, aparecem ulcerações que coalescem. Se não ocorrerem infecções
secundárias, as úlceras cicatrizam em cinco a dez dias, com reepitelização.
Disúria, leucorréia e linfoadenopatia regional são sintomas freqüentes. Após a
infecção inicial, o vírus permanece inativo nos gânglios (Steben, 2005;
Cunningham et al., 2006).
A C. trachomatis é uma bactéria Gram-negativa e intracelular obrigatória.
Produz uma grande variedade de manifestações clínicas, dependendo do sorotipo
envolvido (Panuco et al., 2000). Em mulheres, a C. trachomatis está envolvida em
casos de doença inflamatória pélvica (DIP) e gravidez ectópica (Chan et al., 2000).
Apesar de 50% dos casos serem assintomáticos, essa infecção pode gerar danos
8
BARRETO, R.G.
Introdução
irreparáveis às trompas de Falópio, levando à infertilidade (Paler et al., 2000;
Carvalho, Angeli & Krajden, 2004).
Várias metodologias têm sido descritas para o diagnóstico da infecção pela
C. trachomatis, mas um resultado confiável está diretamente associado a uma
coleta representativa da região infectada, no caso, a JEC e o epitélio endocervical,
que são os locais mais acometidos (Moraes Filho & Longatto Filho, 2000).
Nos esfregaços cérvico-vaginais, a primeira alteração observada no
citoplasma é o aparecimento de numerosos e diminutos corpos cocóides,
circundados por zonas claras. Nos estágios mais avançados, os corpúsculos
cocóides se fundem formando densas inclusões localizadas no interior de
vacúolos maiores.
A VB pode ser conceituada como uma síndrome clínica envolvendo o trato
genital inferior, caracterizada pela diminuição da flora lactobacilar normal e
crescimento excessivo de bactérias anaeróbias ou facultativas, como a
Gardnerella vaginalis, Mobiluncus sp e Mycoplasma hominis (Aroutcheva et al.,
2001).
A VB é a causa mais freqüente de corrimento vaginal em mulheres na idade
reprodutiva, podendo ocorrer em 9,2% a 40,0% das mulheres atendidas em
clínicas ginecológicas (Nazário et al., 1997; Sampaio Neto et al., 1997; Davis et
al., 1997; Lamont et al., 2000; Adad et al., 2001; Avilés et al., 2001; Riedner et al.,
2003, Yen et al., 2003). Porém, aproximadamente, 50% das mulheres não
apresentam sintomas (Amsel et al., 1983). As manifestações clínicas, quando
ocorrem, caracterizam-se por corrimento homogêneo amarelado ou acinzentado,
com odor de peixe, aderente às paredes vaginais e às vezes, bolhoso. Prurido
vaginal não é comum.
Os esfregaços cérvico-vaginais evidenciam numerosas bactérias em forma
de bastão, que podem estar parcial ou totalmente aderidas à superfície das
células escamosas, chegando a recobrir essas células, que são denominadas clue
cells ou “células-alvo”.
Segundo os critérios de Amsel (Amsel et al., 1983), o diagnóstico da VB é
firmado diante de três, entre os quatro seguintes sinais: corrimento fino e
9
BARRETO, R.G.
Introdução
homogêneo, odor espontâneo ou após adição de hidróxido de potássio (KOH) a
10%, pH vaginal > 4,5 e células-alvo (pelo menos uma em cinco células epiteliais).
A coloração pelo Gram é considerada o melhor e mais simples exame para
o diagnóstico da VB. Esse método é preferível à cultura porque é mais específico
e disponível em todos os laboratórios (WHO, 2000). Apresenta elevada
sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo e possui as vantagens de
padronização, se utilizados critérios como o de Nugent e/ou de Spiegel.
O primeiro critério quantifica os morfotipos correspondentes a bacilos Grampositivos grandes (Lactobacillus sp), Gram-negativos pequenos (G. vaginalis) e
Gram variáveis curvos (Mobiluncus spp). Esse critério tem uma pontuação que
varia de zero a dez, atribuindo maior valor à baixa presença de bacilos Grampositivos e elevada presença de bacilos pequenos Gram-negativos e Gram
variáveis. Uma amostra é diagnosticada com a VB, quando a pontuação é maior
ou igual a sete. Pontuação de quatro a seis corresponde a um estado
intermediário e pontuação de zero a três, a uma amostra normal (Joesoef et al.,
1991; Nugent et al., 1991; Hillier & Arko, 1997; Tam et al., 1998; Navarrette et al.,
2000; Delaney & Onderdonk, 2001; Forsum et al., 2002).
No critério mais simples, de Spiegel (Spiegel, Amsel, & Holmes, 1983), os
esfregaços cérvico-vaginais são classificados conforme a presença ou ausência
de bactérias, com base nas quantidades relativas de Lactobacillus sp e G.
vaginalis, não pela presença ou ausência de outros tipos de bactérias. Apresenta
sensibilidade de 62,5% a 100% e especificidade de 73% a 100% (Hillier & Arko,
1997).
Acrescentando-se
a
observação
de
células-alvo
eleva-se
sua
reprodutibilidade interobservador (Lin et al., 2002).
1.3 - Características gerais do HPV e sua participação na carcinogênese
cervical
Recentemente, a nova taxonomia dos Papilomavirus foi reconhecida pela
Internacional Council on the Taxonomy of Viruses como um vírus pertencente à
família Papillomaviridae, gênero papilomavirus Alfa, Beta, Gama, entre outros. O
10
BARRETO, R.G.
Introdução
gênero Alfa-papillomavirus contém todos os tipos de HPV associados às lesões
da mucosa ano-genital (De Villiers et al., 2004).
O HPV é um vírus não-envelopado, com peso molecular de 5x106 daltons e
forma icosaédrica. Apresenta tropismo pela pele e membranas mucosas, podendo
causar uma grande variedade de lesões proliferativas. Possui uma única molécula
de DNA dupla fita, com formato circular e, aproximadamente, 8.000 pares de
bases, envolta por um capsídeo. Esse é formado por 72 subunidades
(capsômeros) e tem cerca de 55nm de diâmetro. O genoma dos HPV (Figura 1),
contém oito ORFs (Open Reading Frames), também conhecidas como unidades
de tradução e é organizado em três regiões: região precoce (E - early), região
tardia (L - late) e região reguladora (LCR - long control region) (Münger, 2004;
Longworth & Laimins, 2004; Jo & Kim, 2005).
Figura 1 - Representação esquemática do genoma do HPV.
Fonte: Jo, H., Kim, J. W. Implications of HPV infection in uterine cervical cancer. Cancer Therapy,
3: 419-434, 2005.
Há seis ORFs na região precoce denominadas E1, E2, E4, E5, E6 e E7,
correspondendo a 45% do genoma viral. As proteínas E1 e E2 são necessárias
para a replicação viral do DNA e formam um complexo em torno da origem de
replicação. A E2, também, atua como controle no mecanismo de transcrição viral.
A proteína E4 interage com a citoqueratina e talvez seja responsável pela
11
BARRETO, R.G.
Introdução
alteração da arquitetura celular, conhecida como coilocitose. A função do gene E5
não está bem clara, mas parece codificar uma proteína membranal com atividade
transformadora fraca. Os genes E6 e E7 codificam, além dos produtos para a
replicação viral, oncoproteínas que têm um papel fundamental na imortalização e
transformação da célula hospedeira. Isso se deve à capacidade das proteínas E6
e E7 se ligarem às proteínas celulares codificadas pelos genes supressores
tumorais p53 e retinoblastoma (Rb), respectivamente, inativando-as (Figura 2).
Dano ao DNA
Apoptose
Fase S
Ubiquitinização
Degradação
A
B
Degradação
Figura 2 - A) Fosforilação da proteína Rb pelo complexo ciclina/cdk inibindo a
atividade repressora de pRb. A oncoproteína E7 liga-se à forma hipofosforilada da
proteína Rb, o que interrompe o complexo formado por pRb e o fator E2F,
liberando esse fator o que leva a célula à fase S do ciclo celular. B) Dano ao DNA
induz a ativação da p53 levando à interrupção no ciclo celular para reparo do DNA
ou à apoptose. A oncoproteína E6 liga-se à E6AP mediando ubiquitinação e rápida
degradação via proteassoma da proteína p53.
Fonte: Jo, H., Kim, J. W. Implications of HPV infection in uterine cervical cancer. Cancer Therapy,
3: 419-434, 2005.
O segmento L representa 40% do genoma e possui dois genes L1 e L2. A
proteína L1 forma o capsídeo viral e a L2 empacota o DNA viral com os outros
produtos gênicos (Figura 1).
A região LCR (Figura 1), que constitui 15% do genoma do HPV, é a única
que não contém ORFs, mas concentra seqüências reguladoras importantes na
replicação e transcrição viral (Sonnex, 1998; Reichman, 2001; Stoler, 2003).
12
BARRETO, R.G.
Introdução
Há mais de 200 tipos de HPV descritos e cerca de 100 já foram
identificados,
com
seus
genomas
inteiros,
isolados
e
completamente
seqüenciados (Bernard, 2005). Entretanto, através da detecção de fragmentos
parciais do genoma, presume-se que existam vários outros tipos do vírus. Tipos
distintos do HPV apresentam diferenças superiores a 10% na seqüência do DNA
na região L1 do genoma. Subtipos do HPV apresentam diferenças entre 2% a
10% e variantes dos tipos apresentam diferenças inferiores a 2% nessa mesma
região do genoma (De Villiers et al., 2004).
Aproximadamente, 40 tipos de HPV podem infectar o trato ano-genital e
são classificados como tipos de baixo ou alto risco oncogênico. Os HPV 6, 11, 40,
42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e CP6108 pertencem ao primeiro grupo e estão
associados a LSIL e, raramente, são encontrados em lesões cancerosas. Já o
segundo, é formado pelos HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68,
73 e 82, que se associam, comumente, a HSIL e ao câncer cervical. Entretanto,
para outros tipos, observam-se divergências na sua classificação, sendo eles,
algumas vezes, considerados como HPV, provavelmente, de alto risco
oncogênico no caso dos tipos 26, 53 e 66. Esses, embora estejam associados a
HSIL, são, raramente, detectados em carcinomas invasores. Enquanto os HPV
34, 57 e 83 são analisados como tipos de risco indeterminado (Munoz et al.,
2003).
A transmissão do HPV requer um contato direto com o tecido epitelial. A
exposição ao vírus, durante o contato sexual com um parceiro infectado
representa a via de infecção mais comum. O HPV infecta as células basais da
região de metaplasia do colo do útero. A perda da integridade da pele ou da
mucosa do trato ano-genital facilita o acesso viral a essas células. Estudos
revelaram um risco estimado em 60% a 80% de se adquirir o HPV através de um
único contato entre pessoas com lesões genitais (Oriel, 1971; Barrasso et al.,
1987; Boon et al., 1988; Malek et al., 1993), sendo o número de parceiros sexuais
um importante fator de risco (Tortolero-Luna, 1999). Embora, as relações sexuais
com penetração sejam importantes na transmissão, admite-se que a aquisição do
HPV possa ocorrer, também, através de contatos sexuais sem penetração,
13
BARRETO, R.G.
Introdução
fômites, por auto-inoculação ou perinatal (Marrazo et al., 2001; Schiffman & Kjaer,
2003; Winer et al., 2003).
Após a exposição ao HPV, a infecção pode se manifestar de três formas:
1 - infecção latente: o DNA
viral encontra-se
na
forma
epissomal,
aparentemente, não-funcional e replica-se apenas uma vez a cada ciclo celular.
Nessa forma de infecção, o DNA-HPV é diagnosticado através de técnicas
moleculares, não existindo evidências clínicas ou morfológicas nos epitélios do
trato ano-genital;
2 - infecção clínica: partículas virais intactas são formadas através de replicação vegetativa do genoma do HPV e se manifesta através da proliferação das
células do epitélio escamoso, o que determina a formação de lesões benignas
como as verrugas genitais e os condilomas;
3 - infecção persistente: o genoma do HPV sofre replicação e expressão e
pode tornar-se integrado ao genoma do hospedeiro. A integração viral resulta na
expressão aumentada dos oncogenes E6 e E7, pela perda dos mecanismos de
regulação mediados por E2, determinando o desenvolvimento de lesões
cancerosas (Ferenczy et al., 1997; Stoler, 2003).
Os primeiros sinais de transcrição do genoma viral aparecem cerca de
quatro semanas após a infecção. O período de incubação pode variar de três a
dezoito meses e a persistência das lesões pode ser avaliada em semanas, meses
ou anos.
