Êpen
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE CÉLULAS DE CARCINOMA
MAMÁRIO HUMANO T47D APÓS TRANSDUÇÃO COM
ANTI-SENSE PARA A PROTEÍNA CARREADORA DE
CÁLCIO S100P
BETTINA BEiSSEL
Dissertação apresentada como parte
dos requisitos para obtenção do Grau
de Mestre em Ciências na Area de
Tecnologia Nuclear - Aplicações.
Orientadora:
Ora. Maria Helena Bellini
São Paulo
2005
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E N U C L E A R E S
Autarquia a s s o c i a d a à Universidade de São Paulo
Avaliação funcional de células de carcinoma mamário
humano T47D após transdução com Anti-sense para a
proteína carreadora de cálcio S100P
Bettina Beíssel
Dissertação apresentada como parte
dos requisitos para obtenção do Grau
de IVIestre em Ciências na Área de
Tecnologia Nuclear - Aplicações.
Orientadora:
Dra. Maria Helena Beilini
S ã o Paulo
2005
Prece de São Francisco de Assis
Ó Senhor!
Faze de mim um instrumento da Tua Paz:
Onde há ódio, faze que eu leve o Amor;
Onde há ofensa, que eu leve o Perdão;
Onde há discórdia, que eu leve a União;
Onde há dúvidas, que leve a Fé;
Onde há erros, que eu leve a Verdade;
Onde há desespero, que eu leve a
Esperança;
Onde há tristeza, que eu leve a alegria;
Onde há trevas, que eu leve a luz.
Ó mestre! Faze que eu procure menos
Ser consolado, do que consolar;
Ser compreendido, do que compreender;
Ser amado, do que amar...
Pois:
É dando, que se recebe.
É perdoando, que se é perdoado.
É morrendo, que se vive para a vida eterna.
Tradução de Manuel Bandeira
Dedicatoria
Dedico este trabalho ao Luiz Paulo, por
toda paciência, a m o r e c o m p r e e n s ã o e
aos nossos mais preciosos tesouros:
Sofia e Mathias...
Dedicatória
e à minha IVIãe, que sempre acreditou
nos m e u s s o n h o s !
iv
Agradecimentos
Agradecimentos
Gostaria de agradecer i m e n s a m e n t e a todos aqueles que participaram
da elaboração deste trabalho, direta ou indiretamente, possibilitando assim que
ele pudesse ser concluído. Foram muitas pessoas especiais c o m as quais convivi
e aprendi muito.
Á Dra. Maria Helena Beilini, doutora pela U N I F E S P e pesquisadora do
IPEN que me orientou neste trabalho, dividindo seu conhecimento e d a n d o - m e a
oportunidade de c o n h e c e r o m u n d o da pesquisa.
Ao
Prof.
Dr.
Ismael
Dale Cotrim
Guerreiro da Silva, d o c e n t e
Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo -
do
Escola
Paulista de Medicina ( U N I F E S P - E P M ) por ter aberto as portas de seu laboratório
e m e acolhido s e m p r e pronto para ensinar e colaborar.
A o Prof. Dr. Néstor Schor, Professor Titular da disciplina de Nefrologia
da U N I F E S P - E P M e P r ó - R e i t o r d e P ó s - G r a d u a ç ã o e Pesquisa da U N I F E S P - E P M ,
que possibilitou a realização de vários experimentos ao permitir que utilizasse seu
laboratório.
Ao
Dr. J o ã o
Bosco
Pesqueiro, do
Departamento
de Biofísica
da
U N I F E S P - E P M , por ter possibilitado a realização da parte de biologia celular,
permitindo que utilizasse o seu laboratório.
Á
Dra.
Regina
Affonso
pelo
apoio
imensurável,
pelo
incentivo
e
principalmente pela a m i z a d e sincera.
Ao IPEN e ao C N P q pela c o n c e s s ã o de recursos financeiros.
À Naiara, Cristina, AIdrey, Fabíola, Tatiana, Márcio, Paulo, A n a Maria,
e todas as pessoas felizes e a m i g a s do laboratório, de Ginecologia Molecular da
UNIFESP-EPM.
Agradecimentos
vi
A o Alberto, à Regiane, ao Marcelo, aos técnicos do laboratório e a
t o d o s os d e m a i s que f a z e m o u fizeram parte do grupo do Dr. J o ã o Bosco pelo
g r a n d e apoio e ensinamentos.
À Dra. Maria Mitzie Brentani Docente do D e p a r t a m e n t o de Radiologia
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, por ter-nos cedido as
células T 4 7 D e à toda sua equipe que s e m p r e esteve disposta a nos auxiliar e m
nossas dúvidas e m relação à cultura celular.
À s amigas
Enia Coutinho e Michelly França
Piccoli pelo apoio
e
amizade.
A o Dr. Vicente de Paulo Castro Teixeira, Doutor e m medicina, da
disciplina de Nefrologia da U N I F E S P - E P M pelo apoio constante.
A o Dr. Esper G e o r g e s Kallás e grupo do Laboratório de Imunologia da
U N I F E S P - E P M pelo uso do citômetro de fluxo e à Dra. Maria Aparecida Daiboni
do laboratório de Nefrologia pelo e n s i n a m e n t o da técnica de citometria.
À
Dra.
Soraya
Soubhi
Smaili
docente
do
Departamento
Farmacologia, setor de Modo de A ç ã o de Drogas pelo uso do
de
microscópio
confocal assim c o m o às técnicas do aparelho.
À Dra. Olga Z a z u k o do IPEN pelo uso da sala de cultura e eterna
simpatia.
À Dra. Mônica Mathor do IPEN e grupo por ter cedido material e pelo
apoio constante.
E a todo o grupo do laboratório de Nefrologia que m e acolheu e me
ajudou muito, principalmente ao Marcos Antonio C e n e d i z e pelo apoio e n o r m e no
que se refere ao uso do P C R e m t e m p o real.
Resumo
vii
A v a l i a ç ã o funcional de células de c a r c i n o m a m a m á r i o h u m a n o T 4 7 D após
t r a n s d u ç ã o c o m Anti-sense para a proteína carreadora de cálcio S 1 0 0 P
Bettina Beissel
RESUMO
A proteína 81 OOP é um membro da familia carreadora de cálcio 3100 e foi
isolada, primeiramente, de placenta humana por Emoto e cois., em 1992. Vários estudos
apresentaram fortes indícios sobre o seu envolvimento em processos neoplásicos, porém
ainda não se conhece sua real função biológica. No tecido mamário, a 81 OOP foi
detectada
em carcinomas
invasivos
de células ductals. Sua
presença em
altas
concentrações nestas células foi considerada um forte indicativo de progressão tumoral in
vivo,
e acredita-se que ela tenha um importante papel na imortalização de células
epiteliais mamárias in vitro. Neste trabalho descrevemos a construção do vetor retroviral
pLXSN com o gene da proteína 81 OOP em sentido anti-sense, a transdução deste gene
para células de carcinoma mamário T47D e o estudo destas células após a transdução.
Para este estudo, utilizamos primeiramente a técnica de PCR em tempo real para a
quantificação da expressão gênica. Os resultados demonstraram uma redução de 63%
da expressão
dos clones T47D8100P-A/S
em
relação à expressão
dos
clones
T47DLX8N controle. Realizamos então, ensaio de imunofiuorescência em Microscópio
confocal para avaliar a técnica anti-sense em relação à expressão proteica. Nas imagens
notamos uma marcação do anticorpo da proteína S I OOP bem menos pronunciada nas
células T47DS100P-A/8 em relação às células controle. Encerramos o trabalho com
ensaios de citometria de fluxo para avaliar uma eventual alteração no ciclo celular. Os
resultados mostraram que o grupo controle apresentou uma média de 34,04% das
células na fase 8 do ciclo celular enquanto que o grupo das células transduzidas
apresentou uma média de 26,40% na mesma fase. Houve, portanto uma redução de 23%
de células na fase 8 entre o grupo de células controle e das que receberam o vetor
retroviral com anti-sense. Estes resultados demonstraram que a técnica de anti-sense foi
eficiente para diminuir a expressão gênica e proteica da proteína carreadora de cálcio
81 OOP em células T47D, confirmando ser esta uma interessante ferramenta nos estudos
de expressão gênica, além de sugerir a continuidade dos estudos com estes clones em
ensaios in vivo.
Resumo
vii
A v a l i a ç ã o funcional de células de c a r c i n o m a m a m á r i o h u m a n o T 4 7 D após
t r a n s d u ç ã o c o m Anti-sense para a proteína carreadora de cálcio S 1 0 0 P
Bettina Beissel
RESUMO
A proteína 81 OOP é um membro da familia carreadora de cálcio 8100 e foi
isolada, primeiramente, de placenta humana por Emoto e cois., em 1992. Vários estudos
apresentaram fortes indícios sobre o seu envolvimento em processos neoplásicos, porém
ainda não se conhece sua real função biológica. No tecido mamário, a 81 OOP foi
detectada
em carcinomas
invasivos
de células ductals. 8ua
presença em
altas
concentrações nestas células foi considerada um forte indicativo de progressão tumoral in
vivo,
e acredita-se que ela tenha um importante papel na imortalização de células
epiteliais mamárias in vitro. Neste trabalho descrevemos a construção do vetor retroviral
pLXSN com o gene da proteína 81 OOP em sentido anti-sense, a transdução deste gene
para células de carcinoma mamário T47D e o estudo destas células após a transdução.
Para este estudo, utilizamos primeiramente a técnica de PCR em tempo real para a
quantificação da expressão gênica. Os resultados demonstraram uma redução de 63%
da expressão
dos clones T47D8100P-A/8
em
relação à expressão
dos
clones
T47DLX8N controle. Realizamos então, ensaio de imunofiuorescência em Microscópio
confocal para avaliar a técnica anti-sense em relação à expressão proteica. Nas imagens
notamos uma marcação do anticorpo da proteína 81 OOP bem menos pronunciada nas
células T47DS100P-A/8 em relação às células controle. Encerramos o trabalho com
ensaios de citometria de fluxo para avaliar uma eventual alteração no ciclo celular. Os
resultados mostraram que o grupo controle apresentou uma média de 34,04% das
células na fase 8 do ciclo celular enquanto que o grupo das células transduzidas
apresentou uma média de 26,40% na mesma fase. Houve, portanto uma redução de 23%
de células na fase 8 entre o grupo de células controle e das que receberam o vetor
retroviral com anti-sense. Estes resultados demonstraram que a técnica de anti-sense foi
eficiente para diminuir a expressão gênica e proteica da proteína carreadora de cálcio
81 OOP em células T47D, confirmando ser esta uma interessante ferramenta nos estudos
de expressão gênica, além de sugerir a continuidade dos estudos com estes clones em
ensaios in vivo.
Abstract
viii
Functional evaluation of h u m a n breast c a n c e r cell line T 4 7 D after anti-sense
transduction w i t h S 1 0 0 P c a l c i u m - b i n d i n g protein.
Bettina Beissel
ABSTRACT
S 1 0 0 P is a m e m b e r of the S 1 0 0 EF-hand calcium binding protein family
and w a s first purified from h u m a n placenta by Emoto and colleagues (1992).
There is considerable evidence that S I OOP is involved in neoplastic processes,
but t h e real function and effect of this molecule are still u n k n o w n . In breast tissue,
S I OOP has been detected in ductal invasive carcinoma. Its presence in high
concentration
in these
cells
was
considered
a
strong
indication
of
tumor
progression in vivo and it is believed that S I OOP might play an important role in
the immortalisation of h u m a n breast epithelial cells in vitro.
In this study w e
describe the construction of the retroviral vector p L X S N with the S 1 0 0 P g e n e in
antisense orientation, the introduction of this g e n e into T 4 7 D cells and the study of
this cells after transduction. First w e used the real time P C R technique to quantify
the g e n e expression. T h e results s h o w a reduction of 6 3 % of expression within the
T 4 7 D S 1 0 0 P - A / S infected population c o m p a r e d with control T 4 7 D L X S N clones. To
determine the impact of the S I OOP antisense technique o n protein expression in
T 4 7 D cells, w e performed i m m u n o f l u o r e s c e n c e staining and analysed the resulting
images using a confocal microscope. T h e i m a g e s s h o w e d m u c h less pronounced
antibody marking of the S I OOP protein in the T 4 7 D S 1 0 0 P - A / S cells c o m p a r e d with
control cells. To evaluate whether the antisense a p p r o a c h could c a u s e
any
alteration in t h e cell cycle, w e finished the study with flow cytomethc analysis of
the cell distribution. This cell cycle analysis confirmed a reduction of 2 3 % in the Sphase fraction of the T 4 7 D S 1 0 0 P - A / S cell group c o m p a r e d with control group.
T h e s e results s h o w that the antisense m e t h o d o l o g y w a s efficient in decreasing
expression of the S I OOP g e n e and protein levels in T 4 7 D cells in vitro and suggest
that these clones should be used for in vivo studies.
Sumário
ix
SUMARIO
Página
1.
ÍNTRODUÇÀO
1
1.1
Carreadores de Cálcio
1
1.2
Família S I 00
2
1.3
S100P
8
1.4
C â n c e r de m a m a
11
1.5
Técnica anti-sense
13
2.
OBJETIVOS DO TRABALHO
16
3
MATERIAIS E MÉTODOS
17
3.1
MATERIAIS
17
3.1.1
Equipamentos e acessórios principais
17
3.1.2
Principais reagentes
19
3.1.3
Principais reagentes utilizados para biologia molecular
20
3.1.4
Principais reagentes para cultura celular
21
3.1.5
Oligonucleotídeos
21
3.1.6
Vetor Retroviral
22
3.1.7
Linhagens celulares
24
3.1.7.1
Fibroblastos NIH-3T3
24
3.1.7.2
Fibroblastos G P + E 8 6
24
3.1.7.3
Fibroblastos G P + e n v + A m 1 2
24
3.1.7.4
Células T 4 7 D
24
3.2
MÉTODOS
25
3.2.1
Construção do vetor retroviral
25
3.2.1.1
Obtenção do c D N A da S I OOP
25
3.2.1.2
S e q ü ê n c i a m e n t o da S 1 0 0 P
25
3.2.1.3
Construção de Oligonucleotídeos
26
3.2.1.4
Amplificação do c D N A da S1 OOP pelo método de P C R
27
3.2.1.5
Extração do Produto de P C R
27
3.2.1.6
Preparação do vetor p L X S N
28
CCMSSÃO l#iTOML Dfc" mñ&A MÜCLhA.R/SP-iPEi^
Sumário
3.2.1.7
3.2.2
x
Ligação da S I OOP ao vetor retroviral p L X S N
28
T r a n s f o r m a ç ã o e m bactérias c o m p e t e n t e s D H 5 a
28
3.2.3 Amplificação dos p l a s m i d e o s
29
3.2.4
Extração e purificação dos plasmideos L S 1 0 0 P S N - Mini Prep
29
3.2.5
Análise de Restrição
30
3.2.6
Preparação das células de e m p a c o t a m e n t o
30
3.2.7
Transfecção transiente e m células G P + E 8 6 c o m cloreto de cálcio
30
3.2.8
Infecção p e r m a n e n t e
31
3.2.9
Titulação
32
3.2.10 Cultura de células d e carcinoma m a m á r i o T 4 7 D
34
3.2.111nfecção d a s células T 4 7 D
34
3.2.12 Extração d e R N A d a s células T 4 7 D
35
3.2.13 Análise da pureza do RNA por eletroforese
35
3 . 2 . 1 4 O b t e n ç ã o d e c D N A pelo método d e transcrição reversa
36
3.2.15 Reação d e polimerização em cadeia e m t e m p o real ( P C R em t e m p o real)37
3.2.16 Ensaio de Imunofluorescência e m Microscopia Confocal
38
3 . 2 . 1 7 Ensaio d e Citometria d e Fluxo
39
4
40
4.1
Resultados
Seqüênciamento
40
4.2
Obtenção do c D N A da S I OOP
41
4.2.1
Amplificação pela técnica de P C R
41
4.2.2
Preparação do c D N A da S I OOP para o vetor p L X S N
41
4.3
Preparação do vetor p L X S N
42
4.4
Ligação do c D N A da proteína S I OOP ao vetor retroviral p L X S N
43
4.5
Análise de restrição
44
4.6
Preparação das células de e m p a c o t a m e n t o Fibroblastos G P + E 8 6
45
4.6.1
Transfecção Transiente e Infecção permanente
45
4.7
Título
viral
apresentado
pelas
células
anfotroficas
para
os
clones
A m i 2 L S 1 OOPSN-anti-sense
46
4.8
Cultura de células d e carcinoma ductal mamário T 4 7 D
48
4.9
Infecção d a s células de carcinoma mamário T 4 7 D
48
4.10
Obtenção d e RNA
50
4.10.1 Extração d e RNA d o s clones T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S e T 4 7 D L X S N
50
Abstract
xi
4.10.2 Eletroforese para avaliar a qualidade do R N A
51
4.11
52
Amplificação e quantificação do c D N A
4.11.1 Reação e m cadeia da Polimerase e m t e m p o real
52
4.11.2 Gel de agarose para confirmação do produto de P C R e m tempo real
56
4.12
Microscopia confocal
57
4.13
Ensaio de citometria de fluxo
59
5
DISCUSSÃO
63
6
CONCLUSÕES
71
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
Lista de Tabelas
xii
Lista de T a b e l a s
Página
Tabela 4.1 Título viral apresentado pelas células anfotroficas A m 1 2 L S 1 0 0 P S N Anti-sense
Tabela 4.2 Título viral apresentado pelas células anfotroficas A m 1 2 L X S N
47
47
Tabela 4.3 Rendimento da extração de RNA total de células T 4 7 D a p ó s o
processo de extração c o m trizol
51
Tabela 4.4 Relação de expressão adquirida a partir das médias dos C T ' s
55
Tabela 4.5 Distribuição das células no ciclo celular, valores estão expressos e m
porcentagem e c o r r e s p o n d e m à média e erro padrão dos resultados de 4 ensaios
e m duplicata
61
Lista de Figuras
xiii
Lista de Figuras
Página
Figura 1.1 Representação esquemática da estrutura secundária da proteína S I 00,
que apresenta os dois domínios EF de ligação ao cálcio (DonatOo, 2001 )
3
Figura 1.2 Desenho da mão EF
3
Figura 1.3 Representação e s q u e m á t i c a do rearranjo de um d í m e r o de proteína
S100 a p ó s a ligação ao ion cálcio
5
Figura 1.4 Representação esquemática das vias de ação intra e extracelulares
das proteínas S I 0 0 (Marenholz I. e cois., 2004)
6
Figura 1.5 E s q u e m a da técnica de anti-sense
14
Figura 3.1 Vetor retroviral p L X S N c o m seus elementos principais:
23
Figura 3.2 E s q u e m a da Transfecção transiente e m linhagem ecotrófica
32
Figura 3.3 E s q u e m a da titulação e m células NIH-3T3
33
Figura 4.1 E s q u e m a da amplificação por PCR
41
Figura 4.2 Gel de agarose 1 % , c o m a representação do f r a g m e n t o do c D N A da
S I OOP, utilizado para a construção do vetor L S 1 0 0 P S N
42
Figura 4.3 Gel de agarose 1 % , c o m a representação do f r a g m e n t o do vetor
p L X S N , utilizado para a construção do vetor L S 1 0 0 P S N
42
Figura 4.4 E s q u e m a da construção do vetor L S I OOPSN-anti-sense
43
Figura 4.5 Desenho da análise de restrição c o m a enzima Saci
44
Figura 4.6 Gel de agarose 1 %
45
Figura 4.7 Clone A m 1 2 L S 1 0 0 P S N - a n t i - s e n s e - 6 corado c o m R o d a m i n a B
46
Figura 4.8 Célula T 4 7 D e m cultura
48
Figura 4.9 Célula T 4 7 D infectada c o m o Clone A m 1 2 L S 1 0 0 P S N anti-sense/4, 7
dias a p ó s o inicio da seleção c o m G 4 1 8
49
Figura 4.10 Células T 4 7 D s e m vetor L X S N , a p ó s 7 dias de seleção c o m o
antibiótico G-418
Figura
4.11
ribossomais
Gel
50
de
agarose
com
MOPS
apresentando
as
subunidades
28S e 18S
e d e m o n s t r a n d o a integridade e a excelente qualidade do R N A extraído
cmss^f) HKiümL Dt" EmmA NUCLEAR/SP-ÍPEÑ
51
51
Lista de Figuras
Figura
4.12
Gráfico
obtido
em
um
dos
ensaios
de
PCR
em
tempo
apresentando o padrão de expressão da ciclofilina A e m todos os clones
Figura
4.13
Gráfico
obtido
em
um
dos
ensaios
de
PCR
em
tempo
xiv
real
53
real
apresentando o padrão de expressão da SlOOP.em todas as amostras
em
triplicata
53
Figura
4.14
Gráfico
obtido
em
um
dos
ensaios
de
PCR
em
apresentando o padrão de expressão das células T 4 7 D - L X S N
tempo
real
para o g e n e
endógeno e para o g e n e da S I OOP
54
Figura 4.15 Gráfico de P C R e m t e m p o real apresentando a expressão do Clone
T47DLS100PSN-A/S 4
54
Figura 4.16 Gráfico d e m o n s t r a n d o a relação de expressão obtida e m P C R e m
tempo real
56
Figura 4.17 Ge! de agarose 1,5% c o m produto do P C R e m t e m p o real
57
Figura 4.19 Gráfico gerado pelo programa ModFit c o m a representação das fases
do ciclo celular
60
Figura 4.20 Gráfico gerado pelo programa ModFit c o m a representação das fases
do ciclo celular do clone T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S 4 de acordo c o m a quantidade de
DNA marcado
60
Figura 4.21 Histograma d e m o n s t r a n d o a distribuição de fases de ciclo celular das
células T 4 7 D - L X S N e do clone T 4 7 D - L X S N - A / S 4. Resultados expressos c o m o
média ± E P
62
Introdução
1
1.1
1
INTRODUÇÃO
C a r r e a d o r e s de Cálcio
U m a das mais difundidas vias de sinalização intracelular está baseada
no uso de s e g u n d o s mensageiros, assim c o m o o cálcio, que é um s e g u n d o
mensageiro
extremamente
comum
e versátil
e
que
controla
uma
grande
variedade de processos celulares.
