Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Síntese de Corantes Esquarílicos para Cromatografia de
Afinidade de Biomoléculas
Dissertação de Mestrado em Bioquímica
Vânia Cristina Santos Sena da Graça
Orientador: Professor Doutor Paulo Fernando da Conceição Santos
Co-orientador: Professor Doutor Paulo Jorge da Silva Almeida
Vila Real, 2013
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Síntese de Corantes Esquarílicos para Cromatografia de
Afinidade de Biomoléculas
Dissertação de Mestrado em Bioquímica
Nome do candidato:
Vânia Cristina Santos Sena da Graça
Orientador:
Professor Doutor Paulo Fernando da Conceição Santos
Co-Orientador:
Professor Doutor Paulo Jorge da Silva Almeida
Composição do Júri:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Vila Real, 2013
Agradecimentos
Este espaço é dedicado àqueles que, de alguma forma, contribuíram para que este
trabalho fosse realizado. O espaço limitado desta secção de agradecimentos, seguramente, não
me permite agradecer, como devia, a todas as pessoas que, ao longo do meu Mestrado em
Bioquímica me ajudaram, direta ou indiretamente, a cumprir os meus objetivos e a realizar
mais esta etapa da minha formação académica. Desta forma, deixo apenas algumas palavras,
poucas, mas um sentido e profundo sentimento de reconhecido agradecimento.
Ao meu orientador, Professor Doutor Paulo Santos, expresso o meu profundo
agradecimento pela orientação deste trabalho, que muito contribuiu para elevar os meus
conhecimentos científicos. O apoio, a sabedoria, os ensinamentos constantes, a
disponibilidade manifestada e a confiança depositada contribuíram decisivamente para que
este trabalho tenha chegado a bom termo. Agradeço, ainda, os incentivos constantes, a
paciência e a amizade ao longo de todo este processo.
Ao Professor Doutor Paulo Almeida, o meu sincero agradecimento pela coorientação,
pela simpatia e pela total disponibilidade que sempre revelou ao longo deste projeto.
À Professora Doutora Lucinda Reis agradeço a disponibilidade e a partilha dos seus
conhecimentos.
Às pessoas do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira
Interior com quem tive o orgulho e privilégio de colaborar, com um agradecimento especial
ao Professor Doutor João Queiroz e à Professora Doutora Fani Sousa pela disponibilização
para me receberem no Laboratório de Cromatografia desse Centro e por terem proporcionado
as condições necessárias para eu testar alguns dos meus suportes cromatográficos.
À Marta pela sua simpatia, disponibilidade e principalmente por me receber em sua
casa durante o tempo de trabalho na Covilhã.
Ao Professor Doutor Renato Boto da Universidade da Beira Interior pela
disponibilidade para a realização dos espetros de RMN.
À Mariana, pela sua alegria e as suas palavras de incentivo, ao Félix por estar sempre
pronto a ajudar.
De uma forma muito especial agradeço à Céu e ao André pela sua constante
disponibilidade para tudo, mas acima de tudo pela força, pelo sorriso e pela paciência, nas
horas de desabafo, que sempre me demonstraram.
I
Aos meus pais, irmãos e toda a minha família direta agradeço por todo o apoio,
amizade, auxílio, incentivo, amor, paciência, compreensão e pela confiança que sempre
depositaram no meu trabalho.
Ao meu namorado, ouvinte atento de algumas inquietações, desânimos e sucessos,
pelo apoio, pela confiança e pela valorização sempre tão entusiasta do meu trabalho, dando-me, desta forma, coragem para ultrapassar a culpa pelo tempo que a cada dia lhe subtraía.
Agradeço ainda à Fundação Portuguesa para a Ciência e a Tecnologia a bolsa de
investigação atribuída no âmbito do projeto PTDC/QUI-QUI/100896/2008.
Obrigada por tudo!
II
Resumo
A Cromatografia de Afinidade (CA) é uma das mais importantes técnicas de separação
e purificação de biomoléculas, sendo a mais específica das atualmente disponíveis. Baseia-se
no reconhecimento bioespecífico entre a molécula alvo e um ligando imobilizado numa
matriz.
Nos últimos anos, a CA tem-se tornado usual para a purificação de proteínas, uma vez
que se baseia numa interação específica reversível única entre a proteína e um ligando. Nesta
interação de afinidade, a escolha do ligando é extremamente importante no sucesso do
protocolo de purificação.
O crescente interesse pela CA tem motivado intenso esforço de investigação no
sentido do desenvolvimento de materiais capazes de superar as desvantagens dos ligandos
naturais convencionais, nomeadamente o elevado custo e a labilidade química e biológica.
Neste contexto, os corantes sintéticos surgiram, nas últimas décadas, como uma promissora
alternativa aos ligandos biológicos. Embora a CA com corantes tenha vindo a ser
intensamente investigada, a utilização de cianinas como ligandos é praticamente
desconhecida.
O principal objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de novos suportes
cromatográficos com corantes esquarílicos cianínicos como ligandos capazes de promover
interações seletivas com biomoléculas de interesse.
Para tal, foram sintetizados vários corantes aminoesquarílicos simétricos com grupos
terminais derivados do benzoselenazole, benzotiazole e quinolina, possuindo grupos
pendentes N-alquilo de diferentes comprimentos. O anel central de quatro membros de cada
corante foi funcionalizado com braços espaçadores de diferente extensão, possuindo um
grupo amina terminal para possibilitar a respetiva ligação à matriz cromatográfica. Os vários
corantes sintetizados foram posteriormente imobilizados em agarose (Sepharose CL-6B), em
diferentes concentrações, usando como agentes de ativação 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano e
cloreto de cianurilo.
Foram igualmente sintetizados vários corantes esquarílicos assimétricos, derivados do
benzotiazole, possuindo um grupo pendente N-alquilo num dos heterociclos terminais e um
grupo N-carboxietilo no outro, sendo este último usado para ligação à matriz (Sepharose CL-6B). Neste caso, os corantes foram imobilizados, via amidação, em agarose previamente
ativada com diferentes aminas.
