UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
MARIA CRISTINA PIRES DE BRUM
MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS DA VIDEIRA NIAGARA
ROSADA (Vitis labrusca L.) E O CONTROLE BIOLÓGICO DE
Fusarium
MOGI DAS CRUZES, SP
2006
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
MARIA CRISTINA PIRES DE BRUM
MICRORG ANISMOS ENDOFÍTICOS DA VIDEIRA NIAGARA
ROSADA (Vitis labrusca L.) E O CONTROLE BIOLÓGICO DE
Fusarium
Dissertação apresentada ao programa
de
pós-graduação
integrada
da
Universidade de Mogi das Cruzes para
obtenção do título de mestre em
Biotecnologia
ORIENTADOR: PROF. Dr. JOÃO LÚCIO DE AZEVEDO
MOGI DAS CRUZES, SP
2006
BOLSA-MESTRADO GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO PROJETO BIOTA
FAPESP
FICHA CATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Brum, Maria Cristina Pires de
Microrganismos endofíticos da videira niagara rosada
(Vitis labrusca L.) e o controle biológico de Fusarium /
Maria Cristina Pires de Brum. -- 2006.
79 f.
Dissertação
(Mestrado
em
Biotecnologia)
Universidade de Mogi das Cruzes, 2006.
Área de concentração: Biologia celular e molecular
Orientador: Dr. João Lúcio de Azevedo
-
1. Fungos endofíticos 2. Vitis labrusca 3. Controle
biológico 4. Fusarium I. Título II. Azevedo, João Lúcio
de
CDD 632.96
DEDICATÓRIA
Ao meu marido, Antonio Gil, e aos meus filhos, Leon Henrique e Isabella Cristina,
por terem suportado com carinho e compreensão todos os momentos de ausência.
Aos meus pais, Armando e Maria do Rosário; aos meus irmãos Ana, Eliza,
Armando e Renata.porque sem o conforto de seu amor e apoio, a caminhada teria sido
muito mais árdua, ofereço.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo, pela orientação valiosa e constante, pela confiança,
por sua inestimável sabedoria, a qual contribuiu para meu crescimento profissional e pessoal.
Ao Prof. Dr. Welington Luís de Araújo pela amizade e constante apoio e sugestões
imprescindíveis para o desenvolvimento desse trabalho.
À Profª. Dra. Regina L. B. C. de Oliveira e ao prof. Dr. Luiz R. Nunes pelos auxílios
prestados na execução dos experimentos.
À todos os professores de pós -graduação em Biotecnologia, pela ajuda durante as
disciplinas, pela dedicação e pelos bons conselhos, em especial ao prof. Dr. José Luiz C. Wolff
e o prof. Dr. Moacyr Wuo.
Ao Antonio Gil Vicente de Brum pelo seu amor companheirismo e apoio.
Ao meu querido irmão Armando Luiz Pires por toda sua generosidade e apoio para o
desenvolvimento deste trabalho e em todos os momentos.
À querida amiga Maristela Boaceff Ciraulo, pelos ótimos momentos, pela amizade e pela
constante ajuda em diversas ocasiões.
Aos amigos do Núcleo Integrado de Biotecnologia pela convivência agradável, pela
união e pelos bons momentos que passamos estes anos: Maristela B. Ciraulo, Walter Rubens
C. de Oliveira, Vânia Ap. Gonçalves, Sonia N. Minami, Fernanda de Oliveira, Renata Martins,
Alex Martins, César Henrique, Tatiane Ivy, Juliana Viana, Fernanda Pessoa, Paulo Mello, Bruno
Pellegrini, André Justino, Vânia Ribeiro, Angela Aparecida Moreira,Emy Tiyo Mano, Fabiana
Iervolino e Neilce.
Aos amigos do Laboratório de Genética de Microrganismos da ESALQ, que muito me
auxiliaram no trabalho prático e pelas dicas valiosas: Cristina Maki, Fernando Andreote, Joelma
Marcon, José Antonio da Silva, Rodrigo Stuart, Rodrigo Mendes e Welington Luiz de Araújo;
Aos amigos do Laboratório de Genética de Microrganismos da ESALQ pelos bons
momentos que passamos nesses anos: Aline Romão, Beatriz Rodrigues, Cristina Maki, Eliandra
Sia, Fernando Andreote, Joelma Marcon, José Antonio da Silva, Carolina Quecine, Priscilla
Rossetto, Rodrigo Stuart, Rodrigo Mendes e Welington Luiz de Araújo;
Ao Governo do Estado de São Paulo pela ajuda financeira cedida através do Projeto
Bolsa-Mestrado e ao Projeto Biota FAPESP.
A UMC por auxiliar o meu crescimento profissional e educacional.
RESUMO
Endófitos são aqueles microrganismos, cultiváveis ou não, que habitam o interior
dos tecidos vegetais, sem causar danos ao hospedeiro e que não desenvolvem
estruturas externas. Estes microrganismos podem aumentar o vigor e/ou proteger a
planta hospedeira contra pragas e doenças. O Estado de São Paulo é o maior produtor
brasileiro de uva de mesa predominando a variedade Niagara Rosada (Vitis labrusca).
Em vista da relevante importância que têm os endófitos para as plantas, o estudo das
comunidades endofíticas de plantas ainda não investigadas, como a Niagara Rosada,
amplia as possibilidades de descoberta de novos microrganismos de interesse
biotecnológico. Diante do exposto o presente trabalho teve por objetivos: i) estudar a
diversidade de fungos endofíticos associados a Niagara Rosada; ii) Avaliar a influência
de fatores abióticos sobre a freqüência de isolados endofíticos e iii) avaliar o potencial
de antagonismo dos endófitos contra Fusarium , um fungo cosmopolita que causa
prejuízos para diversas culturas. A diversidade de fungos endofíticos isolados foi
avaliada por meio da técnica de ARDRA e seqüenciamento. Foram observados 15
haplótipos, evidenciando uma grande diversidade dentro da comunidade endofítica de
V. lambrusca. Foi observado que esta comunidade fúngica é composta por
Colletotrichum, Nigrospora, Aspergillus, Rhizoctonia, Guignardia, Fonsecaea,
Scopulariopsis, Pestalotiopsis, Alternaria, Epicoccum, sendo Colletotrichum o gênero
dominante, sendo que a temperatura e pluviosidade alteram a densidade fúngica em V.
labrusca. Foi observado também que 79% destes fungos endofíticos foi capaz de inibir
in vitro Fusarium sp. e F. oxysporum, indicando o seu potencial para o controle deste
fungo patogênico.
Palavras chave: fungos endofíticos; Vitis labrusca; biocontrole, Fusarium.
ABSTRACT
Endophytes are all microorganisms, culturable or unculturable, that inhabit the
inner plant tissues, causing no disease symptoms or external structures. These
microorganisms may increase plant fitness and/or protect the host plant against insects
and phytopathogens. São Paulo state is the major Brazilian producer of in natura grape,
and the Rose Niagara (Vitis labrusca) is the most important variety. Endophytes are very
important for host plant and, therefore, the study of this community from not studied
plant species, such as V. labrusca, may increase the possibility to find new microbial
species with biotechnological interest. Therefore, the objectives of the present work
were to: i) study the diversity of endophytic fungi from V. labrusca; ii) evaluate the effect
of the abiotic factors on the fungal frequency and iii) evaluate the potential of these
endophytic fungi to inhibit in vitro Fusarium spp, an fungi that can be responsible for
plant disease worldwide. The fungal diversity was evaluated by ARDRA technique and
rDNA sequencing. Fifteen fungal haplotypes were observed, which after morphological
and molecular identification indicated that the endophytic community associated V.
lambrusca is composed by Colletotrichum, Nigrospora, Aspergillus, Rhizoctonia,
Guignardia, Fonsecaea, Scopulariopsis, Pestalotiopsis, Alternaria and Epicoccum, been
Colletotrichum the dominant genus. The fungal density was affected by temperature and
rain intensity. Also, the frequency of endophytic fungi able to inhibit in vitro Fusarium sp.
and F. oxysporum was 79%, indicating that this fungal community has the potential for
biocontrol of these phytopathogenic fungi.
Key words: endophytic fungi; Vitis labrusca; biocontrol, Fusarium.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Componentes e Concentrações Utilizadas nas Reações de PCR......
44
Tabela 2 Haplótipos gerados pela aplicação de ARDRA. Sessenta e um
fungos endofíticos isolados foram submetidos à técnica de ARDRA
gerando 15 padrões eletroforéticos distintos denominados
haplótipos, os fungos são divididos segundo o haplótipo a que
pertencem e as amostras identificadas apresentam o método pelo
qual foram identificadas.......................................................................
56
Tabela 3 Antagonismo ao Fusarium e Fungos Identificados..............................
60
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Metodologia de Coleta. O desenho da videira exemplifica a
metodologia utilizada para coletar o material vegetal,
observe a distância do ramo ao solo, para evitar
contaminação por microrganismos de solo, as 4° e 5°
folhas coletadas são folhas maduras e selecionadas ..........
Figura 2 Agregado de Genes Ribossomais. Destaque da região de
amplificação pela PCR..........................................................
Figura 3 Relação entre Freqüência de Isolamento (F.I.) e
Temperatura; dados de temperatura local fornecidos pelo
DAEE durante as coletas......................................................
Figura 4 Relação entre Freqüência de Isolamento e Pluviosidade;
média da dos pluviosidade 15 dias que antecederam a
coleta, dados de pluviosidade fornecidos pelo DAEECTH.......................................................................................
Figura 5 Estruturas Fúngicas; fotos de estruturas reprodutivas
observadas ao microscópio ótico em aumento de 400x e
1000x.....................................................................................
Figura 6 População Relativa de Fungos Isolados; População relativa
de fungos que compõem a comunidade de fungos
endofíticos associados a Niagara Rosada, 14 gêneros
foram identificados................................................................
Figura 7 Gel de ARDRA; as seqüências de 19 amostras de fungos
endofíticos foram clivadas com a enzima de restrição
HinfI.......................................................................................
Figura 8 Árvore Filogenética; contruída com as seqüências ITS15.8S-ITS2 do rDNA, mostra a relação entre fungos
endofíticos de Niagara Rosada ............................................
Figura 9 Porcentagens de Isolados por Haplótipo; 15 haplótipos
foram obtidos pela análise de ARDRA a partir de 61
isolados.................................................................................
Figura 10 Interações entre fungos endofíticos e F. oxysporum. I e II
as setas indicam formação de halo de inibição *(+++); III e
IV setas indicam inibição forte, mas sem formação de halo
*(++); V, setas indicam a competição entre F. oxysporum e
isolados endofíticos *(+); e em VI, setas mostram que não
ocorreu nenhuma inibição do Fusarium *(-). ........................
Figura 11 Produção de Pigmento. Em A,seta indica produção de
pigmento em meio sólido pelo fungo Aspergillus sp.
amostra 2F6; em B. meio de cultura líquido apresentando
coloração por pigmentos produzidos pelos fungos:
Penicillium sp. 2F14 e Epicoccum sp.1F6.............................
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Figura 12 Reação de Antagonismo de Colletotrichum endofítico;
resultados dos testes de antagonismo do Colletotrichum
sp. ao Fusarium sp. e Fusarium oxysporum.........................
61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ARDRA
BD
Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado
Batata dextrose líquido
BDA
Batata dextrose ágar
CTH
Centro Tecnológico de Hidráulica
DAEE
Departamento de Águas e Energia Elétrica.
DGGE
Gradiente de desnaturação em gel de elétroforese
DNA
EDTA
Ácido desoxiribonucleico
Ácido etilenodiamino tetraacético
EMBRAPA
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
ESALQ
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
F.i.
Freqüência de Isolamento
ITS
Espaçador interno transcrito
LB
Loading buffer (tampão de carregamento)
pb
Pares de bases
PCR
PGPR
P.r
rDNA
Reação de polimerização em cadeia
Rizobactérias promotoras de crescimento
População relativa
Ácido desoxiribonucleico ribossomal
RNA
Àcido ribonucleico
SDS
Dodecil Sulfato de Sódio
Taq
Thermus aquaticus
TE
Tris HCl - EDTA
UV
Ultra violeta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................
1.1 Conceitos....................................................................................................
1.2 Microrganismos Endofíticos e sua ocorrência.............................................
1.3 Isolamento de Microrganismos Endofíticos.................................................
1.4 Fungos: Importância, Características e Biodiversidade..............................
1.5 Identificação dos Fungos Endofíticos.........................................................
1.6 Caracterização Molecular dos Fungos........................................................
1.7 Fungos Associados à Videira......................................................................
1.8 Influência de Fatores Abióticos sobre a Comunidade Endofítica................
1.9 Testes de Antagonismo ao Fusarium .........................................................
1.10 Interações e Especificidade entre Microrganismos Endofíticos e Planta
Hospedeira...........................................................................................................
1.11 Aplicações Biotecnológicas de Microrganismos.......... .............................
1.11.1 Controle Biológico de Insetos e Doenças..............................................
1.11.2 Produção de metabólitos secundários e enzimas..................................
1.11.3 Promoção de crescimento vegetal.........................................................
1.11.4 Características da Niagara Rosada (Vitis labrusca) .............................
2 OBJETIVOS..........................................................................................................
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................
3.1 Material Vegetal e Local de Coleta das Amostras.........................................
3.2 Desinfecção Superficial..................................................................................
3.3 Isolamento de Fungos Endofíticos.................................................................
3.4 Purificação e Conservação dos Fungos Isolados..........................................
3.5 Análise da Diversidade Genética de Fungos Associados à Videira Niagara
Rosada.................................................................................................................
3.5.1 Identificação Morfológica.............................................................................
3.5.2 Extração de DNA Total................................................................................
3.5.3 Amplificação e Seqüenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 do Agregado
de genes rDNA ....................................................................................................
3.5.4 Análise dos Polimorfismos pela utilização de ARDRA ...............................
3.6 Experimentos de A ntagonismo in vitro...........................................................
3.6.1 Leveduras isoladas e Controle biológico....................................................
3.7 Análise dos Dados.........................................................................................
3.7.1 Análise da Variabilidade Genética..............................................................
3.7.2 Construção da Árvore Filogenética.............................................................
3.7.3 Análise estatística.......................................................................................
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................
4.1 Isolamento de Fungos Associados a Niagara Rosada..................................
4.2 Análise da Diversidade dos Fungos Endofíticos Isolados de Niagara
Rosada.................................................................................................................
4.3 Potencial dos Fungos Endofíticos Associados a Videira em Antagonizar in
vitro Fusarium.......................................................................................................
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vitro Fusarium.......................................................................................................
4.3.1 Teste de Antagonismo de Levedura Endofítica ao Fusarium.....................
5 CONCLUSÕES.......................................................................................................
REFERÊNCIAS .....................................................................................................
ANEXOS.................................................................................................................
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APRESENTAÇÃO
Os microrganismos endofíticos comprovadamente protegem a planta hospedeira
contra insetos, doenças fúngicas e bacterianas inclusive aumentando o vigor da planta.
Também se sabe que a utilização de substâncias xenobióticas na agricultura contra
insetos e doenças tem severas implicações tanto ambientais como para o ser humano,
principalmente se aplicado em produtos consumidos in natura como é o caso das frutas.