A relação causal entre HPV, câncer cervical e suas lesões precursoras já
está bem definida (IARC, 1995; Schiffman & Burk, 1997; Walboomers et al., 1999)
e depende, fundamentalmente, do tipo e carga viral, persistência da infecção e
integração com a célula hospedeira (Syrjänen & Syrjänen, 1999). Vários estudos
sugerem que a infecção pelo HPV é necessária, mas que fatores adicionais estão
envolvidos na progressão das lesões precursoras (Herrerro et al., 1990; Cuzick et
al., 1994; Schiffman & Brinton, 1995; Ho et al., 1998; Southern & Herrington,
1998). Múltiplos parceiros sexuais, parceiros sexuais promíscuos, início precoce
da atividade sexual (Gontijo et al., 2005), outras ISTs, paridade,
uso de
anticoncepcionais orais, fatores dietéticos, imunossupressão e tabagismo têm sido
14
BARRETO, R.G.
Introdução
implicados como potenciais fatores de risco para o carcinoma cervical (Syrjänen &
Syrjänen, 1999; Atalah et al., 2001). Considerando, especificamente, as
adolescentes, a metaplasia cervical pode ser um importante fator, aumentando a
suscetibilidade do epitélio às infecções pelas ISTs (Singer, 1975).
No modelo proposto para a história natural do câncer cervical (Figura 3), a
partir do momento em que a mulher inicia a sua atividade sexual ela pode adquirir
a infecção pelo HPV. Essa pode regredir, espontaneamente, ou levar ao
aparecimento da LSIL, cuja progressão subseqüente resultaria na HSIL e,
eventualmente, no câncer cervical invasor. Entretanto, admite-se, também, a
progressão direta da infecção pelo HPV para a HSIL. A evolução das lesões intraepiteliais cervicais não é um processo irreversível, sendo possível sua regressão
espontânea (Bosch et al., 2002; Schiffman & Castle, 2003).
As lesões precursoras e o câncer do colo do útero acometem,
principalmente, mulheres adultas. Contrariando esse paradigma, observa-se
aumento no risco de NIC em adolescentes com início precoce da atividade sexual
(Kahn et al., 1999).
15
BARRETO, R.G.
Introdução
Câncer de colo do útero
Cérvice
normal
Infecção
pelo HPV
Persistência
viral e progressão
Regressão
Lesão précancerosa
Invasão
Câncer
Incidência
Incidência
HPV
Pré-câncer
15
30
Câncer
45
Idade (anos)
Figura 3 - Relação entre incidências de infecção pelo HPV, lesões précancerosas e câncer.
Fonte: Adaptado de Schiffman M.; Castle P.E. The promise of global cervical-cancer prevention.
New England Journal of Medicine, 353(20):2101-2103, 2005.
A infecção genital pelo HPV é uma das ISTs mais comuns e sua
prevalência em mulheres varia de 15% a 40%. A prevalência da infecção em
mulheres com idade inferior a 30 anos é superior a 30% e declina para níveis de
4% a 5% em mulheres com mais de 45 anos (Schiffman et al., 2000; Ferenczy et
al., 2002; Abba et al., 2003). Estudos conduzidos no Brasil, Colômbia, Paraguai e
Peru mostram taxas de prevalência do HPV entre 15% e 20% em mulheres
sexualmente ativas. A maior parte dos casos concentra-se em duas faixas etárias:
a com idade inferior a 25 anos, com destaque para as adolescentes, e a com
idade entre 35 e 45 anos (Munoz et al., 2003).
Mais de 50% das adolescentes e adultas jovens adquirem o HPV dentro de
quatro ou cinco anos após a primeira experiência sexual, com desenvolvimento de
LSIL em mais de 25% (Moscicki et al., 2001). Entretanto, a maioria das infecções
pelo HPV é transitória. Em torno de 90% a 95% das infecções regridem e 95% das
LSIL também, com o vírus tornando-se indetectável em um a dois anos, por
16
BARRETO, R.G.
Introdução
eliminação completa da infecção ou pelo estabelecimento de uma infecção latente
(Ho et al., 1998; Schiffman & Kjaer, 2003).
Adicionalmente,
novas
infecções
são
constantes,
criando
ondas
sobrepostas de aquisição e regressão, o que explica as baixas taxas de LSIL
(<1%) e mais baixas ainda de doença invasiva (< 0,001%) (Mount & Papillo,
1999).
De acordo com o conhecimento atual, a imunidade humoral é responsável
pela inativação das partículas do HPV e pode até impedir a transmissão e
disseminação viral, enquanto a imunidade celular é responsável pela destruição
das células infectadas e pela regressão das lesões HPV-induzidas (Wu, 1994;
Malejczyk, Malejczyk & Jablonska, 1997; Wang & Hildesheim, 2003).
Há várias técnicas moleculares para a detecção do DNA-HPV, dentre as
quais, destacam-se quatro: Hibridização in situ, Southern Blot, Captura Híbrida e a
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A maior parte da utilização desses
testes está restrita à pesquisa. A técnica de PCR é a mais sensível de que se
dispõe, na atualidade, para verificar a presença do DNA-HPV em amostras
biológicas (Lörincz, 1996; Lancellotti et al., 2000; Van Doorn et al., 2001).
Em revisão recente de diversos estudos que avaliaram o desempenho do
teste de identificação do DNA-HPV na prevenção primária do câncer do colo do
útero, Franco (2003) estimou que a citologia teria, em média, sensibilidade de 60%
e especificidade de 95%, enquanto que o teste para o DNA-HPV teria, em média,
sensibilidade de 85% e especificidade de 84%. Em mulheres na faixa de 30-35
anos o teste para o DNA-HPV teria um desempenho melhor (sensibilidade de 89%
e especificidade de 90%) devido, provavelmente, a menor freqüência de infecções
transitórias nessa faixa etária. O teste para o DNA-HPV e a citologia, se utilizados
em combinação, teriam sensibilidade e valor preditivo negativo bastante elevados
- e de quase 100% para as lesões de alto grau (Ratnam et al., 2000; Franco, 2003;
Sherman et al., 2003).
Considerando os demais fatores envolvidos na gênese das lesões do colo
do útero, Wright & Riopelle (1984) analisaram a idade ao início da atividade sexual
e a idade ao diagnóstico em 747 mulheres com NIC. O estudo sugere que o tempo
17
BARRETO, R.G.
Introdução
de atividade sexual pode ser utilizado como parâmetro normativo para o
rastreamento do câncer do colo do útero. No Brasil, Zeferino (1994) concluiu que o
tempo de atividade sexual está associado ao risco da neoplasia do colo do útero,
mas não varia em função da idade ao início da atividade sexual. É fato que a
quase totalidade das normas dos programas de rastreamento utiliza a idade
cronológica para definir quando as mulheres devem iniciar os controles. O controle
anual é proposto por dois anos consecutivos, a partir dos 25 anos de idade e se
esses controles forem negativos, a cada três anos até os 60 anos (WHO, 1988).
Todavia, com base nos estudos citados anteriormente (Wright & Riopelle, 1984; La
Vecchia et al., 1986; Herrero et al., 1990; Zeferino, 1994), uma mulher com 25
anos de idade e que iniciou a atividade sexual aos 15 teria maior risco de
desenvolver câncer do colo do útero que uma mulher também com 25 anos, mas
que iniciou atividade sexual aos 20, o que demonstra que a idade cronológica não
seleciona, homogeneamente, as mulheres que devem iniciar os controles.
Ferguson (1961) publicou estudo pioneiro demonstrando a importância da
coleta sistemática da citologia oncótica em adolescentes sexualmente ativas. Em
sua casuística de 1500 esfregaços cérvico-vaginais alterados, jovens com idade
inferior a 19 anos representavam 5% dos achados anormais.
Sadeghi et al. (1984) realizaram amplo estudo prospectivo avaliando
194.069 pacientes entre 15 e 19 anos e detectaram citologia oncótica alterada em
1,9% das pacientes (lesões displásicas e carcinoma in situ).
Entre 10.296 exames de Papanicolaou de adolescentes com 10 a 19 anos
de idade realizados em New England-EUA, observou-se que 70,0% foram
normais, 9,7% tiveram diagnóstico de ASCUS e 3,7% diagnóstico de LSIL. As SIL
foram mais freqüentes entre mulheres com 20 a 24 anos de idade, seguida pela
faixa etária de 15 a 19 anos (Mount & Papillo, 1999).
Em Nova York-EUA, entre 271 mulheres de 13 a 22 anos de idade e
atendidas em uma clínica de ISTs, a freqüência de exames de Papanicolaou
anormais foi de 20,7%, sendo que 12,2% foram ASCUS, 7,7% LSIL e 0,7% HSIL.
Os exames de Papanicolaou anormais foram mais freqüentes no grupo das
adolescentes em comparação ao das mulheres adultas. Entre essas mulheres,
18
BARRETO, R.G.
Introdução
13,2% apresentavam alterações na citologia, sendo que 9,9% foram ASCUS,
2,5% LSIL, 0,6% HSIL e 0,2% tinham carcinoma invasor (Edelman et al., 1999)
Utagawa et al. (1998) analisando os resultados da CC obtidos entre 1987 e
1995, pelo programa de prevenção do câncer cervical do Serviço Público de
Saúde do Estado de São Paulo, encontraram um aumento na freqüência de
citologias anormais, durante esse período, em mulheres com menos de 22 anos
de idade. De acordo com esse estudo, entre as 9.681 citologias examinadas em
1995, 2,02% tiveram diagnóstico de LSIL e 0,07% teve diagnóstico de HSIL.
Longatto Filho et al. (2003), também, analisaram os resultados da CC obtidos pela
Rede Pública de Saúde do Estado de São Paulo, porém em período posterior
(1996 a 2001). Esses autores observaram, igualmente, aumento na freqüência de
citologias anormais em mulheres com menos de 22 anos de idade, sendo que,
nesse grupo, 4,2% das citologias examinadas tiveram diagnóstico de SIL.
Também no Brasil, Tacla et al. (2000) descreveram o resultado de estudo
retrospectivo abrangendo a análise de 3.483 esfregaços cérvico-vaginais de
adolescentes entre 11 e 19 anos. Verificaram ainda que 4,4% das amostras
apresentavam citologias oncóticas alteradas. Em relação aos resultados alterados,
93% corresponderam a LSIL e 7%, a HSIL.
Outro estudo, conduzido nos EUA, observou maior freqüência de exames
de Papanicolaou anormais entre adolescentes de 13 a 17 anos de idade (29%) do
que em mulheres com 18 anos ou mais (23%). Nesse estudo, entre as 528
adolescentes de 13 a 17 anos de idade, as prevalências de ASCUS, LSIL e HSIL
foram de 16%, 13% e 0,2%, respectivamente. Já nas mulheres com 18 anos ou
mais, as prevalências de ASCUS, LSIL, HSIL e carcinoma de células escamosas
foram de 15%, 7%, 1,2% e 0,1%, respectivamente (Simsir et al., 2002).
Considerando que o Ministério da Saúde preconiza, para o Brasil, ações de
detecção precoce dirigidas às mulheres na faixa etária de 25 a 59 anos de idade,
através do Programa Viva Mulher e os dados descritos acima, ressalta-se a
importância da inclusão das adolescentes nos programas de rastreamento das
lesões precursoras do câncer do colo do útero.
19
2 - Justificativa
BARRETO, R.G.
Justificativa
A prevalência da infecção pelo HPV está relacionada à incidência do câncer
cervical, principalmente, nos países em que os programas de rastreamento são
deficientes ou inexistentes, o que pode ser comprovado pelas altas taxas de
incidência, relacionadas às populações com altas prevalências da infecção pelo
HPV (IARC, 2001; Bosch & De Sanjose, 2003; Shin et al., 2003). Assim, apesar do
câncer cervical ser um evento raro em mulheres jovens, conhecer a prevalência
do principal fator responsável por esse câncer contribuirá para o planejamento de
estratégias de prevenção da doença.
Em relação aos fatores associados à infecção pelo HPV, observa-se que a
idade precoce da primeira relação sexual é, freqüentemente, identificada como um
fator de risco para a infecção. Entretanto, a associação entre essa infecção e
outros fatores comportamentais, sócio-demográficos e reprodutivos, não tem sido
tão consistente e estudos conduzidos em diversos grupos populacionais têm
encontrado diferentes fatores determinantes da infecção pelo HPV (Bauer et al.,
1993; Hildesheim et al., 1993; Franco et al., 1995; Munoz et al., 1996; TortoleroLuna, 1999; Sellors et al., 2000; Giuliano et al., 2001; Lazcano-Ponce et al., 2001;
Peyton et al., 2001; Molano et al., 2002; De Sanjose et al., 2003; Matos et al.,
2003; Pham et al., 2003). Então, a investigação de fatores associados à infecção
pelo HPV e a avaliação da distribuição das taxas de prevalência em mulheres
jovens, com infecções subclínicas e lesões iniciais, correlacionando-as aos
diferentes aspectos comportamentais e ginecológicos poderá contribuir para um
melhor conhecimento da história natural da doença nesse grupo.