III
Os
compostos
novos
sintetizados
foram
1
caraterizados
espectroscopia de UV/Vis, de IV, de RMN de H e de
13
estruturalmente
por
C e de Massa de Alta ou Baixa
resolução. Os suportes cromatográficos obtidos, quando justificado, foram ainda caraterizados
por Análise Elementar.
Alguns dos suportes cromatográficos foram testados na separação de proteínas no
Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da
Universidade da Beira Interior.
O suporte contendo um corante aminoesquarílico simétrico derivado do benzotiazole,
possuindo cadeias N-hexilo e uma baixa densidade de ligando, permitiu a separação de uma
mistura de lisozima, tripsina e α-quimotripsina. A comparação com um suporte de controlo
permite atribuir a eficácia da separação ao corante imobilizado.
Sepharose ativada com diaminodipropilamina permitiu a separação eficiente de uma
mistura de BSA, RNase A e K-Caseína. Unidades de diaminodipropilamina acilada parecem
ser as principais responsáveis pela separação.
Sepharose ativada com etilenodiamina permitiu uma separação muito eficiente de uma
mistura de BSA, RNase A e lisozima, parecendo ser proporcionada por estruturas resultantes
da ciclização de duas unidades de etilenodiamina, com inclusão de um resíduo de NHS, via
rearranjo de Lossen do ácido hidroxâmico intermediário.
Palavras-chave: cromatografia de afinidade, purificação de biomoléculas, corantes
aminoesquarílicos simétricos, corantes esquarílicos assimétricos
IV
Abstract
Affinity Chromatography (AC) is one of the most important techniques for the
separation and purification of biomolecules, being the most specific one currently available. It
is based on the biospecific recognition between the target molecule and a ligand immobilized
on a matrix.
In recent years, AC has become usual for protein purification, since it is based on an
unique specific reversible interaction between the protein and a ligand. In this affinity
interaction, the choice of the ligand is extremely important to the success of the purification
protocol.
The growing interest in AC has motivated an intense research effort towards the
development of materials able to overcome the disadvantages of conventional natural ligands,
namely the high cost and chemical and biological lability. In this context, synthetic dyes have
emerged, in recent decades, as a promising alternative to biological ligands. Although dye-AC
has been intensively investigated, the use of cyanines as ligands is virtually unknown.
The main objective of this work was the development of new chromatographic
supports with squarylium cyanine dyes as ligands capable of promoting selective interactions
with biomolecules of interest.
For this purpose, several symmetrical aminosquarylium dyes bearing terminal groups
derived from benzoselenazole, benzothiazole and quinoline and having pendant N-alkyl
groups of different length were synthesized. The central four-member ring of each dye was
functionalized with spacer arms of different extension, possessing a terminal amino group to
allow binding to the chromatographic matrix. The various dyes synthesized were
subsequently immobilized on agarose (Sepharose CL-6B), at different concentrations, using
as activating agents 1,4-bis(2,3-epoxypropoxy)butane and cyanuric chloride.
Several unsymmetric squarylium dyes derived from benzothiazole, bearing a pendant
N-alkyl group on one of the ending heterocyclic nucleus and a N-carboxyethyl group on the
other, the latter being used to link to agarose (Sepharose CL-6B), were also synthesized. In
this case, the dyes were immobilized, via amidation, on agarose previously activated with
different amines.
The new synthesized compounds were structurally characterized by UV/Vis, IR, 1H
and
13
C NMR and High or Low Resolution Mass spectroscopy. The chromatographic
supports obtained, when justified, were additionally characterized by Elemental Analysis.
V
Some of the prepared chromatographic supports were tested in the separation of
proteins at the Laboratório de Cromatografia of the Centro de Investigação em Ciências da
Saúde of the Universidade da Beira Interior.
The support containing a symmetrical aminosquarylium dye derived from
benzothiazole bearing N-hexyl groups and a low ligand density allowed the separation of a
mixture of lysozyme, trypsin and α-chymotrypsin. Comparison with a control support
attributed the separation ability to the immobilized dye.
Sepharose activated with diaminodipropylamine allowed an efficient separation of a
mixture of BSA, RNase A and K-Casein. Acylated diaminodipropylamine units seem to be
the main responsible for the separation.
Sepharose activated with ethylenediamine allowed a very efficient separation of a
mixture of BSA, lysozyme and RNase A. In this case the separation seems to be provided by
structures resulting from the cyclization of two units of ethylenediamine with inclusion of an
NHS residue, via Lossen rearrangement of an intermediate hydroxamic acid.
Keywords:
affinity
chromatography,
purification
of
biomolecules,
symmetrical
aminosquarylium dyes, unsymmetrical squarylium dyes
VI
Simbologia, abreviaturas e acrónimos
[M]+
ião molecular
µL
microlitro
13
ressonância magnética nuclear de carbono-13
1
ressonância magnética nuclear de protão
C RMN
H RMN
3-ANB
álcool 3-nitrobenzílico
Abs
absorvância
Ac
acetilo
ADP
adenosina difosfato
AMP
adenosina monofosfato
ATP
adenosina trifosfato
Boc
terc-butoxicarbonil
BSA
albumina de soro humano
Bu
butilo
c.c.
cromatografia em coluna
c.c.f.
cromatografia em camada fina
CA
cromatografia de afinidade
calc.
calculada
CDCl3
clorofórmio deuterado
cont.
continuação
CTP
citidina trifosfato
d
dupleto
dec.
decomposição
DMF
N,N-dimetilformamida
DMSO-d6
dimetilsulfóxido hexadeuterado
DNA
ácido desoxirribonucleico
EDC
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EM
espetrometria de massa
EMAR
espetrometria de massa de alta resolução
ESI
ionização por electrospray
Et
etilo
ex.
exemplo
VII
f
forte
FAB
bombardeamento com átomos rápidos
fr
fraca
g
grama
GTP
guanosina trifosfato
h
horas
Hz
hertz
IgA
imunoglobulina A
IgD
imunoglobulina D
IgE
imunoglobulina E
IgG
imunoglobulina G
IgM
imunoglobulina M
IMP
inosina monofosfato
IV
infravermelho
J
constante de acoplamento (Hz)
L
litro
M
concentração molar
m
multipleto
m/z
razão massa/carga do ião molecular
Me
metilo
méd
média
mg
miligrama
mL
mililitro
mmol
milimole
mol
mole
NAD+
dinucleótido de nicotinamida-adenina no estado oxidado
NADP+
dinucleótido de nicotinamida-adenina fosfato no estado oxidado
NHS
N-hidroxisuccinimida
nm
nanómetro
ºC
graus Celsius
p.e.