Sendo o Estado de São Paulo o maior produtor brasileiro de uva comum de mesa, mais
especificamente a variedade Niagara Rosada, este trabalho visou caracterizar a
microbióta endofítica desta variedade de uva, visando sua aplicação no controle
biológico. Para tanto, foi escolhido Fusarium spp. para realização dos testes de controle
biológico in vitro, devido a este fungo ser amplamente distribuído, ser cosmopolita e
causar mundialmente grandes perdas econômicas para a agricultura, tanto pela morte
das plantas como produzindo toxinas que contaminam grãos armazenados causando
sérios problemas à saúde de animais alimentados com rações feitas com grãos
contaminados e ao ser humano sendo o consumo de grãos e cereais contaminados por
Fusarium spp. pode causar câncer esofágico em humanos. Os resultados que foram por
nós obtidos nos testes de antagonismo realizados in vitro são bastante promissores, e
vários endófitos foram capazes de conter o crescimento de Fusarium . Testes em casa
de vegetação poderão ser realizados para a confirmação da eficácia em campo, dos
isolados endofíticos de Niagara Rosada contra o Fusarium spp.
16
1 INTRODUÇÃO
Microrganismos endofíticos são todos aqueles cultiváveis ou não, que habitam o
interior dos tecidos vegetais, sem causar mal ao hospedeiro e que não desenvolvem
estruturas externas.
Endófitos possuem a capacidade de produzir alterações
fisiológicas e muitos outros efeitos nos vegetais que os albergam como proteção contra
doenças e pragas, aumentando a taxa de crescimento pela produção de reguladores de
crescimento vegetal, induzindo a resistência da planta a patógenos, e reduzindo a
herbivoria pela produção de substâncias inseticidas no interior da planta.
A utilização de substâncias xenobióticas para o controle de pragas e doenças da
lavoura, não tem se mostrado totalmente eficiente já que muitas vezes o patógeno
penetra no tecido vascular da planta ou pode criar resistência. Ainda, os insumos
químicos têm causado impactos negativos nos mais diferentes compartimentos dos
ecossistemas, problemas à saúde humana bem como ao meio ambiente. O
desequilíbrio ecológico devido à eliminação de microrganismos endofíticos, que
desempenham um papel de proteção da planta hospedeira, e a seleção de organismos
resistentes a estas substâncias, são fatores de risco para o equilíbrio do meio ambiente
e impulsionam a busca de técnicas alternativas para controlar doenças e pragas que
causam prejuízos para culturas de importância econômica.
Em virtude das vantagens que a planta hospedeira usufrui pela simbiose que
mantém com a comunidade endofítica que alberga, diversos estudos, inclusive sobre
produção de metabólitos secundários com propriedades de interesse da indústria
química e farmacêutica, têm sido desenvolvidos.
A utilização de endófitos no controle biológico de doenças causadas por fungos e
bactérias fitopatogênicos e insetos pragas da lavoura, também vem sendo estudada,
sendo seu emprego, específico para determinado organismo que se pretende controlar,
de modo, que esta prática reduz os riscos ao meio ambiente e ao ser humano. Neste
contexto os endófitos representam uma importante alternativa à utilização das
substâncias xenobióticas no controle dos fungos e bactérias fitopatogênicos, bem
como, insetos pragas da lavoura.
17
O Fusarium é um fungo fitopatogênico cosmopolita, amplamente distribuído ao
redor do mundo, que além de causar inúmeras doenças em diferentes espécies
vegetais, sobretudo em culturas de importância econômica, causando grandes
prejuízos, também produz toxinas que podem comprometer grãos e cereais estocados,
por serem prejudiciais à saúde de animais e humana. Além disto, estes fungos são de
difícil controle, sendo atualmente as principais formas de controle utilizadas o controle
químico e o plantio de variedades de plantas resistentes.
Assim, o isolamento e caracterização de microrganismos endofíticos de plantas
hospedeiras ainda não estudadas, possibilitam a descoberta de novas espécies com
potencial para controle biológico, ou mesmo microrganismos capazes de produzir novas
substâncias de interesse.
O Estado de São Paulo responde pela maior parcela da produção brasileira de
uva de mesa, dentre as variedades cultivadas classificadas como uvas do tipo comum
de mesa, o cultivo da variedade Niagara Rosada predomina.
Niagara Rosada (Vitis labrusca), é uma planta que apresenta certa resistência a
doenças, o que pode ser um indício de resistência adquirida pela simbiose com sua
comunidade endofítica. Desta maneira, sua microbiota endofítica pode conter
microrganismos que apresentem bom potencial como agentes de biocontrole.
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivos gerais isolar e
caracterizar a comunidade fúngica endofítica da cultivar Niagara Rosada (Vitis
labrusca), bem como testar seu potencial de antagonismo contra espécies do fungo
fitopatogênico Fusarium.
1.1 Conceitos
Apesar de os microrganismos endofíticos terem sido mencionados pela
primeira vez no início do século XIX, quem primeiro delineou a diferença entre eles e os
patógenos de plantas foi Bary (1866). Apenas no século XX no fim dos anos 70, é que
os microrganismos endofíticos começaram a adquirir importância, quando foi verificado
18
que eles apresentavam interações simbióticas com o hospedeiro, protegendo as
plantas do ataque de insetos, de doenças e de mamíferos herbívoros.
Microrganismos endofíticos, como podem ser chamados, eram considerados
quaisquer microrganismos que em pelo menos uma parte do seu ciclo de vida,
colonizavam o interior de tecidos vegetais aéreos sem causar danos aparentes àplanta
hospedeira (CARROLL, 1986; PETRINI et al., 1991). As bactérias fixadoras de
nitrogênio, fungos micorrízicos e demais microrganismos que habitam o interior das
raízes,
desta
maneira,
não
eram
considerados
endófitos,
sendo
tratados
separadamente. A definição de que endófitos eram considerados microrganismos que
são isolados de tecidos vegetais desinfectados superficialmente ou do interior destes, e
que não causam danos aparentes à planta hospedeira, foi proposta (HALLMANN et al.,
1997). Apesar desta definição ter englobado os microrganismos endofíticos que
habitam internamente as partes subterrâneas da planta, ainda não era completa por
excluir ou simplesmente omitir as populações microbianas não cultiváveis difíceis de
sobreviver em condições de laboratório, por isso pouco estudadas (ARAÚJO et al.,
2002). Ainda, os endófitos foram definidos como microrganismos que habitam tecidos
internos da planta sem causar qualquer efeito negativo imediato (BACON & WHITE,
2000). A mais recente definição de endófitos é mais ampla e diz que: "Endófitos” são
todos microrganismos cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais,
sem causar mal ao hospedeiro e que não desenvolve estruturas externas, excluindo
desta maneira bactérias nodulantes e fungos micorrízicos que embora endofíticos, são
estudados de maneira separada (AZEVEDO & ARAÚJO, 2006).
1.2 Microrganismos Endofíticos e sua ocorrência
Fungos endofíticos foram estudados principalmente em plantas de regiões
temperadas, e mais recentemente em plantas das regiões tropicais (AZEVEDO et al.,
2002; ARAÚJO et al., 2002). Os primeiros estudos sobre bactérias endofíticas foram
feitos por Colombo (1978), quando estudando algas, verificou a ocorrência de bactérias
19
endofì ticas em seu talo. Este autor supôs existir uma relação fisiológica equilibrada
entre as bactérias e seu hospedeiro, sugerindo uma ligação dos endófitos com a
atividade fotossintética da alga e sua provável dependência de oxigênio, pois estes se
encontravam próximos aos cloroplastos e nas regiões mais jovens dos talos.
Todas as espécies vegetais estudadas até o momento apresentaram
microrganismos endofíticos (STROBEL & DAISY, 2003). Os estudos sobre endófitos se
intensificaram nos anos 80, e apesar de devidamente comprovada a existência da
microbiota endofítica, aspectos ecológicos, genéticos e fisiológicos dessas interações
ainda devem ser melhor esclarecidas. O conhecimento da diversidade desses
organismos é de extrema importância, os estudos referentes à sua presença,
freqüência e funções aumentam as informações sobre a microbiota endofítica,
elucidando as bases biológicas dessas interações (BARROS, 2003). Diversas espécies
vegetais já tiveram suas comunidades endofíticas isoladas e caracterizadas: Citrus
(ARAÚJO et al., 2001), Palicourea longiflora e Strychnos cogens (SOUZA et al., 2004),
Dicksonia Sellowiana (BARROS, 2003), Bactris gasipaes (ALMEIDA et al., 2005);
Glicine max (KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2005); Triticum aestivum ( LARRAN et al.,
2002); e Citrus limon L. (DURAN et al., 2005).
A entrada de microrganismos endofíticos na planta se faz por várias vias, e uma
das principais é através das raízes, por ranhuras causadas pelo atrito com o solo
durante o crescimento, permitindo a entrada de microrganismos. Outros fungos
associados às plantas iniciam seu ciclo de vida com a germinação do esporo seguido
do crescimento da hifa na folha ou superfície de raiz, e a penetração destes fungos
endofíticos na planta pode ocorrer, até mesmo, por aberturas naturais do hospedeiro
como estômatos e hidatódios (WAGNER & LEWIS, 2000). Piriformospora indica é um
fungo endofítico que pode produzir apressórios que favorecem a penetração nos
tecidos da planta hospedeira (VARMA et al., 1999). Entretanto, outros fungos não
utilizam apressórios para penetrar na planta hospedeira, seus esporos germinam sobre
a planta como no milho, e crescendo de forma aleatória nesta superfície, onde
posteriormente podem penetrar via estômatos ou por entre as células da epiderme
através da cutícula. Nesta penetração, deve estar envolvida a ocorrência de ação
enzimática a partir das hifas sobre a cutícula dos tecidos do hospedeiro, como ocorre
20
no fungo Beauveria bassiana, permitindo assim a sua penetração. Em seguida, o
endófito pode se movimentar de forma passiva no interior no hospedeiro, pelo xilema
(WAGNER & LEWIS, 2000).
Os endófitos podem colonizar os tecidos vegetais ocupando espaços
intercelulares, o interior de tecidos vasculares ou mesmo intracelularmente. Segundo
Araújo et al. (2002), os mais variados órgãos vegetais como folhas, ramos, caules,
raízes e estruturas florais, tais como pólen, ovários, anteras e estames, podem ser
colonizados. Entretanto, fungos e bactérias endofíticos parecem apresentar diferentes
preferências quanto às regiões da planta hospedeira que colonizam. Fisher et al. (1992)
isolaram bactérias e fungos endofíticos de três tipos de tecidos (epiderme e córtex do
caule e folha) de plantas de milho sadias, e verificaram que as partes das plantas mais
próximas do solo eram mais colonizadas por bactérias que a parte superior das plantas.
Já os fungos endofíticos, parecem colonizar preferencialmente as partes aéreas da
planta hospedeira e os espaços intercelulares.
1.3 Isolamento de Microrganismos Endofíticos
O processo de isolamento de microrganismos endofíticos é de suma importância
para a caracterização da comunidade endofítica de determinada planta e deve ser
realizado criteriosamente de modo que não seja obtido um perfil irreal das comunidades
microbianas endofíticas que habitam a planta a ser estudada. Assim, a avaliação de
vários fatores deverá preceder o isolamento de microrganismos endofíticos. Segundo
Araújo et al., (2002) é importante a escolha certa do material vegetal, pois espera-se
obter linhagens que colonizem naturalmente a planta e que possam conferir
características desejadas ao hospedeiro; a idade da planta, os órgãos e tecidos
utilizados para o isolamento. O local e a época da coleta também devem ser
considerados.
A produção pela planta de metabólitos de interesse biotecnológico, pode ser um
fator importante na escolha da planta hospedeira pela possibilidade do endófito ter
21
adquirido geneticamente a capacidade para produzi -los, durante sua coevolução com a
planta hospedeira, e esta possibilidade é bastante vantajosa. Segundo Azevedo (1999),
a capacidade potencial que os endófitos possuem de produzir fitoquímicos obtidos
originalmente da planta hospedeira, permite a produção dos fármacos pelo fungo, por
fermentação industrial, protegendo desta maneira plantas que possuem crescimento
lento, de possível risco de extinção.
A realização de várias coletas e repetições é importante para a diferenciação dos
reais endofíticos, daqueles microrganismos epifíticos que eventualmente possam ser
isolados e até mesmo contaminantes, e testes de controle para verificação da eficácia
da desinfecção superficial dos tecidos vegetais a serem submetidos a isolamentos
devem ser feitos a cada processo de desinfecção (BARROS, 2003).
O emprego da microscopia ótica e eletrônica auxilia na detecção de
microrganismos endofíticos, mas não descarta a necessidade de isolamento destes. A
etapa de isolamento deve ser cuidadosamente realizada a fim de eliminar a microbiota
epifítica existente na planta em estudo sem, entretanto, alterar a endofítica. Esta fase
refere-se à lavagem dos tecidos vegetais utilizando agentes desinfectantes (PEREIRA
et al. 1993; ARAÚJO et al 2002). O tempo de imersão do material vegetal nos agentes
desinfectantes e a própria concentração destes pode variar de acordo com a textura do
tecido vegetal em estudo (PEREIRA et al. 1993).
Geralmente as técnicas utilizadas para isolar os endófitos baseiam-se na ruptura
ou fragmentação do tecido vegetal, seguido de sua inoculação sobre meios específicos
para o tipo de microrganismo que está sendo pesquisado (ARAÚJO et al., 2002), sendo
possível monitorar organismos específicos no ambiente, por meio do isolamento
seletivo de determinados endófitos, (MELO E AZEVEDO, 2000).
A purificação dos microrganismos isolados e estocagem dos mesmos
empregando o processo de preservação apropriado entre os vários disponíveis, são as
etapas subseqüentes do processo de isolamento, fase esta, imprescindível, pois uma
colônia isolada aparentando ser constituída por uma única espécie microbiana, pode
ser uma mistura de espécies (ARAÚJO et al. 2002).
22
1.4 Fungos: Importância, Características e Biodiversidade
Atualmente estima-se que o Reino Fungi apresente, aproximadamente, 1,5
milhão de espécies com representantes habitando praticamente todos os ecossistemas
existentes no planeta. Ainda assim, atenção especial deve ser dispensada com relação
à preservação destes microrganismos, pois segundo Cherfas (1991), tem se observado
na Europa um grande declínio no número de espécies fúngicas bem como na
quantidade de indivíduos nos últimos tempos. Diante desta situação e em vista da
importância destes microrganismos, é urgente que estudos para catalogar fungos, no
mundo, sejam realizados, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais, onde esta
situação ainda é mais grave, pelo risco de extinção de espécies antes mesmo de serem
catalogadas.
Os Fungos apresentam grande diversidade dentre as milhares de espécies
conhecidas e apresentam características em comum que os distinguem dos demais
reinos (AZEVEDO, 2001), podendo ser classificados de acordo com aspectos
morfológicos e reprodutivos, nos grupos: Ascomycota, Zygomicota/Trichomycota,
Deuteromycota,
Chytridiomycota
e
Stramenophila
(Hyphochytridiomycota,
Labyrinthulomycota e Oomycota). Encontram-se, nestes grupos, fungos associados a
plantas, os quais compreendem uma porção bastante grande e heterogênea que têm
importância, tanto na agricultura como em ambientes naturais. Eles apresentam uma
diversidade genética bastante grande, fruto das diversas estratégias de sobrevivência e
também da interação de cada espécie com seu hospedeiro (HAWKSWORTH, 1991).
