Fundação Universidade Federal do Rio Grande
Programa de Pós Graduação em Ciências Fisiológicas
Fisiologia Animal Comparada
Efeito da exposição ao arsênio sobre o aprendizado condicionado e
parâmetros bioquímicos em “zebrafish” (Danio rerio)
Dissertação defendida no âmbito do Programa
de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas –
Fisiologia Animal Comparada como parte dos
requisitos para obtenção do título de MESTRE em
Fisiologia Animal Comparada.
Qui. Lic. Micheli Rosa de Castro
Orientadora: Profa Dra Daniela Martí Barros
Co-orientadora: Profa Dra Laura Alicia Geracitano
Rio Grande, 2007
Dedico este trabalho à minha filha e esposo.
2
Agradecimentos
Primeiramente, agradecer a todos que de alguma forma ajudaram para a realização
deste trabalho, colegas de laboratório, técnicos, etc. Agradecer também a todos os colegas
do grupo EAOxigênio, pela ajuda e incentivo, e dizer o quanto vocês foram importantes,
principalmente nas sextas- feiras.
Não poderia faltar um obrigado em especial a minha grande amiga Juliane Ventura
Lima, que além de me ajudar no trabalho, sempre tinha uma palavra de incentivo. Ju
obrigado por fazer parte da minha vida.
Gostaria de agradecer a Profa Dra Carla Bonan, da PUC-RS, e ao professor Luis
Fernando Marins, da FURG, por aceitarem fazer parte desta banca avaliadora.
Ao professor José María Monserrat, incondicional para todos os momentos, tanto o
profissional, quanto o amigo José, e dizer também que foi assistindo às aulas de
bioquímica durante minha graduação, que despertasse em mim o interesse pela ciência.
À professora Laura, que me incentivou, ensinou, e se revelou uma grande amiga e
orientadora. Queria aproveitar a oportunidade de dizer o quanto te admiro pela mulher
batalhadora que você é.
Agradeço a minha dedicada orientadora, que faz com que a convivência a seu lado
seja um grande aprendizado, obrigado por estes anos de ensinamento e amizade,
aproveitando também para te dizer, que se hoje alcanço mais este objetivo na minha vida,
devo parte dele a ti, que acreditou no meu potencial. Obrigada Dani!
E por fim a duas pessoas que são especiais na minha vida, meu marido e minha
filha. Maurício obrigado por “segurar esta barra” comigo, sabemos que não foi fácil, e
reconheço toda a tua dedicação para que hoje eu estivesse aqui. E por fim a minha filha
querida, que ajudou a mamãe até mesmo quando eu treinava para esta apresentação, e por
compreender quando eu tinha que estudar. Queria me desculpar pela minha ausência em
tantos momentos nestes últimos anos, eu amo vocês.
Obrigado!
3
Sumário
1. Resumo
6
2. Abstract
7
3. Introdução
8
3.1 Modelo biológico
8
3.2 A memória e esquiva inibitória
8
3.3 O arsênio e seus efeitos tóxicos
10
4. Justificativa e viabilidade
13
5. Objetivos
14
5.1 Objetivo geral
14
5.2 Objetivos específicos
14
6. Artigo
15
7. Discussão geral
41
8. Referências bibliográficas
43
4
Lista de Abreviaturas
5-HT
Serotonina
Ach
Acetilcolina
AchE
Acetilcolinesterase
As
Arsênio
CAT
Catalase
ChAT
Colina Acetiltransferase
CNS
Central nervous system
CR
Conditioned response
CS
Conditioned stimulus
DA
Dopamina
DC
Direct current
DNA
Ácido desoxirribonucléico
GAD
Ácido glutâmico desidrogenase
GR
Glutationa redutase
GSH
Glutationa reduzida
GSH-Px
Glutationa peroxidase
LTM
Long-term memory
LTP
Long-term potentiation
PCO
Proteínas carboniladas
PSH
Grupos sulfidrila de proteínas
ROS
Reactive oxygen species
DAS
Sistema de defesa antioxidante
SOD
Superóxido dismutase
STM
Short-term memory
US
Unconditioned stimulus
WM
Working memory
5
1. Resumo
O “zebrafish”, Danio rerio (Teleoistei: Cyprinidae) representa um organismo com um alto
potencial para estudo de genes envolvidos na função da aprendizagem e memória nos
vertebrados. Este modelo animal foi utilizado para estudar o efeito da exposição a um
agente tóxico (arsênio) sobre a aquisição e consolidação da memória. Foi desenhado um
experimento onde os peixes foram submetidos a uma sessão de treino em uma esquiva
inibitória e imediatamente após, estes foram expostos a três concentrações de arsênio (AsV)
(1; 10 e 100 µg As/L), incluindo a máxima permitida pela legislação brasileira (10µg As/L)
durante 96h (20oC, pH 7.1, 7.20 mg O2/L). O grupo controle foi mantido somente em água.