Desde o início da vida, este íon está envolvido e m processos vitais,
c o m o mediador da fertilização e regulador de alguns dos processos do ciclo
celular da fase embrionária. Já c o m o s e g u n d o mensageiro, age na transdução
de estímulos extracelulares e m respostas intracelulares (Kirby e cols., 1992;
Muller, A e cols., 1999). U m a propriedade que o torna um mensageiro intracelular
altamente a d e q u a d o é o fato de se ligar f i r m e m e n t e ás proteínas.
O Cálcio intracelular está envolvido no m e c a n i s m o de c o n d u ç ã o e
transmissão
de
impulsos
nervosos, contração
muscular,
motilidade
celular,
secreção, transcrição, apoptose, diferenciação, expressão gênica, e necrose
entre outros (Berridge, 1997; Donato, 2001). Este íon t e m portanto u m importante
papel na regulação do crescimento e diferenciação das células eucariotas, e um
desequilíbrio
em
sua
patológicos,
como
homeostasia
cardiomiopatias,
pode
levar a
hipertensão
uma
e
série de
inclusive
processos
contribuir
na
f o r m a ç ã o tumoral ( H e i z m a n n e B r a u n , 1995).
O nível de cálcio intracelular d e v e ser mantido baixo porque o s esteres
fosfato são muito a b u n d a n t e s e os fosfatos de cálcio são bastante insolúveis, para
isto, todas as células t ê m sistemas de transporte para remoção de cálcio. O nível
citossólico de cálcio e m células não excitadas é de a p r o x i m a d a m e n t e 0,1 p M ,
muitas vezes m e n o r do que a concentração do meio extracelular.
Vários são os m e c a n i s m o s que a t u a m
na homeostasia do
intracelular, e entre eles d e s t a c a m - s e as proteínas carreadoras de cálcio.
cálcio
Introdução
Estas proteínas são as peças chave na transdução da sinalização e
interação do cálcio c o m seus diferentes alvos ( M a n d i n o v a , A, e cols. 1998). Há
um grande número de proteínas carreadoras de cálcio que a t u a m na sinalização
intracelular
e
na
manutenção
da
homeostasia
do
cálcio,
porém
a
maior
representante é a família de proteínas S I 0 0 (Mueller, A. e cols., 1999), parte
importante deste estudo.
1.2
Família S 1 0 0
Os primeiros
m e m b r o s descritos desta família f o r a m as
proteínas
S 1 0 0 B e S 1 0 0 A 1 , isoladas de cérebro de bovinos e d e n o m i n a d a s S100 por serem
solúveis e m u m a solução 1 0 0 % saturada de sulfato de a m ó n i a (Donato, 2001).
A s proteínas carreadoras de cálcio da família S I 0 0 estão envolvidas na
regulação de u m a grande variedade de processos intracelulares e extracelulares.
Entre estes processos estão o crescimento celular, a mobilidade celular, a
regulação do ciclo celular, a transcrição e diferenciação, a regulação de atividades
enzimáticas e a regulação da homeostasia do cálcio ( E n g e l k a m p e cols.,1992;
Pedrocchi e cols., 1994; Donato, 2003). Essa regulação de diferentes processos
celulares é devida á interação c o m diferentes proteínas alvo (Mueller, A. e cols.,
1999) m a s não a p r e s e n t a m ação enzimática conhecida (Zimmer e cols. 2003).
Geralmente, essas proteínas f o r m a m h o m o d i m e r o s ou heterodimeros,
porém t a m b é m já f o r a m descritas f o r m a n d o h e x â m e r o s (Moroz O.V. e cols.,
2002). T o d o s os m e m b r o s p o s s u e m um arranjo estrutural e m c o m u m , c o m d u a s
regiões que a p r e s e n t a m diferentes afinidades pelo cálcio conhecidas por
EF-hand
ou mãos EF.
A t u a l m e n t e , a partir da homología das seqüências de aminoácidos e
outras
propriedades
membros
desta
moleculares,
família, que
está
mais
de
presente
20
proteínas
são
exclusivamente
em
consideradas
vertebrados
(Donato, 2 0 0 1 ; Girolamo, P., 2003).
Dos mais de 2 0 g e n e s h u m a n o s descritos até agora, 16 encontram-se
agrupados no c r o m o s s o m o 1 q 2 1 . Sua estrutura gênica é altamente conservada,
geralmente c o m p r e e n d e n d o três exons e dois introns. Elas p o s s u e m entre 2 2 % e
5 7 % de homología na seqüência de a m i n o á c i d o s e variam entre 79 e
a m i n o á c i d o s (Marehnolz,
114
I. e cols., 2 0 0 4 ; E n g e l k a m p , D . e cols. 1993). São
proteínas de baixa massa molecular variando entre 9 e 13 kDa (Donato, 2003).
Introdução
O que caracteriza esta familia é sua estrutura altamente conservada
f o r m a d a por d u a s regiões que a p r e s e n t a m diferentes afinidades pelo cálcio
conhecidas por EF-hand
ou mãos EF. C a d a região é f o r m a d a por u m a a hélice,
u m a alça de ligação ao cálcio e u m a outra a hélice. Portanto, a maioria destas
proteínas possui dois centros de ligação ao cálcio conforme pode ser visualizado
na figura 1.1. C a d a um d o s centros é f o r m a d o pelas hélices E e F dessa proteína,
que são posicionadas c o m o o d e d o
indicador e o polegar da mão
direita,
f o r m a n d o um ângulo de 9 0 graus (Fig. 1.2), daí a d e n o m i n a ç ã o mão EF. O centro
de ligação ao cálcio é f o r m a d o por u m a alça entre essas hélices.
LI
Hl
L2
H
Híl
H III
HIV
Figura 1.1 Representação esquemática da estrutura secundária da proteína
S I 00, que apresenta os dois domínios EF de ligação ao cálcio (Donato, 2001).
L1 e L2:
H:
HI,HII,HllleHIV:
N:
C:
Figura 1.2 Desenho da mão EF
centros de ligação ao cálcio
alça de ligação dos dois domínios EF
a hélices
região N terminal
região C terminal
Introdução
O modelo de interação entre as proteínas S 1 0 0 e as proteínas alvo ou
receptores de proteínas já foi exaustivamente proposto. Foi d e m o n s t r a d o para
uma série de proteínas S 1 0 0 que, ao se ligarem ao cálcio sua forma apo-inativa,
sofre u m a m u d a n ç a conformacional que expõe importantes resíduos hidrofobicos
ao solvente. De acordo c o m o modelo atual, esse a u m e n t o hidrofóbico leva a
uma m u d a n ç a estrutural da superfície da proteína permitindo a interação c o m a
proteína alvo (Ghbenko,A. e cols. 1998; Girolamo,P., 2003; Z h a n g e cols., 2003).
Portanto,
conformacional,
após
a
tratando-se
ligação
ao
normalmente
Cálcio
de
um
ocorre
rearranjo
uma
da
mudança
hélice
III
(Marenholz, I. e cols., 2004) que e x p õ e m resíduos hidrofóbicos na região da
dobradiça, responsável pela ligação da proteína S 1 0 0 à proteína alvo (Fig. 1.3).
P o r é m , o m o d o de interação c o m os diferentes alvos entre o s distintos m e m b r o s
da família é bem variado (Marenholz, I. e cols., 2004).
Várias
análises
bioquímicas
e
estruturais
demonstraram
que
as
proteínas S100 f o r m a m d í m e r o s e esta d i m e h z a ç ã o parece ser crucial para a
interação da S I 0 0 ao cálcio (Koltzscher e Gerke, 2000). A p e n a s um m e m b r o da
família ocorre na f o r m a de m o n ô m e r o , trata-se de calbindin 3 (Marenholz, I. e
cols., 2004).
Normalmente
são
isolados
na
forma
de
homodimeros,
porém
a
diversidade de suas f u n ç õ e s biológicas provavelmente a u m e n t a pelas f o r m a ç õ e s
de heterodimeros c o m s u b u n i d a d e s de outros m e m b r o s da família S I 0 0 ( W a n g ,
G. e cols., 2004).
Introdução
Sítio de ligação
adaptado de Marenholz e cols. 2004
Figura 1.3 Representação esquemática do rearranjo de u m dímero de proteína
S100 a p ó s a ligação ao íon cálcio.
Em azul claro e azul escuro aparece u m m o n ô m e r o c o m a região de ligação á
proteína alvo e m azul turquesa e o outro m o n ô m e r o aparece e m tons de
vermelho. O cálcio está representado e m amarelo mostrando que cada
subunidade de S 1 0 0 possui dois sítios de ligação ao cálcio. A p ó s a ligação ao
cálcio, as S 1 0 0 e x p õ e m resíduos hidrofóbicos, responsáveis pela ligação á
proteína alvo.
A
região
carboxi-terminal
tem
alta
afinidade
pelo
cálcio,
a p r o x i m a d a m e n t e 100 x superior (Donato, 2003) e m relação à região a m i n o terminal que apresenta baixa afinidade ao cálcio ( H e i z m a n n e Braun, 1995;
Schäfer e H e i z m a n n , 1996).
A região C terminai c o n t é m a seqüência clássica, c o m u m a t o d a s as
proteínas
carreadoras
de
cálcio
EF.
Consiste
em
uma
seqüência
de
12
aminoácidos. Já na região N terminal há uma seqüência diferente da seqüência
típica da EF, porém específica para os m e m b r o s da subfamilia S I 0 0 , consistindo
e m uma seqüência c o m p o s t a por 14 a m i n o á c i d o s (Schäfer e H e i z m a n n , 1996;
Marenholz, I. e cols., 2004).
Introdução
A l é m de f o r m a r e m h o m o d i m e r o s e heterodimeros alguns m e m b r o s da
família t a m b é m f o r m a m estruturas multiméhcas que parecem estar envolvidas
c o m a ação extracelular destas proteínas. A l g u m a s destas f o r m a ç õ e s f o r a m
descritas c o m S 1 0 0 A 1 2 (Moroz, O. V. e cols., 2002), S 1 0 0 A 4 (Novitskaya, V. e
cols., 2000) e S 1 0 0 B (Barger, S. W . e cols., 1992; Huttunen,H. E cols. 2000). Foi
proposto que estas f o r m a ç õ e s d e s e n c a d e i a m a ligação ao receptor
F^GE
(receptor for a d v a n c e d glycation end product o u e m português: receptor para o
produto final glicosilado) que por sua vez ativa a cascata d e
sinalização
intracelular (Fig. 1.4) (Marenholz, I. e cols. 2004).
Figura 1.4 Representação esquemática das vias de ação intra e extracelulares
das proteínas S I 0 0 (Marenholz I. e cols., 2004)
O m e c a n i s m o de sinalização intracelular ativado pelo R A G E ainda não
está c o m p l e t a m e n t e elucidado, mas sabe-se que a ligação ao FíAGE leva a
estimulação de Erk, Jak/Stat e Rho e à ativação do fator de transcrição NF-kp
( A r u m u g a m , T, e cols. 2004) e parece induzir a ativação de C d c 4 2 / R a c e M A P
Quinase (Hsieh, HL e cols. 2004). No caso de células cancerosas, a ativação do
F^GE
foi relacionada
c o m a estimulação
da proliferação, sobrevivência
motilidade celular ( A r u m u g a m , ! . e cols, 2004).
ccMssÃo tmomi DE tm&h ¡M.n.KBj'Sp-í'Pín
e
Introdução
A primeira interação de um m e m b r o da família S100 c o m este receptor
foi relatada por Hoffmann e cols., em 1999, o n d e a ligação da S 1 0 0 A 1 2 c o m o
R A G E sugere estar envolvida e m processos inflamatorios.
A maioria d o s m e m b r o s da família apresenta alta especificidade por
diferentes tecidos, por exemplo, CalbindinS, por células intestinais; S 1 0 0 A 8 e
S 1 0 0 A 9 , células granulomatosas e monócitos; S 1 0 0 A 2 , tecido renal e pulmonar;
S 1 0 0 A 7 , células epiteliais (Girolamo, P., 2003) e S I OOP, pelo tecido m a m á r i o .
O s c o m p o n e n t e s da família S 1 0 0 a p r e s e n t a m diferentes padrões de
expressão nos diversos tecidos h u m a n o s , tanto e m condições normais c o m o e m
patológicas (Gribenko,A.V. e Makhatadze,G.I, 1998). O interesse por essas
proteínas v e m crescendo nos últimos a n o s e m decorrência da sua expressão
diferenciada e m tecidos neoplásicos, m e s m o e m estágios iniciais, e do seu
envolvimento e m processos metastáticos (llg.E.C. e cols., 1996; Gribenko,A.V, e
Makhatadze, G.1,1998; Heizmann,C. 2002).
Alterações nas expressões gênicas de m e m b r o s da família S I 0 0 f o r a m
descritas e m d o e n ç a s c o m o síndromes de D o w n e Alzheimer, inflamação crônica,
fibröse cística, psoríase, epilepsia e cardiomiopatias (van Eldik e Griffin, 1994;
Nacken W . e cols. 2 0 0 3 ; H e i z m a n n , 0 . 2002), bem c o m o uma série de neoplasias
do páncreas, próstata (Cmogorac-Jurcevic,T. e cols. 2003; Amler,L.C. e cols.
2 0 0 0 ; lacobuzio-Donahue,C.A. e cols. 2 0 0 2 ; Sato, N. e cols. 2004) e m a m a (Da
Silva,I.D.C.G. e cols. 2 0 0 0 ; Mackay, A. e cols. 2 0 0 3 ; Emberley,E.D. e cols. 2004).
Já a S 1 0 0 A 2 , foi encontrada pouco expressa e m células tumorais,
sugerindo ser u m a candidata para supressão gênica (Lee e cols., 1992). A
S 1 0 0 A 6 foi encontrada sendo super expressa e m u m a série de tecidos tumorais
(Schäfer,B.W. e H e i z m a n n , C . W . 1996) e a S 1 0 0 A 4 está associada a u m a baixa
taxa de sobrevida e m pacientes c o m câncer de m a m a além de induzir metástases
e m ratos (Rudland,P. e cols. 2000).
Como
nos
últimos
anos
têm-se
descoberto
vários
processos
patológicos relacionados a uma alteração da concentração de cálcio devido a
alterações de expressão de seus carreadores, esses fatos t ê m a u m e n t a d o muito
o interesse científico e m relação a essa classe de proteínas (Mandinova, A. e
cols, 1998; H e i z m a n n , C . W . e Braun,K. 95 ). A tabela 1.1 foi construída a partir de
um trabalho de Schäfer e Heizmann (1996) que correlaciona diferentes m e m b r o s
da
família
S I 00
com
diversas
patologias.
Introdução
8
Tabela 1.1 Correlação de alguns m e m b r o s da família S I 00 c o m patologias.
Proteína
Patologias associadas
S100A1
Cardiomiopatias
S100A2
Câncer de m a m a
S I 00A3
Câncer
S100A4
C â n c e r de m a m a , Metástases
S100A5
Câncer
S100A6
Melanomas
S100A7
Câncer de M a m a
S100A7L1/A15
Psoríase
S100A8
Fibrose cística e processo inflamatório
S100A9
Processos inflamatórios
S100A10
Câncer
S100B
Mal de Alzheimer e síndrome de D o w n
S100P
C â n c e r de m a m a , próstata, pâncreas
Anticorpos
anti-SIOO
vêm
sendo
empregados
em
hospitais
para
classificação do tipo tumoral pela técnica d e imunohistoquímica tanto e m adultos
c o m o e m crianças, incluindo t u m o r e s n e u r o e n d ó c h n o s benignos c o m o malignos,
carcinoma de tireóide, m e l a n o m a e carcinoma renal sendo os principais alvos de
estudo as S 1 0 0 A 1 e S 1 0 0 B (Pedrocchi,M. e cols., 1994; llg,E.C. e cols., 1996).
S e g u n d o Mueller.A. e cols., as proteínas S 1 0 0 provavelmente t ê m u m
papel crucial na regulação da homeostasia do cálcio e m células tumorais.
1.3
S100P
A S I OOP é u m a proteína carreadora de cálcio, pertencente à família
S 1 0 0 , originalmente isolada a partir de placenta h u m a n a (Emoto,Y. e cols., 1992).
Possui 95 aminoácidos, massa molecular de 10,4 kDa, e é o único m e m b r o da
família S I 0 0 cujo g e n e está localizado no c r o m o s o m o 4 p 1 6 (Becker,T. e cols.,
1992).
Até pouco t e m p o , acreditava-se que se apresentava a p e n a s na f o r m a
homodimérica, p o r é m , W a n g , G . e colaboradores, 2004, mostraram que a S I OOP
Introdução
pode f o r m a r h e t e r o d i m e r o s com a S 1 0 0 A 1 . A S 1 0 0 A 1 é uma proteína de 9 3
aminoácidos e apresenta 5 0 % de similaridade c o m a S 1 0 0 P . A m b a s
estão
envolvidas e m diferentes patologias h u m a n a s .
A estrutura molecular da S 1 0 0 P já foi minuciosamente descrita e a
proteína foi cristalizada por Z h a n g e cols., e m 2 0 0 2 , porém ainda não se c o n h e c e
a real f u n ç ã o da S 1 0 0 P . Existem várias e s p e c u l a ç õ e s sobre seu m e c a n i s m o d e
ação dentro d a s células normais, b e m c o m o nas células tumorais. Vários são o s
estudos q u e levam a considerações muito fori:es sobre a participação da S 1 0 0 P
em
processos
neoplásicos. A expressão
da S 1 0 0 P foi descrita e m
várias
linhagens celulares de câncer ( A r u m u g a m , T. e cols, 2004).
Acredita-se que a S 1 0 0 P seja uma das moléculas envolvidas
no
controle do ciclo celular cujo desequilíbrio leva a célula a se tornar imortal. Outra
especulação está relacionada com sua atuação e m relação ao acúmulo de cálcio
extracelular ou microcalcificações, o que por sua vez auxilia no diagnóstico
clínico precoce do câncer de m a m a (Da Silva, l.e cols., 2000).
A expressão da S 1 0 0 P foi descrita e m células epiteliais do esófago e m
diferenciação,
indicando
que
provavelmente
participe
normalmente
desse
processo ( S a t o , N . e Hitomi,J. 2002).
Foi o b s e r v a d o t a m b é m que a S 1 0 0 P pode interagir c o m a proteína do
citoesqueleto ezrina de u m a maneira d e p e n d e n t e de cálcio, trata-se de u m a
ligação altamente específica, e c o m isso influenciar sua habilidade de se ligar à
actina e o s autores postularam haver u m a possível ligação c o m o poder de
métastase e m células cancerosas (Koltzscher,M. e cols., 2003).