São organismos heterotróficos desprovidos de clorofila, mas historicamente
comparados às plantas, com destacada habilidade para utilizar praticamente qualquer
fonte de carbono como alimento. Realizam nutrição absortiva liberando enzimas no
meio em que habitam, quebrando moléculas grandes presentes no meio, tais como
carboidratos, proteínas e lipídios, em moléculas menores e mais solúveis, facilitando
sua absorção. Outra característica é sua fonte primária de reserva de carboidratos que
é o glicogênio, ao contrário das plantas que têm o amido para desempenhar esta
função, (ALEXOPOULOS et al. 1996). As paredes celulares fúngicas têm quitina em
23
sua composição, tornando-as rijas e espessas, principalmente dos fungos chamados
filamentosos, que possuem filamentos ou hifas que conjuntamente, formam o micélio do
fungo. Existem fungos não filamentosos, como as leveduras, que são unicelulares e
reproduzem-se por brotamento; outros ainda, formam estruturas macroscópicas, como
os cogumelos comestíveis (AZEVEDO, 2001).
Como fonte de produtos químicos, incluindo vários antibióticos, os fungos são
extremamente valiosos além de apresentarem grande potencial no controle biológico de
pragas (HAWKSWORTH, 1991; AZEVEDO, 1998.b; STROBEL & DAISY, 2003).
Apesar dos efeitos indesejáveis dos fungos serem enfatizados pela população
leiga, vários são os benefícios que estes microrganismos oferecem: antibióticos como a
penicilina produzida pelo fungo Penicillium notatum, as fermentações biológicas
envolvendo fungos, utilizadas pelo ser humano há milênios na fabricação de pães e
bebidas fermentadas como o vinho e a cerveja (AZEVEDO, 2001 ). Mais recentemente,
o resveratrol, uma fitoalexina produzida pela videira em resposta de defesa ao fungo
Botrytis cinerea, tem sido vastamente estudada pelos seus efeitos benéficos contra
doenças cardiovasculares e o tratamento de algumas neoplasias.
1.5 Identificação dos Fungos Endofíticos
Os métodos utilizados atualmente para detectar e identificar fungos em tecidos
vegetais são: a observação histológica, o método de esterilização superficial do tecido
da planta hospedeira e isolamento do fungo emergente sobre meio de cultura adequado
e
detecção
por
especificidade
química,
incluindo
métodos
imunológicos
e
metagenômica (SCHULZ & BOYLE, 2005).
A metagenômica é a análise genômica de comunidades microbianas inteiras e
tem revolucionado a microbiologia, sendo aplicada a estudos de comunidades
microbianas de solo, água do mar e até do trato digestivo de humanos. É também
utilizada para o estudo de comunidades endofíticas, pois permite a identificação de
microrganismos não cultiváveis em condições de laboratório e que possuem uma
24
variedade de genes desconhecidos com novas funções. Bibliotecas de DNA
metagenômico podem assim, armazenar genes para expressão de novas enzimas e
metabólitos.
Tradicionalmente, a identificação e classificação de fungos endofíticos é baseada
em características morfológicas como: morfologia da colônia de cultura monospórica de
isolados em meios de cultura específicos, pigmentação, taxa de crescimento,
especificidade de hospedeiros, perfil dos metabólitos secundários (THRANE, 1990),
observação das estruturas reprodutivas dos fungos (KENDRICK & CARMICHAEL,
1973). Entretanto, em face da complexidade na identificação de estruturas reprodutivas
fúngicas, as técnicas moleculares vêm sendo preferencialmente utilizadas para esta
tarefa, pelo fato das informações fornecidas serem mais precisas, reproduzíveis, além
de
permitirem
estudos
filogenéticos;
entretanto,
a
caracterização
morfológica
microscópica e macroscópica, pela observação da colônia, ainda desempenham um
papel fundamental na identificação de fungos, complementando outras técnicas.
1.6 Caracterização Molecular dos Fungos
A região ITS (Espaçador interno transcrito ou internal trancribed spacer) localiza se entre os genes 18S e 28S do rDNA. Incorpora também o gene 5,8S e tem sido
utilizada para diferenciar espécies de fungos (WHITE et al. 1990; GARDES & BRUNS,
1993; LARENA et al., 1999). Regiões espaçadoras de rDNA que não codificam, tais
como a ITS, tem o benefício de uma rápida taxa de evolução e resultam em maior
variação da seqüência entre espécies coincidentes comparadas com regiões mais
conservadas do agrupamento de genes do rDNA. Desta forma, seqüências ITS
fúngicas geralmente fornecem maior resolução taxonômica que seqüências geradas de
regiões codificadoras (FUNGARO, 2001).
25
1.7 Fungos Associados à Videira
Até o momento poucos estudos foram realizados para avaliar a comunidade
fúngica associada à videira. Os dados da literatura resumem -se quase que
exclusivamente ao estudo de fungos que causam doenças nessa cultura, sendo
descritos principalmente: o fungo Elsinoe ampelina, forma anamorfa Sphaceloma
ampelinum = Gloeosporium ampelophagum, agente causal da antracnose, também
conhecida como varola, negrão, carvão ou olho-de-passarinho; Phomopsis viticola =
Fusicoccum viticola, agente causal da escoriose da videira; Plasmopara viticola, um
pseudofungo, agente causal do míldio; Uncinula necator agente causal do oídio;
Pseudocercospora vitis agente causal da Mancha das folhas, também conhecida como
mancha de isariopsis; Botryotinia fuckeliana, forma conidiana Botrytis cinerea agente
causal da podridão cinzenta da uva, também conhecida como podridão do cacho, mofo
cinzento ou podridão de botritis; Glomerella cingulata, forma conidial Colletotrichum
gloeosporioides agente causal da Podridão da uva madura; Greeneria uvicola, sinônimo
de Melanconium fuligineum agente causal da podridão amarga; Fusarium oxysporum
f.sp. herbemontis agente causal da fusariose; Armillaria mellea agente causal da
Podridão de Armillaria; Rosellinia necatrix agente causal da comumente conhecida
podridão radicular ou podridão de roselinia. Os aspectos mais abordados são condições
de vulnerabilidade da viticultura à estas doenças, sintomatologia e formas de controle
(SÔNEGO et al, 2001).
1.8 Influência de Fatores Abióticos sobre a Comunidade Endofítica
Segundo Maki (2006), a estrutura da comunidade endofítica varia em função do
ambiente ao qual a planta está adaptada, bem como as oscilações de fatores abióticos,
tais como temperatura, regime de chuvas e predominância de espécies de
microrganismos presentes naquele ambiente e adaptados a ele. Arnold et al. (2003),
26
observou que folhas ou plântulas de cacau em fase de emergência, não apresentam
endófitos cultiváveis, porém, com a molha das plantas pela chuva, orvalho ou névoa, os
microrganismos se tornam aptos a penetrar a planta e colonizá-la persistentemente
como endófitos, sem causar danos aparentes.
1.9 Testes de Antagonismo ao Fusarium
Fusarium é um gênero de fungo filamentoso cosmopolita amplamente distribuído
em plantas e no solo. Fusarium pode produzir micotoxinas em cereais e grãos
estocados, o que pode afetar a saúde de humanos e animais (MARTINS, 2005). As
principais toxinas produzidas por Fusarium são as fumosinas, conhecidas por causar
câncer esofágico em humanos. No Brasil, embora sabidamente as micotoxinas sejam
responsáveis por expressivos prejuízos na produção de grãos, praticamente não
existem estimativas das perdas econômicas associadas às micotoxinas. Mesmo em
países com alta tecnologia para produção e armazenamento de milho, as perdas por
presença de micotoxinas são elevadas.
O gênero Fusarium causa algumas das mais importantes doenças de plantas,
afetando economicamente a agricultura. Culturas como feijão, milho, uva e inúmeras
outras podem sofrer grandes prejuízos por este fungo.
Na viticultura, a fusariose, causada pelo fungo Fusarium oxysporum f.sp.
Herbemontis é uma doença que ataca as plantas através do sistema radicular (fungo de
solo) e se desenvolve no sistema vascular da planta, é considerado um dos principais
problemas da viticultura pois, quando presente no vinhedo, causa a morte das plantas
(SÔNEGO et al, 2001).
A maioria das espécies de Fusarium é composta por fungos de solo ativos na
decomposição de substratos celulósicos das plantas, sendo alguns parasitas destas,
(MARTINS, 2005). Segundo Sonego et al (2001), os fungos de solo são de difícil
controle e os tratamentos com fungicidas são muito dispendiosos, principalmente pelo
alto custo da incorporação do produto ao solo. Outra desvantagem do controle com
27
substâncias xenobióticas é que, além dos problemas de deposição no meio ambiente e
impacto que causam, sua utilização não é completamente eficaz, pelo fato do Fusarium
se alojar no sistema vascular do vegetal.
Dentre as estratégias no combate ao Fusarium estão: o plantio de cultivares
menos suscetíveis, cuidado em evitar ferimentos ao sistema radicular das plantas,
desinfestação do solo com fungicida químico e rotação de cultura, utilizando plantas
não hospedeiras (AGRIOS, 1988; SONEGO et al, 2004). Isolados não patogênicos de
Fusarium , isolados de solo, bem como isolados endofíticos mostraram-se eficientes
para o biocontrole de formas patogênicas do fungo, segundo Fravel et al, (2003).
A utilização de outros fungos endofíticos no biocontrole de Fusarium pode ser
uma alternativa de extrema importância, em vista das dificuldades de controle deste
fungo e os prejuízos causados por este em diversas culturas .
1.10 Interações e Especificidade entre Microrganismos Endofíticos e
Planta Hospedeira
As interações entre uma planta e os microrganismos são diversas; existem
microrganismos que habitam a superfície externa da planta (filoplano), e são
denominados epifíticos; outros vivem na rizofera, e finalmente os microrganismos
endofíticos, que habitam internamente a planta e que são o objeto de estudo deste
trabalho.
Fungos e bactérias endofíticos são simbióticos, não patogênicos ou exercem
baixo grau de patogenicidade dentro da planta hospedeira . Todas as partes da planta
possuem microrganismos endofíticos, existindo um certo grau de especificidade
endófito-hospedeiro (MELO, 2002). Entretanto, a existência de um isolado como
endófito não exclui a possibilidade de que este venha a se tornar patogênico quando o
hospedeiro estiver estressado ou senescente (KULDAU e YATES, 2000), pois um fungo
ocupando assintomaticamente um tecido vegetal, pode ser um patógeno fraco ou ainda
28
um habitante de um nicho aguardando uma oportunidade para propagar-se (SCHULZ &
BOYLE, 2005).
As interações ou simbioses estabelecidas pelos fungos podem ter as mais
variadas características, tais como: mutualística, onde o fungo e o organismo associado
obtêm vantagens na interação; neutra ou comensalística, onde o organismo associado
não é afetado pela interação e antagonista ou parasítica, onde o organismo associado é
comprometido pela interação (CARROLL & WICKLOW, 1992).
Mais recentemente, estas interações entre a planta hospedeira e o endófito
foram analisadas por um outro enfoque. Schulz & Boyle (2005), lançam a hipótese que
não há interações neutras entre endófitos e plantas hospedeiras, mas sim, um balanço
de antagonismos, havendo sempre pelo menos um grau de virulência por parte dos
fungos possibilitando a infecção, enquanto a defesa da planta hospedeira limita o
desenvolvimento do fungo invasor e conseqüentemente, da doença. Também, os
endófitos, em contraste aos patógenos conhecidos, geralmente teriam muito maior
plasticidade genotípica e assim teriam mais opções que os patógenos: infecção, local,
mas
também
extensiva
colonização,
latência,
virulência,
patogenicidade
e/ou
saprofitismo. Esta plasticidade genotípica segundo os autores, seria um motor de
evolução.
Quanto às simbioses e relações mutualísticas, as interações endófito -hospedeiro
assintomáticas em geral, parecem envolver dois parceiros ativamente antagonistas
(SCHULZ & BOYLE, 2005). Entretanto, uma interação antagonista endófito-hospedeiro
balanceada não exclui a possibilidade de que o endófito possa desempenhar um papel
benéfico dentro de seu hospedeiro. Por exemplo, pode ocorrer indução de metabólitos
de defesa potencialmente ativos contra patógenos (ARNOLD et al. 2003; SELOSSE et
al 2004; SCHULZ & BOYLE, 2005), secreção de fitormônios, promovendo crescimento
da planta-hospedeira (TUDZYNSKI & SHARON 2002), aumento de atividade
metabólica da planta hospedeira, ou por indução de resistência a doenças.
O status da interação planta-endófito é transiente, sendo que o termo endofítico
deve ser empregado para microrganismos que estão comportando-se endofíticamente
no momento da detecção (SCHULZ & BOYLE, 2005).
29
Evidências diversas das interações evolutivas entre endófitos e plantahospedeira foram citadas por vários autores; bactérias endofíticas, por exemplo,
provavelmente desenvolveram íntima relação com sua planta hospedeira por meio de
processos
coevolutivos
e
podem
influenciar
a
fisiologia
da
planta
(MISAGHI
&
DONNDELINGER, 1990). Alguns compostos de origem vegetal, também são produzidos
por fungos que habitam esses vegetais, indicando haver uma transposição de genes
entre
plantas
e
fungos
em
uma
verdadeira
engenharia
genética
in vivo.
(AZEVEDO,1998a) Esta interação endófito-planta hospedeira, na qual há produção de
certos fitoquímicos, originalmente característicos da planta hospedeira, pode ocorrer por
uma recombinação genética do endófito com seu hospedeiro ocorrida durante sua
evolução (TAN & ZOU, 2001). A produção de taxol, um diterpenóide antioxidante
utilizado contra certos tipos de câncer, é um exemplo desta interação, que além de ser
produzido por alguns vegetais, como Taxus brevifolia, também é produzido por fungos
que habitam esta planta, como o Taxomyces andreanae (STIERLE et al. 1993;
STROBEL & LONG, 1998).
A diversidade dentro de um determinado hospedeiro pode ser alta (CARROLL,
1995), comunidades de endófitos habitando um certo hospedeiro particular podem ser
amplamente distribuídas ou ter especificidade com determinado hospedeiro (CARROLL,
1988; PETRINI, 1996; STONE et al. 2000; COHEN, 2004), sendo que o termo
especificidade deve ser reservado para organismos que irão crescer somente em um
hospedeiro (CARROLL, 1999; WAGNER & LEWIS, 2000; ZHOU & HYDE, 2001).
Estudos recentes têm mostrado efeitos genéticos da planta hospedeira sobre a
comunidade microbiana e sobre processos no ecossistema, o que permite entender os
impactos de características genéticas sobre os endófitos, como, apresentado por
exemplo, no trabalho com algodoeiros híbridos realizado para examinar ligações entre
variação genética, fitoquímica da planta e endófitos fúngicos de ramo. Nesse caso, os
resultados demonstraram que o genótipo da planta pode albergar parceiros ecológicos
escondidos (fungos endofíticos), resultando em conseqüências para a comunidade e o
ecossistema (BAILEY et al, 2005).
Diversas interações entre hospedeiros e microrganismos são iniciadas pela
detecção de sinais químicos liberados pelo hospedeiro. A detecção destes sinais leva à
30
alteração nos padrões de expressão gênica do microrganismo, que culmina em
mudanças específicas e adaptativas na sua fisiologia e que são necessárias para estas
associações. Os produtos liberados pela planta têm baixo peso molecular, são
moléculas difusíveis e são reconhecidas pelos microrganismos por meio de receptores
específicos de proteínas. Fenômenos semelhantes são observados com outros
patógenos de plantas, incluindo Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum e
Erwinia spp., embora nesses microrganismos os sinais e receptores de sinais não
estejam bem definidos. Em alguns casos, condições nutricionais, tais como limitação de
ferro ou falta de fontes de nitrogênio parecem prover um significante estímulo
(BRENCIC & WINANS,2005).