Vê-se, portanto, que a expressão da doença pode ser ampla e a evolução
imprevisível. De um lado pode ocorrer a cura espontânea e do outro, constantes
recidivas mediadas por inúmeros fatores e situações. O conhecimento de técnicas
moleculares, como a PCR, pode contribuir para um melhor diagnóstico, facilitando
o raciocínio terapêutico e prognóstico, porém não é suficiente para estabelecer,
com clareza, qual será a evolução da doença. Assim, os testes moleculares e
morfológicos permitem traçar o perfil epidemiológico da prevalência da infecção
pelo HPV e das lesões por ele induzidas.
21
BARRETO, R.G.
Justificativa
Além disso, apesar do câncer cervical ser um importante problema de
saúde no Brasil, em revisão da literatura, encontram-se poucos estudos sobre a
infecção pelo HPV em mulheres brasileiras que tenham utilizado técnicas
moleculares para identificação do HPV. Igualmente, poucos estudos abordaram a
ocorrência de anormalidades citológicas cervicais em mulheres brasileiras com a
utilização da CML.
Neste trabalho, os resultados de um estudo realizado em adolescentes e
mulheres brasileiras jovens são relatados, correlacionando dados ginecológicos às
diferentes metodologias para avaliação da flora cérvico-vaginal, o desempenho da
CC e CML e a detecção do DNA-HPV pela PCR.
22
3 - Objetivos
BARRETO, R.G.
Objetivos
3.1 - Objetivo geral
Avaliar a prevalência de processos inflamatórios e displásicos em
adolescentes e mulheres jovens, e correlacionar esses achados com a presença
do DNA-HPV detectado pela PCR.
3.2 - Objetivos específicos
3.2.1 - Comparar o desempenho do exame citológico de esfregaços
coletados e confeccionados pela técnica da CC e pela técnica da CML.
3.2.2 - Comparar
os
diagnósticos
microbiológicos
obtidos
entre
as
diferentes técnicas (Gram, a fresco, CC e CML).
3.2.3 - Determinar a prevalência do DNA-HPV na população estudada.
3.2.4 - Determinar a associação dos fatores de risco ginecológicos em
relação às alterações citológicas associadas ou não ao DNA-HPV.
24
4 - Metodologia
BARRETO, R.G.
Metodologia
4.1 - Casuística
Este estudo foi realizado no Centro de Apoio à Saúde do Adolescente
(CASA), Organização Não-Governamental, sediada em Itabirito, Minas Gerais; na
Escola de Farmácia e no Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto.
Itabirito tem uma população estimada de 42.195 habitantes (IBGE, 2006).
Desses, 7.550 estão na faixa etária de 10 a 19 anos, período, cronologicamente,
estabelecido como adolescência e 3.666 estão na faixa etária de 20 a 24 anos
sendo considerados adultos jovens (IBGE, 2004; WHO, 1998). O CASA atua na
proteção integral ao adolescente através de apoio sócio-educativo em meio aberto
e de atendimento biopsicossocial em caráter preventivo. Desde a sua fundação,
em 2000, prestou atendimento a 3670 adolescentes (meninos e meninas).
Semanalmente, em torno de 400 adolescentes participam das atividades e a cada
dia novos adolescentes são cadastrados, encaminhados pelos pais, conselho
tutelar, escolas, rede de saúde, judiciário etc. Esse trabalho é desenvolvido por
uma equipe interdisciplinar, formada por médicos (generalista, ginecologistaobstetra, pediatra e hebiatra), psicólogos, assistente social, terapeuta ocupacional,
naturólogo e pedagogo.
Na clínica ginecológica, foi constatado que a maior demanda de
atendimentos para as adolescentes foi gravidez não-planejada e ISTs e o trabalho
do CASA reduziu o número de internações por gravidez/parto, de 63% em 2002,
para 59,6% em 2004.
Durante a realização deste trabalho foram avaliadas 166 mulheres jovens
com idade variando de 14 a 23 anos atendidas pelo CASA, cujas amostras foram
encaminhadas à Escola de Farmácia da UFOP, caracterizando amostragem por
conveniência, entre fevereiro e dezembro de 2005, tendo sido respeitados os
critérios de inclusão e exclusão previamente definidos.
Todas as participantes assinaram um Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Anexo 1). O protocolo previa que os resultados da citologia estariam
26
BARRETO, R.G.
Metodologia
disponíveis para as pacientes e que seria responsabilidade do ginecologista
comunicar esses resultados às participantes. Um resultado anormal na citologia
seria explicado à participante, que teria acompanhamento adequado. Os
resultados da PCR para o HPV, também, foram fornecidos. O sigilo foi respeitado
em relação às informações coletadas e em momento algum a paciente foi
identificada. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética, estando de acordo com
as atribuições da Resolução do Conselho Nacional de Saúde (CNS) 196/96 .
4.1.1 - Critérios de inclusão
• Mulheres adolescentes e adultas jovens de 14 a 23 anos de idade;
• Termo de consentimento, devidamente, assinado (ANEXO 1) e
• Útero intacto.
4.1.2 - Critérios de exclusão
• Administração crônica (definida
como
mais
de
14
dias)
de
imunossupressores ou outras drogas modificadoras da imunidade nos últimos seis
meses;
• Defeitos congênitos importantes ou enfermidade crônica grave;
• Anormalidade aguda ou crônica, clinicamente significante, das funções
pulmonar, cardiovascular, hepática ou renal, como determinado pelo exame
clínico e
• Recusa na assinatura do termo de consentimento.
4.2 - Coleta de dados e procedimentos
A assinatura do termo de consentimento foi solicitada (ANEXO 1) após o
esclarecimento sobre a pesquisa, às pacientes e indagado o desejo em participar.
27
BARRETO, R.G.
Metodologia
Todas as participantes completaram um questionário contendo perguntas
relacionadas aos seus dados pessoais e história sexual, contraceptiva e
reprodutiva, com o auxílio de um membro da equipe do estudo (ANEXO 2).
A seguir, as pacientes foram encaminhadas para exame ginecológico, em
mesa apropriada, submetendo-as à introdução de espéculo de Collins,
suavemente, com a inspeção do colo do útero, atentando-se para suas
características e observando-se se havia friabilidade cervical e presença de muco.
4.2.1 - Colpocitologia
4.2.1.1 - Convencional
Foram utilizadas espátulas de Ayre para coleta da amostra ectocervical e
escovas (Cytobrush®) para a coleta da amostra endocervical. A espátula e a
escova com o material colhido foram passadas em uma lâmina de vidro,
devidamente, identificada com as iniciais da paciente e o número de protocolo,
produzindo um esfregaço que foi, rapidamente, fixado em álcool 95%. Todos os
frascos contendo os esfregaços foram encaminhados ao Laboratório de Citologia
da Escola de Farmácia para procedimento de coloração (ANEXO 3).
4.2.1.2 - Meio líquido
Para a realização dessa técnica, introduziu-se uma escova específica
(Digene®) no canal endocervical, de modo que as cerdas maiores tocassem a
região ectocervical sob leve pressão. A escova foi girada cinco vezes (360º) no
sentido horário e, em seguida, a ectocérvice foi escovada. Após a coleta, a escova
foi colocada dentro do frasco contendo o meio líquido e desconectada do cabo. O
frasco foi fechado e agitado por, aproximadamente, trinta segundos para
homogeneizar a amostra. Todos os frascos contendo o meio líquido com a escova
28
BARRETO, R.G.
Metodologia
foram encaminhados ao Laboratório de Citologia da Escola de Farmácia para
processamento.
No laboratório, cada tubo foi homogeneizado, individualmente, em alta
velocidade por vinte segundos. Foram pipetados 200 µL de cada amostra,
dispensando-as, uniformemente, sobre a membrana de policarbonato. A seguir, a
tampa do Prepgene® foi fechada, as laterais travadas durante dez segundos, para
impressão das células às lâminas. Posteriormente, os esfregaços foram fixados
por quinze minutos em álcool 95% e submetidos à coloração de Papanicolaou
(ANEXO 3).
4.2.1.3 - Avaliação citopatológica
As lâminas da CC e da CML foram coradas pelo método de Papanicolaou
(ANEXO 3) e avaliadas com base no Sistema de Bethesda 2001 (Solomon &
Nayar, 2005) para relato de diagnósticos citológicos cervicais (ANEXO 4).
4.2.2 - Exame a fresco
Parte da secreção, coletada com a espátula e a escova, foi colocada em
uma lâmina de vidro, devidamente, identificada, acrescido soro fisiológico e
realizada a leitura em microscópio com aumento de 100X e 400X, procurando-se
identificar a flora bacteriana predominante, T. vaginalis e esporos ou pseudo-hifas
de Candida sp.
4.2.3 - Gram
A espátula (ectocérvice) e escova (endocérvice) foram utilizadas para a
confecção de dois esfregaços distintos. Esses esfregaços foram fixados em
chama e, posteriormente, corados pelo método do Gram (ANEXO 5). As lâminas
29
BARRETO, R.G.
Metodologia
foram avaliadas com aumento de 1000X para determinação da flora bacteriana, de
acordo com método de Spiegel e de possíveis agentes infecciosos.
4.2.4 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
4.2.4.1 - Coleta das amostras
Durante a consulta ginecológica, foram realizados raspados da ecto e
endocérvice, com o auxílio de uma escova (Cytobrush®) que foi colocada em
tubos eppendorfs, contendo 1 mL tampão T.E. (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1
mM), previamente, identificados. As amostras foram refrigeradas (entre 2°C e
10°C) e encaminhadas ao Laboratório de Imunopatologia da UFOP, onde foram
armazenados a -70ºC para posterior realização da PCR.
4.2.4.2 - Seleção dos primers
Neste trabalho, para amplificar o DNA-HPV, foram utilizados os
oligonucleotídeos MY09/MY11 que flanqueiam uma seqüência conservada da
região L1 do genoma viral de 449 pb. Esses primers são degenerados em
algumas posições; assim, o anelamento é possível a mais de um nucleotídeo,
durante a reação da PCR, permitindo a amplificação de um grande espectro de
HPV (Schiffman et al., 1991; Qu et al., 1997).
O gene da β-actina humana, com os primers BAR/BAF, foi amplificado
como controle interno da reação. Esse procedimento teve a finalidade de verificar
a integridade e suficiência de DNA das amostras para amplificação. Esses primers
foram confeccionados utilizando-se o programa Gene Runner. O número de
acesso do gene da β-actina no Gen Bank é XR 019608.
30
BARRETO, R.G.
Metodologia
Tabela 1 - Seqüências dos primers para detecção do HPV e da β-actina.
Número de
Código
nucleotídeos
Seqüência
MY09
20
CGTCCCAGGGGATACTGATC
MY11
20
GCCCAGGGTCATAATAATGG
BAF
24
TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAC
BAR
25
TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG
Figura 4 - Seqüência do gene L1 do HPV 16 (sentido 5′ → 3′). Região de anelamento do par de primers MY09 e MY11.
4.2.4.3 - Padronização das condições da PCR
Com o objetivo de obter uma amostra adequada para a realização da PCR
foram testados vários protocolos. Inicialmente, foi realizada uma preparação
incluindo a digestão com incubação de 4 horas a 550C com proteinase K, seguida
de purificação com fenol:clorofórmio. Em uma segunda etapa, foi testada uma
incubação de 6 horas a 500C e tratamento com fenol:clorofórmio. Após essas
31
BARRETO, R.G.
Metodologia
tentativas, testou-se, também, a incubação com proteinase K, excluindo o
tratamento com fenol:clorofórmio. Essas últimas condições permitiram a obtenção,
de forma simplificada e rápida, de uma amostra de qualidade adequada para a
realização da PCR.
Para a otimização da reação de PCR, foram utilizadas inicialmente
amostras comprovadamente positivas e negativas para a presença do DNA-HPV.
Assim, foram testadas várias condições em relação à PCR: temperatura de
“anelamento”, ciclagem e concentrações de dNTPs, de cloreto de magnésio e de
Taq polimerase. Temperatura de “anelamento”: 500C a 550C com variação de 10C.
Número de ciclos: 35 e 40 ciclos. Concentração de dNTPs total: 5 e 10 mM.
Cloreto de magnésio: 2mM e 4 mM. Taq polimerase: 2,5 unidades e 5 unidades
por reação.
4.2.4.4 - Preparo das amostras após padronização
As amostras acondicionadas em tubos eppendorfs foram homogeneizadas
com auxílio de um vortex por 20 segundos. Em seguida, 200 µL da amostra foram
transferidos para um tubo eppendorf de 500 µL. A solução foi centrifugada a
10.000 r.p.m. por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet,
ressuspendido em 40 µL de solução de digestão contendo 10mM Tris-HCl pH 8,0,
EDTA 1mM e 0,5 % Tween 20 e 4,0 µL de proteinase K (20µg/mL). A solução foi
homogeneizada e incubada a 50ºC, em banho-maria, durante 6 horas. Após o
período da digestão enzimática, os tubos foram colocados em um banho a 95ºC,
por 10 minutos para inativar a proteinase K. Logo após, os tubos foram
centrifugados a 10.000 r.p.m. por 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido em
novo tubo eppendorf e estocado a -20ºC para posterior realização da reação de
amplificação.