No tecido m a m á r i o , a S 1 0 0 P foi detectada e m células de carcinoma
ductal invasivo. A presença dessa proteína e m altas concentrações, nas células
neoplásicas m a m a r i a s , é um forte indicativo de progressão tumoral in vivo. A l é m
disso, acredita-se que a S 1 0 0 P tenha u m importante papel na imortalização de
células epiteliais m a m a r i a s in vitro
(Da Silva,I e cols., 2000). A s
carreadoras de cálcio S100 vêm d e s p e r t a n d o
interesse por sua
proteínas
expressão
diferenciada e m tecidos neoplásicos, m e s m o e m estágios iniciais e por seu
envolvimento e m processos metastáticos (llg,E.C. e cols., 1996; Gribenko,A.V. e
Makhatadze, G.I.,1998; Heizmann,C, 2002).
Há
indícios
de
que
a
S100P
participe
também
do
processo
carcinogênico da próstata humana o n d e t e m sido associada ao carcinoma não
Introdução
10
d e p e n d e n t e de hormônio e ao processo metastático (Gribenko, A.V. e cols.,
1998; Averboukh,L. e cols., 1996, Mousses,S. e cols., 2 0 0 2 ; A m l e r , L . C . e cols.,
2 0 0 0 ; Diederichs.S., e cols. 2004). Sua expressão t a m b é m foi detectada no
epitelio pancreático no qual havia se f o r m a d o um a d e n o c a r c i n o m a ( L o g s d o n , C . D .
e cols., 2003). A l é m disso, a expressão da S I OOP t a m b é m foi relacionada c o m a
diminuição da sobrevida de pacientes c o m câncer de pulmão (Beer,D.G. e cols.,
2002).
A r u m u g a m e cols., e m 2 0 0 4 , observaram que a adição de S I OOP
exógeno
em
células
da
linhagem
de
camundongos
NIH-3T3
aumenta
a
proliferação celular e a sobrevivência das células após estímulos apoptóticos.
C o m p a r a n d o - s e células tumorais c o m células normais adjacentes in
vivo, Da Silva e cols., 2 0 0 0 , d e t e c t a r a m que o gene da S I OOP encontrava-se de
2 a 20 vezes mais expresso no tecido t u m o r a l . O m e s m o resultado foi obtido a
partir de células de linfonodos de pacientes c o m diagnóstico positivo
para
carcinoma m a m á r i o intraductal invasivo, o n d e a S I OOP t a m b é m aparecia 20
vezes mais a u m e n t a d a (Da Silva, I.D.C.G e cols, 2000).
Em t e s e apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de
S ã o Paulo e m 2 0 0 4 , A n a P. T. Shor, d e m o n s t r o u haver forte associação entre a
S I OOP e o receptor de estrogênio na distinção do potencial de hsco das lesões
histológicas,
confirmando
transformação
o
papel
importante
da
S I OOP
no
processo
de
maligna. O b s e r v a n d o ainda que a ausência da proteína torna
praticamente nula a possibilidade de progressão t u m o r a l , e mais ainda que sua
a ç ã o d e p e n d e t a m b é m do receptor de estrogênio.
No tecido m a m á h o , a S I OOP foi detectada e m situações que vão
d e s d e hiperplasia ductal atípica, até carcinoma in situ e carcinoma intraductal
invasivo, porém não e m tecido de m a m a normal, o que levou a crer que a S I OOP
t e m um papel importante no processo tumoral (Da Silva, I., e cols. 2000).
O papel funcional da S I OOP na imortalização e transformação
de
células epiteliais m a m á r i a s não está elucidado. Tudo indica que ela está envolvida
e m múltiplos processos biológicos, c o m o , por e x e m p l o , na ativação de enzimas
envolvidas na progressão do ciclo celular. Por todos estes motivos e acreditando
na
importância
desta
proteína
nos
processos
neoplásicos,
principalmente
relacionados ao câncer de m a m a , resolvemos estudar u m pouco mais sobre esta
proteína.
Introdução
1.4
11
C â n c e r de m a m a
Segundo
o Instituto
Nacional de C â n c e r (INCA), do Ministério
da
Saúde, o câncer de m a m a é o segundo tipo de câncer mais freqüente no m u n d o e
o primeiro entre as muliíeres depois do c â n c e r de pele não m e l a n o m a .
A
incidência por câncer de m a m a feminina apresentou u m crescimento contínuo na
última d é c a d a , o que pode ser resultado de m u d a n ç a s sócio-demográficas. S e u
prognóstico é relativamente b o m , se diagnosticado nos estádios iniciais. Estimase que a sobrevida média geral cumulativa a p ó s cinco a n o s seja de 6 5 % nos
países desenvolvidos, e de 5 6 % para os países e m desenvolvimento.
Apesar
de
ser
considerado
um
câncer
relativamente
de
bom
prognóstico, se diagnosticado e tratado nas fases iniciais, as taxas de mortalidade
por câncer de m a m a continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente porque a
doença ainda é n o r m a l m e n t e diagnosticada e m estádios a v a n ç a d o s . C o m base
nas informações disponíveis dos Registros Hospitalares do INCA, no período
2 0 0 0 / 2 0 0 1 , 5 0 % d o s tumores de m a m a f o r a m diagnosticados nos estádios III e
IV o que diminui a sobrevida da paciente.
O número de casos novos de câncer d e m a m a e s p e r a d o s para o Brasil
e m 2005 é de 4 9 . 4 7 0 , c o m u m risco estimado de 53 casos a cada 100 mil
mulheres (INCA, 2005).
Na região Sudeste, o câncer de m a m a é o mais incidente entre as
mulheres c o m um risco estimado de 73 casos novos por 100 mil.
Se considerarmos que as estimativas de casos novos de câncer de
m a m a e m 2003 e r a m de 4 1 . 6 1 0 , já p o d e m o s notar um a u m e n t o de quase 1 6 %
e m relação as estimativas de 2 0 0 5 , o que significa u m d a d o muito preocupante.
Não existem medidas práticas específicas de prevenção phmária do
câncer de m a m a aplicável à população, e m b o r a estudos observacionais t e n h a m
sugerido que a prevenção do tabagismo, alcoolismo, o b e s i d a d e e sedentarismo
reduzam o risco de câncer de m a m a .
O que se sabe é que durante as diferentes fases da vida da mulher
c o m o crescimento, p u b e r d a d e , gestação, lactação e regressão p ó s - m e n o p a u s a l a
m a m a sofre várias m u d a n ç a s e m relação ao t a m a n h o , f o r m a e função (Russo,J. e
cols. 2001) e essas m u d a n ç a s p o d e h a m levar a alguma f o r m a de mutação o u ao
desenvolvimento do câncer por diferentes motivos.
Introdução
Foi
postulado
também
que
uma
primeira
gestação
a termo
12
em
mulheres j o v e n s exerce u m efeito protetor e m relação ao câncer de m a m a . Porém
não está totalmente elucidada a relação do m e c a n i s m o reprodutivo e m relação ao
d e s e n c a d e a m e n t o do câncer de m a m a o u c o m sua progressão (Russo, J, e cols.
2001).
O câncer de m a m a é u m a doença e x t r e m a m e n t e heterogênea, c o m
u m a grande variabilidade clinica e histopatológica. Essa variabilidade reflete a sua
etiologia c o m p l e x a , que sofre a influência de vários fatores e x ó g e n o s , assim c o m o
e n d ó g e n o s . Dentre os fatores q u e a u m e n t a m o risco e n c o n t r a m o s a dieta, uso de
contraceptivos orais, agentes virais, nuliparidade, idade da phmeira gestação,
duração do período reprodutivo, taxas hormonais e a predisposição genética.
(Silva, R.L.A., 2001).
A l é m destes, d e s t a c a m o s alguns outros fatores de risco considerados
importantes pela Associação Médica Brasileira e C o n s e l h o Federal de Medicina
em 2001:
•
Risco pouco elevado
•
Menarca precoce (<12 anos)
•
M e n o p a u s a tardia (> 55 anos)
•
Phmeira gestação a termo depois dos 34 a n o s
•
O b e s i d a d e , dieta gordurosa e sedentarismo
•
Terapia de reposição hormonal por mais de 5 a n o s
•
Ingestão alcoólica excessiva
•
Risco m e d i a m e n t e elevado
•
M ã e ou irmã c o m câncer de m a m a na p ó s - m e n o p a u s a
•
A n t e c e d e n t e s de hiperplasia s e m atipla o u macrocistos
apócrinos
•
Risco muito elevado
•
M ã e ou irmã c o m câncer de m a m a na p r é - m e n o p a u s a
•
A n t e c e d e n t e s de hiperplasia epitelial atípica ou neoplasia
lobular in situ
Introdução
•
13
Suscetibilidade genética c o m p r o v a d a (mutação d e B R C A 1 - 2 )
C o m relação a o s padrões histológicos dos cánceres de m a m a , cerca
de 8 0 % são carcinomas ductais e 1 0 % s ã o carcinomas lobulares; o s 1 0 %
restantes a p r e s e n t a m características variadas, como o tipo medular e os t u m o r e s
raros como os cistos-sarcoma filóide e os angiosarcomas. O carcinoma ductal in
Situ e o carcinoma
lobular in situ estão associados
a u m maior hsco de
desenvolver câncer de m a m a invasivo (Nascimento, P. A., 2000).
1.5
Técnica anti-sense
A metodologia anti-sense é u m a poderosa ferramenta, não só para o
estudo da regulação e função gênica, m a s , t a m b é m , para o desenvolvimento de
novos agentes terapêuticos (Hélène.C. e T o u l m ê , J . J . 1990).
O princípio da técnica de anti-sense é a regulação da expressão gênica
de u m a proteína alvo. Há algumas a b o r d a g e n s diferentes nesta técnica: u m a
delas tem o D N A c o m o alvo, e o bloqueio da transcrição c o m o objetivo, isso é
conseguido pela f o r m a ç ã o de u m a tripla hélice de D N A formada pela ligação de
oligonucleotídeos
sintéticos, a triple-hélice
é formada
pela
ligação d e u m a
adeni9na a d u a s timinas pela f o r m a ç ã o d a s pontes d e hidrogênio, seguindo o
modelo de p a r e a m e n t o
de W a t s o n
e Crick. Outra a b o r d a g e m t e m o R N A
mensageiro c o m o alvo e o bloqueio da tradução como objetivo pela f o r m a ç ã o de
uma dupla hélice d e R N A (Hélène,C. e T o u l m é , J . J . 1990).
C o n s i d e r a n d o - s e o R N A mensageiro c o m o alvo, há n o v a m e n t e d u a s
a b o r d a g e n s distintas q u e p o d e m ser utilizadas, u m a delas utiliza u m par d e
oligonucleotídeos sintéticos, f o r m a d o s por u m a seqüência determinada do R N A
mensageiro, estes oligonucleotídeos n o r m a l m e n t e não p a s s a m de 2 0 pb. Outra é
introduzindo-se a seqüência codificadora inteira e m sentido invertido na célula
alvo. Essa a b o r d a g e m é conhecida c o m o estratégia de antisense gene (Hélène,C.
e Toulmé,J.J. 1990).
No nosso caso o p t a m o s pela s e g u n d a a b o r d a g e m , o n d e realizamos a
introdução da fita molde do D N A c o m p l e m e n t a r do gene alvo no sentido invertido
e espelhado na célula alvo, c o m a intenção de que esta se ligasse ao R N A
Introdução
14
mensageiro f o r m a n d o u m a dupla fita d e R N A e resultando na inibição parcial d a
tradução pelos ribossomos.(Fig. 1.5).
ANTI-SENSE
GENE
Fita codificadora
5 ' G C T A C C A G G C
3'
3 ' C G G A C C A T C G
5
' G C C T G G T A G C 3 '
3 ' C G A T G G T C C G
5'
Fita IVIolde
R N A anti-sense
RNA sense
5 ' G C U A C C A G G C
5 ' G C C U G G U A G C
3'
5 G C U A C C A G G C
3
3 ' C G A U G G U C C G
5'
3'
Figura 1.5 E s q u e m a d a técnica d e anti-sense
A alta especificidade dessa ligação f a z c o m q u e a técnica d e anti-sense
seja u m a estratégia atrativa para modular seletivamente a expressão d e g e n e s
envolvidos na patogênese d e diversas d o e n ç a s ( T a m m , l . e cols., 2001).
Essa
modulação
pode-se
dar
por
dois
mecanismos
distintos:
competição c o m o m e c a n i s m o d e tradução o u clivagem do R N A mensageiro
(Hélène,C. e T o u l m é , J . J . 1990). A d e g r a d a ç ã o d a dupla fita d e RNA ocorre
principalmente pela ativação da R n a s e H . Este é provavelmente o m e c a n i s m o
mais importante d a técnica d e anti-sense, a R n a s e H corta a fita heteroduplex
D N A - R N A , p o r é m este m e c a n i s m o ainda não está totalmente elucidado (Olie,R.A.
e Z a n g e m e i s t e r - W i t t k e , 2001).
ícmsk) miiomi oe
WOCLEAR/SP-IPEN
Introdução
Para
introduzir
o
gene
no
sentido
anti-sense
nas
células
15
alvo,
utilizamos um vetor retroviral. O vetor p L X S N foi escolhido para a transferência
gênica, pois esses vetores são altamente eficientes e integrativos (Miller,A.D. e
cols.,
1993).
São
vetores
relativamente
seguros,
com
hsco
mínimo
de
m u t a g ê n e s e e o n c o g ê n e s e . Os retrovírus recombinantes são produzidos pela
introdução do vetor e m linhagens de células especializadas, conhecidas c o m o
células de e m p a c o t a m e n t o
virai (Markowitz,D. e cols.,1988a). A s
partículas
recombinantes são anfotroficas, podendo infectar u m a grande variedade de
células de mamíferos. A proliferação celular é necessária
para a
infecção
(transdução) e a eficiência de transdução d a s células alvo pode chegar a 1 0 0 %
e m alguns sistemas (Mulligan,R.C. 1993).
Neste trabalho d e s c r e v e m o s a construção de u m vetor retroviral c o m o
gene
da
proteína
carreadora
de
cálcio
S I OOP e m
sentido
anti-sense,
a
transfecção deste gene para células endoteliais h u m a n a s e a diminuição da
expressão d e s s a s células.
Objetivos do Trabaltio
16
OBJETIVOS DO T R A B A L H O
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar u m a eventual alteração na
f u n ç ã o de células d e c a r c i n o m a ductal m a m á r i o h u m a n o T 4 7 D a p ó s transdução
da proteína carreadora de cálcio S 1 0 0 P e m sentido anti-sense, valendo-se da
transferência gênica c o m vetor retroviral.
Materiais e Métodos
3
MATERIAIS E M E T O D O S
3.1
MATERIAIS
3.1.1
E q u i p a m e n t o s e acessórios principais
•
17
Agitador-aquecedor, modelo 2 5 8 , F A N E M Ltda., São Paulo, S P ,
Brasil;
•
Agitador de tubos (tipo vórtex), Q U I M I S A p . Científicos Ltda., São
Paulo, S P , Brasil;
•
Aparelho de eletroforese Electrophoresis Power Supply - modelo
2 5 0 , Life Technologies, Gibco B R L , EUA;
•
A p a r e l h o Milli-Q-pIus, purificador de água - M I L L I P O R E , Bedford,
MA, EUA;
•
Autoclave vertical, modelo 4 1 5 , F A N E M Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
•
Balança O h a u s , modelo N C T 200, O h a u s Co. Florham Park, N J ,
EUA;
•
Banho-maria, modelo 100 - F A N E M Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
•
B a n h o - m a r i a , modelo T y p e 16500 Dh-Bath, Barnstead/Thermolyne;
D u b u g n e , Iowa, EUA;
•
B a n h o - m a h a , Q U I M I S A p . Científicos Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
•
Centrífuga Marathon 8k, Fischer Scientific, EUA;
•
Centrífuga refrigerada automática Oppendorf Centrifuge 581 OR,
Eppendorf A G , H a m b u r g , A l e m a n h a ;
•
Centrífuga refrigerada automática, M S E Micro Centaur - Sanyo, São
Paulo, S P Brasil;
Materiais e Métodos
•
18
Centrífuga refrigerada automática, S u p e r s p e e d RC2-B, S O R V A L L ,
Newton, Connecticut, EUA;
•
Citômetro de Fluxo modelo FACSCalibur, BD Biosciences, NJ, EUA;
•
Espectrofotômetro, J E W A , 6.500 U.V.V, Inglaterra;
•
Espectrofotômetro, modelo LKB Ultrospec III, Pharmacia Biotech,
EUA;
•
Estufa retilinea, F A N E M Ltda., São Paulo, S P , Brasil;
•
Estufa de cultura de células. Reveo habitat, G S Laboratory
Equipment, Asheville, NC, EUA;
•
Fluxo laminar h o r i z o n t a l , classe II, modelo B B F - 4 S S , Biological
Safety Cabinet - G e r m f r e e Lab. Inc, Miami, EUA;
•
Lâminas para microscopía confocal. Lab T e k II C h a m b e r slide
w/cover RS Glass slides, Nalge N U N C int., Naperville, EUA;
•
Material plástico estéril para cultura celular - C O R N I N G C O S A R
C O R P . , Cambridge, MA, EUA;
•
Microscopio confocal Zeiss Axiovert 1 0 0 M , A l e m a n h a ;
•
Microscopio invertido, modelo eclipse TS 100, Nikon; J a p ã o ;
•
Software ABI Prism 7700 S e q u e n c e Detection Systems version 1,6,
Applied Byositems, EUA;
•
Termociclador ABI P r i s m ^ ^ 7 7 0 0 Sequence Detector, Applied
Biosystems, EUA;
•
Termociclador modelo M J Research PTE-200, Peltier T h e r m a l
Cycler, EUA;
•
Termociclador, P T C - 100 P r o g r a m m a b l e T h e r m a l Controller MJ
R e s e a r c h , INC, EUA;
•
Termociclador G e n e A m p ® P C R System 9 7 0 0 , PE Applied
Biosystem, EUA;
Materiais e Métodos
3.1.2
19
Principais reagentes
•
Acrilamida, Siga AIdricli fine Ciiemicals, St. Louis, IVlissouri, EUA;
•
Agar-ágar purificado para bacteriologia - M E R C K , São Paulo, Brasil;
•
A g a r o s e - G I B C O - B R L , Gaithersburg, MD, EUA;
•
Álcool etílico absoluto p.a. , Labsynth prod p/ Lab. Ltda., São Paulo,
Brasil;
•
Álcool Iso-propílico - M E R C K , São Paulo, Brasil;
•
Ampicilina - Sigma A l d h c h fine Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA;
•
Anticorpo S 1 0 0 P - BD Transduction Laboratories, EUA;
•
Anticorpo secundário Anti m o u s e polyvalent immunoglobulins FITC
conjugate - S i g m a AIdrich fine Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA;
•
Ac. Acético Glacial, p.a , Labsynth Prod, para Laboratório Ltda., S P ,
Brasil;
•
Bacto-triptona - D I F C O I N T E R L A B , São Paulo, Brasil;
•
Cloreto de Cálcio - S i g m a AIdrich fine Chemicals, St. Louis,
Missouri, EUA;
•
Cloreto de Sódio, p.a , Labsynth Prod, para Laboratório Ltda., S P ,
Brasil;
•
Clorofórmio p.a. - M E R C K , São Paulo, Brasil;
•
Dimetilsuifóxido ( D M S O ) , M E R C K , SãoPaulo, Brasil;
•
Etanol p.a. - M E R C K , São Paulo, Brasil;
•
Extrato de levedura , select yeast extract, G I B C O B R L , Gaithersburg,
M D , EUA;
•
Fenol p.a. M E R C K , São Paulo, S P , Brasil;
•
Formaldeído - Sigma AIdrich fine Chemicals, St. Louis, Missouri,
EUA;
•
Glicose p.a. M E R C K , São Paulo, S P , Brasil;
•
H E P E S - S i g m a AIdrich fine Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA ;
•
Isopropanol, M E R C K ,São Paulo, Brasil;
•
Penicilina-estreptomicina - G I B C O - B R L , Gaithersburg, MD, EUA;
•
Saponina, Serva Feinbiochemica G m b H & Co., Heidelberg,
Alemanha;
Materiais e Métodos
3.1.3
20
Principais reagentes utilizados para biologia molecular
•
A g a r o s e L o w Melting, L M P - Low Melting Point, Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, California, EUA;
•
Big Dye Terminator
wersão 2, Applied Biosystem, EUA;
•
BSA (Bovine serum albumine) - P r o m e g a , EUA;
•
Brometo de etídeo - Pharmacia Biotech, EUA;
•
Cloreto de Magnésio MgCl2,,Promega, EUA;
•
Dnasei , Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, EUA;
•
Deoxynucleotideo trifosfato (dNTP) mix ( 1 0 m M ) Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, California, EUA;
•
Diethyl Pyrocarbonate ( D E P C ) - Sigma AIdrich fine Chemicals, St.