Após 96h de exposição foi determinada a memória de longa duração (LTM). Os resultados
mostraram que o arsênio nas três concentrações utilizadas prejudicou a LTM, sugerindo
um efeito amnésico (p<0.05). Entre os efeitos tóxicos do arsênio, encontra-se a produção
de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando a geração de estresse oxidativo, que inclui
o aumento na oxidação de proteínas, podendo inativar enzimas, modificando o sistema de
neurotransmissores, e a redução na capacidade de defesa, enzimática e não enzimática.
Neste estudo os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre o grupo
controle e os animais tratados nas três concentrações de arsênio AsV em relação ao dano de
DNA e capacidade de defesa antioxidante. Houve uma alta percentagem de oxidação de
proteínas de peso molecular intermediário, em animais expostos à 10 e 100 µg As/L
detectado através do método de Western blot. Assim futuros estudos, com o “zebrafish”,
usando o paradigma do comportamento e análises toxicológicas, serão promissores em
estudos fisiológicos e farmacológicos.
Palavras chaves: arsênio, dano de DNA, esquiva inibitória, estresse oxidativo, memória,
“zebrafish”.
6
2. Abstract
“Zebrafish”, Danio rerio (Teleoistei: Cyprinidae), represents an organism with one high
potential for study of involved genes in the function of the learning and memory in the
vertebrates. This animal model was used to study the effect of the exposition to a toxic
agent (Arsenic) on the acquisition and consolidation of the memory. An experiment was
drawn where the fish had been submitted to a session of trainings in a inhibitory avoidance
and immediately after, these had been displayed the three concentrations of arsenic (AsV)
(1; 10 e 100 µg As/L), including the principle allowed for the Brazilian legislation (10µg
As/L), during 96h (20oC, pH 7.1, 7.20 mg O2/L). The group controlled was only kept in
water. After 96h of exposition was determined the memory of long duration (LTM). The
results had shown that the arsenic in the three used concentrations harmed the LTM,
suggesting an amnesic effect (p<0.05). It enters the toxic effect of the arsenic, meets it
production of reactive species of oxygen (ROS), taking the generation of oxidative stress,
that it includes the increase in the protein oxidation, being able to inactivate enzymes,
modifying the system of neurotransmitters, and the reduction in the capacity of defence,
enzymatic and not enzymatic. In this study the results had shown that it did not have
significant difference between the group has controlled and the animals treated in the three
concentrations of arsenic AsV in relation to the DNA damage and capacity of antioxidant
defence. It had one high percentage of protein oxidation of intermediate molecular weight,
in animals displayed to 10 and 100 µ g As/L detected through the method of Western blot.
Thus future studies, with “zebrafish”, using the paradigm of the behaviour and
toxicologicals analyses, will be promising in physiological and pharmacological studies.
Key words: inhibitory avoidance, zebrafish, arsenic and memory.
7
3. Introdução
3.1 Modelo Biológico
Para estudos sobre comportamento, memória e parâmetros bioquímicos utilizamos
como modelo biológico um peixe teleósteo de água doce, o “zebrafish” (Danio rerio,
Teleostei: Cyprinidae). Várias características deste organismo o indicam como um
excelente modelo para observação de efeitos diretos de agentes químicos e metabólitos,
pelas semelhanças com os vertebrados. O seu pequeno tamanho, a sensibilidade para
drogas, e o rápido metabolismo traz uma significante economia e vantagens experimentais.
Além da variedade de manipulações in vivo, existe abundante informação molecular e
genômica (http://www.sanger.ac.uk/projects/drerio/zv4assemblyinformation.shtml). Além
disso sua fisiologia é bem conhecida, uma consideração necessária para integração dos
estudos (Karlovich et al., 1998, Atchinson et al., 1987).
O comportamento atua como um elo entre processos fisiológicos e ecológicos,
sendo ideal para estudos dos efeitos dos poluentes. Este animal é um excelente modelo
experimental, seu comportamento pode ser facilmente observado e quantificado em um
ambiente controlado (Sloman et al., 2003).