ponto de ebulição
p.f.
ponto de fusão
PAGE
electroforese em gel de poliacrilamida
VIII
PDT
terapia fotodinâmica
pH
potencial de hidrogénio
ppm
partes por milhão
PS-DVB
poliestireno-divinilbenzeno
q
quarteto
RMN
ressonância magnética nuclear
RNAse A
ribonuclease A
RPE
ressonância paramagnética electrónica
s
singuleto
SDS
dodecil sulfato de sódio
SDVB
estirenodivinilbenzeno
sl
singuleto largo
t
tripleto
Terc
terciário
TFA
ácido trifluoroacético
THF
tetra-hidrofurano
TOF
tempo de voo
UV
ultravioleta
Vis
visível
δ
desvio químico (ppm)
εmáx
coeficiente de extinção molar máximo (M-1cm-1)
η
rendimento
λmáx
comprimento de onda do máximo de uma banda de absorção (nm)
νmáx
número de onda do máximo de uma banda de absorção (cm-1)
IX
Índice Geral
Agradecimentos
I
Resumo
III
Abstract
V
Simbologia, abreviaturas e acrónimos
Índice geral
Índice de figuras
Índice de esquemas
VII
X
XVIII
XX
Índice de tabelas
XXI
Índice de gráficos
XXII
Capítulo 1 – Introdução
1
1.1 Cromatografia de afinidade
2
1.1.1 As origens da cromatografia de afinidade
2
1.1.2 Princípios básicos da cromatografia de afinidade
4
1.1.3 O suporte e a matriz
6
1.1.4 O ligando
1.1.4.1 Vantagens e desvantagens de ligandos naturais e sintéticos
1.1.5 Imobilização dos ligandos
11
13
15
1.1.5.1 Métodos de ativação da matriz
16
1.1.5.2 Braços espaçadores
16
1.1.5.2.1 Tipos de espaçadores
1.1.6 Principais aplicações da cromatografia de afinidade
1.2 Cromatografia de afinidade com corantes
20
21
23
X
1.2.1 Breve história da cromatografia de afinidade com corantes
25
1.2.2 Cibacron Blue F3G-A e corantes relacionados
26
1.2.3 Interação entre corantes como ligandos de afinidade e proteínas
30
1.2.4 Cromatografia de afinidade com cianinas
31
1.2.5 Cromatografia de afinidade com cianinas esquarílicas
34
Capítulo 2 – Discussão de resultados
37
2.1 Preâmbulo
38
2.2 Síntese de corantes esquarílicos simétricos
38
2.2.1 Síntese dos sais heterocíclicos quaternários 4a-c, 5b e 6b
40
2.2.2 Síntese dos corantes esquarílicos 8a-c, 9b e 10b
40
2.2.3 Síntese dos corantes esquarílicos O-metilados 11a-c, 12b e 13b
43
2.2.4 Síntese dos corantes aminoesquarílicos 14a-c, 15b, 16b e 20b
44
2.2.5 Síntese dos corantes aminoesquarílicos 17a-c, 18b, 19b e 21b
47
2.3 Síntese de corantes esquarílicos assimétricos
49
2.3.1 Síntese dos sais heterocíclicos quaternários 4d e 4e
50
2.3.2 Síntese da 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22)
51
2.3.3 Síntese dos ésteres monossubstituídos do ácido esquárico 23a-d
51
2.3.4 Síntese dos ácidos esquáricos monossubstituídos 24a-d
52
2.3.5 Síntese dos corantes esquarílicos assimétricos 25a-d
53
2.4 Ensaios de imobilização de corantes simétricos à Sepharose CL-6B
2.4.1 Ativação da Sepharose CL-6B com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano
54
54
2.4.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano com os corantes aminoesquarílicos 17b e 17c
55
XI
2.4.3 Ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo
56
2.4.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo com os
corantes aminoesquarílicos 17a-c e 19b
2.5 Ensaios de imobilização de corantes assimétricos à Sepharose CL-6B
57
61
2.5.1 Conversão dos grupos epóxido da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano em grupos amina
61
2.5.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada em 2.5.1 com os corantes 25d
62
2.5.3 Ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina
63
2.5.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina com o
corante 25d
2.5.5 Ativação da Sepharose CL-6B com etilenodiamina
64
68
2.5.6 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com o
corante 25d
68
2.6 Conclusão
73
Capítulo 3 – Parte experimental
76
3.1 Reagentes e equipamentos
77
3.2 Síntese de sais heterocíclicos
78
3.2.1 Síntese do iodeto de 3-butil-2-metilbenzotiazólio (4a)
78
3.2.2 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-metilbenzotiazólio (4b)
78
3.2.3 Síntese do iodeto de 3-decil-2-metilbenzotiazólio (4c)
79
3.2.4 Síntese do iodeto de 3-etil-2-metilbenzotiazólio (4d)
79
3.2.5 Síntese do brometo de 3-(2-carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4e)
79
3.2.6 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-metilbenzoselenazólio (5b)
79
XII
3.2.7 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-metilquinolínio (6b)
3.3 Síntese de corantes esquarílicos simétricos
80
80
3.3.1 Síntese do 4-[(3-butilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8a)
80
3.3.2 Síntese do 4-[(3-hexilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8b)
81
3.3.3 Síntese do 4-[(3-decilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8c)
81
3.3.4 Síntese do 4-[(3-hexilbenzoselenazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (9b)
81
3.3.5 Síntese do 4-[(1-hexilquinolin-3-io-2-il)metilideno]-2-[(1-hexil-1H-quinolinilideno)-metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (10b)
82
3.3.6 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-butil-2-[3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11a)
82
3.3.7 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11b)
83
3.3.8 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-decil-2-[3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11c)
83
3.3.9 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzoselenazól-3-io (12b)
84
XIII
3.3.10 Síntese do trifluorometanossulfonato de 1-hexil-2-[3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]quinolín-3-io (13b)
84
3.3.11 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-butil-2-3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (14a)
84
3.3.12 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól -3-io (14b)
85
3.3.13 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-decil-2-3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (14c)
86
3.3.14 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzoselenazól-3-io (15b)
86
3.3.15 Síntese do trifluorometanossulfonato de 1-hexil-2-3-(1-hexil-1Hquinolin-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilquinolín-3-io (16b)
87
3.3.16 Síntese do iodeto de 3-butil-2-[3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io