Louis, Missouri, EUA;
e EDTA 2 5 m M , Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California,
EUA;
•
Enzimas de restrição EcoRI e X/70I (Promega) SAC I (Promega).
-
G I B C O - B R L (Gaithersburg, M D , EUA), P H A R M A C I A (Uppsala,
Suecia), N E W E N G L A N D B I O L A B S (Beveriy,MA,EUA); P R O M E G A
•
F o r m a m i d a - A m r e s c o , S o l o n , Ohio, EUA;
•
G F X G e n o m i c Blood DNA Purification kit para extração de DNA,
A m e r s h a m Pharmacia Biotech INC,EUA;
•
Improm II M-MLV Transcriptase reversa, Promega, EUA;
•
lodeto de propfdeo, Sigma AIdrich fine Chemicals, St. Louis,
Missouri, EUA;
•
Kit Eppendorf Perfect Prep Gel Cleanup - Eppendorf A G , H a m b u r g ,
Alemanha;
•
Marcador de peso molecular X, 100bp D N A Ladder, Invitrogen Life
Technologies, Carisbad, California, EUA;
•
Master Mix, Eppendorf A G , H a m b u r g , A l e m a n h a ;
•
M O P S (3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid) Sigma AIdrich fine
Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA;
•
Oligo(dT), P r o m e g a , EUA;
•
Platinum Pfx D N A Polimerase e seu t a m p ã o PFX Amplification
Buffer lOx, Invitrogen Life Technologies, Carisbad, California, EUA;
Materiais e Métodos
•
•
3.1.4
21
Syber Green, Applied Biosystems, EUA;
Trizol®, Invitrogen Life Teciinologies, Carisbad, California, EUA;
Principais reagentes para cultura celular
•
Cloreto de Cálcio - Sigma AIdrich fine Chemicals, St. Louis,
Missouri, EUA;
•
Dimetilsuifóxido ( D M S O ) , M E R C K , SãoPaulo, Brasil;
•
Geneticina (G418), Genef/c/n® G I B C O - B R L ,Gaithersburg, MD,
EUA;
•
Glutamina - G I B C O - B R L Gaithersburg, M D , EUA;
•
H E P E S , Sigma AIdrich fine Chemicals, St. Louis, Missouri, EUA;
•
Meio de cultura E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) , G I B C O -
B R L , Gaithersburg, MD, EUA;
•
Penicilina-estreptomicina - G I B C O - B R L , Gaithersburg, MD,EUA;
•
Polibreno (0,8mg/mL) Brometo de hexadimetrina - A L D R I C H ,
Milwaukee, EUA;.
•
R o d a m i n a B - Sigma AIdrich fine Chemicals, St. Louis, Missouri,
EUA;
•
Soro Fetal Bovino, (SFB) Invitrogen Life Technologies, Carisbad,
California, EUA;
•
Tripsina - G I B C O - B R L , Gaithersburg, M D , E U A
•
T r y p a n blue 0 , 4 % (corante vital) - G I B C O - B R L , Gaithersburg,
MD.EUA;
3.1.5
Oligonucleotídeos
SI OOP: Sintetizado pela e m p r e s a Invitrogen™ , baseado no trabalho de
Becker e cols., de 1992 c o m as seqüências a seguir e utilizado para a construção
do vetor retroviral:
P 1 : C 2 N B S P 5' - CTA C T C G A G C A T A T G A C G G A A C T A G - 3' sense
P2: 2 N B S P 5' - T T A G A A T T C G G A T C C A G G G C A TOA T - 3' anti-sense
cmssÃo mmmL
DE
mmíA
N-ÜCLEAP^SP-ÍPEÉ
Materiais e Métodos
22
S100P: Este par de primers foi d e s e n h a d o pelo sistema de software
Primer
Express
oligo design
software
da Applied Biosystems, sintetizado por IDT
Integrated D N A Technologies, Inc. e utilizado para os ensaios de PCR e m t e m p o
real:
P3: 5' - A A T T G C T C A A G G A C C T G G A C G 3' - sense
P4: 5' - G C A T C A T T T G A G T C C T G C C T T C 3' - anti-sense
Ciclofilina A: Sintetizado por IDT Integrated D N A Technologies, Inc. e
utilizado para os ensaios de P C R e m t e m p o real c o m o g e n e e n d ó g e n o .
P 1 : 5' CAA A T G C T G G A C C C A A C A CA 3' - sense
P2: 5' T T G C C A A A C A C C A C A T G C TT 3' - anti-sense
3.1.6
Vetor Retroviral
C o m o vetor para a transferência gênica utilizamos o vetor retroviral
p L X S N , que c o n t é m e l e m e n t o s derivados de retrovirus murine, do vírus da
leucemia
murina de Moloney ( M o M u L V ) e do vírus de sarcoma
murine
de
Moloney ( M o M u S V ) , e é d e s i g n a d o para transferência e expressão gênica. Por
meio de técnicas de DNA recombinante, os genes no g e n o m a viral necessários
para a reprodução do M o M u L V , g e n e s gag, pol e env, f o r a m removidos e no sítio
de policlonagem é inserido o g e n de interesse (Fig.3.1). O que sobra do retrovírus
são seus elementos regulatórios: as repetições terminais longas (LTR), que
f u n c i o n a m c o m o sinais de integração do provirus e promotores da transcrição, e
u m sinal de e m p a c o t a m e n t o para permitir que o RNA transcrito seja a c o m o d a d o
e m uma partícula viral. Para a produção dos vetores retrovirais contendo o gen de
interesse, é utilizada uma linhagem
gag,
pol
e env
incorporados
celular de empacotamento
ao g e n o m a
contendo o s genes
destas células. O vetor
retroviral
desprovido dos g e n e s para a replicação viral não é c o m p e t e n t e para a replicação,
e por isso não é capaz de produzir mais vírus c o m p e t e n t e s dentro da célula-alvo.
Portanto, o vetor age c o m o u m agente final de transferência gênica, deixando
u m a cópia de sua seqüência no g e n o m a da célula-alvo.
Materiais e Métodos
23
SPC
Figura 3.1 Vetor retroviral p L X S N c o m seus elementos principais:
3'LTR e 5'LTR seqüências de DNA do vírus da leucemia murina ( m o M u L V )
neo' g e n e que confere resistência à neomicina
- A m p ' g e n e que confere resistência à ampicilina
- S V 4 0 promotor do "Simian vírus"
f Psí+ sinal de e m p a c o t a m e n t o viral
-
S P C sítio d e policlonagem 5 ' - E c o R I , H p a I, X H O I, S a m HI - 3'
Materiais e Métodos
3.1.7
24
Linhagens celulares
3.1.7.1 Fibroblastos NIH-3T3
Fibroblastos
derivados
de
camundongos
da
linhagem
NIH-3T3,
utilizados no ensaio de titulação virai.
3.1.7.2 Fibroblastos G P + E 8 6
Células de e m p a c o t a m e n t o ecotróficas são fibroblastos derivados de
c a m u n d o n g o s da linhagem N I H 3 T 3 , construidos por Markowitz e cols. e m 1988 e
c o n t é m os g e n e s gag e pol e m um plasmideo e o gene env e m outro. Essa
linhagem é muito segura e eficiente para transferência gênica para
células
murinas.
3.1.7.3 Fibroblastos G P + e n v + A m 1 2
Outra linhagem de células de e m p a c o t a m e n t o , t a m b é m construída por
Markowitz e cols., e m 1988b, e possui igualmente os g e n e s gag e pol e env e m
p l a s m i d e o s separados, p o r é m são células anfotroficas podendo ser utilizadas
para transferência gênica segura para células h u m a n a s .
3.1.7.4 Células T 4 7 D
Células
epiteliais,
de
carcinoma
ductal
mamário
humano.
Foram
originalmente derivadas de efusão pleural de u m a paciente c o m tumor de m a m a .
Escolhemos a linhagem celular T 4 7 D para receber o vetor c o m o anti-sense da
proteína S I OOP, pois é u m a linhagem celular que superexpressa essa proteína
(Da Sílva,I.D.C.G. e cols. 2000).
A s células f o r a m d o a d a s pela Dra. Maria Mitzie Brentani do
Departamento de Radiologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo.
Materiais e Métodos
3.2
MÉTODOS
3.2.1
C o n s t r u ç ã o do vetor retroviral
25
3.2.1.1 O b t e n ç ã o d o c D N A da S I OOP
O c D N A da proteína S 1 0 0 P Inumana foi obtido a partir do vetor pET3^,
o qual já continha o inserto, e foi gentilmente cedido pelo Dr. Ismael Dale C o t h m
Guerreiro da Silva, docente do Departamento de Ginecologia da Universidade
Federal
de
São
Paulo
-
Escola
Paulista
de
Medicina
(UNIFESP-EPM),
pesquisador e chefe do laboratório de Ginecologia Molecular do D e p a r t a m e n t o d e
Ginecologia da U N I F E S P - E P M .
3.2.1.2 S e q ü ê n c i a m e n t o da S 1 0 0 P
Para o seqüênciamento f o r a m utilizados 100ng do vetor p E T 3 ^ diluídos
e m 16|iL de H2O millíQ. A partir desta solução f o r a m preparadas as seguintes
diluições 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:40 e 1:50, e uma amostra p e r m a n e c e u na
proporção de 1:1, completando c o m isso u m total de 8 amostras. Para a reação
utilizamos 1|iL das diluições c o m 1|iL de Big Dye Terminator
Biosystem),
1)iL dos
phmers
versão 2 (Applied
sense o u antisense (na concentração
de
3,2
pmol/|iL), 2|iL de t a m p ã o de s e q ü ê n c i a m e n t o e 5[LL de H2O millíQ autoclavada.
Esta solução foi colocada e m aparelho termociclador G e n e A m p ® (PE Applied
Biosystem, P C R S y s t e m 9700) nas seguintes condições: 92°C por dois minutos;
92°C por d e z segundos; 50°C por dez s e g u n d o s ; 60°C por quatro minutos e 4°C
00. S e n d o os passos 2, 3 e 4 repetidos por 25 ciclos.
A seguir foi realizada a precipitação do DNA, adicionando-se ao volume
total do seqüênciamento 80|LIL de isopropanol 7 5 % , m a n t e n d o esta solução e m
a m b i e n t e escuro e a temperatura ambiente por 15 minutos. A p ó s este período os
tubos f o r a m centrifugados por 30 minutos a uma velocidade de 14000rpm e a
temperatura de 20°C. E m seguida os tubos f o r a m invertidos para descarte do
Materiais e Métodos
26
sobrenadante, deixando-os sobre papel toalha para absorção completa. Foram
acrescentados
150fiL
de
etanol
70%
para
lavagem,
seguida
de
nova
centrifugação por 10 minutos a 1 4 0 0 0 r p m a 2 0 ° C . N o v a m e n t e os tubos f o r a m
invertidos para descartar o sobrenadante e os m e s m o s p e r m a n e c e r a m secando a
temperatura a m b i e n t e e m local escuro
overnight.
No dia seguinte, o material foi ressuspendido e desnaturado. Para isto
foram a c r e s c e n t a d o s 1 5 ^ 1 de f o r m a m i d a e m cada amostra, e as m e s m a s então
foram colocadas no termociclador por 5 minutos a 96°C para a desnaturação. Os
tubos f o r a m imediatamente retirados do aparelho e colocados no gelo
para
choque
para
térmico.
As
amostras
então
foram
aplicadas
nas
placas
seqüênciamento e e n c a m i n h a d a s ao ABI 3 1 0 0 ® , (PE Applied Biosystem), o n d e
obtivemos a seqüência completa d a s bases contidas neste material (Costa,
A . M . M . 2003).
O resultado do seqüênciamento foi analisado pelo programa C r o m a s e
c o m p a r a d o a seqüências conhecidas e m bancos de d a d o s .
3.2.1.3 C o n s t r u ç ã o de Oligonucleotídeos
Solicitamos a construção de u m par de oligonucleotídeos à e m p r e s a
Invitrogen™ c o m as seguintes seqüências:
Sense
PI
5' - C T A C T C G A G C A T A T G A C G G A A CTA G - 3'
Xhol
Ndel
Anti-sense
P2
5' - T T A G A A T T C G G A T C C A G G G C A T C A T - 3'
EcoRI
Bam Hl
Estes oligonucleotídeos f o r a m construídos b a s e a d o s no trabalho de
Becker e cols. (1992), p o r é m nós adicionamos as seqüências reconhecidas pelas
enzimas de restrição Xho\,
N d e l , EcoRI e
fíamHI.
Este par de "primers" foi
utilizado no ensaio de P C R para amplificação do c D N A da S I OOP c o m os sítios
de restrição necessários para cloná-lo no vetor retroviral p L X S N .
COWSSÃO HKiCm. D€ B€R41A NUOEAR/'SP-IPEN
Materiais e Métodos
27
3.2.1.4 A m p l i f i c a ç ã o do c D N A da S I OOP pelo m é t o d o de P C R
O c D N A da S I OOP foi amplificado pela técnica d a reação e m cadeia da
polimerase. Utilizamos 1 ^iL (52ng) do vetor pET 3'^, 1 |iL de Platinum Pfx DNA
Polimerase (Invitrogen), 5|a.L do t a m p ã o PFX Amplification Buffer 10x (Invitrogen),
1,5 |j,L de d N T P mix ( l O m M ) (Invitrogen), 1}j,L de MgS04 ( 5 0 m M ) (Invitrogen), 1)j.L
de cada "primer" (seqüência mencionada anteriormente) (Invitrogen), 38,5|iL de
H2O
MilliQ
autoclavada,
terminando
com
um
volume
total
de
50|iL.
Este
procedimento foi repetido, no dia seguinte, para aumentar o rendimento de c D N A .
A amplificação foi realizada nas seguintes condições: 9 2 ° C , por 5
minutos (desnaturação do D N A ) , 92°C, por 30 segundos, 55°C, por 30 s e g u n d o s
(anelamento) e 6 8 ° C , por 30 s e g u n d o s (extensão dos "primers"). Esses três
últimos ciclos f o r a m repetidos por mais 39 vezes. Depois, mais um ciclo a 68°C,
por 5 minutos (Becker e cols., 1992).
A análise dos f r a g m e n t o s gerados foi realizada mediante eletroforese,
e m gel de agarose 1 % ( G I B C O - B R L ) e corado c o m 1|iL de Brometo de etídeo
(100mg/mL).
3.2.1.5 Extração d o Produto de P C R
Para a extração do c D N A da S I OOP do vetor p E T 3a foi preparado u m
gel de agarose L o w Melting ( L M P - Low Melting Point Invitrogen) a 1,5%, e a
extração e purificação f o r a m realizadas c o m 0 kit Eppendorf Perfect Prep Gel
Cleanup® seguindo o protocolo do fabricante.
A
quantificação
dos
fragmentos
gerados
foi
realizada
mediante
eletroforese em gel de agarose na concentração de 1,5 % ( G I B C O - B R L ) e m T E B
1x e corado com B r o m e t o d e etídeo. Foram utilizados 7|j,L de marcador de peso
molecular EcoRI/HindIIII, 7\iL de marcador de peso molecular Puc H a e l l l , e 3}iL
do resultado da purificação.
O DNA foi precipitado, adicionando-se 200|j,L de Etanol 1 0 0 % e 1 0 %
de Acetato de Na 1M (ph 5,2). P e r m a n e c e u por u m a hora a -20°C, sendo então
centrifugado por 2 0 minutos, a 12.500 rpm a 4 ° C (centrífuga Eppendorf®). O
s o b r e n a d a n t e foi d e s p r e z a d o e f o r a m adicionados 100|iL d e Etanol 7 0 % para
reidratação. Foi, n o v a m e n t e centrifugado
por 5 minutos, a 12.500 rpm, e m
centrífuga refrigerada a 4 °C, o sobrenadante foi desprezado, o pellet
permaneceu
Materiais e Métodos
secando
a
temperatura
ambiente
por
aproximadamente
10
28
minutos
e
ressuspendido e m 20)il de H2O IVIilli Q autoclavada.
3.2.1.6 P r e p a r a ç ã o d o vetor p L X S N
O p l a s m i d e o L X S N foi linearizado c o m as enzimas de restrição EcoRI e
Xho\
(Promega) para se tornar compatível c o m o c D N A anti-sense da S I OOP.
Para a digestão f o r a m utilizados 7iJ.L (200ng) do vetor p L X S N , 0,2fi,L de cada
enzima de restrição, 1|iL de t a m p ã o 2 da Promega e 1,6|i.L de H2O Milli Q
autoclavada. A
solução
permaneceu
por 2
horas
no
banho-maria
a
uma
temperatura de 37°C.
A p ó s a digestão c o m as enzimas de restrição ocorreu a purificação
c o m fenol/clorofórmio na proporção de 1:1, e o produto foi submetido à análise
quantitativa e qualitativa e m gel de agarose 1 % (Bellini, M.H. 2 0 0 1 ; Yang,L. e
cols.1999; Q u a n , S , e cols., 2001).
3.2.1.7 Ligação da S I OOP ao vetor retroviral p L X S N
A ligação do vetor retroviral c o m o c D N A da S I OOP foi realizada c o m a
enzima T4 DNA ligase (Promega). A relação molar entre o vetor e o inserto foi de
1:3, portanto f o r a m utilizados 2fxL d e L X S N (lOOng), 1}j,L de S I OOP (25ng), 1|iL de
T4 DNA Ligase, 1|il de t a m p ã o específico e 5\i\ de H2O Milli Q autoclavada. A
reação d e ligação p e r m a n e c e u incubando por 16 horas a 4°C (Affonso,R. 2000).
3.2.2
T r a n s f o r m a ç ã o e m bactérias c o m p e t e n t e s D H 5 a
As bactérias c o m p e t e n t e s D H 5 a f o r a m transformadas pelo m é t o d o do
cloreto de cálcio. Para isso adicionamos todo o conteúdo da reação de ligação
(10|iL) e m 200|iL de bactérias c o m p e t e n t e s DH5a. A solução p e r m a n e c e u por 20
minutos no gelo. A p ó s este período foi colocada por 1 minuto a uma temperatura
de 42°C e imediatamente retornada ao gelo.
Foram
acrescentados
SOO^iL de
meio
SOC
(Triptona, extrato
de
levedura, NaCI, KCI e H2O destilada), 16|iL de Glicose 1M e 4 |iL de Cloreto de
Magnésio 2 M . A solução p e r m a n e c e u incubando por 1 hora a 37°C sob agitação
máxima de 220 r p m (Mathor,M.B. 1994).
Materiais e Métodos
29
Foram aplicados 200|j.L desta s u s p e n s ã o e m placas de LB-agar c o m
Ampicilina e deixadas na estufa a 37°C overnight.
3.2.3
Amplificação dos p l a s m i d e o s
Os clones resistentes à Ampicilina, f o r a m amplificados e m meio LB
líquido (Bacto-triptona, Extrato d e levedura e NaCI) c o m Ampicilina (100|Lig/mL),
por a p r o x i m a d a m e n t e 16 horas a temperatura de 3 7 ° C sob agitação d e 200 rpm.
3.2.4
Extração e purificação d o s p l a s m i d e o s L S 1 0 0 P S N - Mini Prep
Da s u s p e n s ã o bacteriana f o r a m centrifugados 3 m L por 1 minuto a
12.000 rpm, o s o b r e n a d a n t e foi d e s p r e z a d o e o pellet foi ressuspendido e m 1 mL
de T E ( l O m M Tris-HCI, pH 8,0, I m M Na E D T A ) . A p ó s h o m o g e n e i z a r a amostra
c o m o auxílio do vórtex, houve nova centrifugação por 1 minuto e o sobrenadante
foi descartado. A s bactérias f o r a m ressuspendidas e m 100|iL d e Solução I ( 5 0 m M
de glicose, l O m M Na E D T A e 2 5 m M Tris-HCL, pH 8,0), a solução foi agitada e
p e r m a n e c e u incubando por 5 minutos e m temperatura ambiente. Adicionou-se
2 0 0 | i L da Solução II (0,2M N a O H e 1 % d e S D S ) para efetuar a lise, misturando-se
por
inversão
e a amostra
permaneceu
por
5 min. no
gelo.
