Conformidade de Material Biológico – ITAL maio/2005 ANÁLISES FENOTÍPICAS E GENOTÍPICAS UTILIZADAS NO CONTROLE DE QUALIDADE Lidiane Botelho [email protected] -ALIMENTOS FUNCIONAIS; -CONTROLE DAS ESPÉCIES PRESENTES; -MÉTODOS DIFERENCIAIS DE QUANTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO; -AUMENTO DE PRODUTOS NO MERCADO BRASILEIRO; -MUDANÇAS DA NOMENCLATURA OFICIAL; Outros aspectos: -Industria de Alimentos Funcionais; -Informações tem que ser documentadas e disponíveis; -Monitorar o nº de células e a sua quantificação nestes alimentos é de extrema importância; - No entanto vários estudos vem comprovando o contrário, principalmente pela falta de padronização dos métodos. DIAGNÓTICO BACTERIOLÓGICO -DEMONSTRAÇÃO DIRETA DA BACTÉRIA EXAME AO MICROSCÓPIO COLORAÇÃO DE GRAM COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN -DEMONSTRAÇÃO DE ANTÍGENOS (MÉTODOS IMUNOLÓGICOS- ELISA) -DEMONSTRAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS (CROMATOGRAFIA) -DEMONSTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO TAXONOMIA BACTERIANA -CARACTERIZAÇÃO E DESIGNAÇÃO MICRORGANISMOS -E ORGANIZAÇÃO DOS MO. EM GRUPOS DOS -DIVIDIDO EM: NOMENCLATURA (espécie, gênero ou família) CLASSIFICAÇÃO (agrupamento das bactérias em Taxa) IDENTIFICAÇÃO TAXONOMIA POLIFÁSICA - NÃO É MAIS SOMENTE BASEADA EM CRITÉRIOS FISIOLÓGICOS; - CRITÉRIOS FENOTÍPICOS E GENOTÍPICOS COMBINAÇÃO DEFINIÇÃO: -Os métodos fenotípicos são aqueles que caracterizam os produtos da expressão gênica para a diferenciação das cepas. - Em decorrência deles envolverem a expressão do gene, estas propriedades podem variar, baseado em mudanças das condições de crescimento, fase de crescimento e mutações espontâneas. CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA - MÉTODOS TRADICIONAIS DESVANTAGENS: -Procedimentos podem ser longos -Ambíguos; -Afetados pelas condições do meio; -Espécies filogeneticamente distintas; -Problemas técnicos que dificultam a interpretação dos resultados (crescimento não é suficiente para degradar o substrato que se está testando, algumas características são instáveis – meios de cultura utilizado) -Culturas mistas não permitem a diferenciação de espécies CARACTERES FENOTÍPICOS MAIS UTILIZADOS 1-Características morfológicas das colônias; 2-Forma, Coloração de Gram, Arranjo, Motilidade, Catalase; 3-Modo de fermentação da glicose (carboidratos) e perfil bioquímico; 4-Fatores de crescimento; 5-Disponibilidade de oxigênio; 6-Testes de produção de gás; 7-Tolerância ao sal, pH e bile; 8-Crescimento em determinadas temperaturas (máxima e mínima); 9-Condições do ácido láctico produzido; 10-Tipos de bacteriófagos; 11-Hidrólise da Arginina; 12-Formação de Acetoina (Acetilmetilcarbinol); 13-Fermentação butilenoglicólica; 14-Tipo de hemólise; 15-Produção de polissacarídeos extracelulares; 16-Tipagem sorológica; 17-Presença de enzimas e antígenos na superfície celular; 18-Perfil eletroforético de proteínas; 19-Atividade antimicrobiana; 20-Lipídeos e constituintes da parede celular Características morfológicas das colônias; TCBS CHOLERA MEDIUM 1-V. Cholerae 2-Esch. Coli Encubação: 24hs em 35ºC VRB GLUCOSE AGAR 1-Esch. Coli 2-Staph. aureus Encubação: 24hs em 35ºC -Plaqueamento (meios seletivos, diferenciais) Meios seletivos (antibióticos, ingredientes e suplementos) Meios diferenciais (características morfológicas das colônias) -Características das colônias nestes meios (tamanho, forma, brilho, cor, viragem