(17a)
88
3.3.17 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-aminoetilamino]-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io
(17b)
89
XIV
3.3.18 Síntese do iodeto de 3-decil-2-[3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io
(17c)
89
3.3.19 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]-benzoselenazól-3-io (18b)
90
3.3.20 Síntese do iodeto de 1-hexil-2-[3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]quinolín-3-io (19b)
91
3.3.21 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)hexilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometil-benzotiazól-3-io (20b)
91
3.3.22 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-(6-aminohexilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io
(21b)
3.4 Síntese de corantes esquarílicos assimétricos
3.4.1 Síntese da 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22)
92
92
92
3.4.2 Síntese da 3-butoxi-4-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23a)
93
3.4.3 Síntese da 3-butoxi-4-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23b)
93
3.4.4 Síntese da 3-butoxi-4-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23c)
94
3.4.5 Síntese da 3-butoxi-4-(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23d)
95
XV
3.4.6 Síntese do 4-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24a)
95
3.4.7 Síntese da 4-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24b)
96
3.4.8 Síntese da 4-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24c)
96
3.4.9 Síntese da 4-(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24d)
96
3.4.10 Síntese do 2-[(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]- 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25a)
97
3.4.11 Síntese do 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-2-[(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25b)
97
3.4.12 Síntese do 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-2-[(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25c)
98
3.4.13 Síntese do 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-2-[(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25d)
3.5 Ensaios de imobilização de corantes simétricos em Sepharose CL-6B
3.5.1 Ativação da Sepharose CL-6B com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano
99
99
99
3.5.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano com os corantes 17b e 17c
3.5.3 Ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo
100
100
3.5.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo com os
corantes 17a-c e 19b
3.6 Ensaios de imobilização de corantes assimétricos à Sepharose CL-6B
100
101
XVI
3.6.1 Conversão dos grupos epóxido da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano em grupos amina
101
3.6.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada em 3.6.1 com o corante 25d
102
3.6.3 Ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina
102
3.6.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina com o
corante 25d
3.6.5 Ativação da Sepharose CL-6B com etilenodiamina
103
104
3.6.6 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com o
corante 25d
104
3.6.7 Tratamento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com
EDC/NHS, Ac2O e extração Soxhlet
104
3.7 Realização de ensaios em branco
105
Capítulo 4 – Bibliografia
106
ANEXO A - Publicações no âmbito deste trabalho
117
XVII
Índice de figuras
Figura 1
Princípio esquemático da CA.
5
Figura 2
Gráfico ilustrativo de uma separação eficiente.
6
Figura 3
Estrutura monomérica da agarose (A) e representação da estrutura do gel
de agarose (B).
Figura 4
10
Efeito de um braço espaçador na interação macromolécula-ligando: (A)
ligando diretamente ligado à matriz; (B) o braço espaçador permite o
acesso do ligando ao local de ligação da macromolécula.
19
Figura 5
Exemplos de espaçadores comuns.
20
Figura 6
Estrutura do Cibacron Blue F3G-A.
26
Figura 7
Estruturas de alguns corantes triazínicos usados em CA.
27
Figura 8
Estrutura do corante catiónico Benzamidino Yellow.
28
Figura 9
Estruturas de corantes biomiméticos usados em CA.
30
Figura 10
Fórmula de estrutura geral das cianinas.
31
Figura 11
Estrutura da primeira cianina imobilizada em suportes de celulose.
33
Figura 12
Estrutura da primeira cianina usada como ligando de afinidade.
33
Figura 13
Estrutura da tiacarbocianina usada em estudos de CA.
34
Figura 14
Estrutura geral dos corantes esquarílicos.
34
Figura 15
Exemplos de alguns corantes esquarílicos.
36
Figura 16
Espetros de 1H RMN dos compostos 8a, 11a e 14a.
46
Figura 17
Perfil cromatográfico da separação de uma mistura de lisozima,
α-quimotripsina e tripsina, com uma concentração de 15mg/mL cada,
usando um passo de lavagem com (NH4)2SO4 1 M e um gradiente de
60
XVIII
(NH4)2SO4 de 0,8 M a 0 M (linha a tracejado) com o suporte preparado
com o corante 17b (densidade de ligando: 1,8 x 10-2 mmol/g de suporte)
(adaptado de [110]).
Figura 18
Perfil cromatográfico obtido utilizando o suporte não-tingido após a
injeção de uma mistura de K-Caseina, BSA e RNase A, com uma
concentração de 15mg/mL cada, utilizando Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) no
passo inicial de lavagem, seguido de um gradiente de NaCl de 0 M até 1
M (linha tracejada).
Figura 19
67
Perfil cromatográfico obtido utilizando o suporte não-tingido após a
injeção de uma mistura de lisozima (15 mg/mL) e BSA e RNase A (30
mg/mL), utilizando Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) no passo inicial de
lavagem, seguido de um gradiente de NaCl 0 M até 1 M (linha tracejada).
69
XIX
Índice de esquemas
Esquema 1
Estratégias de ligação para matrizes com grupos hidroxilo.
17
Esquema 1
Estratégias de ligação para matrizes com grupos hidroxilo (cont.).
18
Esquema 2
Síntese geral dos corantes aminoesquarílicos simétricos.
39
Esquema 3
Mecanismo de formação de corantes esquarílicos.
41
Esquema 4
Estrutura de ressonância do anel de quatro membros dos corantes
aminoesquarílicos.
45
Esquema 5
Mecanismo geral de hidrólise ácida do grupo Boc.
48
Esquema 6
Síntese geral dos corantes assimétricos.