Foram
então
adicionados 150|iL da Solução III gelada (60 ml Acetato d e K 5 M , pH 5,5; 11,5 mL
d e Ac. Acético Glacial e 28,5 m L de H2O) misturados por inversão e deixados por
5 m i n . no gelo. A p ó s centrifugação a 13.000 rpm por 5 m i n . a 4 °C, 4 0 0 | i L do
s o b r e n a d a n t e f o r a m transferidos para u m tubo novo. Adicionou-se 400)j,L d e
fenol/clorofórmio na proporção d e 1:1, h o m o g e n e i z a d o , centrifugado por mais 3
min., a 13.000 rpm a 4°C. O s o b r e n a d a n t e foi transferido para tubos novos, e foi
adicionado 1 mL de Etanol 1 0 0 % , p e r m a n e c e n d o
por 5 min. a temperatura
a m b i e n t e . N o v a m e n t e centrifugado por outros 5 min. nas m e s m a s
condições
descritas anteriormente e o s o b r e n a d a n t e foi d e s p r e z a d o . O DNA precipitado foi
lavado por duas vezes c o m 1 ml de etanol 7 0 % . O precipitado foi ressuspendido
e m 50|LiL de T E / R N A s e (100|xg/mL) e incubado por meia hora e m banho-maria a
37°C.
Materiais e Métodos
3.2.5
30
Análise de Restrição
A análise de restrição foi realizada c o m a enzima SAC\
(Promega).
Para isso foram utilizados 8|iL de DNA, 0,5|iL da enzima de restrição S A C I , 1|iL
de t a m p ã o específico J ( P r o m e g a ) e 0,5)iL de BSA (Bovine serum A l b u m i n
-
Promega).
Foi preparado um gel de agarose a 1 % c o m T A E 1 % , corado c o m
B r o m e t o de etídeo e submetido a corrente elétrica e m aparelho de eletroforese.
C o m o o vetor p L X S N c o n t é m dois sítios de reconhecimento para a
e n z i m a SACI e o inserto c o n t é m u m sítio, d e v e m ser encontradas três fragmentos
no gel de agarose.
3.2.6
Preparação das células de e m p a c o t a m e n t o
As d u a s linhagens de células de e m p a c o t a m e n t o f o r a m mantidas e m
cultura c o m meio de E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) , soro fetal bovino
( S F B ) 1 0 % , penicilina/estreptomicina (100 UI/mL) e glutamina (4mM). A s células
f o r a m mantidas a 37°C, e m atmosfera úmida contendo 5 % de CO2 (Markowitz e
cols.,1988a e b).
3.2.7
T r a n s f e c ç ã o transiente e m células G P + E 8 6 c o m cloreto de cálcio
Primeiramente introduzimos a construção
retroviral nas células
de
e m p a c o t a m e n t o ecotróficas, G P + E 8 6 (gag, pol + env), por meio de transfecção
transiente c o m cloreto de cálcio (Maniatis.T. e cols., 1989).
Quatro dias antes da transfecção, as células f o r a m descongeladas,
f o r a m colocadas e m garrafas de 75cm^ c o m 15 mL de meio E A G L E modificado
por Dulbelcco ( D M E M ) c o m 1 0 % de soro fetal bovino e p e r m a n e c e r a m na estufa
c o m 5 % de CO2 a 37°C. Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células
f o r a m tripsinizadas e foram plaqueadas 2 garrafas de 25cm^ c o m 1x10^ células
( s e n d o uma garrafa para controle).
Para a transfecção f o r a m ressuspendidos 10)j,g de c D N A e m 300 jaL de
água MilliQ autoclavada, e adicionados 100|j.L de cloreto de cálcio (2,5M) diluídos
em
600|iL
de
água
MilliQ
autoclavada.
Essa
solução
foi
adicionada
por
gotejamento e m 1 mL de H E P E S P 0 4 ( N a C I 2 8 0 m M , KCL l O m M , Na2HP042H20
1,5mM e H E P E S 5 0 m M ) enquanto este recebia u m borbulhamento de ar c o m
C(MS5À.O
mxmL
D€
B(imk
!^ÜCLEAR/SP-!PEÑ
Materiais e Métodos
31
pipeta. A p ó s incubação d e 30 minutos à temperatura a m b i e n t e , a solução foi
pipetada sobre as placas c o m as células G P E - 8 6 , e mantidas por 2 0 minutos para
incubação e m estufa de CO2. Depois deste período as placas receberam 8 mL de
meio D M E M - 1 0 e f o r a m mantidas a 37°C, e m atmosfera úmida contendo 5 % de
CO2 A p ó s 16 horas, o meio foi trocado e as células p e r m a n e c e r a m por 48 horas
e m estufa a 37°C e 5 % d e CO2 para se restabelecerem (Bellini, M.H. 2 0 0 1 ;
Mathor, M.B. 1994).
3.2.8
Infecção p e r m a n e n t e
Para
a
infecção
permanente
foram
utilizadas
células
G P + e n v A m 1 2 (Markowitz.D. e cols., 1988b). A s células f o r a m
anfotroficas
descongeladas
quatro dias antes da infecção, e cultivadas e m garrafas de 75cm^ c o m 15 m L de
meio E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) c o m 1 0 % de soro fetal bovino e
p e r m a n e c e r a m na estufa c o m 5 % de CO2 a 37°C. Vinte e quatro horas antes da
infecção, as células f o r a m thpsinizadas e foram plaqueadas e m 2 placas de
lOOmm c o m 1x 10^ células.
O s o b r e n a d a n t e das células G P E - 8 6 c o n t e n d o partículas virais foi
utilizado para a infecção permanente das células anfotroficas G P + e n v A m 1 2 , que
consiste no contato por u m determinado período do vírus c o m as células alvo
(Figura 3.2).
O meio das placas contendo as células A m 1 2 foi retirado e f o r a m
pipetados 5 m L do s o b r e n a d a n t e das placas que c o n t i n h a m as células G P E - 8 6
c o m 500|j.L de Polibreno (brometo de hexadimethna 0 , 0 8 m g / m L ) , que a u m e n t a a
permeabilidade da m e m b r a n a celular. A s placas f o r a m colocadas na estufa a
37°C e 5% de CO2 por 3 horas para inoculação, c o m leve agitação de meia e m
meia hora. A p ó s este período foram adicionados mais 5 mL de meio D M E M - 1 0
c o m a m e s m a concentração de polibreno e voltaram para a estufa sob as
condições anteriormente citadas. O restante do meio retirado d a s placas c o m a s
células G P E - 8 6 e contendo partículas virais foi imediatamente congelado a u m a
temperatura de -80°C.
No dia seguinte iniciou-se a seleção c o m Geneticina G 4 1 8 (0,8mg/mL)
(se liga a subunidade ribossomal) que durou 12 dias, c o m d u a s trocas de meio no
período. Os clones resistentes foram amplificados e c o n g e l a d o s e o sobrenadante
foi posteriormente utilizado na titulação (Mathor, 1994; Bellini,M.H. 2001).
Materiais e Métodos
LS100PSN
32
Seleção com G418
Sobrenadante
Anti-sense
após 16 hs
Seleção
por aprox.
12 dias
GR + E86
A p ó s 48 hs
G P + env + A m 1 2
Transfecção
Infecção
Transiente
Permanente
Figura 3.2 E s q u e m a da Transfecção transiente e m linliagem ecotrófica
G P + 8 6 , pelo método do cloreto de cálcio e da infecção permanente, e m linhagem
anfotrófica G P + e n v + A m 1 2 .
3.2.9
Titulação
Os clones A m 1 2 L S 1 0 0 P S N - A n t i - s e n s e
resistentes à Geneticina ( G -
418) f o r a m amplificados e m garrafas de 25cm^ contendo meio de cultura E A G L E
modificado
Glutamina
por
Dulbelcco
(4mM) e foram
(DMEM),
contendo
congelados
em
1 0 % de
meio
soro
especial de
fetal
bovino
e
congelamento
contendo 1 0 % de D M S O e 5 0 % de soro fetal bovino. Os sobrenadantes t a m b é m
foram imediatamente congelados a - 80°C para posterior uso na titulação.
Os clones resistentes á Geneticina f o r a m titulados para determinar a
capacidade de infecção do sobrenadante e m fibroblastos NIH-3T3 (Bignon,Y.J. e
D'lncan,C, 1996; Mann,R. e cols. 1983).
Foram s e m e a d a s 5x10'* células NIH-3T3 e m placas de 2 8 c m ^ c o m 2 m L
de meio E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) , c o m 1 0 % de soro fetal bovino
e Glutamina ( 4 m M ) , mantidas a 37°C, e m atmosfera úmida contendo 5 % de CO2.
No dia seguinte, f o r a m adicionados 0,5mL do s o b r e n a d a n t e de cada clone, e m
diluições de 10"^ e IO"'*, c o m a adição de 8 p g / m L de polibreno. A p ó s u m a hora a
37°C, c o m agitação a cada 15 minutos, f o r a m adicionados mais 1,5 mL de meio
Materiais e Métodos
33
de cultura E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M - Gibco) e incubados por
mais 18 horas. A p ó s este período houve a troca do meio por meio de cultura s e m
polibreno e a p ó s 2 4 horas foi iniciada a seleção c o m G-418 (Fig. 3.3).
A seleção levou 12 dias, as placas foram então coradas c o m R o d a m i n a
B n u m a concentração de 2 % e m u m a solução de 4 % de formaldeído, sendo então
lavados e m água corrente até a eliminação do excesso do corante e o s clones
f o r a m contados. C a d a colônia corresponde a uma célula que foi infectada e
contém
o gene
de
resistência
NeoR
formando
u m clone. A
Eficiência
de
F o r m a ç ã o de Colônias (EFC) é calculada pelo número de colônias obtidas e o
n ú m e r o de células s e m e a d a s (Mathor, M.B.1994).
O resultado foi expresso e m unidades de f o r m a ç ã o de colônias por
mililitro (ufc/mL) (Byun,J. e cols.,1996).
S o b r e n a d a n t e das células
de e m p a c o t a m e n t o c o m
Geneticina G 4 1 8
LS100PSN-AS
Células NIH-3T3
Seleção durante
a p r o x i m a d a m e n t e 12 dias
Figura 3.3 E s q u e m a da titulação e m células NIH-3T3
Materiais e Métodos
34
3.2.10 Cultura de células de c a r c i n o m a m a m á r i o T 4 7 D
T 4 7 D é u m a linhagem celular de carcinoma m a m á h o humano que
apresenta alta expressão da proteína S 1 0 0 P (Da Silva e cols., 2000). As células
f o r a m gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Mana Mitzi Brentani do Departamento
de Radiologia, da Faculdade de Medicina da USP.
A m a n u t e n ç ã o dessa linhagem celular e m cultura foi feita e m meio de
EAGLE
modificado
por
penicilina/estreptomicina
Dulbecco
(DMEM),
soro
fetal
bovino
(SFB)
10%,
(100UI/mL-100pg/mL) e glutamina ( 4 m M ) . As células
f o r a m mantidas a 37°C, e m atmosfera úmida contendo 5 % de CO2.
Para congelamento as células f o r a m thpsinizadas e ressuspendidas e m
meio E A G L E modificado por Dulbecco ( D M E M ) , c o m alta concentração de glicose
(4,5g/L), 2 0 % SFB (Invitrogen) e 1 0 % de Dimethylsulfoxido (DMSO)(Bagatell,R. e
cols., 2001).
3.2.11 Infecção das células T 4 7 D
Para
a
infecção
foram
escolhidos
os
clones
das
células
de
e m p a c o t a m e n t o A M 1 2 S 1 OOPSN-anti-sense, c o m os maiores títulos virais.
Foram s e m e a d a s 5x10'* células T 4 7 D e m garrafas de 25cm^, mantidas
c o m meio de cultura E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) c o m 1 0 % a 2 0 %
de soro fetal bovino, Glutamina ( 4 m M ) e mantidas e m atmosfera úmida contendo
5 % de CO2, por 2 4 horas.
No dia seguinte foi adicionado 1 mL de meio contendo partículas virais
c o m polibreno (8|ag/mL) e m cada placa. A p ó s u m a hora na estufa de CO2 a 37°C
e c o m agitação a cada 15 minutos, f o r a m adicionados mais 3 m L de meio D M E M 10 c o m polibreno (8 )ig/mL). A p ó s 24 horas de incubação foi trocado o meio de
cultura e deixado por mais 24 horas na estufa.
A seleção c o m geneticina iniciou-se 48 horas a p ó s a infecção. O meio
das placas foi substituído por meio D M E M - 1 0 c o m 5 0 0 | i g / m L de Geneticina. Essa
concentração de geneticina foi baseada e m d a d o s da literatura (Sartohus,C.A. e
cols., 2 0 0 3 ; C h i s a m o r e , M.J. e cols., 2001), e d u r o u 12 dias c o m uma troca de
meio no período.
Materiais e Métodos
35
C o m o controle foi utilizado um clone de célula T 4 7 D infectada a p e n a s
c o m o vetor retroviral p L X S N s e m c D N A da S 1 0 0 P , mas que passou pelos
m e s m o s processos ( Q u a n . S . e cols., 2001).
3.2.12 Extração de R N A das células T 4 7 D
Para a realização da extração de RNA das células T 4 7 D , assim c o m o
dos clones T 4 7 D - L S 1 0 0 P S N - A S , f o r a m s e m e a d a s õxIO'* células e mantidas sob
as condições anteriormente mencionadas, até atingirem a sub-confluência ( 8 0 %
de confluência).
As
garrafas
foram
lavadas
com
PBS
1x,
as
células
foram
ressuspendidas e m 1 m L d e Trizol® (Invitrogen) e p e r m a n e c e r a m incubando por 5
minutos e m temperatura ambiente. A solução foi transferida para tubos estéreis
de 1,5 mL e f o r a m adicionados 200fi,L de clorofórmio, seguido de vigorosa
agitação m a n u a l por 15 segundos.
A p ó s incubação a temperatura ambiente por 3 minutos, os tubos f o r a m
centrifugados a 12.000 rpm por 15 minutos e m centrifuga refrigerada a 4 ° C . O
sobrenadante contendo R N A foi c u i d a d o s a m e n t e pipetado e passado para novos
tubos de 1,5 mL. O RNA foi precipitado c o m 500|a,L de Isopropanol e a p ó s
incubação de 10 minutos a temperatura a m b i e n t e , foi centrifugado a 12.000 rpm,
por
10 minutos a 4 ° C . O sobrenadante foi descartado
e o precipitado
foi
ressuspendido e m 1 m L de Etanol 7 5 % , preparado c o m água D E P C (diethyl
pyrocarbonate). A p ó s nova centrifugação o R N A foi ressuspendido e a r m a z e n a d o
a -80°C. (Chomczynsl<i,P. e Sacchi,N., 1987, e C h o m c z y n s k i , P, 1993).
A concentração do RNA foi determinada por leitura da absorbencia a
2 6 0 n m e m espectrofotômetro e para avaliar o grau de pureza foi realizada leitura
da absorbância a 2 8 0 n m e calculada a relação.
3.2.13 Análise da pureza do R N A por eletroforese
Para avaliar a pureza e integridade do R N A extraído das
células
realizamos u m ensaio de eletroforese e m gel de agarose c o m formaldeído 3 7 % .
A n t e s de colocar o R N A no gel de agarose, foi preparada u m a solução
que impede a d e g r a d a ç ã o do m e s m o . Todo o material utilizado foi d e v i d a m e n t e
autoclavado e t o d a s as soluções f o r a m preparadas c o m água D E P C .
Materiais e Métodos
36
Para cada amostra de RNA utilizamos 5,5|j,L de f o r m a m i d a , 1 |iL de
M O P S (3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid) 10x, 2 )iL de formaldeido, 1 \xL de
Loading Buffer para RNA e 0,5 ^iL de brometo de etídeo. A esta solução foi
adicionado 1 [ig de RNA. A solução foi aquecida a 65°C t a m b é m para desnaturar
0 RNA, seguido de choque fho por 3 m i n . no gelo e colocado no gel de agarose
3 % preparado com formaldeído 3 7 % e M O P S e submetido a corrente elétnca e m
aparelho de eletroforese.
3.2.14 O b t e n ç ã o de c D N A pelo m é t o d o de transcrição reversa
Padronizamos este ensaio para utilizar sempre 2|j,g de RNA total de
cada
amostra.
A
phmeira
etapa
deste
ensaio
foi
a
eliminação
de
DNA
contaminante c o m Dnasei (Invitrogen 1U/|iL) para não interferir no resultado final.
As a m o s t r a s p e r m a n e c e r a m incubando por 15 minutos a 25°C c o m a Dnasei e
seu t a m p ã o , após este período foi adicionado 1JJ,L de solução de E D T A 2 5 m M
para i n i b i r a ação da D n a s e i .
Para linearizar a cadeia de R N A f o r a m acrescentados 2)iL de Oligo(dT)
Primer (0,1|ig/|j,L), as amostras p e r m a n e c e r a m incubando por 10 minutos a 65°C.
Para a síntese de DNA complementar, acrescentaram-se BSA (Bovine
S e r u m A l b u m i n - 20|a.g/mL), deoxynucleotideo trifosfato (dNTP) l O m M , M g C b e a
enzima transcriptase reversa M-MLV Reverse
Transcriptase
(200U/)iL) c o m seu
respectivo t a m p ã o , as amostras f o r a m incubadas por 1 hora a 37°C. A p ó s este
período os t u b o s f o r a m transferidos para o gelo picado, a o n d e p e r m a n e c e r a m por
5 minutos. Depois f o r a m colocados outra vez no termociclador a 65°C por 10
minutos e transferidos para o gelo. A s amostras f o r a m estocadas a (D'Alessio,J.M., e Gerard,G.F, 1988; Kotewicz.M.L. e cols. 1988).
20°C.
Materiais e Métodos
37
3.2.15 R e a ç ã o de polimerização e m cadeia e m t e m p o real ( P C R e m t e m p o
real)
Para a d e t e r m i n a ç ã o quantitativa da expressão de S 1 0 0 P foi realizada
a técnica de P C R e m t e m p o real.
O par de primers utilizado neste ensaio foi d e s e n h a d o pelo sistema de
software Primer Express
oligo design
software
da Applied Biosystems (Ginzinger,
D.G., 2002).
Para a reação de polimerização e m cadeia e m t e m p o real utilizamos
0,8|iiL de c D N A de cada a m o s t r a , 5|iL de SYBR® G r e e n I (Applied Biosystems),
0,4|iL (4pmol) de cada primer (seqüência informada nos Materiais) e 3,4|iL de
H2O D E P C , t e r m i n a n d o c o m u m volume total de 10|a.L por reação. Cada amostra
foi realizada e m triplicata.
A amplificação foi realizada nas seguintes condições: 1° estágio: 95°C,
por 10 minutos, 2° estágio: 94°C, por 15 segundos, 55°C, por 30 s e g u n d o s
(anelamento) e 72°C, por 30 segundos (extensão dos primers). Esses três últimos
ciclos foram repetidos por mais 35 vezes.
Depois da reação de amplificação foi realizada a curva de dissociação
seguindo-se o seguinte padrão: 95°C por 20 s e g u n d o s , 60°C por 30 segundos e
95°C por 20 segundos, sendo que a p a s s a g e m da temperatura dos 95°C para os
60°C levou 20 minutos.
C o m o gene e n d ó g e n o para validar o ensaio e servir de padrão interno
foi utilizado
um
par d e
primers da Ciclofilina A (seqüência
informada
nos
Materiais) ( T h e l l i n , 0 . e cols., 1999; Peinnequin, A. e cols., 2004).
A reação foi realizada em um termociclador A B I Prism 7700 S e q u e n c e
Detector, as condições f o r a m programadas e m um c o m p u t a d o r Power Macintosh
7100 (Apple Computer, Santa Clara, CA). Os d a d o s f o r a m analisados
neste
m e s m o computador. T a n t o a coleta c o m o a análise d o s d a d o s foi realizada por
software criado pela PE Applied Biosystems, Abi Prism 7700 S e q u e n c e Detection
System version 1.6.
A análise d o s f r a g m e n t o s gerados foi realizada mediante eletroforese,
em gel de agarose 1 % ( G I B C O - B R L ) e corado c o m 1|iL de Brometo de etídeo.
Materiais e Métodos
38
3.2.16 E n s a i o de Imunofluorescência e m Microscopia Confocal
Para avaliar a expressão proteica da S 1 0 0 P nos clones transfectados
realizamos o ensaio de imunofluorescência. A s células f o r a m tripsinizadas e
plaqueadas e m c â m a r a s apropriadas sobre lâminas de microscopia, para cada
clone foi plaqueada u m a lâmina c o m 5x10"* células por câmara. A s células f o r a m
mantidas e m meio de cultura E A G L E modificado por Dulbelcco ( D M E M ) c o m 1 0 %
de soro fetal bovino e Glutamina ( 4 m M ) , p e r m a n e c e n d o e m atmosfera ú m i d a
contendo 5 % de CO2.