3.2 A memória e a esquiva inibitória
A memória é uma função do sistema nervoso e compreende três processos
distintos: aquisição, consolidação e evocação. Durante os primeiros minutos ou horas após
sua aquisição, ela é suscetível à interferência de outras memórias, de drogas ou de
8
tratamentos (Izquierdo, 2002; Izquierdo e McGaugh, 2000; McGaugh, 2000,1966;
Izquierdo, 1989). A aquisição também é denominada aprendizado. A consolidação
depende de uma série de processos metabólicos compreendendo diversas fases e requer de
três a oito horas para ser consolidada (Izquierdo e Medina, 1997). A evocação é fortemente
modulada pelas vias dopaminérgicas, noradrenérgicas, serotonérgicas e colinérgicas. Em
geral, os hormônios do estresse melhoram a evocação, à exceção dos glicocorticóides que a
inibem até mesmo em doses baixas (Izquierdo, 2002). Quanto à duração, a memória pode
ser classificada em: memória de trabalho, que dura de poucos segundos a minutos e não
forma arquivos duradouros. Gerencia as informações do cérebro, decidindo quais as
memórias vamos formar ou evocar. A memória de curta duração (STM), não forma
arquivos, dura de minutos a horas e não necessita de síntese protéica; já a memória de
longa duração (LTM), que permanece durante horas, dias ou décadas necessita de síntese
protéica para ser consolidada (Izquierdo, 2002).
Uma das formas de estudar a memória é através do aprendizado condicionado. A
esquiva inibitória é uma tarefa cujos parâmetros bioquímicos e farmacológicos estão bem
estudados em mamíferos, em especial em roedores (Izquierdo et al., 2006; Barros et al.,
2002; Izquierdo e McGaugh, 2000). Esta tarefa permite avaliar a memória de trabalho
(WM), de curta duração (STM) e de longa duração (LTM) (Izquierdo e Medina, 1995). O
aprendizado condicionado, também chamado de condicionamento Pavloviano, consiste no
pareamento de um estímulo condicionado (CS) com um estímulo não condicionado (US),
gerando uma resposta condicionada (CR). Neste estudo, investigamos a validação deste
paradigma em um modelo animal aquático amplamente utilizado, o “zebrafish”.
9
3.3 O arsênio e seus efeitos tóxicos
O arsênio é um elemento amplamente distribuído no ambiente, presente na água, ar
e no solo. Devido à ação antropogênica, é encontrado como as sobras de mineração,
fundição de metais, manufatura de vidros, produção de pesticidas e herbicidas (Goyer,
1991). A longa exposição ao arsênio (As) aumenta a incidência de doenças, como o câncer
de pele e outros (Chen et al., 1992), neuropatias periféricas (Mejia et al., 1997) e diabetes
(Lai et al., 1994). Vários estudos relativos aos efeitos tóxicos do arsênio foram analisados
em todo o cérebro (Chaudhuri et al., 1999; Tripathi et al., 1997).
O arsênio possui quatro estados de oxidação (-3, 0, +3, +5), arsenito(+3) e o
arsenato (+5) são espécies importantes para o estudo de seus efeitos tóxicos, pois é
considerada a causa primária do desequilíbrio pró-oxidante e antioxidante, e também pela
alta afinidade do arsênio pelos grupos tióis de proteínas (Aposhian e Aposhian, 1989). O
arsenato é reduzido a arsenito em reações catalisadas pela enzima arsenato redutase
(Radabaugh e Aposhian, 2000). O arsenito interage com grupos tióis; deste modo, é
diretamente tóxico, bloqueando grupos sulfidrila de proteínas e enzimas. Este tipo de
ligação modifica a função de enzimas do metabolismo de carboidratos como a succinato e
piruvato desidrogenase (Aposhian, 1989). A ligação do arsenito em grupo sulfidrilas de
proteínas de membrana altera mecanismos de sinalização intercelular (Zhang et al., 2000).
Durante o processo de obtenção de energia na cadeia respiratória, a molécula de
oxigênio é o aceptor final de elétrons. Neste processo, são geradas espécies intermediárias,
que têm a característica de serem fortes oxidantes capazes de reagir quase que
instantaneamente com qualquer molécula orgânica, modificando suas propriedades.
10
Algumas destas espécies químicas podem ser radicais livres, como o ânion superóxido
(O2•−) e o radical hidroxila (OH•), e outras chamadas espécies reativas de oxigênio (ROS),
como o peróxido de hidrogênio (H2O2) (Halliwell e Gutteridge, 1999; Meneghini, 1987;
Fridovich, 1978).