50
Esquema 7
Ativação da Sepharose CL-6B com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano.
55
Esquema 8
Ligação de corante aminoesquarílicos à Sepharose ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano.
55
Esquema 9
Ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo.
56
Esquema 10
Ligação de corantes aminoesquarílicos à Sepharose ativada com
cloreto de cianurilo.
58
Esquema 11
Conversão dos grupos epóxidos em aminas.
61
Esquema 12
Ligação do corante 25d à Sepharose ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano derivatizado com grupos amina.
62
Esquema 13
Ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina.
63
Esquema 14
Ligação da amina do braço espaçador ao grupo ácido carboxílico do
corante via EDC/NHS.
65
Esquema 15
Reação de amidação mediada por EDC e NHS.
66
Esquema 16
Possíveis reações que podem ocorrer durante a preparação do suporte
com etilenodiamina.
72
XX
Índice de tabelas
Tabela 1
Propriedades de uma matriz de afinidade ideal.
7
Tabela 2
Exemplos de matrizes comerciais para CA.
9
Tabela 3
Principais designações comerciais da agarose.
11
Tabela 4
Exemplos de ligandos biológicos, sintéticos e suportes apropriados.
12
Tabela 4
Exemplos de ligandos biológicos, sintéticos e suportes apropriados
(cont.).
13
Tabela 5
Comparação entre ligandos naturais e sintéticos.
13
Tabela 6
Ensaios preparados com os corantes 17a-c e densidade de ligando dos
vários suportes cromatográficos.
59
Tabela 7
Suportes preparados com Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina.
70
Tabela 8
Tingimentos realizados com Sepharose CL-6B ativada com cloreto de
cianurilo.
Tabela 9
Análise elementar e densidade de ligando dos vários suportes
cromatográficos
Tabela 10
102
Tingimentos realizados com Sepharose CL-6B ativada com
diaminodipropilamina.
Tabela 11
101
104
Tratamento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina
com EDC/NHS, Ac2O e extração Soxhlet.
105
XXI
Índice de gráficos
Gráfico 1
Espetros de absorção no UV/Vis dos compostos 8a-c possuindo diferentes
cadeias N-alquílicas.
Gráfico 2
Gráfico 3
42
Espetros de absorção no UV/Vis dos compostos 8b, 9b e 10b, possuindo
diferentes heterociclos.
43
Espetros de absorção no UV/Vis dos compostos 23a-d e 25a-d.
54
XXII
Capítulo 1
Introdução
Introdução
1.1 Cromatografia de afinidade
Nas últimas décadas, o crescente aumento do interesse em processos de inovação em
áreas como a biotecnologia, a biomedicina e a bioquímica aplicada, incluindo a pesquisa e o
desenvolvimento de produtos bioquímicos vitais e compostos biofarmacêuticos, tem exigido o
desenvolvimento e aperfeiçoamento de métodos de separação e purificação de biomoléculas
[1,2].
A pureza de uma biomolécula é um importante pré-requisito para a sua aplicação, tal
como o rendimento do processo utilizado. No entanto, o grau de pureza exigido varia de
acordo com a finalidade para a qual a biomolécula é usada. Para aplicações terapêuticas, um
elevado nível de pureza (> 99,9%) é necessário de modo a minimizar o risco de efeitos
secundários ou de respostas imunogénicas; para aplicações industriais, tais como na indústria
alimentar ou na produção de detergentes domésticos, uma pureza inferior é suficiente [3,4].
Atualmente a técnica potencialmente mais seletiva e eficaz para a purificação de proteínas e
outras macromoléculas biológicas é a CA. Esta explora o princípio do reconhecimento
biomolecular, isto é, a capacidade de reconhecimento de macromoléculas biologicamente
ativas por ligandos de afinidade, originando complexos específicos e reversíveis [3,5,6].
A interação global entre a molécula alvo e o ligando imobilizado sobre uma
matriz é o resultado da combinação de vários tipos possíveis de interações moleculares,
nomeadamente, eletrostáticas, hidrofóbicas, ligações de hidrogénio e interações de Van der
Waals [4].
A CA, quando comparada com outras técnicas de purificação convencionais baseadas,
por exemplo, na precipitação com sais, na variação de temperatura ou pH e na utilização de
polímeros de elevado peso molecular, poderá ter a capacidade de reduzir o número de etapas
do processo de purificação, aumentando os rendimentos finais e diminuindo os custos do
equipamento necessário [7].
1.1.1 As origens da cromatografia de afinidade
Embora, por vezes, se considere a CA um método relativamente recente,
a literatura refere a sua primeira aplicação em 1910, por Emil Starkenstein, como
resultado
do
estudo
da
ligação
de
amido
insolúvel
à
enzima
α-amilase,
2
Introdução
sendo também este o primeiro caso conhecido em que a cromatografia líquida foi usada para
separação de uma proteína [8]. O amido insolúvel utilizado por Starkenstein atuou tanto como
material de suporte, como substrato para a amilase, levando assim à ligação e à retenção desta
enzima. Estudos similares de CA com amido e amilase foram desenvolvidos por outros
investigadores entre 1920 e 1940 [9]. Outros exemplos incluem a utilização de
poligalacturonase simultaneamente como suporte e como ligando para a adsorção de ácido
algínico, o isolamento da elastase suína usando elastina [8] e a purificação de pepsina através
da utilização de edestina, uma proteína cristalina [10].
Contudo, nem todo o trabalho desenvolvido nessa altura se baseou na purificação de
enzimas; também se desenvolveram técnicas que permitiam a purificação específica de
anticorpos recorrendo a ligandos biológicos como evidenciou Landsteiner, em 1920,
mostrando que os anticorpos podem reconhecer e ligar-se a substâncias com um estrutura
específica, referida como "antígenos" [8]. Este tipo de ligação, para além de permitir a
formação de complexos insolúveis com os antigénios, levou ao desenvolvimento, dez anos
mais tarde, da imunoprecipitação como uma importante técnica para a purificação de
anticorpos [11,12]. Esta descoberta serviu de base ao trabalho realizado por Kirk e Sumner
para a purificação de anticorpos usando a urease e para demonstrarem que estes anticorpos
eram proteínas [8], bem como para a purificação de outras enzimas.