No dia seguinte, as células f o r a m fixadas com formol 4 % gelado e
p e r m a n e c e r a m por 10 minutos a 4°C. A s células f o r a m então lavadas d u a s vezes
c o m PBS
1 % , seguida de u m a lavagem c o m P B S com glicina 0,1 M, nova
lavagem c o m PBS 1 % , e outra lavagem c o m P B S e BSA 1 % . A p ó s t o d a s as
lavagens, as células f o r a m incubadas c o m anticorpo monoclonal primário para a
proteína S I OOP (BD Transduction Laboratories,), a u m a diluição de 1:50 e m P B S
e BSA 1 % , p e r m a n e c e n d o overnight a 4°C.
A p ó s incubação, as células f o r a m lavadas duas vezes c o m P B S e BSA
1 % , e durante 30 minutos foram repetidamente lavadas c o m PBS 1 % para ser
retirado todo excesso d e anticorpo.
Foi
adicionado
o
Anticorpo
secundário
(Anti
mouse
polyvalent
immunoglobulins FITC conjugate - Sigma), a u m a diluição de 1:250 e m P B S e o
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) para corar o núcleo das células (Yang, E.S e
Burnstein,K.L, 2003). A s células p e r m a n e c e r a m incubando por 30 minutos a
temperatura ambiente e protegidas da luz.
A p ó s este período as células f o r a m lavadas 8 vezes c o m P B S 1 % ,
depois f o r a m rapidamente lavadas c o m água destilada e as lamínulas f o r a m
montadas c o m glicehna t a m p o n a d a .
As
lâminas
foram
observadas
primeiramente
em
microscópio
de
fluorescência e c a m p o claro convencional O l y m p u s BX60 e posteriormente e m
microscópio de fluorescência Zeiss L S M 510.
Materiais e Métodos
39
3.2.17 Ensaio de Citometria de Fluxo
O ciclo celular foi analisado pela coloração do DNA por iodeto de
propídeo e adquirido e m citômetro d e fluxo
FACSCalibur (BD
Biosciences),
equipado c o m laser de argônio de 1 5 m W , 488 n m , refrigerado a ar, c o m e x p a n s o r
prismático
e
lentes
esféricas,
criando
um
feixe
elíptico
de
20x64pm.
As
m e n s u r a ç õ e s f o r a m realizadas e m câmara retangular de quartzo de 4 3 0 x 1 8 0 p m ,
c o m fluxo de a p r o x i m a d a m e n t e 100 cel/segundo. A s dispersões de luz frontal e
lateral foram detectadas c o m fotomultiplicadores, c o m valores obtidos e m escala
logarítmica. Os sinais luminosos f o r a m c a p t a d o s por filtros de 600/650 para iodeto
de propídeo. O citômetro é acoplado a u m microcomputador que realiza a
aquisição dos parâmetros e a r m a z e n a m e n t o de d a d o s e m disco rígido.
Para a aquisição das amostras foi utilizado o programa CellQuest, e
para análise, o programa ModFit LT (Verity Software House, T o p s h a m , M e m p h i s ,
EUA).
Foram
adquiridos
10.000
eventos
de
cada
amostra,
cada
um
correspondendo a uma célula, através de dois parâmetros, dispersões frontal e
lateral de luz, que representam, respectivamente, t a m a n h o e complexidade da
célula (Chaves, M.M.S., 2004).
De cada clone T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S 1, 4, 8 e das células T 4 7 D L X S N
f o r a m s e m e a d o s 1x10^ células e m garrafas de cultura de 2 5 c m ^ e mantidas sob
as m e s m a s condições anteriormente citadas. A p ó s vinte e quatro horas, as
células f o r a m tripsinizadas, lavadas d u a s vezes c o m 1 m L de P B S gelado e
fixadas e m 1 m L de etanol gelado 7 0 % por 30 m i n . Esta suspensão de células foi
a r m a z e n a d a , protegida da luz a temperatura de 4°C até o dia do ensaio. No dia da
leitura no citômetro, as células foram centrifugadas e m centrífuga eppendorf, a
12000
rpm
por
2
minutos,
o
sobrenadante
aspirado,
e
as
células
foram
ressuspendidas e m I m L de PBS 1 % gelado, passadas para tubos especiais de
1 2 m m X 7 5 m m e m polietileno (BD Discovery Labware) e coradas c o m solução de
iodeto de propídio (50pg/mL e m PBS) e R n a s e A (50pg/mL) por 30 min, à
temperatura a m b i e n t e , no escuro. A análise foi feita por citometria de fluxo, e m
citômetro F A C S C a l i b u r equipado c o m u m c o m p u t a d o r Macintosh Power PC,
modelo
7300/200
(Apple
Computer
Inc.,
Cupertino,
CA,
EUA)
utilizando
o
programa CellQuest (BDIS) (Vindelov.L.L e Christensen, I.J., 1990; Michea L., e
cols.2000).
cmss^.o mmmL
DE Emm MIXIEÃR/SP-IPEÍ
Resultados
40
Resultados
4.1
Seqüênciamento
O c D N A da S I OOP foi sequenciado no seqüênciador A B I 3100® (PE
Applied
Biosystem),
analisado
pelo
programa
Cromas
e
comparado
com
seqüências de banco de d a d o s que d e m o n s t r a r a m que a seqüência da S I OOP por
nós
apresentada
contém
100%
de
similaridade
com
a
S I OOP
conhecida,
c o n f o r m e d e m o n s t r a d o a seguir e este c D N A foi então utilizado e m
nossos
ensaios.
r
>qi|305834161gbIET007289.11
Length = 2 8 8
E
Score = 563 bits (284), Expect
Identities = 284/284 (100^)
Strand = Plus / Hinus
Homo sapiens SlOO calcium binding protein P mRNA, complete cds
e-157
Query: 1
ttgagtcctgccttctcaaagtacttgtgacaggcagacgtgattgcagccacgaacacg 60
I IIIIIIII I IIIIIIIII IIIIIIIIII IIIII II IIIIIIII IIII IIIIIIII IIII
Sbjct: 284 ttgagtcctgccttctcaaagtacttgtgacaggcagacgtgattgcagccacgaacacg 225
Query: 61
atgaactcactgaagtccacctgggcatctccattggcgtccaggtccttgagcaattta 12D
I IIIIIIII II IIIIIIII I III IIII II IIIIIIIIII III IIIIIIIIIIIIIIII II
Sbjct: 224 atgaactcactgaagtccacctgggcatctccattggcgtccaggtccttgagcaattta 165
Query: 121 tccacggcatccttgtcttttccactctgcaggaagcctggtagctccttctccatcagc 180
I II IIIII II IIIIIIIII IIIIIIIIII IIIIIIIIIIIII IIIIII IIIIIIIII II I
Sbjct: 164 tccacggcatccttgtcttttccactctgcaggaagcctggtagctccttctccatcagc 105
Query: 181 accttgagctcccccttggtcagggtctgcgtgctgccctcgctgcccgaatatcgggaa 240
I IIIII III M IIIIIIIII II IIII IIIIIIIIIII IIIIIIII IIIIIIIIIIII III
Sbjct: 104 accttgagctcccccttggtcagggtctgcgtgctgccctcgctgcccgaatatcgggaa 45
Query: 241 aagacgtctatgatcatgcccatggctgtctctagttccgtcat 284
I IIIIIIII IIIIIIIIII IIIIIIIIII IIIIIM III IIII I
Sbjct: 44 aagacgtctatgatcatgcccatggctgtctctagttccgtcat 1
Resultados
4.2
O b t e n ç ã o do c D N A da S1 OOP
4.2.1
Amplificação pela técnica de P C R
41
O vetor pET3a contendo o c D N A da proteína S 1 0 0 P foi amplificado
pela técnica da Reação e m Cadeia da Polimerase (PCR) c o m u m par de "primers"
por nós d e s e n l i a d o que lhe forneceu o sítio reconhecido pela enzima de resthção
Xho\
na extremidade 5 ' da S 1 0 0 P , e da enzima EcoRI na extremidade 3 ' da
S 1 0 0 P ( F i g . 4.1).
5602,X6a I
5562,Ase I ,
5544.8g/ll .!,
5262 .Salí ,
Ase 1,43
,Afllll,134
.Sai 1,170
5 X T A CTC GAG CAT ATG ACG GAA CTA G 3'
Xhol
PCR
5 T T A GAA TTC GGA TCC AGG GCA TCA T 3"
EcoRI
Figura 4.1 E s q u e m a da amplificação por P C R
4.2.2
Preparação do c D N A da S I OOP para o vetor p L X S N
A p ó s a amplificação do c D N A pelo método de PCR, o fragmento
gerado foi digehdo c o m as enzimas EcoRI e Xho\.
Depois este foi precipitado,
purificado e submetido à análise quantitativa e qualitativa e m gel de agarose 1 %
(Figura 4.2). A análise do gel confirmou o t a m a n h o do fragmento (299pb) c o m o
t a m b é m sua pureza. Confirmando portanto a possibilidade de uso do c D N A para
a continuidade do trabalho.
Resultados
42
21000
5148/42002030
1700/ 1300
580
• 299pb
1
2
3
Figura 4.2 Gel de agarose 1 % , c o m a representação do f r a g m e n t o do c D N A da
S 1 0 0 P , utilizado para a construção do vetor L S 1 0 0 P S N .
1)
marcador de peso molecular EcoRI/HindIll (21000pb a 580pb)
2)
marcador de peso molecular 100pb ( 2 0 0 0 p b a 100pb)
3)
c D N A da S1 OOP c o m 299 pb
4.3
Preparação do vetor p L X S N
Para linearizar o vetor e prepará-lo para receber o fragmento
da
S 1 0 0 P , o plasmideo p L X S N foi digerido c o m as enzimas EcoRI e X ^ o l , foi
precipitado, purificado e submetido à análise qualitativa e m gel de agarose 1 %
(Figura 4.3). A análise do gel confirmou não só o t a m a n h o do fragmento (5874pb)
c o m o t a m b é m sua pureza. Neste ponto t í n h a m o s o c D N A e o vetor c o m as
extremidades condizentes para a ligação no sentido anti-sense.
21000
5148/4200
5874pb
2030
1700/ 1301
940
830
580
Figura 4.3 Gel de agarose 1 % , c o m a representação do f r a g m e n t o do vetor
p L X S N , utilizado para a construção do vetor L S 1 0 0 P S N .
1)
Marcador de peso molecular EcoRI/H/ndlll
2)
vetor p L X S N c o m 5874pb
Resultados
4.4
43
L i g a ç ã o d o c D N A d a proteína S 1 0 0 P a o vetor retroviral p L X S N
O c D N A da S 1 0 0 P foi inserido no vetor p L X S N previamente linearizado
c o m as m e s m a s enzimas {Xho\ e EcoRI), utilizando-se a e n z i m a T 4 Ligase
(Figura 4.4), no sentido anti-sense da proteína S 1 0 0 P .
Ecoñ\
',
on
5.9 kb
3'LTR
Xhol
I PBFI322
pLXSN
6.2 kb
S100P-anti-sense
^-
\ ^ 3 LTR
P, 1 f
'' •<
""--ly /
Figura 4 . 4 E s q u e m a da construção d o vetor LS1 OOPSN-anti-sense.
O vetor p L X S N foi digerido c o m as e n z i m a s EcoRI e Xho\. O c D N A da S 1 0 0 P ,
c o m os m e s m o s sitios, foi obtido por P C R e inserido no vetor p L X S N no sentido
anti-sense.
A s bactérias D H 5 a f o r a m transformadas pelo produto da ligação e
obtivemos quatro clones positivos, o u seja, resistentes ao antibiótico Ampicilina.
Resultados
4.5
44
Análise de restrição
A confirmação da ligação foi realizada por análise de restrição, os
f r a g m e n t o s f o r a m digeridos c o m as enzimas Xho\
e E c o R I , para analisar o
t a m a n h o dos f r a g m e n t o s resultantes e c o m a enzima Sacl para avaliar a posição
do inserto (Fig. 4.5). Na figura 4.6 p o d e m o s confirmar o resultado das digestões
e m gel de agarose 1 % .
Escolhemos a e n z i m a de resthção Sacl para a análise de resthção pois
o
vetor
pLXSN
possui
apenas
dois
sítios de
restrição
para
esta
enzima,
localizados nas posições 3 1 6 4 e 414, e a S I OOP possui a p e n a s um sitio,
localizado na posição 99. C o m isso, no caso de inserto positivo encontraríamos
três fragmentos.
5874
S e m inserto:
3124pb
2750pb
C o m inserto anti-sense:
188
3 1 2 4 (2710 + 414)
1 1 5 5 ( 1 0 5 6 + 99)
3164
1 8 6 8 ( 1 6 8 0 + 188)
Figura 4.5 Desenho da análise de restrição c o m a enzima S a c l
Resultados
45
21000
5148/4200
2030
Figura 4.6 Gel de a g a r o s e 1 %
1)
Marcador de peso molecular EcoRI/HindIll
2)
Marcador de peso molecular 10Opb de 2 0 0 0 p b a 10Opb
3)
Plasmideo LS1 OOPSN-anti-sense clivado c o m EcoRI e Xho\ g e r a n d o
f r a g m e n t o s de a p r o x i m a d a m e n t e 5900 (vetor L X S N 5 8 7 4 p b ) e 300pb (S100P)
4)
Plasmideo LS1 OOPSN-anti-sense clivado c o m a enzima SACI gerando
f r a g m e n t o s de 3 1 2 4 p b , 1868pb e 1155pb
5)
Plasmideo L S I OOPSN-anti-sense linearizado c o m a enzima EcoRI gerando
um único fragmento d e a p r o x i m a d a m e n t e 6.200 pb
6)
S l O O P c o m 299 pb
4.6 P r e p a r a ç ã o das células de e m p a c o t a m e n t o Fibroblastos G P + E 8 6
4.6.1 T r a n s f e c ç ã o Transiente e Infecção p e r m a n e n t e
A s células de e m p a c o t a m e n t o G P + E 8 6 f o r a m transfectadas c o m o
vetor
pLSIOOPSN-anti-sense
e
pelo
vetor
vazio
pLXSN
pela
técnica
da
coprecipitação c o m cloreto de cálcio. O s o b r e n a d a n t e , contendo as partículas
virais, foi coletado a p ó s 48 horas do início da transfecção e utilizado para infecção
das células anfotroficas G P + e n v + A m 1 2 . O restante do meio c o m partículas virais
foi imediatamente congelado.
A seleção d o s clones positivos foi realizada c o m o antibiótico G 4 1 8
durante 12 dias.
C o n s e g u i m o s isolar 11 clones positivos A m i 2 L S 1 OOPSN-anti-sense e
4 clones A m 1 2 L X S N . A s células não a p r e s e n t a r a m n e n h u m a alteração fenotípica
durante ou após o término da seleção.
Resultados
46
4.7 Título viral a p r e s e n t a d o pelas células anfotroficas para os c l o n e s
A m 1 2 L S 1 OOPSN-anti-sense
Para
presentes
realizada
no
testarmos
a
sobrenadante
a cultura
capacidade
dos
de fibroblastos
11
da
de
clones
infecção
das
partículas
virais
A m i 2 L S 1 OOPSN-anti-sense
linhagem
de
camundongos
foi
NIH-3T3,
seguida d e infecção pelas partículas virais e seleção d a s células infectadas c o m o
antibiótico G-418, por 12 días. A p ó s a seleção, as placas f o r a m coradas c o m o
corante não vital R o d a m i n a B (Fig. 4.7) e as colonias f o r a m c o n t a d a s e os valores
expressos e m unidade de f o r m a ç ã o d e colonia por mL (ufc/mL).
Figura 4.7 Clone A m 1 2 L S 1 0 0 P S N - a n t i - s e n s e - 6 corado c o m R o d a m i n a B
Conforme
pode
ser
analisado
na
Tabela
4 . 1 , todos
os
clones
a p r e s e n t a r a m títulos iguais ou superiores a lO'* ufc/mL. S e n d o q u e 7 dos 11
clones anti-sense
titulação
(64%)
considerada
boa
apresentaram
valores
entre
1,2
e
1,8x10^
ufc/mL,
para esse tipo de vetor e coerente c o m
valores
encontrados na literatura (Beilini,M.H. 2 0 0 1 ; Mathor,M.B.1994). O s clones c o m
maior poder de infecção, ou seja, c o m o maior título viral f o r a m escolhidos para
infecção d a s células tumorais m a m a d a s T 4 7 D .
C0«fSS^.O MAC!Of*L 06 EK'cft&A fv'üCLEAR/SP-IPEfil
Resultados
47
T a b e l a 4.1 Título viral apresentado pelas células anfotroficas A m 1 2 L S 1 0 0 P S N Anti-sense
Clone
Título (ufc/mL)
1
1 , 5 x 10^
2
1,4 X 10^
3
1,6 X 10^
4
1,6 x 10^
5
1,5 X 10^
6
1,8x 10^
7
0,7 X 10^
8
1,2 X 10^
9
0,9 X 10^
10
0,8 X 10^
11
0,5x10^
Para serem utilizados c o m o controle positivo, f o r a m infectadas células
NIH-3T3 c o m clones A m 1 2 L X S N , seguindo-se os m e s m o s padrões da infecção
d o s clones A m i 2 L S 1 OOPSN-anti-sense. C o n f o r m e d e m o n s t r a d o na Tabela 4.2,
t o d o s os clones apresentaram títulos iguais ou superiores a 10"* ufc/mL .
T a b e l a 4.2 Título viral apresentado pelas células anfotroficas A m 1 2 L X S N
Clone
Título (ufc/mL)
1
1 , 7 x 1 0^ "
2
0,7x10^
3
0,3x10^
4
0,5x10^
Resultados
48
4.8 Cultura de células de c a r c i n o m a ductal m a m á r i o T 4 7 D
As células T 4 7 D d e m o n s t r a r a m ser de difícil cultura e tripsinização,
p e r m a n e c e n d o muito aderidas ás placas e f o r m a n d o g r u m o s ao se soltarem o que
exigiu maior t e m p o para padronização das técnicas de cultura. S e u crescimento
foi lento e para melhiorá-lo f o r a m adicionadas 0,2UI de insulina (WilIard.S.T. e
cols. 1997). A p ó s o domínio d a s técnicas de cultura e m a n u t e n ç ã o , as células
f o r a m utilizadas e m nosso trabaliio.
Na figura 4.8, p o d e m o s visualizar u m a placa c o m células T 4 7 D a p ó s 12
dias de cultura.
Figura 4.8 Célula T 4 7 D e m cultura.
4.9 Infecção das células de c a r c i n o m a m a m á r i o T 4 7 D
Para a infecção das células de carcinoma mamário h u m a n o T 4 7 D ,
f o r a m escolhidos três clones d a s células de e m p a c o t a m e n t o A M I 2LS1 OOPSNanti-sense, dentre os quais estão o s que obtiveram os maiores títulos, que f o r a m
os clones 1, 4 e 8 c o m 1,5x10^ , 1,6x10^ e 1,2x10^ células respectivamente e o
clone
controle A m 1 2 L X S N
infectadas. A infecção
4 que
apresentou
u m título
de 0,5x10'* células
retroviral ocorreu na presença de polibreno que
age
tornando a m e m b r a n a mais permeável. (Mathor,M.B. 1994).
Este ensaio
foi
células, foram s e m e a d a s
realizado
com
duas
concentrações
diferentes
de
1x10^ células e 5x10'* células de cada clone
em
duplicata. Utilizamos d u a s concentrações celulares diferentes para avaliar o
Resultados
49
rendimento da infecção. Porém não o b t i v e m o s diferença significativa entre as
d u a s concentrações. Em todas as placas obtivemos a f o r m a ç ã o de clones após a
seleção c o m G 4 1 8 .
Na
Fig.
4.9
podemos
observar
uma
placa
com
células
T47D
transduzidas o n d e após um período de 7 dias de seleção as colônias se f o r m a r a m
n o r m a l m e n t e e não apresentaram n e n h u m a alteração morfológica, este padrão se
manteve estável até o final do último ensaio celular. A placa que havia recebido
a p e n a s células T 4 7 D sem vetor, que serviu como controle de seleção, não
continha mais n e n h u m a célula viva após o s 12 dias de seleção c o m G 4 1 8 (Fig.
4.10).
Estas
células
passaram
a
ser
denominadas
T47DLS100PSN-A/S
e
T47DLXSN.