32
BARRETO, R.G.
Metodologia
4.2.4.5 - Amplificação do DNA-HPV e da β-actina
A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 25 µL
composto por 10 µL da solução contendo o DNA extraído anteriormente, 2 µL da
solução de dNTPs a 10 mM, 3,0 µL do tampão da Taq DNA Polimerase 10x
concentrado, 2 µL de cloreto de magnésio 50mM, 1,0 µL da enzima Taq DNA
Polimerase (Platinum Taq DNA Polymerase, Invitrogen) a 5 U/µL, 6,0 µL de
água mili-Q e 1,0 µL de cada primer MY09/11 ou 1,0 µL de cada primer BAF/BAR
a 50 picomol/µL. Para cada bateria de amplificação pela PCR, foi utilizado um
controle negativo constituído pelas mesmas concentrações e pelos mesmos
reagentes da reação de amplificação, exceto o DNA.
Os sistemas de amplificação contendo os primers MY09/11 e BAF/BAR
foram realizados, separadamente, em tubos eppendorf de 200µL e foram
transferidos para o termociclador. O programa de PCR utilizado consistiu das
seguintes etapas: desnaturação inicial por 5 minutos a 95ºC, seguida por 35 ciclos
de amplificação (95ºC a 1 minuto; 53ºC a 1 minuto e 72ºC a 1 minuto), uma etapa
de extensão final a 72ºC durante 5 minutos e posterior manutenção a 4ºC
(Schiffman et al., 1991; Qu et al., 1997).
4.2.4.6 - Análise da reação de PCR
Ao produto final amplificado foram adicionados 3,0 µL de loading buffer
(Promega). Para cada amostra, o volume total obtido da reação de amplificação
para os primers do HPV e da β-actina foram aplicados, seqüencialmente, em gel
de agarose a 1,5%, o qual foi submetido à corrente eletroforética, em cuba
horizontal, a 90V durante 90 minutos, utilizando-se TBE 0,5x como tampão de
corrida. O gel foi corado com brometo de etídio (0,5 mg/mL) e os fragmentos
amplificados foram visualizados através de um transluminador com luz ultravioleta
e, posteriormente, fotografados para análise do tamanho dos fragmentos de DNA
obtidos. O resultado foi considerado positivo para DNA viral quando duas bandas
foram visualizadas sendo uma com 449 pb, correspondente ao DNA-HPV e a
33
BARRETO, R.G.
Metodologia
outra com 290 pb, ao gene da β-actina (Figura 4). Se apenas a banda de 290 pb
foi visualizada, o resultado foi considerado negativo para DNA-HPV. Foram
excluídas da análise as amostras negativas para o gene da β-actina.
A intensidade das bandas foi avaliada utilizando-se o software Quantity One
(Bio Rad), conforme instrução do manual do fabricante. O produto da razão das
bandas obtidas com primers específicos para HPV e β-actina foram expressos em
unidade arbitrária de densitometria.
4.3 - Processamento e Análise dos Dados
Todas as fichas foram ordenadas, numericamente, para arquivamento e os
resultados dos exames foram codificados para se criar um banco de dados. Todas
as informações foram digitadas no programa Excel®. Após a digitação, foram
realizadas tabelas descritivas para verificação da consistência dos dados para
cada variável do estudo. Os formulários foram submetidos a uma revisão.
Eventuais erros, inconsistências ou lacunas foram corrigidos, recorrendo-se aos
prontuários originais.
Primeiramente, foi realizada análise descritiva das características da
amostra através de medidas de freqüência e porcentagem. Posteriormente,
cruzamentos entre os resultados obtidos para o DNA-HPV foram realizados no
intuito de observar o percentual de concordância entre eles.
Para verificar a significância estatística das diferenças entre os grupos,
utilizou-se o teste do χ2, adotando-se como significância estatística o valor inferior
a 5% (p<0,05). Para avaliação de concordância utilizou-se o índice Kappa, que
varia de -1 (discordância total) a +1 (concordância perfeita) e classifica a
concordância como ruim quando < 0,00; fraca entre 0,00 e 0,20; sofrível entre 0,21
e 0,40; regular entre 0,41 e 0,60; boa entre 0,61 e 0,80; ótima entre 0,81 e 0,99 e
perfeita quando igual a 1,00. As prevalências da infecção pelo HPV e das lesões
identificadas na citologia cervical foram calculadas com seus respectivos
intervalos de confiança de 95%.
34
5 - Resultados
BARRETO, R.G.
Resultados
5.1- Caracterização da amostra
No período de janeiro a dezembro de 2005, 175 pacientes foram atendidas
pelo CASA em Itabirito, Minas Gerais. Dessas, 166 preencheram os critérios de
inclusão e ingressaram neste estudo. Nove pacientes foram excluídas porque não
assinaram o termo de consentimento.
A Tabela 2 apresenta a distribuição das pacientes de acordo com a idade
no dia do exame e ao início da atividade sexual. A idade média foi de 17,8±1,9
anos, oscilando entre 14 e 23 anos, com idade prevalente de 17. Entre as 166
mulheres, 99,4% eram sexualmente ativas e, apenas, uma paciente de 16 anos
(0,6%) relatou nunca ter tido atividade sexual. Das 165 pacientes sexualmente
ativas, 113 (68,7%) iniciaram atividade sexual antes dos 15 anos, 49 (29,5%) entre
os 16 e 17 anos e apenas 3 pacientes (1,8%) aos 18 anos (Tabela 2).
A Tabela 3 apresenta a distribuição das pacientes de acordo com o tempo
de atividade sexual, em anos. Verificou-se que 29,5% das pacientes tinham entre
um e dois anos de atividade sexual, 45,2% entre três e cinco anos e 24,7% com
mais de cinco anos de atividade sexual.
A Tabela 4 apresenta a distribuição das pacientes de acordo com algumas
características ginecológicas selecionadas. Como método de anticoncepção, 3,6%
eram usuárias de DIU, 31,3% de anticoncepcional oral e 56% alegaram utilizar
método de barreira. Quando solicitada informação a respeito de gravidez, 3,6%
tinham por motivo da consulta ginecológica, o esclarecimento sobre possível
gravidez, 13,3% encontravam-se grávidas e 83,1% não. Quanto à paridade, 16,9%
tinham um ou dois filhos e, apenas, 1,8% acima de três filhos. Apesar do colo,
macroscopicamente, ter se apresentado alterado em 18,7% das pacientes,
apenas, 4,8% apresentavam características clínicas sugestivas de ISTs. O teste
de Schiller foi positivo em 17,5% das pacientes, não sendo observada correlação
do teste positivo aos achados citológicos. A presença de secreção com aspecto
distinto do fisiológico foi verificada em 44,6% das pacientes.
36
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 2 - Distribuição das mulheres por idade cronológica e idade ao início
da atividade sexual, em anos.
Idade ao início da atividade sexual
Idade
N/%
virgem
12
13
14
15
16
17
18
14
1/0,6%
-
-
1
-
-
-
-
-
15
11/6,6%
-
-
3
6
2
-
-
-
16
29/17,5%
1
-
5
5
13
5
-
-
17
42/25,3%
-
8
8
-
12
10
4
-
18
30/18,1%
-
-
3
10
7
9
1
-
19
18/10,1%
-
-
4
3
2
2
7
-
20
18/10,1%
-
-
-
8
4
4
2
-
21
8/4,8%
-
-
3
-
3
-
2
-
22
6/3,6%
-
1
-
1
1
-
2
1
23
3/1,8%
-
-
-
-
-
-
1
2
TOTAL 166/100% 1/0,6% 9/5,4% 27/16,3% 33/19,9% 44/26,5% 30/18,1% 19/11,4% 3/1,8%
37
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 3 - Distribuição das mulheres por idade cronológica e tempo de
atividade sexual, em anos.
Tempo de atividade sexual (anos)
Idade
atual
N/%
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
14
1/0,6%
-
-
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
15
11/6,6%
-
2
6
3
-
-
-
-
-
-
-
-
16
29/17,5%
1
5
13
5
5
-
-
-
-
-
-
-
17
42/25,3%
-
4
10
12
-
8
8
-
-
-
-
-
18
30/18,1%
-
-
1
9
7
10
3
-
-
-
-
-
19
18/10,1%
-
-
7
2
2
3
4
-
-
-
-
-
20
18/10,1%
-
-
-
-
2
4
4
8
-
-
-
-
21
8/4,8%
-
-
-
-
-
2
-
3
-
3
-
-
22
6/3,6%
-
-
-
-
-
1
2
-
1
1
-
1
23
3/1,8%
-
-
-
-
-
-
2
1
-
-
-
-
TOTAL
166
1
11
38
31
16
28
23
12
1
4
0
1
100%
0,6% 6,6% 22,9% 18,7% 9,6% 16,9% 13,9% 7,2% 0,6% 2,4% 0% 0,6%
38
BARRETO, R.G.
Tabela 4 - Distribuição
das
características ginecológicas.
Resultados
mulheres
de
acordo
com
as
Freqüência
Porcentagem
Sim
Não
Uso de anticoncepcional oral
6
160
3,6
96,4
Sim
Não
Grávidas
52
114
31,3
68,7
Sim
Não
Não sabe
Realização de Papanicolaou
22
138
6
13,3
83,1
3,6
Primeira vez
Já fizeram
Número de gestações
60
106
36,1
63,9
0
1-2
≥3
IST
135
28
3
81,3
16,9
1,8
Suspeita
Não
Aspecto macroscópico do colo
8
158
4,8
95,2
Colo alterado
Colo normal
Colo não-visualizado
Teste de Schiller
31
134
1
18,7
80,7
0,6
Positivo
Negativo
Secreção
29
137
17,5
82,5
92
74
55,4
44,6
Usuárias de DIU
Fisiológica
Não-fisiológica
39
BARRETO, R.G.
Resultados
5.2 - Exame citológico: convencional e meio líquido
A qualidade dos esfregaços foi semelhante entre as duas técnicas, sendo
considerados satisfatórios em 100% das amostras da CC e em 97,5% das
amostras da CML. Quatro esfregaços (2,5%) foram considerados insatisfatórios na
CML devido à baixa celularidade (Tabela 5).
Epitélio metaplásico foi identificado em 30,7% da CC e em 13,9% da CML. A
presença de células metaplásicas mostrou uma correlação moderada (Índice
Kappa= 0,5; IC= 0,34-0,67, p<0,05). As células endocervicais estavam presentes
em 72,3% dos esfregaços confeccionados pela CC e em 62,4% da CML,
mostrando uma boa correlação, de acordo com análise de concordância (Índice
Kappa= 0,64; IC= 0,51-0,77, p<0,05). Portanto, a ausência de células
endocervicais/metaplásicas foi mais freqüente na CML (Tabela 5).
As células metaplásicas imaturas foram visualizadas em 4,2% da CC e em
0,6% da CML. Células endometriais foram observadas apenas na CC (1,8%).
A prevalência dos diagnósticos citológicos foi semelhante entre os dois
métodos, sendo observados 48,8% de exames citológicos com diagnóstico normal
(Figura 6A) na CC e 46,8% na CML (Índice Kappa= 0,88; IC= 0,81-0,96). O
diagnóstico de processo inflamatório (Figura 5A) foi observado em 47% da CC e
em 51,3% da CML (Índice Kappa= 0,99; IC= 0,96-1,01).
O diagnóstico de lesões pré-neoplásicas mais prevalente foi LSIL nos dois
grupos. Não foi detectada a presença de HSIL, carcinoma invasor ou lesões
glandulares no material avaliado. A avaliação da CC (Figura 5) mostrou a
presença de um caso de ASC-US (0,6%, Figura 5B) e seis de LSIL (3,6%, Figuras
5C-H). Coilócitos, binucleação, disceratose e aumento do tamanho nuclear
acompanhado de hipercromasia foram observados em quatro dos seis esfregaços
com diagnóstico de LSIL, sugerindo a presença do HPV.
Na CML (Figura 6), foi identificado um caso de ASC-US (0,6%, Figura 6B) e
apenas dois de LSIL (1,3%, Figuras 6C e D), sem características citológicas
sugestivas da presença do HPV (Tabela 5). A concordância entre esses
40
BARRETO, R.G.
Resultados
diagnósticos frente aos dois métodos foi moderada (Índice Kappa= 0,59; IC= 0,190,99).
Dos seis esfregaços com diagnóstico de LSIL na CC, dois, também,
receberam esse diagnóstico na CML. Os outros quatro foram classificados como
esfregaços inflamatórios. A avaliação posterior desses quatro esfregaços mostrou
a presença de raras células com características de LSIL com infecção pelo HPV
(Figuras 6E e F) em duas amostras. Nas outras duas, o diagnóstico de processo
inflamatório foi mantido.