No entanto, e apesar de todos estes progressos, a popularidade da CA foi relativamente
reduzida devido à complexidade encontrada para a obtenção de ligandos apropriados e/ou
suportes disponíveis. Este obstáculo começou finalmente a ser ultrapassado entre 1940 e 1950
quando surgiram novas técnicas de síntese que permitiram aceder a uma vasta gama de
ligandos para matrizes insolúveis. Estes suportes começaram por ser sólidos revestidos por
uma camada de um ligando capaz de estabelecer ligações não covalentes com a matriz [8].
Mais tarde verificou-se a necessidade de ter sistemas quimicamente mais estáveis
relativamente à natureza da ligação do ligando à matriz. Em 1951, um trabalho desenvolvido
por Campbell e colaboradores, em que foi utilizada uma forma ativada de celulose para
imobilizar a albumina do soro, permitiu um grande avanço na utilização desta técnica
cromatográfica [13]. Vários trabalhos foram realizados nos anos seguintes, nomeadamente
por Lerman, no sentido de um maior aperfeiçoamento de métodos de imunopurificação
[8,14]. Em 1960 Arsenis e McCormick utilizaram suportes à base de celulose para o
isolamento de algumas enzimas [15,16].
3
Introdução
O próximo grande desenvolvimento da CA ocorreu precisamente na década
de 60 e baseou-se, fundamentalmente, em três descobertas: a primeira, foi a descoberta de um
suporte mais eficiente e mais flexível do que a celulose para utilização com biopolímeros - a
agarose - em meados de 1960 por Hjerten [8]; a segunda, foi a invenção de
um método eficiente de imobilização usando brometo de cianogénio, em 1967,
por Axen e colaboradores [8]; e a terceira, ocorreu em 1968, imaginada por Cuatrecasas e
colaboradores [17], e resultou da utilização simultânea das duas descobertas anteriores,
dando origem, pela primeira vez, à utilização do termo CA para definir o processo
desenvolvido.
Estes resultados fomentaram claramente o uso generalizado da CA, a qual
passou a ter grande impacto nas técnicas de separação de biomoléculas, surgindo
nos anos seguintes a introdução de métodos tais como a CA com DNA-celulose,
a CA com boronato, a CA de iões-metálicos e, recentemente, a CA usando
corantes [8,18].
A CA continua em constante desenvolvimento e tem desempenhado um
papel central em diversas tecnologias das áreas da bioquímica e da biotecnologia como a
genómica, a proteómica e a metabolómica, possibilitando aos investigadores explorar, por
exemplo, os mecanismos responsáveis por interações proteína-proteína, a modificação
química de uma cadeia proteica depois do seu processo de tradução e ainda a degradação de
proteínas, fenómenos cujo estudo não era possível anteriormente. O acoplamento da CA de
fase inversa à espetrometria de massa tem auxiliado na descoberta de biomarcadores de
proteínas [18,19].
1.1.2 Princípios básicos da cromatografia de afinidade
A separação de uma dada proteína por CA depende das interações reversíveis
entre a proteína a ser purificada e o ligando de afinidade preso à matriz. A maioria das
proteínas tem um local de reconhecimento intrínseco que pode ser utilizado para
selecionar o ligando de afinidade apropriado. A proteína a separar e o ligando usado para essa
separação devem ser escolhidos tendo em conta tanto a especificidade como a reversibilidade
da ligação que se estabelece entre ambos [7].
Neste método, uma molécula com capacidade de reconhecimento específico (ligando)
é imobilizada num suporte insolúvel, designado por matriz, como, por exemplo, a agarose.
4
Introdução
Procede-se então ao empacotamento da coluna cromatográfica com a matriz previamente
ativada com o ligando. Uma amostra contendo o composto de interesse é injetada na coluna,
sob condições favoráveis, promovendo a ligação do analito de interesse ao ligando
imobilizado. Estas condições envolvem, tipicamente, a utilização de um tampão aquoso com
um pH e uma força iónica que imitam o ambiente natural do ligando e do seu alvo. Os
compostos da amostra que têm pouca ou nenhuma interação com o ligando irão ser removidos
da coluna durante o passo da lavagem. As moléculas alvo são então eluídas usando tampões
de eluição, com composição diferente do tampão inicial, sob condições que enfraqueçam a
afinidade entre o ligando e a macromolécula, como o ajustamento do pH, da força iónica ou
da temperatura, usando solventes específicos ou ligandos livres competitivos, para que a
interação entre o ligando e a molécula alvo seja quebrada e esta seja obtida na forma
purificada [8]. Depois da molécula alvo ter sido eluída, a coluna pode ser regenerada, antes da
aplicação seguinte, fazendo passar pela mesma, por exemplo, um tampão igual ao usado no
início de cada ensaio (figura 1).
Figura 1 - Princípio esquemático da CA.
5
Introdução
Vários métodos de deteção podem ser usados para identificar e quantificar o analito de
interesse, tais como a absorvância, a fluorescência ou a espetrometria de massa [20].
Na figura 2 está representado um gráfico ilustrativo de uma separação eficiente obtida
por CA, no qual se relaciona a resposta obtida durante uma eluição com o tempo de eluição
ou com o volume de eluente gasto.
Figura 2 - Gráfico ilustrativo de uma separação eficiente.
A purificação de proteínas por CA distingue-se assim de todas as outras técnicas de
separação uma vez que não se baseia nas diferenças das propriedades físico-químicas das
moléculas a separar [4]. A absoluta dependência da interação de afinidade do reconhecimento
biológico implica que o processo preserve a atividade biológica e/ou imunológica da proteína
a isolar [6].
1.1.3 O suporte e a matriz
O termo suporte diz respeito à combinação de um ligando, de configuração molecular
conhecida, imobilizado numa matriz que, na maioria das vezes, é um material insolúvel no
sistema em que se encontra a molécula a purificar [21].
Um item fundamental na seleção e elaboração de um método de CA é a
escolha da matriz e, tal como no caso dos suportes utilizados noutras modalidades
de cromatografia, as matrizes para CA necessitam satisfazer certos critérios (tabela 1)
[8,22,23].