1.11 Aplicações Biotecnológicas de Microrganismos
1.11.1 Controle Biológico de Insetos e Doenças
Embora os microrganismos endofíticos aparentem ser neutros para o
hospedeiro, atualmente são bastante evidentes os benefícios proporcionados à planta
por estes microrganismos, tais como: I) proteção da planta contra insetos, patógenos e
até mesmo mamíferos herbívoros; II) proteção contra estresse ambiental, tal como o
hídrico; III) produção de compostos que alteram a fisiologia das plantas como
hormônios vegetais. Além disso, certos microrganismos endofíticos produzem
substâncias de valor biotecnológico, principalmente fármacos, entre eles, antibióticos e
antitumorais (AZEVEDO et al. 2002).
No Brasil, o controle biológico começou a ser utilizado com o fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae e com o Baculovírus, no controle das
cigarrinhas da cana e das pastagens e no controle da Anticarsia gemmatalis na soja,
respectivamente. Na cultura do cacau, o fungo Trichoderma tem sido utilizado com
sucesso em restos de ramos doentes para o controle do fungo Crinipellis perniciosa,
31
agente causal da vassoura-de-bruxa. Recentemente, endófitos foram testados contra
Crinipellis perniciosa in vitro e in vivo e Gliocladium catenulatum apresentou potencial
como antagonista reduzindo em 70% a doença nas mudas de cacau analisadas
(RUBINI et al, 2005).
Na proteção da planta contra insetos, pode ser citado o Bacillus thuringiensis.
Esta bactéria produz umas inclusões protéicas, que lhe confere a capacidade
entomopatogênica. Esse cristal, sintetizado durante a fase de esporulação, é formado
por polipeptídeos denominados δ-endotoxinas (proteínas cry). Quando este cristal
protéico é ingerido por uma larva de inseto suscetível, o efeito tóxico é ativado e ocorre
uma ligação das toxinas a receptores específicos nas células intestinais, levando o
inseto à morte (VILAS -BÔAS et al. 2002). O B. thuringiensis é a espécie mais utilizada
no controle de insetos e destaca-se por produzir cristais protéicos ativos contra cerca de
130 espécies de insetos das ordens Lepidóptera, Díptera e Coleoptera, bem como
vetores de doenças humanas, como contra os gêneros Aedes, Culex e Anopheles
(LERECLUS et al. 1993; LE ROUX, 1996).
Weber (1981), foi provavelmente o primeiro pesquisador a relatar a proteção de
plantas a insetos devido a um fungo entomopatogênico. Trabalhos posteriores
sustentaram esses dados em gramíneas e outras plantas (FUNK et al., 1983;
CLAYDON et al. 1985).
A utilização de fungos para o controle de insetos-pragas se fundamenta em sua
capacidade de infectá-los, causando doença e morte num processo dependente de
fatores bióticos e abióticos (AZEVEDO et al. 2002). Vários fungos, ainda, são
conhecidos pela produção de compostos, tais como ácido nodulispórico, novos
diterpenos e indol, que possuem potentes propriedades inseticidas. Os compostos
nodulispóricos foram isolados primeiramente de um endófito, o Nodulisporium sp., da
planta Bontia daphnoides. Outro fungo endofítico, Muscodor vitigenus isolado da planta
Paullina paullinioides produz naftaleno, que é amplamente utilizado como repelente de
insetos (STROBEL & DAISY, 2003).
Leveduras são utilizadas no controle biológico, preferencialmente pela proteção
de frutos destinados ao consumo in natura. Por esses organismos terem sua ação
antagônica vinculada mais à competição que à antibiose, geralmente, não produzem
32
antibióticos, elementos considerados contaminantes químicos nos vegetais. As
leveduras atuam no controle de doenças, mais como protetoras da infecção
(VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000). As principais formas de ação das leveduras como
agentes de biocontrole, são a competição por nutrientes e a indução de resistência
(WILSON et al. 1991; WISNIEWSKI et al. 1991). Mais recentemente, a habilidade de
leveduras para atacar hifas e conídios de fungos fitopatogênicos, tem sido especulada
por contribuir para a atividade de biocontrole sobre a superfície das plantas, Allen et
al.,(2004), observou o combate de Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani e Sclerotinia
homoeocarpa por leveduras do filoplano, comprovado por testes de antagonismo in
vitro.
Os mecanismos de interações antagônicas que levam ao controle biológico de
um determinado organismo são o parasitismo, a antibiose e a indução de resistência.
Se mais de um destes mecanismos for utilizado por um microrganismo antagonista,
este fato será considerado como uma característica favorável para este ser bem
sucedido como agente de biocontrole (BÉLANGER et al. 1998).
Microrganismos produtores de sideróforos também podem atuar como agentes
de biocontrole. Sideróforos são moléculas de peso molecular relativamente baixo, que
atuam como agentes quelantes de ferro, produzidos por bactérias e fungos, crescendo
sob condições limitantes de ferro. Estas moléculas possuem uma alta afinidade por
ferro, e seletivamente complexam e transportam ferro para o interior das células de
microrganismos (NEILANDS, 1981; LEONG, 1986). Geralmente, a maioria dos
microrganismos aeróbios e anaeróbios respondem às condições limitantes de ferro
produzindo sideróforos, e a competição por ferro mediada pelos sideróforos, é
considerada um importante mecanismo no biocontrole de patógenos em solos em que o
ferro disponível encontra-se em baixas concentrações (LEONG, 1986). Os patógenos
podem ser desfavorecidos em relação a produção de sideróforos do antagonista, além
disso, são incapazes de utilizar os produzidos pelo antagonista (LEONG, 1986). A
estrutura geral dos sideróforos microbianos varia amplamente, mas a maioria deles
possui os grupos catecol ou hidroxamato, os quais estão envolvidos em quelar o ferro
férrico. Além disso, os sideróforos também podem atuar como fatores de crescimento, e
alguns, ainda, apresentam potente atividade antimicrobiana.
33
1.11.2 Produção de metabólitos secundários e enzimas
Metabólitos secundários são formados geralmente nas fases finais do
crescimento. Aparentemente são substâncias não essenciais para o crescimento, e
dentre outros produtos, podem ser antibióticos, pigmentos, toxinas, etc.
A maioria dos microrganismos produtores de antibióticos é comumente encontrada
no solo. No entanto, certos endófitos também têm se mostrado potentes produtores de
antibióticos, dos quais muitos com propriedades de uso na agricultura e na medicina
(STROBEL et al. 2003).
Actinomicetos, bactérias e fungos estão entre os produtores mais conhecidos. A
vasta maioria de antibióticos atualmente utilizados é produzida por actinomicetos e em
particular, por membros do gênero Streptomyces. Entre os fungos, Penicillium e
Cephalosporium spp. são os mais conhecidos. Bactérias dos gêneros Bacillus e
Pseudomonas são também estudadas como produtoras de potentes antibióticos,
destacando-se o B. colistinus, produtor da colistina; B. brevis (tirotricina); B.
licheniniformis (gramicidinas); B. polymycia (polimixina,etc) (STROBEL & DAISY, 2003).
Acremonium coenophialum, é um fungo endofítico de gramíneas, que apresenta
efeito inibitório sobre vários patógenos.
1.11.3 Promoção de crescimento vegetal
Fungos Ascomycetes produzem a maioria dos reguladores de crescimento
também produzidos pelas plantas (ALEXOPOULOS et al, 1996). Promoção de
crescimento vegetal por microrganismos endofíticos tem sido observado em diversos
estudos: Bacillus pumilus isolado endofíticamente, de cultura in vitro de Vitis vinifera,
apresentou potencial capacidade na promoção de crescimento vegetal de brotos e
raízes de uva (THOMAS, 2004); Rizobactérias promotoras de crescimento (PGPR),
colonizam raízes, realçando a emergência de brotos, e estimulando o crescimento da
34
planta, diretamente pela produção de hormônios vegetais e melhorando a obtenção de
nutrientes, ou indiretamente pela mudança no balanço microbiano na rizosfera em favor
de microrganismos benéficos (LAZAROVITS & NOWAK, 1997; NOWAK et al. 1998); a
bactéria Pseudomonas sp. amostra PsJN, isolada da superfície esterilizada de raízes
de cebola (NOWAK, 1998), proporciona também aumento do crescimento de batata
(LAZAROVITS & NOWAK, 1997; NOWAK et al., 1998), tomate e pimentão (NOWAK,
1998) sob condições gnobióticas. Comunidades bacterianas endofíticas isoladas de
mudas de batata crescendo em campo, apresentaram habilidades na promoção de
crescimento vegetal. Nesses casos, a quantidade de ácido 1,3-indol-acético, um
hormônio de crescimento vegetal, geralmente apresentou-se alta (SESSITSCH et al.,
2004).
Segundo Azevedo & Araújo (2006), fungos endofíticos também podem influenciar
no crescimento da planta diretamente pela produção de reguladores de crescimento
vegetal produzidos pelo fungo, ou indiretamente pela proteção da planta contra efeitos
deletérios causados por um ou mais organismos fitopatogênicos.
1.11.4 Características da Niagara Rosada (Vitis labrusca L.)
A variedade de uva Niagara Rosada surgiu de uma mutação somática da
Niagara Branca, detectada em 1933, no município de Louveira, São Paulo (SOUSA,
1996). Ganhou a preferência do consumidor brasileiro substituindo quase que
totalmente sua forma original nos parreirais destinados à produção de uvas de mesa. A
Niagara Branca originou-se a partir do cruzamento Concord X Cassady realizado em
1868 em Nova Iorque, Estados Unidos (HEDRICK, 1908), e apresenta as
características gerais da Niagara Rosada.
Esta planta apresenta vigor médio, tolerante às doenças e pragas e produt iva
(CATO, 2002), e na viticultura Paulista, as Niagaras são as uvas mais cultivadas,
perfazendo uma área de 7.626 hectares, o que representa 66,3% dos vinhedos, com
forte predominância da ‘Niagara Rosada’ (GHILARDI & MAIA, 2001).
35
A videira é uma planta sarmentosa do gênero Vitis, pertencente à família
Vitaceae, cujo fruto produzido, a uva, é o mais cultivado no mundo. Apresenta um ciclo
de vida dividido em três períodos: repouso, no qual ocorre a perda das folhas e a planta
entra em latência; período de crescimento, quando se inicia o brotamento de folhas,
floração, produção e circulação da seiva; e o período de elaboração, que é marcado
pela formação e o amadurecimento dos frutos e início da queda das folhas .
São Paulo apresenta pequena participação na produção da uva destinada para
indústria, sendo que nas denominadas uva para mesa (tipos comum e fina), o Estado
responde pela maior parcela da produção brasileira, e dentre as uva comuns de mesa,
predomina o cultivo da variedade Niagara Rosada.
A escolha da planta hospedeira, a Niágara Rosada, para a realização do estudo
e isolamento de suas populações endofíticas, deve-se ao fato de ser uma planta que
surgiu de uma mutação aqui no Brasil, estar bem adaptada a este ambiente, apresentar
resistência média a doenças e ser uma variedade de grande destaque dentro da
viticultura brasileira, a mais consumida em todo o país, e ser de grande produtividade
no Estado de São Paulo.
36
2 OBJETIVOS
1)
Isolar os fungos endofíticos da videira, cultivar Niagara Rosada (Vitis
labrusca), e caracterizar sua comunidade fúngica endofítica por
identificação morfológica e molecular;
2)
Estudar a diversidade genética dos isolados pela utilização de ARDRA ;
3)
Testar o potencial de antagonismo, in vitro, dos fungos endofíticos
isolados contra espécies do fungo fitopatogênico Fusarium
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal e Local de Coleta das Amostras
O material vegetal utilizado nesta pesquisa foi proveniente de plantas da
variedade Niagara Rosada (Vitis labrusca). Foram utilizados tecidos foliares, para o
isolamento dos endófitos, coletados em três estações do ano, abrangendo, desta forma,
a maior parte das fases do ciclo da uva no Brasil.
As videiras amostradas da variedade estudada, Niagara Rosada, foram
cultivadas na região de Salesópolis SP, localizada à 96km da capital, latitude sul 23°32’
e longitude oeste 45°51’, produzidas de forma orgânica. Todo o material coletado foi
obtido obedecendo-se o padrão de coleta mencionado a seguir:
Foram coletadas folhas sem lesões causadas por patógenos, insetos ou
danificadas, a partir do ápice caulinar em crescimento de um ramo, distante
aproximadamente 1m do tronco e 1,50 m acima do solo. Foram selecionadas a 4° e 5°
folhas como mostra a figura 1. Os ramos selecionados foram transportados em sacos
plásticos, previamente etiquetados com nome da variedade, local e data da coleta. A
extremidade do saco foi fechada com elástico conservando-se um pouco de ar no seu
interior, depois foram acondicionadas dentro de caixa térmica contendo gelo.
No laboratório as amostras foram retiradas dos ramos, este procedimento de
coleta e processamento do material no laboratório não ultrapassou 72 horas após a
coleta, sendo o material conservado em câmara fria em temperatura de
aproximadamente 4°C, até o momento da utilização.
38
Figura 1: Metodologia de Coleta. O desenho da videira exemplifica a
metodologia utilizada para coletar o material vegetal, observe a distância do
ramo ao solo, para evitar contaminação por microrganismos de solo, as 4°
e 5° folhas coletadas são folhas maduras e selecionadas.
As 5 coletas foram realizadas nos meses de julho, agosto, outubro e dezembro
de 2004, e em março de 2005. Procurou-se abranger todas as fases do ciclo da uva no
Brasil. Dados de temperatura média local e pluviosidade diária acumulada dos meses
de coleta no período de 2004 a 2005, foram fornecidos pelo Departamento de Águas e
Energia Elétrica do Estado de São Paulo - Centro Tecnológico de Hidráulica e Recursos
Hídricos (DAEE-CTH).
39
3.2 Desinfecção Superficial
O material vegetal coletado foi submetido ao método de desinfecção superficial
com hipoclorito de sódio (Araújo et al, 2002) para a eliminação dos microrganismos
epifíticos. As folhas foram lavadas em água corrente abundante, e secas,
cuidadosamente com papel toalha. Pedaços da parte central do limbo foliar foram
cortados, em fragmentos de 8 à 12 cm, e em seguida pesados. Estes foram incubados
em H2O destilada estéril por 30 seg, álcool 70% por 30 seg., hipoclorito de sódio (2-4%
de Cloro ativo) por 2,5 min, e 3 lavagens em água destilada esterilizada. Como controle,
alíquotas de H2O da última lavagem foram semeadas sobre meio BDA para avaliação
da eficiência do processo de desinfecção superficial. O meio BDA (Batata Dextrose
Agar) utilizado foi composto por: infusão de 200g de batata em água destilada,
acrescido de 20,0g de glicose e 15,0g de àgar, sendo o volume completado com água
destilada até 1000mL e o pH acertado para 6,0. Finalmente o meio foi autoclavado a
121°C por 20 minutos, e quando o meio de cultura apresentava temperatura próxima à
temperatura ambiente, após a autoclavagem, o antibiótico tetraciclina foi adicionado ao
meio na concentração de 50mg/L, para restringir o crescimento de bactérias.
3.3 Isolamento de Fungos Endofíticos
Após desinfecção superficial (item 2.2), fragmentos de tecido foliar de
aproximadamente 0,5 - 0,7mm foram obtidos assepticamente e transferidos para placas
de Petri contendo meio BDA (item 3.2.4). Cada placa recebeu 4 fragmentos. Cerca de
24 fragmentos foram inoculados por amostragem, sendo as placas incubadas à 28°C
por cerca de 21 dias com observação a partir do 5° dia. Os microrganismos foram então
purificados por novos cultivos, pelo método de estrias de esgotamento.