de meio, presença de halo e pontos centrais, borda, tempo de incubação) Figure 1: Single cell sort ( Nebe-von Caron et al., 2000) of Salmonella culture results in different colony morphology. Forma, coloração de Gram, Arranjo, Motilidade, Catalase; Figure 2: Surface detail of Salmonella cells obtained by atomic force microscopy 3-Modo de fermentação da glicose (carboidratos) Tube 1:Culture en WW (rose) Tube 2:Lait Tube 3:Type respiratoire anaerobi (WW profond) Tube 4:Glucose Tube 5:Saccharose Tube 6:Lactose Tube 7:Glycerol Tube 8:Mannitol Tube 9:Amidon Tube 10Indole Tube 11:Nitrate Bifidobacterium Bacterial culture showing zones of inhibition around various antibiotic disks Coloração de Cryptococcus neoformans com Tinta da India. Destaca-se a cápsula de natureza polissacarídica. Variações no polissacarídeo majoritário da cápsula levam à classificação em diferentes sorotipos e variedades dessa espécie, as quais podem ser diferenciadas por métodos bioquímicos e genéticos. Eletroforese de proteínas -Transaldolase -Fosfogluconato desidrogenase -Proteínas totais -Lactato desidrogenase Composição da parede celular CARACTERES GENOTÍPICOS MAIS UTILIZADOS DNA/RNA DEFINIÇÃO -MÉTODOS GENOTÍPICOS IDENTIFICAM ATRAVÉS DO GENOMA, AO CONTRÁRIO DOS MÉTODOS BIOLÓGICOS E IMUNOLÓGICOS (FENOTÍPICOS) QUE DETECTAM OS PRODUTOS CODIFICADOS PELO GENOMA. Ácidos nucléicos são universais em biologia celular, e a seqüência de bases de nucleotídeos das moléculas não são influenciadas pelas condições de cultivo. Análises dos ácidos nucléicos deste modo, provem a base dos métodos de identificação e possuem a vantagem da reprodutibilidade. Métodos genéticos são mais promissores para uma rápida e acurada identificação. Métodos capazes - Relação FILOGENÉTICAS - Hibridização DNA-DNA; - Seqüenciamento do gene codificador do rRNA 16S; - Seqüenciamento da região espaçadora ITS (Internal Transcribed Space) entre os genes do operon que codificam o rRNA. - Permitem detectar diferenças amostras bacterianas da conseqüentemente, verificar se diferentes pacientes ou locais comum. e similaridades entre mesma espécie, e amostras isoladas de possuem uma origem Sondas genéticas (PROBE) -Segmentos específicos de DNA ou RNA (fita simples) que reconhecem e anelam (hibridizam) com seqüências complementares (pareamento de bases complementares) formando moléculas híbridas de fita dupla. -As sondas são marcadas (radioisótopos, enzimas ou moléculas quimioluminescentes); -As amostras em teste são inoculadas sobre um suporte sólido (filtro nitrocelulose) colocado na superfície de um meio de cultura sólido. - As colônias desenvolvidas sobre o filtro são submetidas a um tratamento (lise), expondo e desnaturando seu genoma; - Para os testes de hibridização, os filtros são incubados com uma solução contendo a sonda marcada. Onde for homólogo ela hibridiza e é detectada (cor ou luz); - Praticamente todos os microrganismos contêm alguma seqüência nucleotídica exclusiva que pode ser usada como sonda (sondas podem ser gênero, espécie ou mesmo amostra específica). PCR (REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA) - Permite a detecção de microrganismos isolados ou diretamente em material clínico, mesmo se presente em pequenas quantidades; -Amplificação de seqüências nucleotídicas específicas (segmento alvo); -Amplificação – processo de síntese de DNA dirigida (desnaturação, ligação de primers seqüências pequenas presentes