6
Introdução
Tabela 1 - Propriedades de uma matriz de afinidade ideal [6].
Propriedades de uma matriz ideal
Inerte
Hidrofílica
Não biodegradável
Estável mecânica e quimicamente
Facilmente derivatizável
Boas características de fluxo
Ausência de efeitos de adsorção não específicos
Económica
Uma característica importante de uma matriz prende-se com o fato de esta dever ser
inerte relativamente aos outros solutos, isto é, dever apresentar uma adsorção extremamente
baixa e não específica em relação aos componentes não desejados da amostra a purificar. A
adsorção não desejada pode ser comprometida pela presença de grupos carregados ou
hidrofóbicos na sua superfície. Evitar a adsorção não específica é essencial porque o poder de
absorção de afinidade depende da interação específica entre o ligando imobilizado e as
moléculas alvo dentro do meio de adsorção [22].
Uma vez que quase todas as separações por afinidade ocorrem em soluções aquosas, a
matriz deve ser preferencialmente hidrofílica. Tal permite não só reduzir a adsorção não
específica de compostos indesejados, mas também promover a dilatação dos poros da matriz
em meio aquoso, com consequente diminuição do volume intrínseco da estrutura da matriz
[6,8,22-24].
Outra característica que a matriz deve apresentar é ser não biodegradável, ou seja, ser
resistente a ataques provocados por agentes biológicos presentes na mistura a separar.
A matriz deve ser física e quimicamente estável numa ampla gama de condições, tais
como valores de pH altos e baixos, intervalos largos de temperaturas, utilização de diferentes
solventes orgânicos, detergentes e eluentes, especialmente para eluições difíceis ou passos de
regeneração, bem como ser resistente a processos mecânicos como a agitação [21-24].
7
Introdução
Uma outra característica importante é que a matriz possa ser facilmente derivatizada
quimicamente, necessitando, para isso, de possuir grupos funcionais superficiais (por exemplo
hidroxilo, carboxilo, amida) que permitam a imobilização dos ligandos.
A matriz deve ainda ser altamente porosa para permitir a imobilização de uma elevada
quantidade do ligando e, portanto, possuir grande capacidade de adsorção da molécula alvo.
No entanto, nem sempre um alto nível de substituição da matriz é sinónimo de uma elevada
capacidade adsorvente. O acesso rápido de analitos ao ligando requer que os poros da matriz
sejam de pequenas dimensões. Por outro lado, como na maioria dos casos o ligando e/ou a
molécula alvo são proteínas de grande tamanho, torna-se necessário que os poros apresentem
dimensões maiores, tornando a estrutura do suporte cromatográfico mais solta e permitindo
que as moléculas alvo se movimentem mais facilmente no seu interior durante as etapas de
separação, proporcionando assim uma eluição mais rápida. A caracterização física do suporte
em termos do tamanho das partículas e do tamanho, volume e área superficial dos poros, deve
ser tida em conta quando se pretendem boas características de fluxo, pois tal ajuda na
determinação da velocidade de transferência de massa do soluto dentro do leito
cromatográfico e da sua capacidade efetiva de ligação ao ligando [6,21-23].
É igualmente importante poder obter matrizes de baixo custo que possam resultar em
técnicas de separação não muito dispendiosas [23].
Na realidade, não existe uma matriz verdadeiramente ideal para CA dado que,
infelizmente, muitos dos requisitos referidos estão em conflito direto entre si. Como
resultado, todas as matrizes de afinidade atuais envolvem algum compromisso entre essas
propriedades e, portanto, o processo de seleção da matriz permanece largamente empírico e
dependente dos requisitos de cada aplicação.
Atualmente um grande número de matrizes para separação por CA estão
comercialmente disponíveis (tabela 2).
De longe, a matriz mais utilizada em CA é a agarose, não só devido à sua introdução
numa fase inicial do desenvolvimento desta técnica de separação mas também porque esta
possui a maioria das propriedades de uma matriz ideal, nomeadamente: estrutura porosa larga,
uniformidade esférica das partículas, boa estabilidade em gel e presença de grupos suscetíveis
de ativação e fixação química de ligandos [22,25].
Hoje em dia a agarose é utilizada como matriz de fase sólida em mais de 90% das
aplicações da CA [26].
8
Introdução
Tabela 2 - Exemplos de matrizes comerciais para CA [8, 22].
Nome comercial
Tamanho da
partícula (μm)
Material
Sepharose 4B ou
6B
60-140
45-165
Agarose
Trisacryl
40-80
60-180
Derivado de poliacrilamida
Ultrogel
60-140
Poliacrilamida e agarose
Sephadex
10-300
Dextrano reticulado
Magnogel
60-140
Poliacrilamida e agarose com 7%
de Fe3O4
Superose
10-12
Agarose
Lichrospher
5-10
Sílica
Bakerbond
40
Sílica
TSK- Gel
Matrex Cellufine
20-40
Polimetacrilato
40-120
Celulose
Zorbax
5
Affi-Gel
75-150
Agarose
Affi-Prep
10-50
Polimetacrilato
Eupergit C
30
Bio-Gel A
38-75
Poros-50
50
Fractogel TSK
ProteinPak
30-65
40
Sílica
Metacrilato
Agarose
Poliestireno
Polimetacrilato
Sílica
A agarose tem uma estrutura primária que consiste em resíduos alternados de D-galactose e 3,6-anidro-L-galactose (figura 3). A presença de resíduos de açúcar torna a
agarose uma matriz hidrofílica não carregada, com abundância de álcoois primários e
secundários, que podem ser usados na ativação e ligação [21]. Os grupos hidroxilo presentes
9
Introdução
na agarose, depois de derivatizados, permitem facilmente a imobilização dos ligandos através
de ligações covalentes.
(A)
(B)
Figura 3 - Estrutura monomérica da agarose (A) e representação da estrutura do gel de agarose (B) [27].