41
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 5 - Distribuição das mulheres de acordo com a citologia convencional
e em meio líquido.
Convencional (n=166)
Meio líquido (n=158)
Freqüência
Porcentagem
Freqüência
Porcentagem
0
166
0,0
100,0
4
154
2,5
97,5
166
120
51
100,0
72,3
30,7
154
96
22
100
62,4
14,3
Células endometriais
3
1,8
0
0,0
Células metaplásicas imaturas
7
4,2
1
0,6
Citólise
24
14,5
13
8,4
Normal
81
48,8
72
46,8
Inflamatório
78
47
79
51,3
51
27
30,7
16,3
47
32
30,5
20,8
ASC-US
1
0,6
1
0,6
LSIL
sem HPV
com HPV
6
2
4
3,6
1,2
2,4
2
2
0
1,3
1,3
0
Amostra
Insatisfatória
Satisfatória
Presença de epitélios
Escamoso
Glandular
Metaplásico
Específico
Inespecífico
42
BARRETO, R.G.
Resultados
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 5 - Fotomicrografias dos esfregaços de Papanicolaou confeccionados de
acordo com a técnica convencional. A - Inflamatório; B - Células atípicas de
significado indeterminado (ASC-US); C a H - Lesão intraepitelial escamosa de
baixo grau (LSIL). Papanicoloau, 1000X.
43
BARRETO, R.G.
Resultados
A
B
C
D
E
F
Figura 6 - Fotomicrografias dos esfregaços de Papanicolaou confeccionados a
partir de material colhido em meio líquido. A - Normal; B - Células atípicas de
significado indeterminado (ASC-US); C a F - Lesão intraepitelial escamosa de
baixo grau (LSIL). Papanicolaou, 1000X.
44
BARRETO, R.G.
Resultados
A Tabela 6 apresenta os resultados da avaliação da flora bacteriana na CC
e na CML. Na CML, foi observado maior percentual de flora escassa 7,8%
(p<0,05) e menor capacidade de diagnóstico de Candida sp e lactobacilos.
De modo geral, a infecção do trato genital inferior de maior prevalência, na
população estudada, foi a VB. Apenas 12 casos apresentaram Candida sp e
outros três, T. vaginalis. A presença de C. trachomatis, Actinomyces ou Vírus
Herpes simples não foi observada nos esfregaços avaliados (Tabela 6).
A detecção de T. vaginalis foi idêntica nos dois métodos corados pelo
Papanicolaou (3 diagnósticos). Porém, quando se compara o exame a fresco, que
identificou cinco amostras com T. vaginalis, tanto o Gram quanto a CC e a CML,
foram menos eficientes na detecção desse protozoário (p<0,05). Por outro lado, a
detecção de G. vaginalis foi menos eficiente nos exames a fresco (19,9%), quando
comparados aos esfregaços de Papanicolaou (CML= 22,8% ou CC= 21,7%) e
Gram (24,7% - p<0,05) - Tabelas 6, 7 e 8.
45
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 6 - Distribuição das mulheres segundo o resultado da avaliação
microbiológica na citologia convencional e em meio líquido.
Diagnóstico citológico
Convencional (n=166)
Meio líquido (n=154)
Freqüência
Porcentagem
Freqüência
Porcentagem
Lactobacilos
89
53,6
68
44,1
Bacilos
16
9,6
19
12,4
Cocos
1
0,6
0
0,0
Cocos + Bacilos
8
4,8
8
5,3
Gardnerella vaginalis
36
21,7
36
23,4
Candida sp
12
7,2
8
5,2
Candida + Bacilos
3
1,8
4
2,6
Candida + Lactobacilos
6
3,6
2
1,3
Candida + Lactobacilos + Bacilos
1
0,6
1
0,6
Candida + Cocos + Bacilos
2
1,2
1
0,6
Trichomonas vaginalis
3
1,8
3
1,9
TV + Bacilos
2
1,2
2
1,3
TV + Bacilos + Cocos
1
0,6
1
0,6
1
0,6
12
7,8
166
100,0
154
100,0
Flora escassa
TOTAL
46
BARRETO, R.G.
Resultados
5.3 - Exame a fresco
Analisando-se o conteúdo cérvico-vaginal ao exame a fresco, constatou-se
a presença de lactobacilos em 89 (53,6%) amostras, anormalidade em 49 (29,5%),
resultado inconclusivo em 12 (7,2%) e 16 amostras (9,6%) não foram avaliadas no
exame a fresco. Dentre as pacientes com conteúdo vaginal anormal, os achados
foram: G. vaginalis em 33 (19,9%), esporos ou pseudo-hifas de Candida sp em 11
(6,6%), dos quais dois (1,2%) associados às células-alvo (clue cells); T. vaginalis
em 5 (3,0%), dos quais 2 (1,2%) associados às células-alvo (Tabela 7).
Tabela 7 - Resultados do exame a fresco do conteúdo vaginal obtido ao exame
especular.
Resultados do exame a fresco
Frequência
Porcentagem
Lactobacilos
89
53,6
Gardnerella vaginalis
33
19,9
Candida sp (Esporos ou pseudo-hifas)
11
6,6
+ Lactobacilos
7
4,2
+ Gardnerella vaginalis
2
1,2
+ Bacilos + Cocos
1
0,6
+ Bacilos
1
0,6
5
3,0
+ Gardnerella vaginalis
2
1,2
+ Bacilos + Cocos
2
1,2
+ Bacilos
1
0,6
Inconclusivo
12
7,2
Não realizado
16
9,6
TOTAL
166
100
Trichomonas vaginalis
47
BARRETO, R.G.
Resultados
5.4 - Gram
A bacterioscopia das lâminas coradas pelo método de Gram empregando o
critério de Spiegel, associado às células-alvo para o diagnóstico de VB, revelou
esfregaço normal em 97 (58,3%), presença de T. vaginalis em 3 (1,8%), esporos
ou pseudo-hifas de Candida sp em 13 (7,8%) e achados de VB em 41 (24,7%)
pacientes (Tabela 8). Flora escassa foi observada em 5,4% das pacientes.
Diferenças no diagnóstico da amostra coletada da ecto ou endocérvice não foram
observadas.
Tabela 8 - Resultados do exame corado pelo Gram do conteúdo vaginal obtido ao
exame especular.
Freqüência
Porcentagem
Lactobacillus G+
67
40,3
Lactobacillus G-
16
9,6
Bacilos G+
11
6,6
Cocos G+
3
1,8
Gardnerella vaginalis
41
24,7
Candida sp (Esporos ou pseudo-hifas)
13
7,8
Lactobacilos G+
5
3,0
Lactobacilos G-
2
1,2
Bacilos G+ e G-
4
2,4
Cocos G+
2
1,2
3
1,8
Bacilos + Cocos
1
0,6
Bacilos G+
2
1,2
Flora Escassa (inconclusivo)
9
5,4
Não realizado
3
1,8
166
100
Resultados do exame corado pelo Gram
Trichomonas vaginalis
TOTAL
48
BARRETO, R.G.
Resultados
5.5 - Concordância dos diagnósticos microbiológicos
A Tabela 9 apresenta as concordâncias da bacterioscopia pelo Gram e os
exames a fresco, CC e CML nos diagnósticos de VB, candidíase vaginal e
tricomoníase, enquanto a Tabela 10, os resultados da análise estatística para
esses parâmetros.
Tabela 9 - Concordância entre os diagnósticos de vaginose bacteriana, candidíase
vaginal e tricomoníase pelo Gram frente ao exame a fresco, citologia convencional
e em meio líquido.
GRAM
G. vaginalis
Candida sp.
T. vaginalis
presente ausente presente ausente presente ausente
Exame a
fresco
Presente
33
0
11
0
3
2
Ausente
8
125
2
153
0
161
Total
41
125
13
153
3
163
Citologia
convencional
Presente
36
0
12
0
3
0
Ausente
5
125
1
153
0
163
Total
41
125
13
153
3
163
Citologia em
meio líquido
Presente
36
0
8
0
3
0
Ausente
5
113
5
141
0
151
Total
41
113
13
141
3
151
49
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 10 - Sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos (VPP) e
negativos (VPN) dos diagnósticos de vaginose bacteriana, candidíase vaginal e
tricomoníase pelo Gram frente ao exame a fresco, citologia convencional e em
meio líquido.
GRAM
G. vaginalis
Candida sp.
T. vaginalis
Sensibilidade
80,5
84,6
100,0
Especificidade
100,0
100,0
98,8
VPP
100,0
100,0
60,0
VPN
94,0
98,7
100,0
Índice Kappa
0,86
0,91
0,74
Sensibilidade
87,8
92,3
100,0
Especificidade
100,0
100,0
100,0
VPP
100,0
100,0
100,0
VPN
96,2
99,4
100,0
Índice Kappa
0,92
0,96
1,0
Sensibilidade
87,8
61,5
100,0
Especificidade
100,0
100,0
100,0
VPP
100,0
100,0
100,0
VPN
95,8
96,6
100,0
Índice Kappa
0,91
0,75
1,0
Exame a fresco
Citologia
(Convencional)
Citologia
(meio líquido)
50
BARRETO, R.G.
Resultados
5.6 - Detecção do DNA-HPV pela PCR
A Figura 7 ilustra um gel de agarose realizado utilizando amostras,
sabidamente, positivas e negativas para o DNA-HPV, já tendo sido submetidas às
condições ótimas de reação.
500pb
449pb
390pb
Figura 7 - Gel de agarose representativo da padronização da reação de PCR.
Análise das reações de PCR: conforme descrito em materiais e métodos, 20µL
das amostras foram analisados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo
de etídio. Canaleta 1: Padrão de Peso Molecular (bandas variam de 100 em 100
pb). Canaletas 2, 4, 6, 8 e 12: Ausência de banda do HPV. Canaletas 3, 5, 7, 9,
11, 13 e 15: Banda da β-actina (390pb). Canaletas 10 e 14: Banda do HPV
(449pb). Canaleta 16: Ausência de banda no controle negativo.
Após a padronização das condições ótimas para realização da PCR, foram
processadas 166 amostras, das quais 159 foram viáveis e sete não permitiram
amplificação do DNA da β-actina (Tabela 11). O par de primers MY09/11 detectou
DNA-HPV em 20,1% das amostras (32 pacientes).
O DNA-HPV foi detectado em 100% das pacientes com ASC-US e LSIL. Na
CC (um ASC-US e seis LSIL) e na CML (um ASC-US e dois LSIL). A sensibilidade
do diagnóstico citológico para ASC-US e LSIL na CC frente à positividade do
DNA-HPV foi de 21,9%, especificidade e valor preditivo positivo de 100% e valor
preditivo negativo de 83,6%. Entretanto, o coeficiente Kappa foi de 0,31 (IC= 0,060,56) indicando uma fraca concordância. Porém, frente a um diagnóstico de ASC-
51
BARRETO, R.G.
Resultados
US ou LSIL, há uma probabilidade de predizer positividade para DNA-HPV de
100%.
Considerando a CML, a sensibilidade do diagnóstico citológico de ASC-US
e LSIL frente à positividade do DNA-HPV foi menor, 9,4%, especificidade e valor
preditivo positivo de 100% e valor preditivo negativo de 79,9%. Nesse caso, o
coeficiente Kappa foi de 0,14 (IC= -0,14 a 0,42) indicando uma pobre
concordância. Porém, frente a um diagnóstico de ASC-US ou LSIL na CML,
também há uma probabilidade de predizer positividade para DNA-HPV de 100%.
Das pacientes negativas para lesão na avaliação citopatológica, ou seja,
pacientes com esfregaços normais e inflamatórios na CC (152) e na CML (144),
25 (16,5%) e 29 (20,1%), respectivamente, apresentaram DNA-HPV.
52
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 11 - Distribuição das mulheres segundo a detecção do DNA-HPV pela técnica
da PCR de acordo com os resultados citopatológicos obtidos na avaliação da citologia
convencional e em meio líquido.
Resultado da citologia
Convencional
(n=159)
Meio líquido
(n=147)
Resultado
da
PCR
PCR
Negativo
(n=127)
Normal
n
%
Inflamatório
n
%
ASC- US
n
%
LSIL
n
%
61
48
66
52
0
0
0
0
PCR
Positivo
(n=32)
7
21,9
18
56,3
1
3,1
6
18,8
PCR
Negativo
(n=115)
60
52,1
55
47,9
0
0
0
0
PCR
Positivo
(n=32)
8
25
21
65,6
1
3,1
2
6,25
53
BARRETO, R.G.
Resultados
A avaliação da densitometria das bandas da β-actina e do HPV nos subgrupos pacientes DNA-HPV positivo/citologia negativa e pacientes DNA-HPV
positivo/citologia positiva (Figura 8) não mostrou distinção entre os dois grupos.