40
3.4 Purificação e Conservação dos Fungos Isolados
A maioria das amostras foi purificada pelo método de estrias de esgotamento,
que consiste em coletar, com a alça de platina, um inóculo da colônia fúngica a ser
purificada e fazer estrias em meio de cultura sólido, obtendo-se desta forma colônias
isoladas no final das estrias, sendo este método repetido por três vezes. Para amostras
em que este método não foi eficiente para purificação do fungo endofítico isolado, foi
utilizado o método de purificação por diluição, no qual foi inoculado, em um tubo
contendo 1mL de solução salina, o fungo a ser purificado e em seguida agitado em
vortex por dois minutos, esta solução foi então diluída na proporção de 1/100 e 100µL
foram semeados sobre meio BDA, sendo assim possível obter colônias isoladas e
purificadas.
Os fungos endofíticos isolados estão sendo mantidos armazenados utilizando-se
para isso dois métodos: 1) o tubo com meio de cultura inclinado submerso em Óleo
Mineral (Nujol) e 2) o método de Castellani (1939) no qual fragmentos de colônia com
meio são colocados em água esterilizada dentro de frascos fechados. Ambos
processos permitem manter os microrganismos por um período de cerca de 1 a 4 anos.
No processo com óleo mineral, após cada fungo ser purificado, ele foi inoculado com
alça de platina em tubo contendo meio de cultura inclinado e após crescimento da
colônia, óleo mineral (autoclavado) foi adicionado ao tubo até cobrir completamente o
meio e o fungo endofítico, sendo então os tubos tampados com rolhas ou tampas e
guardado em estantes. Pelo método de Castellani, os fungos a serem mantidos
conservados, foram cultivados em meio de cultura sólido e posteriormente, fragmentos
de cerca de 0,5cm do meio de cultura contendo pedaços de colônia foram retirados e
colocados em frascos contendo água esterilizada. Em ambos os métodos, tubos e
frascos com as amostras foram marcados com o código da amostra e data de
armazenamento e mantidos à temperatura ambiente.
41
3.5 Análise da Diversidade Genética de Fungos Associados à Videira
Niagara Rosada
3.5.1 Identificação Morfológica
A identificação foi realizada por meio de micro-cultivo e observação de aspectos macro
e micro-morfológicos de estruturas vegetativas e reprodutivas dos isolados endofíticos e
subseqüente análise comparativa dos resultados embasados em literatura específica
(Barnett & Hunter, 1972). Para isto, os fungos isolados foram crescidos em meio BDA,
lâminas foram preparadas para a observação de estruturas reprodutivas e coloração
das hifas, sendo que para a preparação do material a ser observado ao microscópio
ótico, lamínulas foram flambadas e colocadas sobre meio de cultura BDA em placas, 1 2 lamínulas por placa, e o fungo a ser observado, foi inoculado sobre o meio de cultura
margeando a lamínula para que as hifas crescessem sobre a lamínula. Após período de
7 – 14 dias incubadas à 28°C, foram preparadas as lâminas que foram tratadas com
lactofenol e observadas ao microscópio ótico em aumento de 400X e 1000X (óleo de
imersão).
3.5.2 Extração de DNA Total
Para a extração de DNA, os fungos endofíticos isolados foram crescidos em
meio BD (batata dextrose líquido), que é igual ao meio BDA, mas sem adição de ágar.
Cada fungo foi inoculado em tubos contendo 3ml de BD e incubados à 28°C por um
período de aproximadamente 7 - 14 dias, dependendo do tempo de crescimento do
fungo. A massa micelial formada foi, então removida para o funil de porcelana contendo
papel filtro, lavado por duas vezes com água destilada esterilizada. Após esse
processo, a massa micelial foi retirada do papel com pinça e embalada em folha de
42
alumínio, sendo descriminado o código da amostra, conservando-se em câmara fria à –
4°C por um período de até 15 dias. O papel filtro e folha de alumínio utilizados foram
previamente autoclavados.
A massa micelial de fungos isolados crescidos em meio BD, foi triturada em N2
líquido, 2g do pó resultante foi ressuspendido em 2mL de solução Tampão (Tris 1M e
pH 8.0; EDTA, 0,5M; NaCl 5M; SDS 10% e H2O milliq). Esta suspensão foi incubada a
65°C por 60 min. e centrifugada a 12000Xg por 10 minutos. A seguir, 800 µL de
sobrenadante foram transferidos para tubos tipo ependorff de 2,0 mL contendo 800 µL
de fenol. A mistura foi homogeneizada e centrifugada a 12000 X g por 10 minutos. Após
esse processo, recolheu-se o sobrenadante e este foi transferido para outro tubo
ependorff de 1,5mL e a este adicionado um volume de “Clorofane” (Fenol: Clorofórmio
na proporção de 1:1)
igual ao de sobrenadante. Os tubos foram novamente
homogeneizados e centrifugados a 12000 X g por 10 minutos. Novamente foi recolhido
o sobrenadante e transferido para outro tubo ependorff de 1,5mL adicionando-se a este
um volume de “Clorofil” (Clorofórmio: Álcool isoamílico na proporção de 24:1), em igual
ao de sobrenadante. Mais uma vez os tubos foram homogeneizados e centrifugados a
12000 X g por 10 minutos, o sobrenadante, mais uma vez, foi transferido para outro
tubo ependorff de 1,5mL adicionando-se a este 50µL de NaCl (5M) e etanol P.A. para
completar um volume total de 1,5mL. Os tubos foram levemente agitados e mantidos
por 60 minutos à –20°C. Em seguida, os tubos foram durante 3 minutos centrifugados a
12000 X g. Desta vez, o sobrenadante foi descartado e aos tubos foram acrescentados
200µL de álcool 70% para lavagem do DNA. Esse processo foi repetido mais uma vez.
Os tubos foram centrifugados a 12000 X g por mais 3 minutos e finalmente o
sobrenadante foi descartado e os tubos foram acondicionados emborcados sobre papel
absorvente em câmara fria a – 4°C por 12 horas, para que o DNA precipitado secasse.
Após extração do DNA, este foi quantificado; o DNA extraído foi ressuspenso em
50µL de TE, pH 9,0 e aquecido por 15 minutos a 37°C. O marcador λ íntegro foi
aplicado ao gel de quantificação nas seguintes quantidades: 1,2,4,8, e 16µ.
Posteriormente, à aplicação do marcador λ íntegro, as amostras contendo 5µL
de DNA mais 3µL de LB (6X), foram aplicadas e a eletroforese em gel de agarose a
43
1,2% foi realizada, sendo o gel corado por 15 – 20 min. em solução de brometo de
etídio (1,0 µg/ml) e fotografado.
Os resultados da quantificação do DNA foram então analisadas comparando-as
com os valores do marcador λ íntegro. Para a realização da reação de PCR, as
amostras foram padronizadas e diluídas para 20ng.
3.5.3 Amplificação e Seqüenciamento da região ITS1-5,8S-ITS2 do
Agregado de genes rDNA
O DNA que codifica para RNA ribossômico apresenta-se como um agregado
gênico, no qual se tem os genes 18S, 5,8S e 28S (Figura 2). Estes genes são
separados por regiões denominadas ITS1 e ITS2, as quais são transcritas e
processadas para dar origem ao RNA ribossômico maduro. O agregado gênico que
codifica para rRNA aparece repetido centena de vezes no genoma fúngico. O fato
desse agregado gênico apresentar algumas regiões altamente conservadas e outras
variáveis, tem permitido a análise de variação de diferentes níveis taxonômicos
(Fungaro, 2001).
A amplificação por meio de PCR da região ITS1-5,8S-ITS2 do agregado de
genes rDNA e restrição por aplicação de ARDRA da mesma região, foi realizada para
definir diferentes haplótipos, seguido do seqüenciamento de representantes dos
diversos haplótipos obtidos, principalmente aqueles cuja identificação morfológica não
foi possível.
A reação de PCR foi preparada para 2.0µl de DNA fúngico. Para cada amostra,
os componentes e quantidades da mistura para cada reação da PCR estão descritos na
Tabela
1,
os
iniciadores
TCCGTAGGTAACCTGCGG-3’)
utilizados
e
ITS4
para
a
amplificação
foram
ITS1
(5’-
(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’).
Em
seguida, as amostras reação foram colocadas em termociclador em um ciclo de 94°C
44
por 2 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e
72°C por um minuto.
Figura 2: Agregado de Genes Ribossomais. Destaque da região
de amplificação pela PCR.
A separação dos fragmentos amplificados foi realizada por eletroforese em gel
de agarose a 1,2% (2,4g de agarose dissolvidos em 200 mL Tampão Tris-Ácido acéticoEDTA 1X) a 100 Volts, conjuntamente com o marcador de peso molecular (1Kb). Após
o término da eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,0 µg/ml),
Por ser este um agente intercalante, o DNA pode ser evidenciado e então foi
fotografado (câmara Kodak Digital Science), sobre transluminador de luz UV.
Tabela 1: Componentes e Concentrações Utilizadas nas Reações de PCR.
Mistura para 2.0 µ l de DNA Fúngico
Componentes
Água Milli-Q*
Tampão da enzima (Invitrogen)
MgC12
dNTP (2,5uM de cada dNTP)
Primer ITS1
Primer ITS4
Taq DNA Polimerase (Invitrogen)
DNA (10ng/uL)
*Autoclavada
1 Reação (µl)
34.1
5.0
3.7
4.0
0.4
0.4
0.2
2,0
Concentração Final
7,4mM
50mM
0,2 mM
50µM
50µM
45
Para
o
seqüenciamento,
foram
selecionados
fungos
cuja
identificação
morfológica não foi possível e eram representantes de haplótipos diferentes; para isto 7
isolados endofíticos foram seqüenciados. As amostras amplificadas pela PCR foram
purificadas com o Kit de purificação (MoBio) e aplicadas em gel de agarose a 1,2% para
eletroforese, a fim de confirmar a eficiência do processo de purificação das amostras. A
seguir, as amostras foram submetidas à reação de seqüenciamento, preparada em tubo
tipo eppendorf de 1,7mL, adicionando-se 2µL de DNA da amostra, 2µL de H2O MilliQ
(esterilizada), 1µL de Iniciador ITS1, 3µL Save Money (Tampão) e finalmente 2µL de
Big Dye foi adicionado. A mistura foi colocada no termociclador em 94°C por 2 minutos
seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por um
minuto.
A etapa subseqüente à reação de seqüenciamento é a preciptação em tubo.
Para tal, transferiu-se 80µL de isopropanol 75% para um microtubo de 1,7mL, em
seguida a amostra ficou em repouso por 10 min. em temperatura ambiente. Após esse
processo, centrifugou-se a amostra em 3000 X g por 30 min., descartou-se o
sobrenadante, adicionou-se 200µL de ETOH 70%, centrifugou-se por mais 2min. em
3000 X g, e em seguida, descartou-se o sobrenadante e o material foi seco em Speed
Vac por 15min. Finalmente o material foi ressuspenso em 10µL de formamida e
transferido para microplaca do Seqüenciador e desnaturado em 95°C por 5min.
As seqüências foram contrastadas com seqüências depositadas no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),
por
meio
do
Blastn,
em
busca
de
seqüências
semelhantes.
3.5.4 Análise dos Polimorfismos pela utilização de ARDRA
A reação de clivagem do rDNA foi realizada por meio da digestão dos fragmentos
de rDNA, utilizando-se a enzima Hinf I. A mistura de digestão apresentou um volume de
46
11µl, sendo composta por 7µl do produto de amplificação da região ITS1–5.8S–ITS2 do
rDNA; 3 unidades da enzima de restrição e 1X de tampão da enzima. O volume foi
completado com água MilliQ autoclavada. A reação de ARDRA foi incubada à 37°C por
3,0h. Após a clivagem, a separação dos fragmentos foi realizado por eletroforese em
gel de agarose 2,4% juntamente com marcador molecular 100pb (Invitrogen) em
eletroforese a 100V. Após isto, o gel de eletroforese foi corado em solução de brometo
de etídio (1,0 µg/ml) durante 20 minutos, as bandas foram visualizadas em
transluminador de luz UV e o gel foi, então, fotografado e os fragmentos de restrição
gerados foram analisados e agrupados segundo o pradrão de bandas apresentado em
haplótipos.
3.6 Experimentos de Antagonismo in vitro
Foram utilizados nos ensaios de antagonismo os fungos fitopatogênicos:
Fusarium sp, agente causal de fusariose em videiras, procedente da coleção da
EMBRAPA Uva e Vinho, e Fusarium oxysporum, isolado de cana-de-açúcar, cedido
pelo laboratório de genética de microrganismos da Esalq.
Os fungos endofíticos isolados e os fungos fitopatogênicos foram cultivados em
placas contendo meio BDA. Em seguida, em outra placa contendo meio BDA, foi
inoculado centralmente um círculo de 0,8mm de diâmetro de micélio do fungo
fitopatogênico, e distante 40mm do centro; nas extremidades diametrais, foram
inoculados círculos de 0,6mm de micélio de dois fungos endofíticos isolados para que
fossem analisadas as reações de antagonismo. Placas de controle foram preparadas
apenas com o inóculo central de Fusarium, quando o crescimento da colônia nas placas
de controle atingiram a borda da placa, os testes de antagonismo foram avaliados.
47
3.6.1 Leveduras isoladas e Controle biológico
Os testes de antagonismo de leveduras endofíticas contra os respectivos
patógenos foram realizados em placas contendo meio BDA. Um disco de cultura do
fungo fitopatogênico crescido em meio de cultura sólido foi colocado centralmente e em
dois lados da placa foi inoculada a levedura, fazendo-se uma estria com alça de platina
contendo um inóculo da levedura. O controle foi feito em triplicata, com placas contendo
apenas o fungo fitopatogênico inoculado centralmente, após o crescimento do Fusarium
ter atingido a borda das placas de controle, as placas do teste de antagonismo foram
avaliadas, o experimento foi mantido em estufa climatizada a 28 C.
3.7 Análise dos Dados
3.7.1 Análise da Variabilidade Genética
Os dados de ARDRA foram utilizados para a avaliação da variabilidade genética,
onde foram realizados agrupamentos das amostras que apresentaram o mesmo
padrão de bandas, denominados haplótipos, resultantes da clivagem da região ITS15,8S-ITS2 com a enzima de restrição HinfI.
3.7.2 Construção da Árvore Filogenética
48
A árvore filogenética foi construída com base na região ITS1-5,8S-ITS2 do
agregado de genes de rDNA obtida no seqüenciamento. Para o alinhamento das
seqüências, foi utilizado o programa Clustal X 1.8. (Thompson et al., 1997). Em
seguida, as seqüências tiveram suas extremidades cortadas afim que todas
apresentassem mesmo número de caracteres; essa edição foi realizada com o
programa BioEdit v5.0.9 copyright (c) 1997-2001, Tom Hall, North Carolina State
University. Finalmente a árvore foi construída utilizando o programa Phylogenetic
Analysis Using Parsimony PAUP* 4.0 b10, considerando máxima parcimônia.
3.7.3 Análise estatística
Para a análise dos dados de isolamento microbiano, foi calculada a freqüência de
isolamento (FI) ao final de cada isolamento para avaliar o número de fragmentos que
apresentaram crescimento microbiano em relação ao número total de fragmentos
vegetais avaliados.
FI= N° de fragmentos foliares com crescimento fúngico
N° total de fragmentos foliares
A população relativa (Pr) foi calculada pela razão entre o número de indivíduos da
espécie e o número total de isolados.
Os dados brutos de pluviosidade acumulada diária em mm foram utilizados
fazendo-se a partir da média dos 15 dias que antecederam a coleta, e temperatura
média no dia de coleta.