Figura 4.9 Célula T 4 7 D infectada c o m o Clone A m 1 2 L S 1 0 0 P S N anti-sense/4, 7
dias a p ó s o início da seleção c o m G 4 1 8
Resultados
50
Figura 4.10 Células T 4 7 D s e m vetor L X S N , após 7 dias de seleção c o m o
antibiótico G-418.
4.10 O b t e n ç ã o de R N A
4.10.1 Extração de R N A dos clones T 4 7 D L S 1 0 0 P S N - A / S e T 4 7 D L X S N
A extração
de
RNA
foi realizada
segundo
protocolo
descrito
Chomczynski e Sacchi (1987). Devido a rápida d e g r a d a ç ã o do RNA,
por
foram
t o m a d a s todas as precauções e m relação à d e g r a d a ç ã o do m e s m o .
C o m o reagente foi escolhido o Thzol®, finalizando-se a extração c o m o
volume de 50|iL.
Para garantirmos u m resultado mais acurado, o RNA foi quantificado
e m espectrofotômetro de capilar a uma leitura DO de 2 6 0 n m e o resultado final
a p ó s cálculo de 40xDO260 foi expresso e m ^ig/mL e está descriminado na tabela
4.3.
Para avaliar o grau de pureza das amostras realizamos t a m b é m a
leitura da DO280 e obtivemos e m todos os casos u m a razão > 1,7 portanto estando
de acordo c o m o s padrões de uso e qualidade de R N A (Tabela 4.3).
Resultados
51
Tabela 4.3 Rendimento da extração de RNA total de células T 4 7 D a p ó s o
processo de extração c o m trizol.
C l o n e T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S
Quantificação de RNA OD260
Razão
T47DLS100PSN-A/S 1
1.030jig/mL
1,85
T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4
600|ig/mL
1,91
T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 8
496fig/mL
1,70
T47DLXSN
1.500|ig/mL
1,91
4.10.2 Eletroforese para avaliar a qualidade do R N A
Para avaliar a pureza e a integridade do RNA extraído das células foi
realizada eletroforese e m gel de agarose com M O P S e formaldeído (Fig. 4.11).
C o m o o R N A t e m a tendência a formar estruturas secundárias e
terciárias, que poderiam impedir a separação por eletroforese e a a d e q u a d a
análise, foi realizada a desnaturação preliminar do RNA, tanto no gel c o m o
auxílio do formaldeído, c o m o por aquecimento pré eletroforese.
Figura 4.11 Gel de agarose c o m M O P S apresentando as s u b u n i d a d e s
ribossomais 28S e 18S
e d e m o n s t r a n d o a integridade e a excelente qualidade do RNA extraído
1)
2)
3)
4)
T47DLXSN
T47DLS1 OOPSN-A/S 1
T47DLS100PSN-/VS4
T47DLS1 OOPSN-A/S 8
cowssAo mícmi
de b&^&a
imewsp-iPEfi
Resultados
52
4.11 Amplificação e quantificação do c D N A
4.11.1 R e a ç ã o e m cadeia da Polimerase e m t e m p o real
A técnica da Reação e m cadeia da polimerase e m t e m p o real ( P C R e m
t e m p o real) t e m d e m o n s t r a d o grande eficiência para avaliar a expressão gênica e
quantificar o c D N A .
Após
padronizar
as
a
transcrição
condições
para
ideais
de
cDNA,
realizamos
temperatura
de
vários
ensaios
anelamento,
que
para
ficou
estabelecida e m 55°C, quantidade de ciclos (40), quantidade de c D N A (2pg) e
escolha do g e n e e n d ó g e n o para controle interno.
Utilizamos
primeiramente
o
GAPDH
(glyceraldehyde-3-phosphate
d e h y d r o g e n a s e ) c o m o g e n e endógeno para validar o ensaio (Wilkening,S. e
Bader, A., 2004), porém este não foi a d e q u a d o para as nossas condições,
d e m o n s t r a n d o muita variação entre ensaios.
E s c o l h e m o s então a ciclofilina A c o m o g e n e e n d ó g e n o (Peinnequin, A.
e cols, 2004), esta escolha se baseou e m referências da literatura e se mostrou
muito mais apropriada para o nosso estudo.
Os d a d o s para a análise f o r a m obtidos pelo próprio programa
do
termociclador, S D S versão 1.9 (Applied Biosystems), que gerou tabelas c o m os
valores relativos de cada limiar, o u seja, u m ponto pré-estabelecido na fase linear
da curva de expressão que representa a melhor emissão de fluorescência. Estes
d a d o s foram exportados para uma tabela Excel (Microsoft) e então analisados
pelo método 2"'^'^*^' e apresentados na f o r m a de tabela (Peinnequin, A. e cols.,
2 0 0 4 ; Peirson,S.N, e cols., 2 0 0 3 ; Y a n g , J. e. cols., 2004).
A figura 4.12 mostra o padrão de expressão do g e n e da ciclofilina A e m
todos os clones. A s curvas são resultantes de um dos ensaios realizados e que
nos forneceram parte dos d a d o s para posterior análise estatística. T o d a s as
amostras f o r a m amplificadas e m triplicata, sendo que as amplificações
das
triplicatas f o r a m muito similares, o desvio padrão
em
n e n h u m a amostra.
não ultrapassou 0,35
Resultados
53
Limiar
0 4 •
- m
1 1 1 I I I ! I a I
1—I 1 I. « J 1 I
* # 10 1S 11 l f 1» ÍS 14 í* í* » » IS W « W
I
s
Figura 4.12 Gráfico obtido e m um dos ensaios de P C R e m t e m p o
apresentando o padrão de expressão da ciclofilina A e m todos os clones.
real
Na figura 4.13 p o d e m o s visualizar o padrão de expressão do g e n e da
S I OOP do m e s m o ensaio mostrado na figura anterior, c o m todos os clones e
todas as amostras e m triplicata.
10- I
¡0
0
Limiar
10- Z ,
M i l
H
II
se «e
40
Figura 4.13 Gráfico obtido e m u m dos ensaios de P C R e m t e m p o real
apresentando o padrão de expressão da SlOOP.em t o d a s as amostras e m
triplicata.
Nas figuras 4.14 e 4.15 a p r e s e n t a m o s a p e n a s as curvas de expressão
do
clone
T47D-LXSN
e
do
clone
T 4 7 D - L S 1 OOPSN-A/S
4
respectivamente
mostrando as expressões da S I OOP e do gene e n d ó g e n o da ciclofilina A.
Resultados
54
S100P
Média= 20,13 ciclos
N=3
Diferença: 2,94
Ciclofilina A
Média = 17,19 ciclos
N=3
Limiar
Figura 4.14 Gráfico obtido e m u m dos ensaios de P C R e m t e m p o real
apresentando o padrão de expressão das células T 4 7 D - L X S N para o g e n e
endógeno e para o g e n e da S I OOP.
As curvas de cor azul marinho, azul claro e rosa c o r r e s p o n d e m ao p n m e r da
ciclofilina A. A s outras c o r r e s p o n d e m ao p h m e r da S I OOP
S100P
Média= 20,49
N=3
Ciclofilina A
Média =16,16
Diferença de 4,33 ciclos
N= 3
Limiar
I I I I • I I I I 11
0
î
*
i
8 10
u
— 1 — I — I
1*
si
tî
11
11
I I I—I—11
¿5 2-i î4 î4 :a
ïû
Si
i I I I I
S-A
-Jt
TÍ
Figura 4.15 Gráfico de P C R e m t e m p o real apresentando a expressão do Clone
T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4
Curvas: verde, amarelo e vermelho: p h m e r ciclofilina A
Curvas: preto, vermelho e azul: p n m e r S I OOP
Levando
em
consideração
o
limiar
admitido
para
as
expressão, obtivemos os valores de ciclos (CT). N o t a m o s que
curvas
houve
de
uma
diferença de expressão entre os dois g e n e s de 2,94 ciclos no clone controle T47DLXSN e esta diferença subiu para 4,33 ciclos no clone T47DLS1 OOPSN-A/S 4. Estes
Resultados
55
valores f o r a m exportados para u m a tabela e analisados pelo m é t o d o 2"^"^^' que
gerou os d a d o s finais apresentados na tabela 4.4.
Este cálculo é sugerido pelo fabricante do aparelho de P C R e m t e m p o
real e foi o escolhido por diversos autores. S e g u e o seguinte phncípio: os níveis
relativos d e expressão do gene alvo são c o m p a r a d o s aos do g e n e e n d ó g e n o e
calculados como 2"^*^^, o n d e ACT = m é d i a s dos C T ' s da S 1 0 0 P - médias dos C T ' s
da ciclofilina A. A razão da expressão do clone T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4 e m relação
a expressão do clone controle T 4 7 D L X S N foi então calculado c o m o 2"^"^*^', o n d e
A A C T = A C T T47DLS100PSN-A/S4- A C T T47DLxsN(Yang,J. e cols. 2004).
Tabela 4.4 Relação de expressão adquihda a partir das médias d o s C T ' s .
S100P média
Ciclofilina A
CT ± erro
média CT ± e r r o
padrão
padrão
ACT*
AACT"
17,13 ±0,21
2,92 ± 0,28
0,00 ±0,28
1,00
16,23 ±0,13
4,34 ± 0,23
1,42 ±0,23
0,37
Amostras
T47D-LXSN
T47D-A/S-4
20,05 + 0,19
20,57 ±0,20
Relação
2-AACt
*ACT = médias dos CT's da S I OOP - médias dos CT's da ciclofilina A
** AACT = ACT (T47D-A/S-4) - ACT da T47D-LXSN (controle)
valores expressos em ciclos
Nesta tabela estão os resultados dos clones T 4 7 D L S 1 0 0 P - A / S 4 e
T47D-LXSN.
Esses
valores
correspondem
a
dois
ensaios
independentes
realizados e m thplicata, totalizando u m n=6. P o d e m o s observar que 9 clone
T47DLS100P-A/S
4
apresentou
apenas
3 7 % da expressão
da
S100P
em
c o m p a r a ç ã o com o T 4 7 D - L X S N . Nos clones T 4 7 D L S 1 0 0 P - A / S 1 e 8 não houve
alteração significativa da expressão d e s s e gene.
Resultados
56
P C R e m t e m p o real
100% 80%
60%
40%
20%
o
iro
to
to
a;
Q.
X
<u
TO
T3
nj
0%
T47D-LXSN
T47D-S100PA/S
Figura 4.16 Gráfico demonstrando a relação de expressão obtida e m PCR e m
t e m p o real.
Células T 4 7 D - L X S N e T 4 7 D L X S N - A / S 4 . Os resultados f o r a m analisados pelo
método 2"'^'^'^'. Resultados analisados pelo teste "t" d e m o n s t r a r a m que a diferença
foi significativa P< 0 , 0 0 1 . Os resultados apresentados são médias ± EP.
Neste histograma consideramos a expressão do clone T 4 7 D - L X S N
c o m o sendo 1 0 0 % e a expressão do clone T 4 7 D - L S 1 0 0 P - A / S 4 sendo relativa a
este controle. P o d e m o s visualizar a significativa diminuição da expressão do g e n e
da
S I OOP.
As
células
transduzidas
com
o
anti-sense
apresentaram
um
decréscimo da expressão de 6 3 % e m relação á expressão das células T 4 7 D
controle.
4.11.2 Gel de a g a r o s e para c o n f i r m a ç ã o do produto de P C R e m t e m p o real
A p ó s a realização do P C R e m t e m p o real foi preparado um gel de
agarose
1,5%
e todas as amostras f o r a m
submetidas
a eletroforese
confirmar a integridade do produto do P C R e m t e m p o real (Figura 4.17).
para
Resultados
1
2
3
4
5
6
7
57
8
Figura 4.17 Gel de agarose 1,5% c o m produto do PCR e m t e m p o real.
1) M a r c a d o r d e peso molecular lOObp
2) T 4 7 D - L X S N
3) T 4 7 D - L S 1 0 0 P - A / S 1
4) T 4 7 D - L S 1 0 0 P - A / S 1
5)T47D-LS100P-A/S4
6) T 4 7 D - L S 1 0 0 P - A / S 4
7)T47D-LS100P-A/S 8
8) T 4 7 D - L S 1 0 0 P - A / S 8
4.12
Microscopia confocal
A microscopia confocal foi utilizada neste trabalho para avaliação da
eficácia da técnica anti-sense e m relação á expressão proteica. O u seja, avaliar
se u m decréscimo de 6 3 % na expressão do clone T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4 sena o
suficiente para demonstrar u m a alteração na concentração proteica celular.
As células f o r a m
marcadas
c o m o anticorpo
da S I OOP, que
na
micrografia p o d e m o s localizar emitindo fluorescência na coloração esverdeada, e
c o m o marcador DAPI que marca o núcleo celular c o m u m a coloração azulada.
Na Figura 4.18 p o d e m o s observar o clone T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S
4
representado nas imagens B, D e F c o m uma marcação do anticorpo da S I OOP
b e m m e n o s pronunciada e m relação as células controle T 4 7 D L X S N Fig. 4.18 A, C
e E sinalizando u m a redução da concentração de proteína S 1 0 0 P celular no clone
transduzído c o m o anti-sense d e s s a proteína.
O ensaio foi repetido três vezes, e m thplicata finalizando c o m u m n=9,
c o m dupla m a r c a ç ã o .
Resultados
58
B
D
Figura 4.18 A , C e E Micrografia confocal do clone T 4 7 D L X S N e B, D
e F do clone T 4 7 D - L X S N - A / S 4 c o m dupla m a r c a ç ã o : S I OOP e m verde e D A P I
e m azul, mostrando
a
imunolocalização
intracelular da proteína S1 OOP.Nas
imagens E e F p o d e m o s visualizar a colocalização da marcação ( S 1 0 0 P e D A P I ) .
Analisando a s imagens n o t a m o s u m a diminuição muito a c e n t u a d a no
t a m a n h o nuclear entre a s células transduzidas e a s controle. Realizamos então
um ensaio histométrico, utilizando o programa Image Lab 2 0 0 0 para calcular o
Resultados
59
t a m a n h o dos núcleos nas d u a s amostras. C o m uma a m o s t r a g e m de 69 células de
cada grupo obtivemos uma diminuição, da média, de 6 5 % do volume nuclear nas
células transduzidas.
Este
ensaio
será
repetido,
p o r é m já d e m o n s t r a
uma
alteração muito importante.
4.13 Ensaio de citometria de fluxo
Para analisarmos se haveha alguma alteração nas fases do ciclo
celular, principalmente visando a fase S do m e s m o , realizamos o ensaio de
citometria de fluxo. A s determinações do conteúdo de D N A nuclear por citometria
de fluxo são obtidas por c o m p a r a ç ã o c o m u m padrão q u e no nosso caso f o r a m as
células T 4 7 D s e m a marcação c o m o fluorócromo de escolha.
As
células
especificamente
e
foram
coradas
com
estequiométricamente
um
ao
fluorócromo
DNA.
Em
que
nossos
se
liga
ensaios
e s c o l h e m o s o lodeto de Propideo (IP) para corar a dupla fita de DNA, pois
segundo Crissman e cols. 1976, o IP e m c o m p a r a ç ã o ao Brometo de Etideo (BE),
outro
fluorócromo
utilizado
para
esta
técnica,
produz
histogramas
com
Coeficientes de variação ligeiramente inferiores aos obtidos c o m B E . Hoje e m dia,
o IP é o corante intercalar mais usado e m estimativas do conteúdo e m DNA
nuclear. C o m o este corante t a m b é m se liga à cadeia dupla de RNA, a precisão
d a s determinações do c o n t e ú d o de DNA utilizando este corante d e p e n d e da
destruição do RNA por Rnases (Price,H. e Johnston, J. 1996).
O conteúdo do D N A foi analisado pela fluorescência 2 (FL2A) área
versus a largura de FL2 ( F L 2 - W ) , que permite excluir a g r e g a d o s de d u a s o u mais
células que poderiam proporcionar u m a super estimação da fração de células e m
G 2 / M ( W u , W . B e cols. 2003). A s porcentagens das células nas fases G 0 / G 1 , S e
G 2 / M f o r a m determinadas c o m o auxílio do programa ModFit LT (Verity Software
House Inc., T o p s h a m , ME, USA).
Na Fig. 4.19 m o s t r a m o s um gráfico de um d o s ensaios realizado c o m o
clone controle T 4 7 D L X S N d e m o n s t r a n d o o padrão de distribuição de células, no
nosso controle, nas diferentes fases do ciclo celular. A fig. 4.20 mostra o padrão
de distribuição
nas diferentes fases do ciclo celular do clone
ccMSSÃo umomi c€
WUCLEAR/SP-ÍPE?*'
transfectado.
Resultados
60
Date acquired: 0«-S«p-04
File: cicxie t47cl real .006
Source: clone t47d real
Case; PATIENT ID
Analysis type: Automatic analysis
Go/G 1=49,74%
<—
DIPLOID: 1 OO.OO %
Dip GO-Gl: 49.74%
Dtp G2-M: 22.84 %
Dip S: 27.42 %
5=27,42%
Total S-Phase: 27.42 %
G2/M=22,84%
Extra Pop: %
Debris: 1.78 %
Aggregates: O.OO %
Modeted Events: 5901
30
Channels
Figura 4 . 1 9 Gráfico g e r a d o pelo p r o g r a m a ModFit c o m a r e p r e s e n t a ç ã o d a s f a s e s
d o ciclo celular
d o clone T 4 7 D L X S N de a c o r d o c o m a q u a n t i d a d e d e D N A m a r c a d o .
Date acquired: 08-Sep-04
File: clone clone 4 PI real 1.010
Source: done clone 4 PI real 1
Case: PATIENT ID
Analysis type: Automatic analysis
0/G1 = 60.79%
DIPLOID: 100.00%
Dip GO-Gl: 60.79 %
Dip G2-M: 22.70%
Dip S: 16.51 %
Totarf S-Phase: 16.51 %
G2/M =22,70%
Extra Pop: %
Debris: 0.00 %
Aggregates: 0.00 %
Modeled Events: 6895
Channels
Figura 4 . 2 0 Gráfico g e r a d o pelo p r o g r a m a ModFit c o m a r e p r e s e n t a ç ã o d a s f a s e s
do ciclo celular do clone T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4 d e acordo c o m a q u a n t i d a d e d e
DNA marcado.
Resultados
61
Na tabela 4.5 p o d e m o s observar os resultados das médias d e quatro
ensaios
com
células
T47DLXSN
usadas
como
controle
e
das
células
T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4 .
T a b e l a 4.5 Distribuição d a s células no ciclo celular, valores estão expressos e m
p o r c e n t a g e m e c o r r e s p o n d e m à média e erro padrão d o s resultados de 4 ensaios
e m duplicata.
C I T O M E T R I A DE F L U X O - Média ± erro padrão
S100P
G0-G1
Fase S
G2-M
T47D-LXSN
54,07 ± 2 , 1 7
34,04 ± 3 , 1 7
11,89 ± 3 , 4 7
T47D-A/S4
57,73 ± 1,25
26,40 ± 3,35
13,26 ± 3 , 6 7
A s análises estatísticas f o r a m realizadas para c o m p a r a r o perfil do ciclo
celular d a s células T 4 7 D L X S N
e T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S clone 4 . O
programa
ModFit especializado e m ciclo celular analisa as seguintes fases: G 0 / G I , S e
G2/M.
O grupo controle apresentou 34,04 % das células na fase S e o grupo
das células c o m anti-sense da S I OOP apresentou uma média de
26,40% das
células na m e s m a fase do ciclo celular. Houve, portanto u m a redução de 2 3 % de
células na fase S entre o grupo d e células controle e das que receberam o vetor
retroviral c o m anti-sense. Aplicando o teste "t" d e Fisher nos valores apresentados
pelos dois clones, o b s e r v a m o s que tanto na fase S c o m o na fase GO-Gl houve
diferença significativa P< 0,01.
Na figura 4.21 representamos graficamente a distribuição das células
nas diferentes fases do ciclo celular.
Resultados
62
Citometria de F l u x o
70
60
«, 50
JS
I 40
IT47D-LXSN
O
IT47D-A/S4
« 30
20 4 —
10
G0-G1
Fase S
G2-M
Figura 4.21 Histograma d e m o n s t r a n d o a distribuição de fases de ciclo celular das
células T 4 7 D - L X S N e do clone T 4 7 D - L X S N - A / S 4. Resultados expressos c o m o
média ±EP
Discussão
63
5 DISCUSSÃO
O Câncer representa um grande problema de s a ú d e pública tanto nos
países desenvolvidos c o m o nos países e m desenvolvimento, e sua incidência
v e m a u m e n t a n d o vertiginosamente no m u n d o . Dentre os diversos tipos de câncer,
o de m a m a está entre os que c a u s a m maior preocupação.