As ROS são responsáveis por muitos danos em macromoléculas
importantes como o DNA, proteínas e lipídeos. Para a proteção frente a este tipo de dano,
há a necessidade de um sistema de defesa antioxidante (SDA) (Halliwell e Gutteridge,
1999). Esse sistema de defesa contra ROS pode ser enzimático, incluindo superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px), glutationa reductase
(GR) e não enzimático, incluindo moléculas de baixo peso molecular como a glutationa
reduzida (GSH) e vitamina E (Halliwell e Gutteridge, 1999; Young e Woodside, 2001). No
entanto, quando a produção de ROS está aumentada e o SDA está diminuído estabelece-se
uma situação de estresse oxidativo que gera dano em macromoléculas (Halliwell e
Gutteridge, 1999). O dano de proteínas é refletido pelo aumento dos níveis de proteínas
carboniladas (PCO) (Butterfield et al., 1998) e diminuição dos níveis de grupos tióis (PSH)
(Halliwell e Gutteridge, 1999; Dubey et al., 1996).
O dano em lipídios é de vital
importância, pois os ácidos graxos polinsaturados são os maiores constituintes de
membrana de células neurais e são substratos para espécies reativas de oxigênio e
peroxidação lipídica (Coyle e Puttfarcken, 1993). Estudos mostram que o aumento da
peroxidação lípica causa uma diminuição da atividade antioxidante das enzimas SOD e
GPx (Chaudhuri et al.,1999; Flora, 1999). Por fim, o ácido desoxirribonucléico (DNA) é
um alvo celular crítico dos processos de oxidação mediados por vários agentes químicos e
físicos, tendo efeitos biológicos chaves como letalidade celular, mutagênese, carcinogênese
e envelhecimento (Halliwell e Gutteridge, 1999).
11
O comportamento é um bom indicador para danos no sistema nervoso central
relativo à exposição ao arsênio (Sloman et al., 2003). Vários autores (Yu, 1999; Chen and
Wang, 1990; EPA, 1984) relacionam déficits em funções neurológicas superiores, como
aprendizagem, memória recente e concentração em humanos expostos aos compostos do
arsênio. Alguns sintomas são relatados como diminuição da concentração, desorientação,
agitação severa, paranóia e labilidade emocional.
Assim, a utilização de biomarcadores de poluição têm sido alvos de vários estudos,
principalmente pelo fato de distintos tipos de poluentes poderem interferir em processos
comportamentais com alta relevância ecológica, como os relacionados com reprodução e
estratégias de escape frente a predadores (Scott e Sloman, 2004). Foi demonstrado que
tóxicos quimicamente não relacionados podem afetar vários parâmetros de comportamento
(Abdul Farah et al., 2004; Lefebvre et al., 2004; Nakayama et al., 2004; Yilmaz et al.,
2004; Sloman et al., 2003).
12
4. Justificativa e viabilidade
•
O arsênio é um dos metais mais nocivos à saúde humana, assim como o mercúrio, o
chumbo e o cádmio (Scott e Sloman, 2004). Em concentrações elevadas, pode provocar
vários tipos de cânceres, como o de pele, pâncreas e pulmão, além de abalos ao sistema
nervoso e malformação neurológica. Baseado nestes fatos, este estudo servirá para
identificar possíveis riscos decorrentes da contaminação por arsênio, e para avaliar danos
em nível bioquímico e comportamental, tendo em vista que a memória é uma função
primordial para a sobrevivência do animal.
•
A relevância ambiental do tema, visto que, trabalhos prévios relataram que o sedimento
da Laguna dos Patos estava contaminado por arsênio (Mirlean et al., 2003).
•
O uso do “zebrafish” (Danio rerio) oferece diversas vantagens para o estudo, devido ao
grande número de informações detalhadas, incluindo extensas informações genéticas a
respeito deste modelo animal (http://www.sanger.ac.uk/projects/drerio/zv4assemblyinformation.shtml).
• O Departamento de Ciências Fisiológicas (DCF) da Fundação Universidade Federal do
Rio Grande (FURG) conta com a infra-estrutura necessária para sua realização, uma vez
que dispõem de biotério aquático, laboratórios onde se realizam testes comportamentais e
bioquímicos, viabilizando a execução deste projeto.
13
5. Objetivos
5.1 Objetivo geral
•
Estudar o efeito da exposição ao arsênio em dois níveis: comportamental
(aprendizado condicionado) e bioquímico (estresse oxidativo, dano oxidativo a
proteínas e DNA), em Danio rerio (Teleostei:Cyprinidae).