49
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolamento de Fungos Associados a Niagara Rosada
Nas placas de controle em que alíquotas de H2O da última etapa de desinfecção
superficial foram semeadas sobre meio BDA, não ocorreu, em qualquer dos testes,
crescimento de microrganismos, o que indica que a comunidade epifítica foi eliminada
com eficácia, sendo que os fungos isolados eram seguramente endofíticos.
A metodologia empregada possibilitou isolar aproximadamente 120 fungos
endofíticos de tecidos foliares de Niagara Rosada. A freqüência de isolamento (FI)
destes fungos foi avaliada em cinco épocas diferentes de coleta para verificar o número
de fragmentos que apresentaram crescimento microbiano em relação ao número total
de fragmentos vegetais avaliados. Os valores obtidos da freqüência de isolamento,
foram altos, acima de 0.70, em todos os isolamentos.
Foi possível verificar que o método de Castellani, utilizado para conservar os
fungos isolados, foi mais eficiente em relação ao método do meio inclinado. Além de
manter os isolados viáveis por um período mais longo, o método de Castellani permitiu
reduzir a perda de isolados por contaminação, em comparação ao método do tubo com
meio inclinado.
Dados de temperatura e pluviosidade nas épocas de coleta foram fornecidos
pelo DAEE-CTH para o Município de Salesópolis (prefixo: E2-054); altitude 700m;
latitude 23°32’; longitude 45°51’, região onde as coletas foram realizadas. A análise dos
dados de freqüência de isolamento comparados aos dados de temperatura média nos
meses de coleta indicou que houve influência significativa da temperatura sobre a
ocorrência de fungos nas folhas de Niagara Rosada, sendo observada uma prevalência
de fungos endofíticos isolados nas coletas em que as temperaturas foram mais altas.
Isto sugere que a temperatura exerce influência sobre o desenvolvimento desses
microrganismos. Vale salientar que a discrepância observada no período de outubro de
2004, onde a segunda mais alta temperatura registrada refletiu em uma frequência de
50
isolamento menor, pode ter sido devida às os cilações de temperatura ocorridas em tal
período, provocadas pelas chegadas de frentes frias que por vezes, reduziram de forma
significativa a temperatura tipicamente alta para a época em questão. Essas oscilações
podem ter sido responsáveis pela reduzida freqüência de isolamento observada. A
figura 3 mostra as freqüências de isolamento obtidas e as respectivas temperaturas
médias no local onde as folhas foram coletadas.
A pluviosidade também exerce influência positiva sobre a freqüência de isolados
(Figura 4), porém de forma mais discreta, se comparada à influência térmica. A
pluviosidade atua na evapotranspiração da planta, interferindo no fluxo hídrico do
hospedeiro, porém, sem alterar de forma drástica as condições internas dos tecidos
vegetais. A temperatura, por sua vez, é capaz de alterar diretamente as condições
internas e também, o fluxo hídrico do interior do hospedeiro. As figuras 3 e 4
apresentam, em outubro, uma freqüência de isolamento muito baixa e que não
representam a situação real devido às
frentes frias intercalando-se a dias de
temperaturas altas, conforme comentado anteriormente. É provável que esses fatores
conjuntamente tenham contribuído com as diferenças encontradas nas comunidades
endofíticas e suas freqüências de isolamento. Porém deve se ter em mente, que esta
forma de análise é limitada, no sentido de que apenas uma pequena parcela
(aproximadamente 5%) dos fungos endofíticos podem ser cultivados em condições de
laboratório. Assim, estes estudos devem ser complementados com técnicas que
permitam a detecção de fungos não cultiváveis, tais como: DGGE e Metagenômica, que
permitiriam também, avaliar a influência de fatores abióticos sobre esta comunidade.
Os fungos isolados de tecidos foliares de Niagara Rosada foram microcultivados
e identificados pela morfologia de estruturas reprodutivas, como pode ser observado na
figura 5. A população relativa de cada gênero foi calculada e é apresentada na figura 6,
onde foram incluídos, também, gêneros identificados por técnicas moleculares,
representantes de grupos que não desenvolveram estruturas reprodutivas in vitro, não
sendo possível sua identificação pela técnica morfológica.
51
Temperatura Média (°C)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
Freqüência de
Isolamento (F.I.)
Temperatura °C
Freqüência de Isolamento (F.I.)
0
jul/04
ago/04
out/04
dez/04
mar/05
Meses de coleta
Figura 3. Relação entre Freqüência de Isolamento (F.I.) e Temperatura; dados de
temperatura local fornecidos pelo DAEE durante as coletas.
Pluviosidade média (mm)
Pluviosidade Média (mm)
16
1,2
14
1
12
0,8
10
8
0,6
6
0,4
4
0,2
2
0
Freqüência de Isolamento (F.I.)
Freqüência de Isolamento (F.I.)
0
jul/04
ago/04
out/04
dez/04
mar/05
Meses de Coleta
Figura:4 . Relação entre Freqüência de Isolamento e Pluviosidade; média da
pluviosidade dos 15 dias que antecederam a coleta, dados de pluviosidade
fornecidos pelo DAEE -CTH.
52
A . Colletotrichum sp.
B . Penicillium sp.
C . Alternaria sp.
D . Nigrospora sp.
E . Cladosporium sp
F . Scopulariopsis sp.
G. Micélio estéril
Figura 5: Estruturas Fúngicas; fotos de estruturas reprodutivas observadas ao microscópio ótico
em aumento de 400x e 1000x.
53
Colletotrichum sp.
Guignardia sp.
Diaporthe sp.
Nigrospora sp.
Pestalotiopsis sp.
Epicoccum sp.
Scopulariopsis sp.
Rhizoctonia sp.
Aspergillus sp.
Penicillium sp.
Paraphaeosphaeria sp.
Alternaria sp.
Preussia sp.
Fonsecea sp.
0
0,25
0,5
0,75
1
Figura 6: População Relativa de Fungos Isolados; População relativa de fungos que compõem a
comunidade de fungos endofíticos associados a Niagara Rosada, 14 gêneros foram identificados.
4.2 Análise da Diversidade dos Fungos Endofíticos Isolados de
Niagara Rosada
O protocolo utilizado para a extração de DNA fúngico proporcionou bom
rendimento e DNA de boa qualidade, bem como sua amplifi cação por PCR. e a
54
aplicação de ARDRA ao produto amplificado para as análises de diversidade e de
identificação molecular dos fungos endofíticos.
A análise de polimorfismos gerados pela aplicação de ARDRA foi utilizada com o
objetivo de se obter uma caracterização mais precisa da diversidade dos fungos
endofíticos associados a Niagara Rosada (Vitis labrusca). Foram selecionadas
aleatoriamente 60 fungos endofíticos, cujas regiões ITS1-5.8S-ITS2 do agregado
gênico do rDNA foram amplificadas pela utilização dos iniciadores ITS1 e ITS4, onde
fragmentos com cerca de 600-700pb foram gerados. A clivagem destes fragmentos com
a enzima de restrição HinfI gerou 15 diferentes perfis eletroforéticos os quais foram
denominados haplótipos (tabela 2), sugerindo que é grande a diversidade de fungos
endofíticos associados as folhas de Niagara Rosada. A Figura 7 apresenta um exemplo
das bandas resultantes da aplicação de ARDRA para 19 amostras de fungos
endofíticos, evidenciando a grande diversidade de haplótipos. A tabela 2 e figura 9
evidenciam o predomínio dos fungos pertencentes aos haplótipos H2, com 17 isolados;
H3, com 8 isolados de diferentes morfologias; e H5, com 13 isolados. Os haplótipos 2 e
5 tiveram a maior parte de seus isolados pertencentes ao gênero Colletotrichum, sendo
provavelmente espécies diversas, pois apresentam diferentes padrões eletroforéticos.
Devido a ausência de estruturas reprodutivas ou outras estruturas que pudessem
identificar o isolado, fungos dos haplótipos H3, H9, H10 e H11, foram identificados por
meio de seqüenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA e comparação com
seqüências depositadas no GeneBank por meio do BLASTn como: Diaporthe helianthi,
Guignardia
mangiferae,
Paraphaerosphaeria
pilleata
e
Preussia
africana,
respectivamente, na Tabela 2 é possível verificar o método utilizado para identificar os
isolados.
55
600pb
300pb
100pb
Figura 7: Gel de ARDRA; as seqüências de 19 amostras de
fungos endofíticos foram clivadas com a enzima de restrição HinfI.
A maioria dos gêneros isolados das folhas de Niagara Rosada são citadas como
fitopatogênicas, inclusive para a viticultura. Estes microrganismos isolados podem
habitar em equilíbrio, vivendo endofíticamente nos tecidos da videira. Colletotrichum é
fitopatogênico em diversas culturas, causando doenças como a podridão da uva
madura causada pelo C. gloeosporioides e também tem sido isolado endofíticamente
de diversas plantas, tais como: Glyicine max (Mendes et al., 2001); Citrus (Araújo et al.,
2001); Himanthus sucuuba (Magalhães, 2000). Dos fungos associados a Niagara
Rosada, este foi o gênero com maior porcentagem de isolados.
Outros gêneros isolados tais como Nigrospora são conhecidos por serem
decompositores de plantas, e amplamente distribuídos em solo. O gênero Nigrospora,
também é comumente encontrado como saprófita em sementes de um grande número
de hospedeiros, sendo que também já foi isolado habitando endofiticamente diversas
plantas.
Espécies do gênero Guignardia são citadas como os agentes da podridão da
videira e da doença “mancha negra” nas culturas de citros (Glienke-Blanco, 1999).
Colletotrichum, Nigrospora e Guignardia foram isolados de plantas sadias neste
trabalho, indicando que estes gêneros podem habitar endofíticamente Vitis labrusca L.
(Niagara Rosada).
56
Tabela 2- Haplótipos gerados pela aplicação de ARDRA. Sessenta e um fungos endofíticos isolados
foram submetidos à técnica de ARDRA gerando 15 padrões eletroforéticos distintos denominados
haplótipos, os fungos são divididos segundo o haplótipo a que pertencem e as amostras identificadas
apresentam o método pelo qual foram identificadas.
Haplótipos
Isolados
Identificação
Tipo
Identificação
H1
2F8
Sem identificação
-
4F5
Colletotrichum
boninense
Molecular
4F2
Alternaria sp.
Morfológica
3F19, 2F3, 4F12, 5F16, 3F22, 4F16, 4F20, 4F18, 3F23, 4F28, 3F11,
5F14, 5F11, 5F15, 5F8
Colletotrichum sp.
Morfológica
3F2
Diaporthe helianthi
Molecular
3F24, 4F21, 4F19, 3F16
Sem identificação
-
1F10
Rhizoctonia sp.
Morfológica
3F13, 4F9, 4F7, 3F7, 4F22, 1F7, 1F15, 3F4, 4F2, 3F20, 1F5, 2F15
Colletotrichum sp.
Morfológica
1F8
Nigrospora sp.
Morfológica
2F7
Colletotrichum sp.
Morfológica
H6
3F9
Sem identificação
-
H7
3F12, 4F11, 5F9
Sem identificação
-
H8
3F17
Sem identificação
-
3F6, 5F6
Guignardia mangiferae
Molecular
3F21
Sem identificação
-
4F27
Paraphaeosphaeria
pilleata
Molecular
3F18
Preussia africana
Molecular
1F12, 1F16, 1F14, 1F6, 1F4,
Epicoccum sp.
Morfológica
2F26
Sem identificação
-
1F13
Pestalotiopsis sp.
Morfológica
4F24, 4F4, 4F23
Sem identificação
-
5F12
Nigrospora sp.
Morfológica
5F7
Sem identificação
-
1F2
Sem identificação
-
H2
H3
H4
H5
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
57
3F18
4F27
3F6
5F6
4F5
3F2
Figura 8 – Árvore Filogenética; contruída com as seqüências ITS1-5.8S -ITS2 do rDNA, mostra a
relação entre fungos endofíticos de Niagara Rosada
Porcentagem
30%
20%
10%
0%
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
Haplótipos
Figura 9- Porcentagens de Isolados por Haplótipo; 15 haplótipos foram obtidos pela análise de
ARDRA a partir de 61 isolados.
H15
58
4.3 Potencial dos Fungos Endofíticos Associados a Videira em
Antagonizar Fusarium in vitro
Das amostras de isolados endofíticos testadas contra as espécies de Fusarium
sp. e Fusarium oxysporum, a porcentagem de inibição positiva foi idêntica para as duas
(79%). A figura 10 apresenta os resultados das reações de antagonismo e critérios
adotados para quantificar a inibição ao Fusarium.
Das amostras utilizadas nos testes de antagonismo 20,5% foram identificadas
como Colletotrichum sp., Como as plantas amostradas não apresentavam sintomas de
doença, o Colletotrichum sp estava vivendo endofíticamente sem causar danos a planta
podendo inclusive estar sendo de algum modo benéfico para a videira; o Fusarium sp. é
responsável pela fusariose em videiras, podendo levar a planta à morte. Dentre os
fungos endofíticos isolados, nenhuma amostra foi identificada como pertencendo ao
gênero Fusarium . É possível que a comunidade fúngica endofítica proteja a planta
contra Fusarium.
A utilização de isolados de Fusarium não patogênicos foram eficazes no
biocontrole de isolados patogênicos deste fungo, Fravel et al, (2003), porém várias
espécies de Fusarium são conhecidas pela produção de toxinas, fato que talvez possa
inviabilizar sua utilização para o biocontrole pelo risco de contaminação por estas
toxinas.
59
I.
II.
III.
IV.
V.
VI
Figura 10: Interações entre fungos endofíticos e F. oxysporum. I e II as setas indicam formação de halo
de inibição *(+++) ; III e IV setas indicam inibição forte, mas sem formação de halo *(++); V, setas
indicam a competição entre F. oxysporum e isolados endofíticos *(+); e em VI, setas mostram que não
ocorreu nenhuma inibição do Fusarium *(-).
*Indicação utilizada para representar o grau de inibição na tabela 2.
60
Tabela 3: Antagonismo ao Fusarium, e fungos identificados
Identificação
Isolados
Produção * de
pigmento
Antagonismo
F. oxysporum
Fusarium sp.
P
P
0
Colletotrichum sp.
P
P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Guignardia sp.
P
0
Nigrospora sp.
0
0
0
Penicillium sp.
0
Rhizoctonia sp.
P
Scopulariopsis sp.
P
Não identificados
P
0
0
0
0
0
0
0
P
0
0
* 0= sem pigmento; * P= com pigmento.Os pigmentos foram caracterizados por uma coloração
intensa do meio de cultura, produzidos pela colônia fúngica.
Aspergillus sp.
2F24
2F6
4F5
2F15
4F14
4F3
5F17
2F10
2F17
2F18
2F3
2F4
2F5
3F15
3F19
2F23
3F1
2F11
3F3
4F19
2F14
2F25
2F12
2F19
2F2
2F20
2F22
2F26
2F8
3F5
5F1
5F13
5F3
5F4
5F5
+
+
+
+
+
+
++
++
+
++
+
++
+
+
++
+
+
++
++
+
+
+
+
+
++
++
+
+
+
++
++
+
+
+
+
+
++
+
+
+
++
_
+
+
+
_
++
+
_
++
+
++
+
+
+
++
++
A.
B.
Figura 11: Produção de Pigmento. Em A,seta indica produção de pigmento
em meio sólido pelo fungo Aspergillus sp. amostra 2F6; em B. meio de cultura
líquido apresentando coloração por pigmentos produzidos pelos fungos:
Penicillium sp. 2F14 e Epicoccum sp.1F6.