A
500pb
449pb
390pb
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
B
449pb
500pb
390pb
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Densidade de banda
2,5
C
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Pacientes HPV+
Citologia –
n=25
Pacientes HPV+
Citologia +
n=7
Figura 8 - A - Gel de agarose representativo de cinco amostras (1, 3 e 5: HPV
negativo; 2, 4, 6 e 8: β-actina positivo; 7: HPV positivo; 9 e 10: amostra
insatisfatória); B - Gel de agarose de cinco amostras (1: HPV negativo; 2, 4, 6, 8 e
10: β-actina positivo; 3, 5, 7 e 9: HPV positivo); C - Média da razão das
densitometrias (HPV/β-actina) nas amostras negativas ou positivas para lesões na
citologia convencional.
54
BARRETO, R.G.
Resultados
5.7 - Taxa de detecção do DNA-HPV e as alterações celulares segundo
alguns fatores de risco ginecológicos
A Tabela 12 relaciona a prevalência da infecção pelo HPV de acordo com
as características ginecológicas. Não foram observadas diferenças significativas
em relação ao uso de DIU, gravidez, realização anterior de Papanicolaou, número
de gestações, ISTs, aspecto macroscópico do colo, teste de Schiller, aspecto da
secreção, nessa amostra populacional, entre os grupos de mulheres positivas ou
negativas para o DNA-HPV.
A idade de início, bem como o tempo de atividade sexual, e o uso de
anticoncepcional foram, significativamente, associados à detecção do DNA-HPV
(p=0,04, p=0,037 e p=0,003).
55
BARRETO, R.G.
Resultados
Tabela 12 - Prevalência de infecção pelo HPV de acordo com as características
ginecológicas.
HPV negativo
n
%
HPV positivo
n
%
Idade (anos)
14 - 19
126
97
61,0
29
18,2
20-23
33
30
18,9
3
1,9
159
127
79,9
32
20,1
0-3
79
68
42,8
11
6,9
4-7
75
54
34,0
21
13,2
8 - 11
5
5
3,1
0
0,0
159
127
79,9
32
20,1
Sim
6
5
3,1
1
0,6
Não
153
122
76,7
31
19,5
Anticoncepcional oral
50
31
19,5
19
11,9
Método de barreira
109
97
61,0
12
7,5
Sim
22
18
11,3
4
2,5
Não
131
103
64,8
28
17,6
6
6
3,8
0
0,0
0
130
106
66,7
24
15,1
1-2
27
19
11,9
8
5,0
≥3
2
2
1,3
0
0,0
TOTAL
Atividade sexual (anos)
TOTAL
Usuárias de DIU
Anticoncepção
Gravidez
Não sabe
Número de gestações
56
BARRETO, R.G.
Resultados
HPV negativo
HPV positivo
n
%
n
%
Papanicolaou
Primeira vez
60
45
28,3
15
9,4
Já fizeram
99
82
51,6
17
10,7
Suspeita
7
5
3,1
2
1,3
152
122
76,7
30
18,9
Alterado
29
21
13,2
8
5,0
Normal
129
105
66,0
24
15,1
1
1
0,6
0
0,0
Positivo
27
18
11,3
9
5,7
Negativo
132
109
68,6
23
14,5
Fisiológica
89
68
42,8
21
13,2
Não-fisiológica
70
59
37,1
11
6,9
IST
Não
Aspecto macroscópico do colo
Não-visualizado
Teste de Schiller
Secreção
57
6 - Discussão
BARRETO, R.G.
Discussão
6.1 - Exame de Papanicolaou
Todas as amostras avaliadas pela CC foram satisfatórias, sendo verificada
a presença de células glandulares e metaplásicas em 72,3% e 30,7%, das
amostras respectivamente. Considerando as células metaplásicas imaturas, essas
foram vistas em 4,2%, enquanto as endometriais em apenas 1,8% das amostras
colhidas pela CC. Por outro lado, nos esfregaços preparados de acordo com a
técnica da CML, 4 amostras (2,5%) apresentaram baixa celularidade. Nas demais,
foram visualizadas células glandulares endocervicais em 60,8% e metaplásicas
em 13,9%. Células endometriais não foram encontradas nesse preparado e
metaplásicas imaturas em uma amostra apenas.
Neste trabalho, diferente do relatado por outros autores (Pereira et al.,
2003; Kirschner, Simonsen & Junge, 2006), não foi observada melhora na
qualidade da amostra da CML, quando comparada à CC. Pelo contrário,
encontraram-se
amostras
paucicelulares,
especificamente,
na
CML.
Provavelmente, esse fato deve relacionar-se à coleta do material, assim como, à
menor freqüência de células glandulares e metaplásicas, também, pode ser
explicada por esse motivo à semelhança do observado por Obwegeser & Brack
(2001) e Monsonego et al. (2001). Esse é um aspecto importante, pois a JEC é a
sede preferencial das lesões displásicas e neoplásicas do colo do útero (Luzzatto
& Boon, 1996).
Na CC, a escova utilizada (Cytobrush) parece ser superior à utilizada na
CML (Digene) na amostragem das células do canal endocervical, uma vez que a
área de contato com o epitélio glandular é maior. Esse fato pode explicar o porquê
da redução do número de células endocervicais nos esfregaços preparados a
partir da CML. Nesse caso, utilizou-se apenas a escova contida no kit da DIGENE,
enquanto, na CC, a espátula de Ayre, associada a cytobrush em todos os casos.
No estudo de Obwegeser & Brack (2001), os autores discutem que o
problema da CC não estaria na fixação e preparo da lâmina, mas sim na coleta.
No nosso trabalho, foram tomados inúmeros cuidados durante a coleta do material
e, possivelmente, são os responsáveis pela melhor qualidade da CC frente
59
BARRETO, R.G.
Discussão
àqueles preparados a partir da CML. Ou seja, na rotina elevada do dia-a-dia,
talvez, a CC seja prejudicada em termos de qualidade da amostra ainda no
momento da coleta. Não se pode deixar de concordar que, realmente, a coleta, o
material usado, o treinamento do profissional e todos os procedimentos que
antecedem a fixação e a preparação da lâmina são fatores relevantes para um
bom resultado citológico. Como esses mesmos cuidados foram tomados em
relação à coleta da CML, isso reforça, mais uma vez, a deficiência desse método
em relação à CC, pelo menos em relação à faixa etária estudada.
6.2 - Diagnóstico citopatológico
Diversos estudos compararam o desempenho da CML ao da CC e as
conclusões são variadas. Grande parte relata a diminuição do número de
esfregaços insatisfatórios e aumento na sensibilidade para detecção das
alterações displásicas com a utilização da CML (Sanches-Ramos & Ndubisi, 2001;
Obwegeser & Brack, 2001). Muitos estudos sugeriram a superioridade da CML no
diagnóstico citológico das SIL e relataram diminuição do diagnóstico de ASC, pois
presumiram que a homogeneização e a filtração da amostra permitiram melhor
avaliação das células, facilitando o diagnóstico citológico.
No nosso trabalho o diagnóstico de esfregaços normais ou inflamatórios,
tanto aqueles da CC, quanto aqueles preparados a partir da CML, não
apresentaram diferenças significativas. Porém, o diagnóstico de lesão intraepitelial
escamosa (ASC-US e LSIL) foi maior no material da CC (3,6%) em relação a CML
(2,4%) sugerindo que a CC foi melhor no diagnóstico das lesões pré-malignas, à
semelhança do demonstrado por outros autores (Hutchinson et al.,1999).
Corroborando esses dados, ainda em 2002, frente à grande utilização da
CML, Mosely & Paget (2002) afirmaram que os dados existentes, comparando as
duas técnicas, não eram suficientes para justificar a sua implantação no
rastreamento do câncer do colo do útero em detrimento da CC. Além disso, há
que se considerar o alto custo da CML frente à CC. Posteriormente, em 2006,
Davey et al. realizaram um grande estudo de metanálise e concluíram que a CML
60
BARRETO, R.G.
Discussão
não é melhor que a CC, pois eles não verificaram diferenças significativas nas
porcentagens dos esfregaços insatisfatórios entre essas técnicas. Como
agravante, os diagnósticos de HSIL foram mais freqüentes na CC e os de ASC
menos freqüentes, sugerindo que a performance da CC ainda é superior a CML.
6.3 - Achados citopatológicos
Entre os critérios morfológicos utilizados na realização dos diagnósticos
citopatológicos, a coilocitose e a disceratose são considerados sinais clássicos da
presença do HPV e como sinais não-clássicos: binucleação, citomegalia, halo
perinuclear, escamas córneas e núcleos hipercromáticos. A atipia coilocitótica é
considerada o maior critério morfológico usado pelos citopatologistas para o
diagnóstico de infecção pelo HPV. Pode-se destacar que esse não é o critério
mais freqüentemente encontrado nos esfregaços citológicos. Cerca de um terço
das infecções pelo HPV podem passar desapercebidas citologicamente se o
diagnóstico for baseado somente no encontro dessas alterações. A coilocitose
apresenta-se como o quarto, nono e sexto critério mais observado nos trabalhos
de Jordão et al., (2003), Kaneshima et al., (2003) e Silveira et al., (2005),
respectivamente. Neste estudo, a coilocitose associada a sinais não-clássicos da
infecção pelo HPV foi observada em quatro casos (66,6%).
Diversos autores mostraram que a multinucleação, binucleação e mitoses
atípicas estiveram, significativamente, associadas com a positividade para DNAHPV, sendo confiáveis para a detecção da infecção (Roteli-Martins et al., 2001;
Jordão et al., 2003; Kaneshima et al., 2003; Silveira et al., 2005). Neste trabalho, a
binucleação e a hipercromasia mostraram-se como os critérios não-clássicos
predominantes no diagnóstico citológico de infecção pelo HPV.
Neste estudo, encontro de atipia coilocitótica, disceratose ou núcleos
aumentados e hipercromáticos associados à binucleação mostraram-se presentes
nos casos positivos para o DNA-HPV. Dessa forma, este trabalho reafirma que os
dados morfológicos há muito tempo conhecidos e valorizados, são fortes
61
BARRETO, R.G.
Discussão
indicadores da infecção viral, com alto valor preditivo quanto à presença do HPV,
como foi demonstrado pela PCR.
Os esfregaços, tanto da CC quanto da CML, que citologicamente
apresentaram-se normais ou inflamatórios, porém com DNA-HPV detectado pela
técnica da PCR, foram reavaliados (dados não mostrados). No entanto, sinais
clássicos ou não-clássicos, sugestivos da infecção pelo HPV, não foram
observados, permanecendo válidos os diagnósticos anteriores.
6.4 - Aspectos microbiológicos
O trato genital feminino inferior e sua microflora representam um
ecossistema balanceado (Pybus & Onderdonk, 1999). Esse ecossistema é
dinâmico, com alterações na estrutura e composição influenciadas pela idade,
menarca, fase do ciclo menstrual, gravidez, infecções, métodos contraceptivos,
freqüência de relações sexuais, número de parceiros sexuais e duchas vaginais
(Schwebke et al., 1999; Eschenbach et al., 2000; Burton & Reid, 2002; Clarke et
al., 2002; Ness et al., 2002).
Desde o primeiro estudo microbiológico (Döderlein, 1892), os lactobacilos
têm sido descritos como membros predominantes da microflora vaginal normal
(Hillier et al., 1993; Antonio, Hawes & Hillier, 1999) desempenhando um
importante papel na manutenção do ecossistema vaginal normal, prevenindo o
crescimento exacerbado de bactérias e de outros organismos oportunistas,
através da produção de ácido láctico, peróxido de hidrogênio, bacteriocinas e
outras substâncias antimicrobianas (Hillier, 1998; Sobel, 1999a; Donders et al.,
2000). Porém, outras bactérias, em pequeno número, como Staphylococcus,
Ureaplasma, Corynebacterium, Streptococcus, Peptostreptococcus, Gardnerella,
Bacterioides, Mycoplasma, Enterococcus, Escherichia, Veillonella, Bifidobacterium
e fungos como a Candida sp (Redondo-Lopez et al., 1990; Larsen & Monif, 2001;
Marrazzo et al., 2002) podem estar presentes.
No Brasil, a alta prevalência de agentes bacterianos, fúngicos e
protozoários na cérvice uterina tem sido relatada, apresentando variações ao
62
BARRETO, R.G.
Discussão
longo do tempo. A incidência da candidíase tem aumentado, significativamente,
representando 20% a 25% dos corrimentos genitais de natureza infecciosa,
(Almeida Filho, Passos & Fonseca, 1990; Aleixo Neto, Hamdan & Souza, 1999;
Adad et al., 2001; Corsello et al., 2003), de forma semelhante ao observada para a
G. vaginalis, enquanto a tricomoníase apresenta-se em curva descendente.
Freqüentemente, a G. vaginalis tem sido relatada em associação a infecções pelo
HPV (Adad et al., 2001; CDC 2005).