5.2 Objetivos específicos
•
Avaliar possíveis alterações no comportamento em indivíduos de D. rerio expostos
ao arsênio, através da tarefa de esquiva inibitória;
•
Quantificar a indução do sistema de defesa antioxidante (SDA) no cérebro de
indivíduos da espécie D. rerio expostos ao arsênio.
•
Estudar o efeito no cérebro, produzido pela exposição de indivíduos da espécie D.
rerio ao arsênio, através do dano gerado em proteínas e no DNA.
14
6. Artigo
Behavioral and neurotoxic effects of arsenic exposure in
zebrafish Danio rerio (Teleostei: Cyprinidae)
(será submetido a Neurotoxicology)
15
Title: Behavioral and neurotoxic effects of arsenic exposure in zebrafish (Danio rerio
Teleostei: Cyprinidae)
Authors: Micheli Rosa de Castro1,2, Juliane Ventura Lima1,2, Natália Seus Dummer1, Luis
Fernando Marins1,2, Laura Alicia Geracitano1,2, José Maria Monserrat1,2, Daniela Martí
Barros1,2*.
1
Departamento de Ciências Fisiológicas, Fundação Universidade Federal do Rio Grande
(FURG), (96201-900), Rio Grande, RS, BRASIL.
2
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, Fisiologia Animal Comparada
(FURG)
*
Corresponding author: Phone/Fax: +55 53 32336847 / +55 53 32336850
E-mail address: [email protected]
16
7. Discussão geral
O estudo realizado, teve como objetivo analisar os efeitos toxicológicos decorrentes
da exposição de Danio rerio ao arsênio, incluindo a concentração deste metal (10 µg As/L)
que é considerada “segura” e por isto é permitida em sistemas aquáticos pela legislação
brasileira. Os resultados mostraram que o As(V) na concentração referida produz efeito
amnésico. Estudos prévios indicam que o arsênio pode ser tóxico por sua capacidade de
afetar sistemas de neurotransmissão nervosa. Estas alterações podem se refletir no
comportamento animal e por isto podem ser medidas através de tarefas comportamentais
(Rodriguez et al., 1998). O arsênio também atua como um agente oxidante produzindo
estresse oxidativo (Bau et al., 2002; Shi et al., 2004; Wang et al., 2007). Nossos resultados
mostraram um aumento de proteínas oxidadas após a exposição a 10 e 100 µg de As/L.
Existe um amplo conhecimento de que as proteínas são susceptíveis de sofrer dano
causado pela presença de espécies reativas de oxigênio, in vitro e/ou in vivo. A
modificação oxidativa de proteínas, pode levar à alteração estrutural e funcional destas
moléculas, inclusive de muitas enzimas (Davies, 1988).
Neste estudo, o efeito genotóxico do metal foi medido através da formação de
adutos de DNA. As proteínas adjacentes à molécula de DNA podem se unir a este de
forma covalente, produzindo o que se chama “protein-DNA crosslink” (DNAPC). Bau et
al. (2002) afirma que o arsênio é um carcinógeno não mutagênico. Apesar de todo o
conhecimento a respeito dos seus efeitos carcinogênicos, os mecanismos pelos quais
produz câncer são confusos. O dano de DNA produzido pelo arsênio somente pode ser
medido quando são usadas altas concentrações deste metal.
A ausência de resposta na capacidade antioxidante frente a radicais peróxidos
sugere um a existência de estresse oxidativo. A incapacidade do cérebro em aumentar a sua
17
competência antioxidante frente a uma situação de estresse oxidativo, foi reportada em
estudos prévios realizados em ratos por Maidana et al. (2006) e Barros et al. (2007).
Como conclusão pode se dizer que o arsênio causa efeitos deletérios na memória de
longa duração, em peixes expostos durante 96h nas quatro concentrações testadas,
inclusive na considerada segura para a preservação da fauna aquática pela legislação
brasileira (10 µg As/L). Este resultado é extremadamente importante já que existe
dificuldade em determinar a toxicidade deste elemento pelos testes classicamente
utilizados para a elaboração de leis ambientais. Dificuldade que, pode subestimar
problemas ambientais produzidos pela presença de arsênio em ambientes aquáticos. O
efeito deletério na memória em conseqüência pode afetar o comportamento, a ecologia e a
preservação de muitas espécies aquáticas.
18
8. Referências bibliográficas
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