61
Porcentagem das reações
80
70
60
não inibe
inibe
inibe fortemente
50
40
30
20
10
0
Fusarium oxysporum
Fusarium sp.
Figura 12- Reação de Antagonismo de Colletotrichum endofítico; resultados
dos testes de antagonismo do Colletotrichum sp. ao Fusarium sp. e Fusarium
oxysporum.
A Figura 12 mostra as porcentagens da reação de antagonismo exibidas nos
testes de antagonismo do Colletotrichum sp. ao Fusarium sp e Fusarium oxysporum,
onde nota-se que Colletotrichum sp. antagonizou a espécie Fusarium sp. e a
porcentagem de amostras não inibidas foi menor que os resultados dos testes com
Fusarium oxysporum. No entanto, a porcentagem de amostras fortemente inibidas foi
maior nos experimentos com Fusarium oxysporum.
Dentre as amostras utilizadas nos testes de antagonismo, foi interessante
observar que as amostras de Colletotrichum pertencentes ao haplótipo 2 não inibiram
Fusarium sp e nem Fusarium oxysporum (tabela 3). A Tabela 3 apresenta resultados
obtidos nos testes de antagonismo para as amostras analisadas (identificadas), bem
como destaca as amostras de fungos que produzem algum tipo de pigmento no meio
de cultura durante seu cultivo. A amostra 2F2 inibiu fortemente tanto Fusarium
oxysporum como Fusarium sp. (videira), sendo possível que a produção deste pigmento
seja responsável pela reação de inibição. Os outros fungos ensaiados que produzem
pigmentos não apresentaram resultados relevantes no antagonismo ao Fusarium,
62
sugerindo que estes pigmentos possivelmente não apresentam propriedades
antimicrobianas (Figura.11).
4.3.1 Teste de Antagonismo de Levedura Endofítica ao Fusarium
Foi possível notar que o crescimento de Fusarium spp foi menor quando
colocado próximo à levedura, evid enciando uma discreta competição entre a levedura e
as duas espécies de Fusarium analisadas, sendo mais realçada a reação contra
Fusarium oxysporum. Leveduras competem com outros microrganismos sem produzir
antibióticos sendo isto uma vantagem para sua utilização no controle biológico de frutas
que são consumidas in natura. A comunidade fúngica endofítica de Vitis labrusca L.
variedade Niagara Rosada apresenta uma grande diversidade genética sendo
composta por espécies dos gêneros Colletotrichum, Nigrospora, Aspergillus, Alternaria,
Rhizoctonia, Guignardia,
Fonsecaea,
Scopulariopsis, Pestalotiopsis, Diaporthe,
Preussia, e Paraphaeosphaeria, sendo Colletotrichum o gênero predominante.
A temperatura e pluviosidade influenciam diretamente sobre a freqüência de
isolamento de fungos endofíticos.
Fungos fitopatogênicos para outras culturas podem habitar endofíticamente
Niagara Rosada (Vitis labrusca).
Vários dos fungos endofíticos associados à Niagara Rosada têm a capacidade
de inibir o crescimento de Fusarium sp e F. oxysporum, sugerindo que sua comunidade
fúngica endofítica está equilibradamente envolvida na proteção da planta hospedeira,
auxiliando-a no controle de doenças fúngicas.
63
5 CONCLUSÕES
A comunidade fúngica endofítica de Vitis labrusca L. variedade Niagara Rosada
apresenta uma grande diversidade genética sendo composta por espécies dos gêneros
Colletotrichum , Nigrospora, Aspergillus, Alternaria, Rhizoctonia, Guignardia, Fonsecaea,
Scopulariopsis, Pestalotiopsis, Diaporthe, Preussia, e Paraphaeosphaeria, sendo
Colletotrichum o gênero predominante.
A temperatura e pluviosidade influenciam diretamente sobre a freqüência de
isolamento de fungos endofíticos.
Fungos fitopatogênicos para outras culturas podem habitar endofíticamente
Niagara Rosada (Vitis labrusca).
Vários dos fungos endofíticos associados à Niagara Rosada têm a capacidade
de inibir o crescimento de Fusarium sp e F. oxysporum, sugerindo que sua comunidade
fúngica endofítica está equilibradamente envolvida na proteção da planta hospedeira,
auxiliando-a no controle de doenças fúngicas.
64
REFERÊNCIAS
AGRIOS, G.N.; Plant Pathology, 3. ed. New York: Academic Press, 1988.
ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C.W.; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. 4. ed.
New York: Wiley & Sons, 1996.
ALLEN T.W.; BURPEE L.L.; BUCK J.W. In: vitro attachment of phylloplane yeasts to
Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, and Sclerotinia homoeocarpa. Canadian
Journal Microbiology, v. 50, p. 1041-1048, 2004.
ALMEIDA, C. V.; YARA, R.; ALMEIDA, M. Fungos Endofíticos Isolados de Ápices
caulinares de Pupunheira Cultivada in vivo e in vitro. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v. 40, p. 467-470, 2005.
ARAÚJO, W. L.; MACCHERONI, W. J.; AGUILAR-VILDOSO, C. I.; BARROSO, P. A. V.
SARIDAKIS, H. O.; AZEVEDO, J. L.Variability and interactions between endophytic
bactéria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal
microbiology, v. 47, p. 229-236, 2001.
ARAÚJO, W. L.; LIMA, A. O. S.; AZEVEDO, J. L.; MARCON, J.; KUKLINSKY SOBRAL,
J.; LACAVA, P. T. Manual isolamento de microrganismos endofíticos.
Piracicaba: CALQ, 2002.
ARNOLD, A. E.; MEJÍA, L. C.; KYLLO, D.; ROJAS, E. I.; MAYMARD, Z.; ROBBINS, N.;
HERRE, E. A. Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree.
Proceedings of the National Academy of Sciences. Washington, v. 26, p. 1564915654, 2003.
AZEVEDO , J. L. Microrganismos endofíticos. In: Melo, I. S.; AZEVEDO , J. L.
(Coords.). Ecologia Microbiana. Jaguariúna: ed. EMBRAPA CNPMA, p. 117-138,
1998 a.
AZEVEDO, J. L. Biodiversidade microbiana e potencial biotecnológico. In: Melo, I.
S.; Azevedo, J. L., (Coords.). Ecologia microbiana Jaguariúna: ed. Embrapa,
CNPMA, p. 445-461, 1998 b.
65
AZEVEDO, J. L. Botânica: uma ciência básica ou aplicada? Revista brasileira de
Botânica, São Paulo, v. 22, p. 225-229, 1999.
AZEVEDO, J. L. Endophytic fungi and their roles in tropical plants. Progress In
Microbial Ecology, p. 279-287, 2001.
AZEVEDO, J. L.; MACCHERONI, W. J.; ARAÚJO, W. L.; PEREIRA, J. O.
Microrganismos Endofíticos e seu Papel em Plantas Tropicais In: SERAFINI, L.
A.; BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L.; (Coords.) Biotecnologia: Avanços na
Agricultura e na Agroindústria; Cap.9, Coleção Biotecnologia, Caxias do Sul:
Educs., p. 233–269, 2002.
AZEVEDO, J. L.; SERAFINI, L.A.; BARROS, N. M. Biotecnologia: Avanços na
Agricultura e na Agroindústria; Coleção Biotecnologia, Caxias do Sul: Educs., p.
433 p., 2002.
AZEVEDO, J.L. & W.L. ARAÚJO. Diversity and Applications of Endophytic Fungi
Isolated from Tropical Plants. In: GANGULI, B. N.; DESHMUKH, S. K. (Eds).
Fungi: Multifaceted Microbes, New Delhi, India: Anamaya Publishers, 2006.
BACON, C. W.; WHITE, J. F. Microbial endophytes. Marcel Dekker Inc., New York,
N.Y. 487 p., 2000.
BAILEY, J. K.; DECKERT, R.; SCHWEITZER, J. A.; REHILL, B. J.; LINDROTH, R. L.;
GEHRING, C.; WHITHAM, T. G. Host plant genetics affect hidden ecological players:
links among Populus, condensed tannins, and fungal endophyte infection. Canadian
Journal Microbiology, v. 83, p. 356-361, 2005.
BARNETT, H.L. & HUNTER, B.B. Illustrated genera of imperfect fungi. 3. ed.
Minneapolis: Burgess Publishing Company, 241 p. 1972.
BARROS, I. A.; Isolamento e biodiversidade de bactérias endofíticas de Dicksonia
Sellowiana e seu potencial biotecnológico. Tese de Mestrado, Mogi das Cruzes:
Universidade de Mogi das Cruzes, 2003.
BARY, A. Morfologie und physiologie der Pilze, Flecheten und Myxomyceten v.2,
Engelman, Leipzig, 316p.1866
66
BÉLANGER, R. R.; LABBÉ, C.; JARVIS, W. R. Comercial-scala control of rose powdery
mildew with a fungal antagonist. Plant disease, v. 78, p. 420-424, 1998.
BRENCIC, A.; WINANS, S. C. Detection of and response to signals involved in hostmicrobe interactions by plant-associated bacteria. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, v. 1, p. 155-94, 2005.
CARROLL, G. The biology of endophytism in plants with particular reference to
woody perennials. In: Microbiolgy of the phylloplane. FOKKEMA, N. J.; VAN DER
HEAVEL, J. (edts). London, UK: Cambridge University Press, p. 205-222, 1986.
CARROLL, G. C. Fungal Endophytes in stems and leaves: from latent pathogen to
mutualistic simbiotic. Ecology, v. 69, p. 2-9, 1988.
CARROLL , G. C. Forest Endophytes: pattern and process. Canadian Journal of
Botany, v.73, p. 1316-1324. 1995.
CARROLL, G. C. The foraging ascomycete. Abstracts, XVI International Botanical
Congress, St. Louis, p. 309, 1999.
CARROLL, G. C.; WICKLOW, D. T. The fungal community: its organization and role
in the ecosystem. 2. ed. Marcel Dekker, New York, 1024 p., 1992.
CASTELLANI, A. Viability of Mold Culture of Fungi in Distilled Water. Journal of
Tropical Medicine and Hygiene, v. 42, p. 225-226,1939.
CATO, S. C.; Efeito do anelamento e de doses de ácido giberélico na frutificação das
uvas Niagara Rosada e Venus nas regiões noroeste e da alta paulista do Estado de
São Paulo. Tese de Mestrado, Piracicaba: Escola Superior de Agicultura Luiz de
Queiroz, 112 p., 2002.
CHERFAS, J. Disappearing Mushrooms: Another Mass Extinction? Science, v. 254, p.
1458,1991.
CLAYDON, N.; GROVE, J. F.; POPLE, M. Elm bark beetle boring and feeding deterrents
from Phomopsis oblonga. Phytochemistry, v. 24, p. 937-943,1985.
67
COHEN, S. D. Endophytic-host selectivity of Discula umbrinella on Quercus alba and
Quercus rubra characterized by infection pathogenicity and mycelial compatibility.
European jo urnal of Plant Pathology, v. 110, p. 713-721, 2004.
COLOMBO, P.M. Occurrence of endophytic bacteria in Siphonous algae. Phycologia,
v.17, p.148-151, 1978
DURÁN, E. L.; PLOPER, L. D.; RAMALHO, J. C.; PICCOLO GRANDI, R. A.; HUPPER
GIANCOLI, A. C.; AZEVEDO, J. L. The foliar fungal endophytes of Citrus limon in
Argentina. Canadian Journal of Botany, v. 83, p. 350-355, 2005.
FISHER, P. J.; PETRINI, O.; SCOTT, H. M. L. The distribuition of some fungal an
bacterial endophytes in maize (Zea mays L.). New Phytologist, v. 122. p. 299-305,
1992.
FRAVEL, D.; OLIVAIN, C.; ALABOUVETTE, C. Fusarium oxysporum and its biocontrole.
New phytologist, v. 157, p. 493-502, 2003.
FUNGARO, M. H. P. PCR na Micologia–Diagnóstico e Análise de Variabilidade.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v.14, p. 12–16, 2001.
FUNK, C. R.; HALISKY, P. M.; JOHNSOS, M. C.; SIEGEL, M. R.; STEWART. A. V.;
AHMAD, S.; HURLEY, R. H.; HARVEY, I. C. An endophytic fungus and
resistance to sod webworms: association in Lolium perenne. Bio/Technology, v.
1, p. 189 -191,1983.
GARDES, M.; BRUNS, T. D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes:
application to the identification of mycorrhiza and rusts. Molecular Ecology, v. 2, p.
113-118, 1993.
GARRIDO, L. R.; SONEGO, O. R.; GOMES, V. N. Fungi associated with grapevine
showing decline and plant death in the state of Rio Grande do Sul, Southern Brazil.
Fitopatologia brasileira. v. 29, p. 322-324, 2004.
GHILARDI, A. A.; MAIA, M. L. Tecnologia, custo de produção e rentabilidade do cultivo
de uva Niagara no Estado de São Paulo. Informações Econômicas. Revista
Brasileira de Fruticultura , v. 31, p. 48-64, 2001.
68
GLIENKE-BLANCO, C. Guignardia citricarpa Kiely: Análise genética cariotípica e
interação com o hospedeiro. Tese de Doutorado, Piracicaba: Escola Superior de
Agicultura Luiz de Queiroz, 200 p., 1999.
HALLMANN, J.; QUADT-HALLMANN, A.; MAHAFEE, W. F.; OEPPER, J. W. Bacterial
Endophytes In: Agricultural Crops. Canadian Journal of Microbiology, v. 43, p.
895-914,1997.
HAWKSWORTH, D. L. The Fungal Dimension of Biodiversity: Magnitude, significance,
and Conservation. Mycological Research, v. 95, p. 641-655, 1991.
HEDRICK, U.P. The grapes of New York. Albany, J.B. Lyon, 584 p., 1908.
KENDRICK, W. B.; CARMICHAEL, J. W. Hyphomycetes.; The Fungi. An advanced
treatise. In: AINSWORTH, G. C.; SPARROW, F. K.; SUSSMAN, A. S. (eds.). New
York: Academic Press, v. 4, p. 323-509, 1973.
KUKLINSKY-SOBRAL, J.; ARAÚJO, W. L.; MENDES, R.; PIZZIRANI-KLEINER, A.;
AZEVEDO, J. L. Isolation and characterization of endophytic bacteria from
soybean (Glycine max) grown in soil treated with glyphosate herbicide. Plant and
Soil, v. 273, p. 91-99, 2005.
KULDAU, G. A.; YATES, I. E. Evidence for Fusarium endophytes in cultivated and
wild plants. In: Microbial Endophytes. BACON,.C. W.; WHITE, J. F. (eds), New
York: Marcel Dekker, p.85-120, 2000.
LARENA, I.; SALAZAR, O.; GONZÁLEZ, V.; JULIÁN, M. C.; RUBIO, V. Design of a
primer for ribosomal DNA internal transcribed spacer with enhanced specificity for
ascomycetes. Journal Biotechnology, v. 75, p. 187 194, 1999.
LARRAN, S.; PERELLÓ, A.; SIMÓN, M. R.; MORENO, V. Isolation and analysis of
endophytic microorganisms in wheat (Triticum aestivum L.) leaves. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, v. 18,p. 683-686, 2002.
LAZAROVITS, G.; NOWAK, J. Rhizobacteria for improvement of plant growth and
establishment. Horticultural Science, v. 32, p. 188-192, 1997.
69
LEONG, J. Siderophores: their biochemistry and possible role the biocontrol of plant
pathogens. Annual Review of Phytopathology, v. 24, p. 187-209, 1986.
LERECLUS, D.; DELECLUSE, A.; LECADET, M. M. Diversity of Bacillus
thuringiensis toxins and genes. In: ENTWISTLE, P. F.; CORY, J. S.; BALEY, M. J.