nas extremidades que ladeiam o segmento-alvo e a extensão dos primers, através da DNA polimerase, para produzir cópias idênticas do segmento-alvo. -Seqüência entre os dois primers é amplificada RESTRICTION FRAGMENTE LENGHT POLYMORFISM – RFLP - Polimorfismo observado no tamanho dos fragmentos resultantes da restrição enzimática -As bactérias apresentam em seu cromossomo regiões que tendem a variar de amostra para amostra, dentro de uma mesma espécie bacteriana, embora essas regiões sejam constantes dentro de uma mesma amostra. -Quando o cromossomo é purificado e clivado com endonucleases de restrição, em numerosos fragmentos de fita dupla, essa variabilidade pode ser observada. -Os fragmentos devem ser separados em gel (poliacrilamida ou agarose). -Ao se comparar o DNA de duas amostras por esse método, é freqüentemente possível distinguir diferenças no padrão de bandeamento (devido as diferenças no tamanho dos fragmentos). -As diferenças podem ser sutis, e as vezes, para melhor visualização podemos escolher sondas que hibridizam especialmente com regiões altamente variáveis. Após a hibridização, as diferenças na localização e no tamanho dos fragmentos são acentuadas e facilmente identificadas. ETAPAS - RFLP 1 – Isolamento do DNA cromossômico; 2 – Digestão com enzima (s) de restrição; 3 – Eletroforese em Gel de Campo Pulsante; – PFGE (Pulsed Fied Gel Electrophoferis) 4 – Coloração com Brometo de Etídio; 5 – Fotografia do perfil obtido. Digestão com Eco R1 Ação - E. R. Purificação Digestão com Hind ll Banda escolhida ou probe PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS - PFGE -Eletroforese em gel de agarose mais utilizado; -Entretanto este método não permite uma resolução eficiente de fragmentos de DNA maiores do que 40Kb; -Estes fragmentos são tão grandes que acabam apresentando uma mesma taxa de migração no campo elétrico; PFGE – as moléculas são submetidas a campos elétricos aplicados alternadamente em duas direções; da mesma forma de RFLP, o DNA é purificado e clivado com enzimas de restrição, só que, no caso da PFGE, as enzimas utilizadas cortam o DNA em número menor de fragmentos e, portanto, maiores em tamanho. • PCR – Polimerase Chain Reaction - Polimerase termoestável; - Deoxinucleotídeos (dNTP); - Dois iniciadores (primers) Etapas 1) Separação das hélices do DNA a ser amplificado; 2) Ligação complementar entre os primers e o DNA; 3) Síntese do DNA pela Taq polimerase. •Multiplex-PCR - A técnica de PCR na sua forma mais simples; - Amplifica regiões específicas do DNA; - Utiliza um conjunto de iniciadores diferentes; - Mais regiões amplificadas mais confiável é a técnica; - Conhecimento prévio das seqüências (ou seja, do gene/ região de interesse). • RAPD –PCR (Random Amplified Polymorphic DNA) ou AP-PCR (Arbitrary Primed Polimerase Chain Reaction) - Não requer um conhecimento dos fragmentos do genoma; - Usa-se um único iniciador arbitrário; - Amplifica as seqüências com maior homologia; - Pode-se adequar as condições da reação; - Intervalo entre as regiões é amplificado (orientação dos primers – síntese ocorre na região interna entre eles) • Triplet RAPD-PCR ou TAP-PCR - Contorna o problema de reprodutibilidade do RAPD-PCR; - Temperaturas de hibridização (38; 40 e 42ºC); - Bandas presentes em pelo menos dois perfis são consideradas flexíveis; - Discriminatória ao nível de espécie e cepas dentro de uma mesma espécie; - Limite de confiança é ampliado.