A Organização Mundial da S a ú d e estima que, por ano, o c o r r a m mais
de 1.050.000 de c a s o s novos de câncer de m a m a e m todo o m u n d o , ò que o
torna o mais c o m u m entre as mulheres. No Brasil, não t e m sido diferente.
Informações
processadas
pelos
registros de Câncer de Base
Populacional,
disponíveis para 16 cidades brasileiras, mostram que na década de 90, este foi o
câncer mais freqüente no país. A s maiores taxas de incidência foram o b s e r v a d a s
e m São Paulo, no Distrito Federal e e m Porto Alegre (INCA, 2 0 0 5 ) .
A l é m disso, o câncer de m a m a constitui-se na phmeira causa de morte
por câncer entre as mulheres, registrando-se uma vahação percentual relativa de
mais
de
80%
em
pouco
mais
de
duas
décadas:
a taxa
de
mortalidade
padronizada por idade, para 100.000 mulheres, a u m e n t o u d e 5,77 e m 1979, para
9,74 e m 2 0 0 0 (Ministého da S a ú d e , 2002).
S e g u n d o estimativas do INCA, no Brasil para o ano de 2005 ocorrerão
467.440 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes serão os de pele não
melanoma (56 mil), o s de próstata (46 mil) e do pulmão (17 mil) no sexo
masculino e de pele não m e l a n o m a (57 mil), de m a m a (49 mil) e colo de útero (21
mil) para o sexo feminino, a c o m p a n h a n d o a m e s m a magnitude observada no
mundo (INCA, 2005).
A
detecção
precoce
é
extremamente
importante
para
reduzir
a
mortalidade por câncer de m a m a e por isso o auto-exame e a mamografia são
altamente r e c o m e n d a d o s pela Sociedade A m e h c a n a de Câncer e pelo Instituto
Nacional do Câncer. Os benefícios da detecção precoce ficam muito claros
quando analisamos as taxas de sobrevivência de mulheres diagnosticadas c o m
Discussão
64
câncer de m a m a : para um t u m o r localizado, a taxa de cura é de 9 0 % se
precocemente diagnosticado, esta taxa baixa para 7 0 % nos casos de linfonodos
positivos e chega a m e n o s de 2 0 % nos casos de metástases. Por isso t a m b é m a
incessante busca por novos m a r c a d o r e s do início da d o e n ç a .
Acredita-se
que
entre
90-95%
dos
cánceres
de
mama
sejam
esporádicos e decorram de m u t a ç õ e s somáticas que se verificam durante a vida,
e que 5-10% sejam hereditários (familiares) devido á herança de uma mutação
germinativa que confere maior suscetibilidade ao desenvolvimento de u m câncer
de m a m a (Bilmoha, M. M., 1995).
Os cánceres de m a m a desenvolvem-se c o m o resultado de m u t a ç õ e s
e m váhos o n c o g e n e s e g e n e s supressores tumorais. A p r o x i m a d a m e n t e 5 - 1 0 %
dos cánceres de m a m a são h e r d a d o s c o m o resultado de mutações nos g e n e s
supressores de t u m o r B R C A 1 e B R C A 2 . Mulheres que h e r d a m u m alelo B R C A 1
mutante têm u m a probabilidade de 6 0 % de desenvolver câncer de m a m a e m
torno dos 50 anos. Já os casos esporádicos p o d e m apresentar m u t a ç õ e s e m
váhos outros g e n e s c o m o erbB-2,
c-myc, p53 e Rb. O g e n e erbB-2,
que codifica
um receptor proteína-tirosina quinase é amplificado e expresso e m níveis altos e m
cerca de 3 0 % dos cánceres de m a m a .
C o m o a superexpressão da proteína S I OOP e m células de t u m o r de
m a m a foi associada a imortalização d e s s a s células in vitro e a progressão tumoral
in
vivo
(Da Silva e cols. 2000), decidimos avaliar, se u m a redução
dessa
expressão podeha refletir de alguma maneira no desenvolvimento destas células.
A p e s a r das evidências
de que a S I OOP está
presente
em
uma
v a h e d a d e de cánceres e t e m relação c o m a transformação celular, p e r m a n e c e
obscuro o efeito que esta causa sobre a função celular ( A r u m u g a m , ! . e cols.
2004). A s proteínas da família S I 00 t e m sido objeto de váhos estudos in
assim c o m o in
vivo
nos últimos anos, que avaliam suas diversas
vitro
funções
intracelulares e extracelulares e m situações tanto normais, c o m o patológicas.
P o r é m , ainda existem inúmeras dúvidas sobre sua função e interação 'celular.
Para
proporcionar
uma
base
sólida
para
futuros
estudos
funcionais,
são
necessários ainda muitos trabalhos envolvendo estudos clínicos e terapêuticos,
até se conseguir u m a total c o m p r e e n s ã o sobre a complexidade biológica dessa
proteína.
Discussão
65
E s c o l h e m o s a linhagem de células de carcinoma intraductal m a m á h o
T 4 7 D para receber o vetor retroviral c o m a construção no sentido anti-sense da
proteína S 1 0 0 P , pois trata-se de uma
linhagem celular que apresenta
alta
expressão da proteína S 1 0 0 P (Da S i l v a , l . d . C G . e cols., 2000).
Estas células se mostraram de difícil manuseio, f o r m a n d o colônias que
se a d e h r a m muito às placas, o que dificultou bastante a thpsinização. Poré.m, este
projeto nos f o r n e c e u o domínio na manipulação de células tumorais além do
conhecimento de técnicas analíticas refinadas.
Para realizarmos este estudo, e s c o l h e m o s a técnica de
anti-sense
gene, introduzindo toda a seqüência do g e n e e m sentido contráho no vetor. Essa
técnica foi escolhida c o m o possível fator de redução de expressão do g e n e
( Q u a n , S. e cols, 2001). O p t a m o s pela a b o r d a g e m de anti-sense g e n e
por
considerarmos mais segura, sendo a ligação altamente específica e por ser mais
econômica e portanto a o p ç ã o mais viável para iniciar este projeto.
Q u a n e colabradores (2001), utilizaram a técnica de anti-sense para
avaliar se a superexpressão, assim c o m o a baixa expressão, do g e n e da h e m e
oxigenase h u m a n a I (HO-I) p o d e h a m ser controladas durante um longo período,
baseados
na
introdução
deste gene
nos sentidos
sense e anti-sense.
Os
resultados d e m o n s t r a r a m que células endoteliais transduzidas c o m o reírovírus
contendo o HO-I no sentido anti-sense a p r e s e n t a v a m u m a diminuição nos níveis
de proteína de HO-I de 5 5 % e 4 5 % . Esses resultados f o r a m adquiridos de células
tratadas e não tratadas c o m h e m e respectivamente.
Em um outro estudo realizado por A n n a b e colaboradores e m 2 0 0 0 e
que t a m b é m valeu-se da técnica de anti-sense g e n e e do vetor retroviral p L X S N ,
os resultados f o r a m igualmente positivos. A n n a b tinha c o m o objetivo testar a
hipótese de que o g e n e B R C A 1 d e s e m p e n h a u m importante papel na regulação
da morte de células de t u m o r de ovário, bem c o m o na inibição da proliferação de
células ovahanas. Para tal construiu um vetor retroviral c o m o gene da B R C A 1 e m
sentido anti-sense e infectou células BG-1 (células de a d e n o c a r c i n o m a o v a h a n o )
d e p e n d e n t e s de estrógeno. Os resultados d e m o n s t r a r a m u m a diminuição tanto
dos níveis de RNA c o m o de proteína de B R C A - 1 nas células B G - 1 .
Utilizamos o vetor p L X S N c o m o método de transferência gênica, pois
esse vetor é altamente eficiente e integrativo. O trabalho realizado por Bellini e
cols. e m 2003, d e m o n s t r o u
a alta eficiência
do vetor
retroviral p L X S N
na
Discussão
66
transdução de queratinócitos h u m a n o s p h m á h o s . A produção de h G H , in vitro, foi
de 4Mg/10^ cél. dia e m células não selecionadas e 7,7pg/10® cél. dia e m células
selecionadas c o m 0,6 m g / m L de geneticina.
Em nosso trabalho obtivemos igualmente uma alta eficiência d e s s e
vetor. Os títulos virais apresentados pelas células anfotroficas para os clones c o m
o gene anti-sense assim c o m o para o vetor vazio estiveram todos condizentes
com
os
valores
apresentou
apresentados
um
título
pela
máximo
de
literatura. O
1,8
XI0^
vetor
retroviral
UFC/mL,
resultado
LS100PSN
que
está
perfeitamente e m concordância c o m a literatura.
O resultado da transdução de células de carcinoma m a m á r i o t a m b é m
foi altamente eficiente, e não obtivemos n e n h u m a alteração fenotípica
nas
células selecionadas após a transdução e m n e n h u m m o m e n t o do ensaio, e este
padrão se m a n t e v e até o final do último ensaio. P o d e m o s então, reafirmar a alta
eficiência do vetor p L X S N para transferência gênica.
O
uso
da
técnica
da
reação
em
cadeia
da
polimerase
quantificação gênica e para auxiliar e m diagnósticos moleculares
para
aumentou
tanto, que atingiu um lugar de destaque na medicina diagnóstica. S e u uso inclui
estudos sobre quantificação de marcadores de resistência a drogas e m células
tumorais,
circulantes
monitora
em
respostas
pacientes
a
com
quimioterapias,
câncer,
além
detecta
de detectar
células
tumorais
patógenos
como
bactéhas e vírus (Bustin, S. A., 2000) transformando-se e m um e q u i p a m e n t o
essencial e m laboratórios de pesquisa. A reação e m cadeia de polimerase e m
t e m p o real t e m levado a u m a maior aceitação pela sua rapidez, especificidade,
sensibilidade e reprodutibilidade (Mackay, I. M., e cols, 2002).
Em
nosso
trabalho
utilizamos
esta técnica
com
a finalidade
de
quantificar a expressão do g e n e da S I OOP e m células T 4 7 D normais e nas
células T 4 7 D transduzidas, e para avaliarmos o uso da técnica de anti-sense e m
relação a expressão gênica.
Para obter o c D N A da S I OOP realizamos a transcrição reversa e m
ensaio separado da PCR. Para tal, utilizamos a enzima M-MLV-RT
(Moloney
murine leukaemia vírus) que segundo Bustin (2000) é considerada a melhor
escolha se o objetivo do estudo for a amplificação total do g e n e . Utilizamos oligodT
primers, que
segundo
o
mesmo
autor t a m b é m
é uma
escolha
muito
Discussão
67
interessante, pois maximiza o número de moléculas de m R N A que p o d e m ser
analisadas m e s m o partindo-se de uma amostra p e q u e n a de RNA.
Iniciamos este estudo utilizando o g e n e da G A P D H (glyceraldehyde-3pfispfiate-defiydrogenase) c o m o gene e n d ó g e n o , p o r é m esta escollia apesar de
ter sido t o m a d a b a s e a d a e m trabalhos publicados (Wilkening, S. e Bader, A.,
2004) não foi a d e q u a d a para o nosso ensaio.
Outros trabalhos t a m b é m discutiram a eficiência deste g e n e para uso
c o m o controle e n d ó g e n o , s e g u n d o Theilin e cols., 1999, que sugerem que a
concentração de G A P D H pode vahar muito por inúmeros motivos, levando a u m a
significativa vahação nos niveis de transcrição de G A P D H . Vale ressaltar o
trabalho de Bustin (2000), que compilou vários d a d o s da literatura de pesquisas
envolvendo a metodologia de R T - P C R e, entre outros, o uso de G A P D H c o m o
controle e n d ó g e n o .
E s c o l h e m o s , então, o gene da ciclofilina A c o m o g e n e e n d ó g e n o para
validar o nosso ensaio, por ser u m a proteina de expressão constante, tanto e m
células normais c o m o patológicas (Peinnequin, A. e cols., 2004) o que nos
inspirou muita confiança e m relação aos nossos resultados.
A Ciclofilina A é uma prolina isomerase que foi descoberta graças a
seu poder de ligação à droga imunossupressora Ciclosporina A (Songkai, L. e
cols., 2004). Está envolvida no d o b r a m e n t o celular e nas interações das m e s m a s
proteínas (Theilin, O., 1999).
E s t a b e l e c e m o s 40 ciclos como ideal para esta análise, pois por volta
do ciclo 21 a m b o s o s g e n e s
iniciavam
a fase de aceleração
negativa
de
crescimento da curva e após o ciclo 32 c o m e ç a m o s a notar a estabilização do
platô. P o r é m , c o m o segurança, d e i x a m o s correr mais alguns ciclos.
A escolha pelo método de cálculo da quantificação foi baseada e m
vários trabalhos publicados ( Y a n g , J. E cols. 2 0 0 4 ; Peinnequin, A. e cols. 2 0 0 4 ;
Peirson,S,N. e cols. 2003), pela indicação do próprio fabricante do aparelho
utilizado e na experiência de outros profissionais do laboratório. S e g u n d o este
método escolhido, faz-se a c o m p a r a ç ã o da expressão entre o g e n e e m estudo e
um gene e n d ó g e n o estável. A quantificação é realizada e m relação ao resultado
da subtração do n ú m e r o de ciclos atingidos pelo g e n e e m estudo no m o m e n t o do
limiar (Ct) e pelo Ct do g e n e e n d ó g e n o . Esta diferença de ciclos (ACT) é o que
nos fornece as informações sobre a expressão gênica. O A C T é o exponencial da
Discussão
68
base 2 devido a duplicação do material durante cada ciclo da PCR (Ginzinger, D.
G., 2002).
Os
resultados
obtidos
foram
altamente
expressivos,
e
pudemos
observar que o clone T47D-anti-sense 4 apresentou a p e n a s 3 7 % da expressão
da S 1 0 0 P e m c o m p a r a ç ã o c o m a T 4 7 D - L X S N o que significa u m a diminuição da
expressão d e 6 3 % .
A p ó s tão significativa diminuição da expressão gênica
resolvemos
avaliar a eficácia da técnica de anti-sense t a m b é m e m relação a u m a possível
diminuição da expressão proteica. Ou seja, avaliar se um decréscimo de 6 3 % na
expressão do clone T 4 7 D L S 1 OOPSN-A/S 4 poderia levar a u m a alteração da
concentração proteica celular.
Para tal avaliação l a n ç a m o s mão da técnica de
imunofluorescência
c o m análise das imagens por microscopia confocal. Realizamos u m a
dupla
marcação utilizando um marcador nuclear (DAPI) e o anticorpo específico da
S100P.
A l é m de analisarmos a expressão proteica, o b s e r v a m o s a localização
intra-celular dessa proteina e m células de carcinoma mamário. B a s e a d o s nas
descrições sobre as localizações de outros m e m b r o s da família S 1 0 0 , c o m o
S 1 0 0 A 1 , S 1 0 0 A 2 , S 1 0 0 A 4 e S 1 0 0 A 6 , que f o r a m bem descritos por Mandinova, A.
e cols., e m
localização
1998, cada
intracelular.
A
membro
S100A6
da
foi
família
SI00
localizada
demonstra
principalmente
ter
no
diferente
retículo
sarcoplasmático, assim c o m o t a m b é m no núcleo. A s S 1 0 0 A 1 e S 1 0 0 A 4 f o r a m
encontradas p r e d o m i n a n t e m e n t e no citosol, o n d e f o r a m fortemente associadas ao
retículo sarcoplasmático e ás fibras de actina.
A s imagens obtidas indicam que a S I OOP d e m o n s t r a maior afinidade
ao núcleo nas células de carcinoma ductal mamário T 4 7 D . E pela diminuição da
intensidade de marcação nas células que receberam o anti-sense da S 1 0 0 P ,
concluímos que há u m a diminuição da expressão proteica nestas células.
A s s i m c o m o a maioha dos outros m e m b r o s da superfamília € F , as
proteínas S I 00 a g e m principalmente no meio intracelular, porém alguns m e m b r o s
a g e m t a m b é m no meio extracelular, o n d e atuam junto ao receptor para o produto
final glicosilado ou FIAGE. A s s i m t a m b é m a S I OOP já foi descrita agindo no meio
extracelular e provavelmente interagindo c o m o m e s m o receptor ( A r u m u g a m , ! . e
cols., 2004).
Discussão
69
Outro aspecto e m relação ás células transduzidas que c h a m o u nossa
atenção, foi o t a m a n h o do núcleo destas e m relação ao t a m a n h o nuclear das
células controle. Realizamos então um ensaio histométrico para c o m p a r a m o s o
t a m a n h o dos núcleos e realmente obtivemos um resultado muito expressivo.
Analisando 69 núcleos de células transduzidas e, 69 núcleos de células controle,
obtivemos uma diminuição do t a m a n h o nuclear da grandeza de 6 5 % . C o m o este
resultado é muito impactante pretendemos dar seguimento a esta linha de
estudos.
Para finalizar nosso projeto resolvemos realizar estudos relacionados
ao ciclo celular das células T 4 7 D transduzidas e normais.
A f a s e S d o ciclo celular é, s e m dúvida, o parâmetro mais utilizado para
estimar a c a p a c i d a d e de progressão de células tumorais. Para essa análise
escolhemos a técnica de Citometha de Fluxo. Esta técnica t e m se destacado
c o m o método d e estudo do ciclo celular por ser uma técnica semi-automatizada,
precisa, de a c u r a d a estatística, alta reprodutibilidade, e possibilitando a análise
de u m grande n ú m e r o de amostras e m um t e m p o curto (Rabinovitch, P.S, 1994,
Oliveira, M. S. P., 1993)
Vale lembrar que não há na literatura até o presente m o m e n t o u m
estudo definindo claramente a interação da S I OOP no ciclo celular. Há p o r é m ,
estudos de outros m e m b r o s da família S I 0 0 que a g e m diretamente na regulação
do ciclo celular c o m o a S 1 0 0 B que segundo Baudier e cols., interage c o m a
proteína supressora tumoral p53 protegendo-a contra denaturação e agregações
causadas pelo calor.
U m a vez que essa proteína apresenta 5 0 , 6 % de similaridade c o m a
S I OOP (Da Silva,I.D.C.G. e cols. 2000) acreditamos poder haver t a m b é m alguma
interação da S 1 0 0 P c o m esta o u outra proteína envolvida na m a n u t e n ç ã o do ciclo
celular.
Os resultados da citometria de fluxo d e m o n s t r a r a m que há a l g u m a
interação da proteína S I OOP c o m o ciclo celular, e mostraram que houve uma
alteração significativa na porcentagem de células na fase S do ciclo celular. Se
analisarmos esta fase do ciclo, v e r e m o s que houve uma diminuição de 2 3 % de
células na fase S entre o grupo de células controle e d a s que receberam o vetor
retroviral com anti-sense, já que o grupo controle apresentou 3 4 , 0 4 % das células
e m fase S e o grupo das células c o m anti-sense da S I OOP apresentou uma média
C0«ISSÂO
mtomi D€ íUEmA MüaEÃR/SF-iPEf«
Discussão
70
de 2 6 , 4 0 % das células na fase S do ciclo celular. Portanto o presente estudo
mostra que a redução de níveis de S 1 0 0 P pela técnica anti-sense e m células de
carcinoma ductal mamário T 4 7 D contribuí para a confirmação da hipótese de que
a S 1 0 0 P t e m um significativo papel na regulação do cíelo celular.
A p o i a d o s nos resultados obtidos neste trabalho p o d e m o s afirmar que a
técnica
de
anti-sense
realmente
demonstrou
ser
altamente
eficiente
na
diminuição da expressão gênica da proteína carreadora de cálcio S 1 0 0 P .
Acreditamos que este trabalho tenha sido o inicio de um grande projeto
q u e possa colaborar c o m a elucidação de parte d e s s a s questões. O s clones que
f o r a m construidos neste projeto poderão servir como objeto de novos estudos in
vivo .
Conclusões
71
6 CONCLUSÕES
A técnica de anti-sense foi eficaz para reduzir e m 6 3 % a expressão do
g e n e da proteína carreadora de cálcio S 1 0 0 P e m células de carcinoma
ductal mamário T 4 7 D .
A diminuição do n ú m e r o de células na fase S do ciclo celular, do clone
T47D-anti-sense/4 indica, que a proteína S 1 0 0 P apresenta u m importante
papel na capacidade proliferativa d a s células de carcinoma ductal m a m á r i o
T47D.
O clone T47D-anti-sense 4 , ao nosso ver, é um excelente m o d e l o biológico
para estudos futuros.
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