No exame de Papanicolaou, o diagnóstico dos agentes microbiológicos é de
importância secundária, pois a sua finalidade é a identificação precoce de lesões
precursoras do câncer do colo do útero. Porém, o diagnóstico de alguns agentes,
é possível e foi mantido pelo Sistema de Bethesda revisado em 2001 (Solomon &
Nayar, 2005). Neste trabalho, avaliamos, comparativamente, o método do exame
a fresco, Gram, CC e CML para a detecção da flora cérvico-vaginal.
Neste trabalho, a flora de padrão lactobacilar foi identificada em 53,6%,
49,9%, 53,6% e 44,1% das amostras avaliadas no exame a fresco, Gram, CC e
CML, respectivamente. Apenas, quando se comparou o diagnóstico microbiológico
da CML aos demais métodos, foi verificada diferença, sugerindo que a
determinação de lactobacilos por esse método tende a ser prejudicada. De acordo
com Alves et al. (2004), a CML apresenta desempenho diagnóstico similar à CC.
Esse autor ressalta que a CC é mais precisa na identificação da flora lactobacilar e
de cocos, enquanto a CML tem um melhor desempenho na identificação da G.
vaginalis. Essa característica da CML é importante e pode ser explicada pela
homogeneização e filtragem da amostra como dito anteriormente, facilitando a
identificação das clue cells, as quais confirmam o diagnóstico de G. vaginalis.
Estes aspectos também podem explicar o maior percentual de flora escassa na
CML quando comparada a CC.
Neste trabalho, a G. vaginalis foi identificada em 19,9%, 24,7%, 21,7% e
23,4% das amostras avaliadas no exame a fresco, Gram, CC e CML
respectivamente. Como era esperado, dado a necessidade da visualização de
clue cells para o diagnóstico da vaginose, tanto no exame a fresco, quanto na CC
e CML, o percentual de diagnóstico foram semelhantes. Por outro lado, a
63
BARRETO, R.G.
Discussão
identificação de G. vaginalis pelo método do Gram mostrou-se superior, refletindo
a sua denominação de padrão-ouro para o diagnóstico da vaginose bacteriana. No
entanto, a especificidade do exame de Papanicolaou, seja na CC ou na CML, foi
elevada. Além disso, a diferença no percentual entre o Gram e o Papanicolaou
residiu no diagnóstico de cocos ou cocos e bacilos no Papanicolaou frente ao
diagnóstico de G. vaginalis no Gram.
O exame a fresco apresenta-se, segundo Cavalcante, Miranda & Portugal
(2005), como o melhor método para o diagnóstico da candidíase, quando
comparado ao Gram e Papanicolaou. Neste trabalho, verificamos 6,6%, 7,8% e
7,2% quando utilizado o exame a fresco, Gram e CC respectivamente, o que está
de acordo com os dados da literatura. Por outro lado, o Papanicolaou, utilizando a
CML, identificou, apenas, 5,2% de amostras positivas para o fungo. Esses
resultados sugerem que a CML dificulta a visualização desse microorganismo.
Os achados, quanto à concordância diagnóstica do Gram, exame a fresco,
CC e CML do conteúdo cérvico-vaginal para tricomoníase, estão coerentes com a
literatura, uma vez que o exame a fresco apresentou maior sensibilidade para
tricomoníase do que os métodos de coloração pelo Gram e Papanicolaou. Isso
pode estar relacionado à perda da motilidade do T. vaginalis nas amostras já
fixadas (Gram, CC e CML), o que faz com que sua forma se confunda com outras
estruturas presentes no esfregaço. Uma outra explicação possível para a maior
detecção do T. vaginalis no exame a fresco pode ser o pequeno número desse
protozoário na amostra, facilmente identificado em movimento e, dificilmente,
quando fixado, imóvel.
Por outro lado, quando comparada a CC à CML, Alves et al. (2004)
sugeriram que o T. vaginalis é mais visualizado na CC, provavelmente, pela maior
familiarização dos observadores com essa técnica. No entanto, neste trabalho,
houve concordância da CC e da CML, muito provavelmente pelo treinamento ao
qual foram submetidos os avaliadores responsáveis pela análise microscópica
deste trabalho.
De uma maneira geral, a baixa detecção de T. vaginalis na atualidade,
possivelmente, está relacionada à alta detecção da vaginose bacteriana, que é
64
BARRETO, R.G.
Discussão
tratada intensa e aleatoriamente, provocando uma quase erradicação do
protozoário, pois esse, também, é sensível aos fármacos utilizados no tratamento
da VB. Esse fato é notado por outros pesquisadores, que ressaltam, ainda, que as
campanhas de prevenção da AIDS com a disseminação do uso de métodos de
barreira
estão
colaborando
para
o
decréscimo
dessa
infecção,
pois,
diferentemente, da candidíase e da VB, a tricomoníase está mais relacionada à
transmissão sexual (Lossick et al., 1991; Petrin et al., 1998; Sobel, 1999b).
6.5 - Diagnóstico molecular do HPV
A freqüência de SIL (3,6%) neste trabalho foi menor do que a de pacientes
portadoras do vírus HPV (20,1%) no diagnóstico pela PCR. Nossos dados
demonstraram fraca concordância entre a presença do HPV e o diagnóstico de
SIL, o que significa dizer que HPV positivo nem sempre quer dizer SIL, podendo
haver infecções que não se manifestaram ou não produziram alteração
morfológica. Por outro lado, todas as SIL mostraram positividade para o DNAHPV, ou seja, diante de um diagnóstico de SIL na presente amostra, há uma
chance de 100% de positividade para o DNA-HPV.
A detecção do DNA-HPV, pelas técnicas moleculares, em mulheres com
citologia oncótica dentro dos limites da normalidade, sugere latência clínica.
Mesmo com resultado de Papanicolaou na CC dentro dos limites da normalidade,
16,5% (25/159) das participantes deste estudo estavam infectadas pelo HPV.
Estudos demonstram que os HPV podem ser encontrados em parcela significativa
de mulheres sexualmente ativas, em estado de latência clínica. Para Villa (1995),
o percentual de mulheres nessa situação oscila entre 10% a 40%, sendo os
maiores índices encontrados nas mais jovens; já, para Perez e Crum (2000), 80%
das mulheres podem estar infectadas por esses vírus, em algum período de sua
vida sexual, embora, somente, uma parcela reduzida daquelas infectadas pelo
HPV desenvolverá lesões displásicas na cérvice uterina.
65
BARRETO, R.G.
Discussão
É importante considerar que, em adolescentes e mulheres jovens, a maioria
das infecções pelo HPV e das LSIL é transitória e regride espontaneamente (Ho et
al., 1998; Moscicki et al., 1998; Moscicki, 1999; Saslow et al., 2002), admitindo-se,
portanto, para adolescentes com LSIL, uma abordagem mais conservadora. Para
esse grupo etário, a Sociedade Americana de Colposcopia e Patologia Cervical
considera a repetição da citologia com seis e 12 meses ou a pesquisa do DNAHPV após 12 meses como alternativas aceitáveis para a abordagem de uma LSIL,
não sendo necessária a realização imediata da colposcopia (Wright et al., 2002).
Considerando esses aspectos, o diagnóstico de SIL é tão importante quanto
o de infecção pelo HPV. Por um lado, sabe-se que a maioria das LSIL regride
espontaneamente (Solomon, Schiffman & Tarone, 2001) e por outro, que a
simples presença e persistência do DNA do HPV aumenta em 100 vezes a chance
do aparecimento do câncer cervical em relação às mulheres livres da infecção
(BOSCH, 2001). Esses dados mostram a importância de estudos que avaliem a
prevalência de infecção pelo HPV e lesões pré-neoplásicas em adolescentes e
mulheres jovens, principalmente se esses estudos são desenvolvidos ao longo do
tempo com o mesmo grupo de pacientes.
Neste estudo mostramos que 20,1% das mulheres jovens apresentaram
infecção pelo HPV. Essa taxa é compatível com a literatura, em que a prevalência
em mulheres jovens varia de 15% a 40% (Schiffman et al., 2000; Ferenczy et al.,
2002; Abba et al., 2003; Lazcano-Ponce et al., 2001; Molano et al., 2002; Matos et
al., 2003; Ferlay et al., 2001; Kotloff et al., 1998; Bauer et al., 1991; Sellors et al.,
2000; Melkert et al., 1993; Jacobs et al., 2000). Por outro lado, sabe-se que,
embora, a prevalência da infecção pelo HPV seja maior em mulheres jovens,
quando comparadas às mulheres com mais de 30 anos, a maioria dessas
infecções se resolverá dentro de um período de aproximadamente 24 meses,
sendo consideradas infecções sem o desenvolvimento de SIL, provavelmente,
devido à resposta imune da paciente (Meijer et al., 2000).
Corroborando esses dados, nossos resultados mostraram que mesmo com
essa taxa de 20,1% de infecção pelo HPV, 78,1% das amostras positivas
apresentaram resultados citológicos negativos para lesões pré-neoplásicas.
66
BARRETO, R.G.
Discussão
Portanto, a citologia permanece como método diagnóstico extremamente
necessário visto que, a presença do HPV sem a detecção de lesão, tem pouco ou
nenhum significado clínico, apenas conduz ao acompanhamento, fato esse que,
tradicionalmente, já seria contemplado pelas consultas anuais. Vale a pena
ressaltar que esse acompanhamento visa a detecção daquelas pacientes em que
o HPV persiste e, ainda, leva ao desenvolvimento de lesões. Por outro lado, é
importante considerar que estudos acompanhando essas pacientes HPV positivas
e com resultado citológico dentro dos limites da normalidade são fundamentais
para o conhecimento da história natural do câncer do colo do útero.
Esses dados reafirmam que outros fatores precisam ser levados em
consideração quando se analisa o risco do desenvolvimento das lesões préneoplásicas. A detecção isolada do DNA-HPV é insuficiente e outros aspectos
devem ser analisados conjuntamente. Dentre esses fatores, a história natural da
infecção pelo HPV, incluindo o desenvolvimento de infecção persistente, a
eliminação espontânea do vírus e a interação com o sistema imunológico, devem
ser avaliados, simultaneamente, a fim de se avaliar o risco de lesões préneoplásicas.
6.6 - Fatores de risco ginecológicos e diagnóstico molecular do HPV
No presente estudo, as mulheres que apresentaram entre quatro e sete
anos de atividade sexual e ainda na faixa etária da adolescência (14 a 19 anos)
apresentaram maior chance de infecção pelo HPV que as mulheres que haviam
iniciado a vida sexual há mais tempo. Isso pode ser explicado porque quanto
maior o tempo de atividade sexual maior a probabilidade de aquisição de
imunidade para alguns tipos de HPV.
Em revisão sistemática da literatura, Green et al. (2003) concluíram que não
existem evidências sugerindo uma associação negativa ou positiva entre o uso de
anticoncepcionais orais e as infecções prevalentes por HPV. Entretanto, na faixa
etária avaliada neste trabalho houve associação do uso de anticoncepcional à
presença do HPV. Tal fato pode ser explicado pela maior exposição a parceiros
67
BARRETO, R.G.
Discussão
infectados pelo HPV sem o uso de preservativos uma vez que as adolescentes
têm uma preocupação real com gravidez, mas não com as ISTs. Assim, o uso de
anticoncepcional fornece a elas uma idéia de proteção falsa.
A idade das mulheres que compõem este estudo e a associação entre HPV
e câncer do colo do útero sugerem que elas deverão ser acompanhadas com
cuidado. Deve-se observar, no entanto, que a tipificação do HPV (não realizada
neste estudo) ajudaria a identificar as mulheres sob maior risco de desenvolver
lesões displásicas. Por outro lado, cumpre ressaltar que a presença do HPV em
mulheres com resultado citológico normal permitiria uma investigação mais
apurada, mas nunca intervenção terapêutica (reservada àquelas com alterações
morfológicas).
A maior incidência do câncer do colo do útero acomete mulheres com
idades entre 40 e 60 anos, sendo menos freqüente antes dos 30 anos. Isso pode
ser explicado pelo longo período de evolução da infecção pelo HPV no início da
atividade sexual, passando pelas lesões pré-neoplásicas até o câncer da cérvice
uterina. Entretanto, esse quadro vem se modificando e o aparecimento de
anormalidades
citopatológicas
em
adolescentes
sexualmente
ativas
tem
aumentado, progressivamente, alterando-se de 3%, na década de 70, para 20%,
na década de 90 (Mount & Papillo, 1999; Wright et al., 2005). Fatores de risco,
como o início cada vez mais precoce da atividade sexual, multiplicidade de
parceiros e fatores biológicos, geram maior vulnerabilidade a essa faixa etária.
Diante disso, justifica-se a inclusão do exame de Papanicolaou como rotina
laboratorial em mulheres jovens, não como instrumento para rastrear o câncer do
colo do útero, já que a doença é rara nessa faixa etária, mas, sim, como
ferramenta para preservação da saúde e prevenção de futuras lesões, uma vez
que elas têm um longo período de desenvolvimento que se inicia, a partir do
contato com HPV. As pacientes detectadas como portadoras do HPV, neste
trabalho, permanecem em acompanhamento para que a manutenção/eliminação
do vírus seja avaliada, assim como as características citológicas verificadas nesse
primeiro momento.