& HIGGS, S. (Coords.) Bacillus thuringiensis an environmental biopesticide: theory
and pratice. J. Wiley & Sons, p. 37–70, 1993.
Le ROUX, C. N. Mode of action of Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus toxins.
In: Simpósio de Controle Biológico. Foz do Iguaçu, Resumos, EMBRAPA, p. 264269, 1996.
MAGALHÃES, A. A. S. Isolamento e variabilidade genética detectada por RAPD do
fungo endofítico Guignardia sp. de Himatanthus sucuuba Spruce (Wood)
Apocynaceae. Tese de mestrado, Manaus: FUA/UFSCAR, 130 p., 2000.
MAKI, C. S.; Diversidade e potencial biotecnológico de fungos endofíticos de cacau
(Theobroma cacao L.). Tese de Doutorado, Piracicaba: Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, 128 p., 2006.
MARTINS, M. K. Variabilidade genética de isolados de Fusarium spp. e estudo da
interação com a planta hospedeira. Tese de Doutorado, Piracicaba: Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, 110 p., 2005.
MELO, I. S.; AZEVEDO,J. L. Controle Biológico. 1. Ed. Jaguariúna: EMBRAPA MEIO
AMBIENTE; v. 2, 308 p., 2000.
MELO, I. S. Recursos Genéticos e Melhoramento de Microrganismos. Jaguariúna,
EMBRAPA Meio Ambiente, v. 1., 743 p., 2002.
MENDES, R.; KUKLINSKY-SOBRAL, J.; GERALDI, I. O.; ARAUJO, W. L.; AZEVEDO,
J. L.; PIZZIRANI-KLEINER, A. A.; Monitoring soybean endophytic fungal community
associated with glyphosate. In: XXI Congresso Brasileiro de Microbiologia, Foz do
Iguaçu. Sociedade Brasileira de Microbiologia, São Paulo, Brasil, 242 p., 2001.
MISAGHI, I. J.; DONNDELINGER, C. R. Endophytic bacteria in symptom-free cotton
plants. Phytopathology, v. 80, p. 808-811,1990.
70
NCBI, National Center for Biotechnology Information; Gene Bank . Disponível em:
(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/genebank/index.html). Acesso em:10 março, 2006.
NEILANDS, J. B. Iron absorption and transport in microorganisms. Annual Review of
Nutrition, v. 1, p. 27-46, 1981.
NOWAK, J. Benefits of in vitro “biotization” of plant tissue cultures with microbial
inoculants. In vitro Plant, v. 34, p. 122–130, 1998.
PEREIRA, J. O.; AZEVEDO, J. L.; PETRINI, O. Endophytic Fungi of Stylosanthes: a first
report. Mycologia, v. 85, p. 362-364, 1993.
PETRINI, O. Fungal endophytes of tree leaves; Microbial ecology of leaves.
ANDREWS,J.; HIRANO, S. S.(Eds.),New York: Spring-Verlag, p. 179-197, 1991.
PETRINI, O. Ecological and physiological aspects of host specificity in endophytic
fungi. In Endophytic Fungi in Grasses and Wood Plants (S. C. Redlin & L. M. Carris
eds), St Paul,MN.: American Phythopatological Society Press, p. 87–100, 1996.
RODRIGUEZ, R. J.; REDMAN, R. S.; HENSON, J. M. The Role of Fungal Symbioses in
the Adaptation of Plants to High Stress Environments. Mitigation and Adaptation
Strategies for Global Change , v. 9, p. 261-272, 2004.
ROHLF F. L. J. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, NTSYS -PC.
New York: Exeter Publishing, 1998.
RUBINI, M. R.; SILVA-RIBEIRO, R. T.; POMELLA, A. W. V.; MAKI, C. S.; ARAÚJO, W.
L.; SANTOS, D. R.; AZEVEDO, J. L. Diversity of endophytic fungal community of
cacao (Theobroma cacao L.) and biological control of Crinipellis perniciosa, causal
agent of Witches' Broom Disease. International Journal of Biological Sciences, v.
1, p. 24–33, 2005.
SCHULZ, B.; BOYLE, C. The Endophytic Continuum. Review, Cambridge University
Press, v. 109, p. 661-686, 2005.
SELOSSE, M. A.; BAUDOIN, E.; VANDENKOORNHUYSE, P. Symbiotic
microorganisms, a Key for ecological success and protection of plants. Article
Comptes Rendus Biologies, v. 327, p. 639-648, 2004.
71
SESSITSCH, A.; REITER, B.; BERG, G. Endophytic bacterial communities of fieldgrown potato plants and their plant-growth-promoting and antagonistic abilities;
Canadian Journal Microbiology, v. 50, p. 239-249, 2004.
SÔNEGO, O. R.; BOTTON, M.; MAIA, J. D. G.; GARRIDO, L. R. Doenças e pragas.
In.: Maia, J. D. G.; Kuhn, G. B. (Eds.). Cultivo da Niágara rosada em áreas tropicais
do Brasil. Bento Gonçalves, Embrapa Uva e Vinho, p. 45-63, 2001.
SOUZA, A. Q. L.; ASTOLFI FILHO, A. D. L. Atividade antimicrobiana de fungos
endofíticos isolados de plantas tóxicas da amazônia: Palicourea longiflora (aubl.)
rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amazonica, v. 34, p. 185-195, 2004.
SOUSA, J. S. I. Uvas para o Brasil. 2.ed. Piracicaba: FEALQ, 791 p., 1996.
SOUSA, J. S. I.; MARTINS, F. P. Viticultura brasileira : principais variedades e
suas características. Piracicaba: FEALQ, 368 p., 2002.
STIERLE, A., STROBEL, G. A.; STIERLE, D. Taxol and taxane production by
Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific Yew. Science, v. 260, p.
214-216. 1993.
STONE, J. K., BACON, C. W.; WHITE, J. F. An overview of endophytic microbes:
endophytism defined. In Microbial Endophytes. BACON, C. W.; WHITE, J. F.
(Eds), New York:Marcel Dekker, p. 3 –30, 2000.
STROBEL, G. A.; DAISY, B. Bioprospecting for microbial Endophytes and their Natural
Products. American Society of Microbiology News, Review, v. 67, p. 491-502,
2003.
STROBEL, G. A.; LONG, D. M. Endophytic microbes embody pharmaceutical potential.
American Society of Microbiology News, v. 64, p. 263-268, 1998.
TAN, R. X.; ZOU, W. X. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Natural
Product Reports, v. 18, p. 448-459, 2001.
72
THOMAS , P. Isolation of Bacillus pumilus from in vitro grapes as a long-term alcoholsurviving and rhizogenesis inducing covert endophyte. Journal of Applied
Microbiology, v. 97, p. 114–123, 2004.
THOMPSON, J. D.; GIBSON, T. J.; PLEWNIAK, F.; JEANMOUGIN, F. E.; HIGGINS, D.
G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence
alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, v. 24, p. 48764882,1997.
THRANE, U. Grouping Fusarium section Discolor isolates by statistical analysis of
quantitative high performance liquid chromatographic data on secondary metabolite
production. Journal Microbiologic Methods, v. 12, p. 23-39, 1990.
TUDZYNSKI, B.; SHARON, A. Biosynthesis, biological role and application of fungal
hormones. In: The Mycota X: Industrial Applications. OSIEWACZ, H. D. (Ed.),
Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, p. 183-211, 2002.
VARMA, A.; SUDHA, S.; FRANKEN, P. Piriformospora indica-a cultivable plant growth
promoting root endophyte with similarities to arbuscular mycorrhizal fungi. Applied
and Environmental Microbiology, v. 65, p. 2741-2744, 1999.
VALDEBENITO-SANHUEZA, R. M. Leveduras para o Biocontrole de Fitopatógenos. In:
MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L.; (Coords.); Controle Biológico; v. 3, p. 41-55, 2000.
VILAS-BÔAS, G. T.; VILAS-BÔAS, L. A.; ARANTES, O. M. N. Bacillus thurigiensis:
Estratégias no Controle Biológico. In: AZEVEDO, J. L.; SERAFINI, L.A.; BARROS,
N. M., (Coord.) Biotecnologia: Avanços na Agricultura e na Agroindústria,
Cap.9, Coleção Biotecnologia, Caxias do Sul: Educs, p. 269–294, 2002.
WAGNER, B. L.; LEWIS, L. C. Colonization of corn, Zea mays, by the
entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana. Applied and Enviromental.
Microbiology, v. 66, p. 3468-3473, 2000.
WEBER, J. A natural control of Dutch elm disease. London: Nature, v. 292, p.449-451,
1981.
WHITE, T. J.; BRUNS, T. D.; LEE, S.; TAYLOR, J. Analysis of phylogenetic
relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes.
73
In PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. INNIS, M.A.,
GELFAND, D.H., SNINSKY, J.J.; WHITE, T.J. (Eds). New York: Academic Press, p.
315 322, 1990.
WILSON, C. L.; WISNIEWSKI, M. E.; Mc LAUGHLIN, R.; CHALUTZ, E.; DROBY, S.
Biological control of postharvest diseases of fruits : alternatives to synthetic
fungicides. Crop Protection, v. 10, p. 172-177, 1991.
WISNIEWSKI, M.; BILES, C.; DROBY. The use of yeast Pichia guilliermondii as a
biocontrol agent; Characterisation of attachment to Botrytis cinerea. In:
WILSON, C. L.; CHALUTZ, E. (Eds). Biological control of post harvest diseases of
fruits and vegetables, Workshop Proceedings. (S.L): USDA, Agricultural Research
Service. 394 p., 1991.
ZHOU, D.; HYDE, K. Host-specificity, host-exclusivity and host-recurrence in saprobic
fungi. Mycological Reseach, v. 105, p. 1449- 457, 2001.
74
ANEXOS
75
ANEXO A
Seqüências Fasta
76
Amostra:4F5
NGGTTTTTTTTGAANNCCGCTCTNTTNCCTTTGTGAACATACCTACAACTGTTGCTT
CGGCGGGTAGGCCGTCCCCTGAAAAGGACGCCTCCCGGCCCGGACCGGACCCCC
CGCGGGACCGGACCCGGCGCCCGCCGGAGAGATAACCAAACTCTATTGTAACGAC
GTTTCTTCTGAGTGGCATAAGCAAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGG
TTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAT
TCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGC
ATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCTCTAC
NGTCGACGTAAGCCCTCAAAAGTAGTGGCGGACCCTNCCNGANCCTNCTTTGCGT
AGTAACATTTCGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCAA
TTTTCNAANGTTGACTNNGATNANGTAGAATACCCGCTGACTTAACCTNTAATAACG
GGNGAA
Amostra: 3F18
GGNTTTTTTTNGTAACGCTTCGGCCTTGTCGAGNAANAACCCTTGCCTTTTTGAGTA
CCTTTTCGTTTCCTCGGCAGGCTCGCCTGCCAATGGGGACCCCAACAAACACTTTG
CAGTACCTGTAAACAGTCTGAACAAACTTTTAAAAATTAAAACTTTCAACAACGGATC
TCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTG
CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCTT
AAGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTGAAACCTTCAAGCTCANCTTGGTGTTGGGTG
ACTGTCCGCTTGCGGACTCGCCTCAAATGATTGGCGGNCGGTACTTTTGGCTTNGA
GCGCANCAAAAACCCGAACTCGANGCCTGTGTGCTGGCTNCCAAAANCTATCTTCA
AATTTTTGACNCCGNTCAGNTNGGATCCCCGNTGACTNAGCTTTNAATANCGGGNG
AA
Amostra: 3F6
GGTTTTTNTGAAACTAACAACTTTTTTGAAANGTNCCAGAGTANGCGCTACAACGCC
GAAATGACNTTCTCACCCTTGTGTACTCACTATGTTGCTTTGGCAGAGGTCGACCT
GGTTCCGACCCAGAGCGAGCCGGCGCCCCCAGCCTTAACTGGCCAGAGACGCCC
GGCTAAGTGCCCGCCAGTATACAAAACTCAAGAATTCATTTTGTGAAGTCCTGATAT
ATCATTTAATTGATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA
TCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTNGTATTCCGGAAGGCATGCCTGTTCGAGCGT
CATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTATTNGGCAACGTCCGCTGCCNGACGTGCN
TTGAANACCTTNGCGACNGNGTNCTAACCTTGAGCGTATNNTAAAATTCTNNCTTTG
AATGCTGGGCNANNGNCCNCNGAAAATTNACNTTGGTNTNTTTTNCAAGNTGACCN
NGATNAGGTNNGATCCCCNTGAACTTAACNTTTNATAGNGGGGG
Amostra 4F27
GGNTTTTTATTCCATCTCCAACCAGGTGNGGTCGCGGCCTCTGGGCTAACCCAGGT
GGTTTCGCGCCGCATTCCTGCATCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGG
CGGGGCAACCTGCCGCTGGAACTTAACAAAACCTTTTTTTGCATCTAGCATTACCT
GTTCTGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATC
GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC
ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTC
GAGCGTNATCTACACCCTNAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTNTGTCCCCCCTNTG
CGCGCGGACTCGCCCCAAATTCATTGGCAGCGGTNTTTGCCTNCTNTTGCGCAAC
77
AAATTGCNTTTGCAANGGGCGTGNCCCNNNTCCNAAANCAAATTACCGTTTTNACC
TNGAATANGTAGGGANCCCNCTGAATTTAACCTNTAATANCGGGGGNAA
Amostra: 3F2
NGGNTTTTTNCTGGAACGCGCTTCGNTTCACCCAGAAAACCCTTTGTGAACTTATAC
CTATCTGTTGCCTCNGCGCAGGCCGGCTTCTTCACTGAAGCCCCCTGGAGACAGA
GGGAGCAGCCCGCCGGCGGCCAACTAAACTCTTGTTTCTACAGTGAATCTCTGAGT
AAAAAACATAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT
GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCNNGAAGGCATGCCTGTTCGA
GCGTCATTTTAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATNGGGCACTGCCTGTAAAANGGC
ANGCCCTGAAATCTAGTGGCNAGCTCGCCANGACCCCGAGCGTANTAGTTNNTCT
CNCTTTGNAAGCCCTGNNGNNCCNNCCGTNAACCCCAACTTTTNAANTTNACCTNG
GNTAGGTNNNATNCCCNTNAACTTAACNTTTATTAGNGGNGG
Amostra:5F6
GAGTTTTTTACTGAACGTAACAACTTTTATTGAAAGGTTCCAGAGTAGGCGCTACAA
CGCCGAAATGACCTTCTCACCCTTGTGTACTCACTATGTTGCTTTGGCGGGTCGAC
CTGGTTCCGACCCAGAGCGGCCGGCGCCCCCAGCCTTAACTGGCCAGGACGCCC
GGCTAAGTGCCCGCCAGTATACAAAACTCAAGAATTCATTTTGTGAAGTCCTGATAT
ATCATTTAATTGATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA
TCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTNGTATTCCGGAAGGCATGCCTGTTTCGAGCG
TNATTTNAACCCTNAAGCTCTGCTTGGTNTTNGGCAACGTCCGNTGCCGGACGTGC
CTTGAAAACNTGGGGACNGNGTNCTAACCTTGANCGTNTNNTAAAATTNTNGCTTT
NAATGCTGGGCAANGGCCCCNGAAAATNAANCTTGGNTTNTTTTNCAAGGTNACCT
NGNNTAGGNNGGNATCCCNNTNACTTNANCTTTTATTAGCGGGGGNA
78
ANEXO B
Dados de Pluviosidade (fonte: DAEE-CTH):
79