68
7 - Conclusões
BARRETO, R.G.
Conclusões
A qualidade dos esfregaços confeccionados com a CC foi melhor do que a
CML.
A detecção de esfregaços normais e inflamatórios foi semelhante entre os
dois métodos enquanto de lesões intra-epiteliais escamosas, foi superior na CC.
A infecção cérvico-vaginal de maior prevalência foi a vaginose bacteriana
(21,7%), seguida pela candidíase (7,2%) e tricomoníase (1,8%). A prevalência do
diagnóstico de lactobacilos e de Candida sp foi superior na CC. Não houve
diferença entre as duas técnicas para o diagnóstico de cocos, bacilos, G. vaginalis
e T. vaginalis.
A concordância entre os diagnósticos microbiológicos no exame a fresco,
na CC e na CML, tendo como padrão-ouro o Gram, variou de boa a muito boa,
com alta especificidade e alto valor preditivo positivo. A sensibilidade variou de
80,5% a 100%, com exceção do diagnóstico de Candida sp. realizado pela CML
onde a sensibilidade foi de 61,5%.
A prevalência de DNA-HPV na população estudada foi de 20,1%, sendo
16,5% associados a esfregaços normais ou inflamatórios e 3,6% associados a
lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau, detectadas pela CC.
Não houve correlação da presença do DNA-HPV com os agentes
microbiológicos.
A idade de início, bem como o tempo de atividade sexual e o uso de
anticoncepcional foram associados à presença do DNA-HPV.
70
8 - Referências Bibliográficas
BARRETO, R.G.
Referências Bibliográficas
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Médicas Universidade Estadual de Campinas].
89
9 - Anexos
BARRETO, R.G.
Anexos
ANEXO 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido
Título do Projeto: Alterações inflamatórias e processos displásicos do colo do
útero em adolescentes e mulheres jovens e sua relação com o vírus do papiloma
humano (HPV)
Observação: Este documento lhe dará [e a seus pais]* as informações
necessárias para ajudá-la a decidir se você deseja participar ou não desse estudo.
Ele permitirá uma compreensão completa, mas simples, acerca das razões
científicas desse estudo, bem como sobre seus direitos e responsabilidades no
caso de decidir participar.
Objetivo do Estudo: Muitos estudos científicos demonstraram uma forte
correlação entre as infecções genitais causadas por determinados grupos de vírus
e o desenvolvimento de câncer do colo do útero anos mais tarde. Esses vírus, do
grupo do Papilomavírus Humano (HPV), são adquiridos, geralmente, durante as
relações sexuais. Nós planejamos um estudo que tem como principal enfoque a
identificação e o acompanhamento de mulheres portadoras do HPV bem como de
outras lesões associadas presentes no colo uterino. Por isso, convidamo-la a fazer
parte desse estudo, cujos objetivos, procedimentos, riscos e benefícios estão
descritos a seguir.
Participação no Estudo: Se você decidir participar nesse estudo, o primeiro
passo será uma entrevista com um profissional da saúde que lhe explicará [e para
seu pai/mãe/responsável] o estudo detalhadamente. Você deverá [você e seu
pai/mãe/responsável deverão] antes consentir com a participação no estudo.
Pediremos que você responda um questionário contendo perguntas sobre dados
pessoais tais como: escolaridade, saúde reprodutiva, história sexual e práticas
sexuais. Suas respostas não serão reveladas a ninguém, nem mesmo a seus
pais.
Também, durante a visita ao local do estudo serão realizados os seguintes
procedimentos:
91
BARRETO, R.G.
Anexos
• Uma entrevista médica e um exame físico limitado que o médico realizará para
verificar se você se encontra saudável e
• Um exame pélvico interno no qual: - O médico verificará se seu colo do útero
apresenta alguma anormalidade. - Uma escovinha plástica e espátula serão
utilizados para retirar algumas células do seu colo do útero para exames
microbiológicos, de citologia cervical (Papanicolaou) e um exame de DNA de HPV.
Riscos associados com o estudo: Esse estudo não implica na aplicação de
nenhuma vacina ou remédio. Os procedimentos usados para a coleta de amostras
durante o exame pélvico são os padronizados, normalmente, realizados em
mulheres [adolescentes ou adultas]. Uma coleta de raspado cérvico-vaginal será
efetuada. Os riscos associados a esse procedimento são mínimos pois, não se
trata de procedimento invasivo. Além disso, será realizado por profissional médico
altamente qualificado e devidamente, habilitado, para realizar esse procedimento.
Você será informada de qualquer nova descoberta que houver durante o período
dessa pesquisa.
Participação voluntária: A sua participação é voluntária. Negar-se a tomar parte
ou continuar o estudo não implica nenhuma punição ou perda de benefícios ou de
atenção que lhe sejam devidos por seu prestador de saúde. Você tem direito a
receber uma cópia assinada desse formulário.
Confidencialidade e acesso aos dados: Sua participação no estudo será tratada
com absoluto sigilo. Seu nome não será mencionado nos informes do estudo e a
sua identidade não será revelada a nenhuma pessoa.
Direito a fazer perguntas e/ou retirar-se do estudo: Você pode fazer perguntas
sobre o estudo. Apesar de apreciarmos o seu apoio contínuo, você tem direito de
retirar-se do estudo quando quiser e não estará obrigada a outras coletas de
amostras. Se você tiver alguma pergunta, por favor entre em contato com: Prof.a
Cláudia Martins Carneiro ([email protected], 031 35591694, 031 88974347)
92
BARRETO, R.G.
Anexos
Consentimento Livre e Esclarecido (Adultos)
Os objetivos e procedimentos desse estudo foram explicados de forma clara e eu
li e compreendi a informação fornecida. Concordo em fazer parte do estudo.
Entendo que tenho o direito de não tomar parte no estudo e que posso retirar-me
dele quando quiser e por qualquer motivo, sem que por isso haja conseqüências
na atenção à minha saúde, presente ou futura, e ao atendimento que recebo de
meu prestador de saúde. Fui informada sobre meu direito de acessar e pedir que
meus dados pessoais sejam corrigidos. Informo que recebi uma cópia desse
formulário
para
referência.
Eu,
(Nome
e
sobrenome
da
pessoa)
____________________________________________, por esse meio e de livre e
espontânea vontade, dou o meu consentimento para participar desse estudo.
Assinatura da participante:
Endereço da participante:
Telefone da participante:
Data:
Consentimento Livre e Esclarecido (Adolescente)
O estudo foi-me explicado de forma clara e eu li e compreendi a informação
fornecida. Eu concordo em ser incluída no estudo. Entendo que tenho o direito de
não tomar parte no estudo e que posso retirar-me dele quando quiser e por
qualquer motivo, sem que, por isso, haja conseqüências na atenção à minha
saúde presente ou futura e ao atendimento que recebo de meu prestador de
saúde. Fui informada sobre meu direito de acessar e pedir que meus dados
pessoais sejam corrigidos. Informo que recebi uma cópia desse formulário para
referência.
Eu,
(Nome
e
sobrenome
da
pessoa)
______________________________________________, por esse meio e de livre
e espontânea vontade, dou o meu consentimento para participar desse estudo.
Nome do Participante:
Assinatura da participante (quando for aplicável):
93
BARRETO, R.G.
Anexos
Consentimento dos responsáveis
O estudo foi-me explicado de forma clara e eu li e compreendi a informação
fornecida. Concordo que a minha filha/tutelada faça parte do estudo. Entendo que
minha filha tem o direito de não tomar parte no estudo e de retirar-se dele quando
quiser e por qualquer motivo, sem que, por isso, haja conseqüências na atenção à
sua saúde, presente ou futura, e ao atendimento que ela recebe de seu prestador
de saúde. Fui informado sobre seu direito de acessar e pedir que seus dados
pessoais sejam corrigidos. Informo que recebi uma cópia desse formulário para
referência.
Eu,
(nome
e
sobrenome
do
pai/mãe/responsável)
____________________________________, por esse meio e de livre e
espontânea vontade, dou o meu consentimento para que minha filha, (nome da
filha/tutelada) __________________________ participe desse estudo.
Nome do pai/mãe/responsável:
Assinatura do pai/mãe/responsável:
Grau de relação/parentesco com a participante:
Endereço da participante:
Telefone da participante:
Data:
94
BARRETO, R.G.
Anexos
ANEXO 2 -
95
BARRETO, R.G.
Anexos
ANEXO 3 - Coloração de Papanicolaou modificada
• Água destilada............................................................................... 3 minutos
• Hematoxilina de Harris................................................................... 1 minuto
• Água corrente................................................................................. 1 minuto
• Álcool 95% ..................................................................................... 10 imersões
• Álcool 95% ..................................................................................... 10 imersões
• Orange G ....................................................................................... 30 segundos
• Álcool 95% ..................................................................................... 10 imersões
• Álcool 95% ..................................................................................... 10 imersões
• EA 36.............................................................................................. 7 minutos
• Álcool 95% ..................................................................................... 10 imersões
• Álcool 95% ..................................................................................... 10 imersões
• Deixar secar a temperatura ambiente
• Xilol ................................................................................................ 3 minutos
• Montar a lâmina com Entellan e cobrir com lamínula
96
BARRETO, R.G.
Anexos
ANEXO 4 - Emissão do laudo de acordo com o Sistema de Bethesda 2001
1. TIPOS DA AMOSTRA
Citologia:
Convencional
Em meio líquido
2. AVALIAÇÃO PRÉ-ANALÍTICA
Amostra rejeitada por:
Ausência ou erro de identificação da lâmina e/ou do frasco;
Identificação da lâmina e/ou do frasco não coincidente com a do formulário;
Lâmina danificada ou ausente;
Causas alheias ao laboratório (especificar);
Outras causas (especificar).
3. ADEQUABILIDADE DA AMOSTRA
Satisfatória
Insatisfatória para avaliação oncótica devido ao:
Material acelular ou hipocelular (< 10% do esfregaço)
Leitura prejudicada (> 75% do esfregaço) por presença de:
sangue;
piócitos;
artefatos de dessecamento;
contaminantes externos;
intensa superposição celular;
outros (especificar).
Epitélios representados na Amostra:
Escamoso;
Glandular;
Metaplásico.
97
BARRETO, R.G.
Anexos
4. DIAGNÓSTICO DESCRITIVO
Dentro dos limites da normalidade, no material examinado;
Alterações celulares benignas
Inflamação;
Reparação;
Metaplasia escamosa imatura;
Atrofia com inflamação;
Radiação;
Outras (especificar), por exemplo: Presença de células endometriais (na
pós-menopausa ou acima de 40 anos, fora do período menstrual).
Atipias celulares
Células atípicas de significado indeterminado:
Escamosas:
Possivelmente não neoplásicas (ASC-US);
Não se pode afastar lesão intra-epitelial de alto grau (ASC-H).
Glandulares:
Possivelmente não neoplásicas;
Não se pode afastar lesão intra-epitelial de alto grau.
De origem indefinida:
Possivelmente não neoplásicas;
Não se pode afastar lesão intra-epitelial de alto grau.
Em células escamosas:
Lesão intra-epitelial de baixo grau (compreendendo efeito citopático pelo HPV e
neoplasia intra-epitelial cervical grau I);
Lesão intra-epitelial de alto grau (compreendendo neoplasias intra-epiteliais
cervicais graus II e III);
Lesão intra-epitelial de alto grau, não podendo excluir micro-invasão;
Carcinoma epidermóide invasor.
Em células glandulares:
Adenocarcinoma in situ
Adenocarcinoma invasor:
Cervical
Endometrial
Sem outras especificações
Outras neoplasias malignas (especificar)
98
BARRETO, R.G.
Anexos
5. MICROBIOLOGIA
Lactobacillus sp;
Bacilos supracitoplasmáticos (sugestivos de Gardnerella/Mobiluncus);
Outros bacilos;
Cocos;
Candida sp;
Trichomonas vaginalis;
Sugestivo de Chlamydia sp;
Actinomyces sp;
Efeito citopático compatível com vírus do grupo Herpes;
Outros (especificar).
99
BARRETO, R.G.
Anexos
ANEXO 5 - Coloração de Gram
• Cristal violeta ................................................................... 1 minuto
• Água corrente, retirando o excesso do corante
• Lugol ................................................................................ 1 minuto
• Água corrente, retirando o excesso do corante
• Descoloração com éter-acetona ...................................... 5 segundos ou até
que
a
violeta
coloração
não
desprenda
• Água corrente
• Fucsina ............................................................................ 30 segundos
• Água corrente
• Deixar secar a temperatura ambiente
• Examinar ao microscópio
100
se
BARRETO, R.G.
Anexos
101