A agarose é mais do que um simples conjunto de resíduos de açúcares. As estruturas
secundárias e terciárias da agarose podem ser descritas como fibras únicas rodadas num fio de
fibras múltiplas formando uma malha com grandes poros acessíveis. A estrutura porosa em
malha da agarose é nodosa, estabelecendo-se ligações de hidrogénio fortes na junção dos
poros, que podem ser quebradas (causando a desagregação dos nós) com o aquecimento ou na
presença de agentes desnaturantes. A fim de aumentar a sua resistência física e química, e
também para controlar a sua estabilidade estrutural, os nós de agarose modificados
quimicamente com uma ligação covalente cruzada, introduzida com reagentes como, por
exemplo, a epicloro-hidrina ou a divinilsulfona, originam a agarose de ligação cruzada (por
exemplo, Sepharose CL-6B). Este tipo de agarose é usado na maioria das aplicações de CA
que requerem ativação ou condições de uso rigorosas. Infelizmente, as ligações
intermoleculares e a estabilidade mecânica da agarose, resultantes da ligação cruzada,
proporcionam a perda de grupos hidroxilo ativos (aproximadamente 30-50%) que são
consumidos nas reações químicas conducentes às ligações cruzadas.
A estrutura apresentada pela agarose de ligação cruzada produz um suporte de
afinidade com capacidade superior (em termos de massa de molécula alvo a separar por
volume de suporte) quando aquela (ou o ligando) é uma proteína de grandes dimensões ou um
polissacarídeo [21,22].
Este tipo de matriz é atualmente comercializado sob várias designações (tabela 3).
10
Introdução
Tabela 3 - Principais designações comerciais da agarose [21].
Companhia
Nome comercial
Sepharose 2B, 4B, 6B
Sepharose CL-2B, CL-4B, CL-6B
GE Healthcare Life Sciences
Superose
Sepharose Fast Flow
BioRad
Bio-gel A
IBF
Ultrogel
1.1.4 O ligando
O ligando desempenha um papel fundamental no sucesso dos processos de separação e
purificação baseados em interações de afinidade como é o caso da CA.
A seleção do ligando para esta técnica é influenciada, principalmente, por dois fatores:
um deles é a necessidade do ligando exibir uma especificidade de afinidade reversível para a
substância a ser purificada; e o outro é que possua grupos quimicamente modificáveis que
permitam a sua união à matriz sem destruir a sua atividade [23].
Hoje em dia existe uma grande variedade de ligandos que podem ser classificados
como naturais ou biológicos (ex: proteínas, anticorpos, antígenos, enzimas, oligonucleótidos,
péptidos, oligossacáridos) ou não biológicos, pseudo-específicos ou sintéticos (ex: metais,
aminoácidos, corantes, ligandos biomiméticos) [6]. Na tabela 4 são apresentados alguns
exemplos destes tipos de ligandos.
De
acordo
classificada
em
com
o
tipo
diferentes
de
categorias
ligando
como,
a
usar
por
em
CA
exemplo:
esta
pode
ser
cromatografia
de
bioafinidade (que inclui várias subcategorias como a CA com lectina, CA com
proteína
A
ou
proteína
G,
entre
outras),
CA
com
boronatos,
de imunoafinidade, CA usando iões metálicos, CA com corantes e CA
cromatografia
biomimética
[8,20,28].
11
Introdução
Tabela 4 - Exemplos de ligandos biológicos, sintéticos e suportes apropriados [6].
Ligando
Suporte apropriado
Concanavalin A
Con A Sepharose
Agarose (45-165 μm)
Gérmen de trigo Lectina
Lentil lectin
Sepharose
Agarose (45-165 μm)
Helix pomatina
Helix pomatina
Agarose (200-300 μm)
Lectina
Lectin Sepharose 4MB
Heparin Avidgel P
Polímero (40-120 μm)
HiTrap Heparin
Agarose (34 μm)
Heparina Sepharose CL6B
Agarose (45-165 μm)
IgG Sepharose 6 FF
Agarose (45-165 μm)
HiPac Protein A
Sílica (30 μm)
AffiPrep Protein A
Polímero (40-60 μm)
HiTrap Protein A
Agarose (34 μm)
Protein A Avid Gel F
Polímero (40-120 μm)
Poros A
PS-DVB (15-25 μm)
Gammabind Protein G
Sílica (30 μm)
HiTrap Protein G
Agarose (34 μm)
Protein G Sephrose
Agarose (45-165 μm)
Poros G
SDVB (15-25 μm)
Benzamidina
Benzamidine
Agarose (45-165 μm)
5’-AMP
5’-AMP Sephrose
Agarose (45-165 μm)
2’, 5’-ADP
2’, 5’-ADP Sephrose 4B
Agarose (45-165 μm)
7-metil-GTP
7-metil-GTP
Agarose (45-165 μm)
Heparina
IgG
Biológicos
Nome comercial
Proteína A
Proteína G
12
Introdução
Tabela 4 - Exemplos de ligandos biológicos, sintéticos e suportes apropriados (cont.).
Ligando
Nome comercial
Suporte apropriado
HiTrap Blue
Agarose (34 μm)
Blue Sepharose 6
Cibacron Blue F3G-A
Sintéticos
Blue Sepharose CL-6B
Procion Red HE-3B
Red Sepharose CL-6B
Agarose (45-165 μm)
6% reticulada
Agarose (45-165 μm)
6% reticulada
Agarose (45-165 μm)
6% reticulada
Lysine AvidGel P
Polímero (40-120 μm)
Lysine Sepharose
Agarose (40-165 μm)
Arginina
Arginine Sepharose
Agarose (40-165 μm)
IgG
Avid AL
Polímero (40-120 μm)
Lisina
1.1.4.1 Vantagens e desvantagens dos ligandos naturais e sintéticos
Os principais fatores que servem de base de comparação entre ligandos naturais e
sintéticos são a seletividade, a capacidade de ligação a diferentes biomoléculas, a estabilidade
química e biológica, o tempo de vida e o custo associado quer à sua aquisição, quer à sua
produção (tabela 5). A competição entre laboratórios dedicados a ligandos sintéticos ou
biológicos é intensa, resultando numa corrida para demonstrar qual a classe de ligandos mais
promissora [5].
Tabela 5 - Comparação entre ligandos naturais e sintéticos [5].
Classe de
ligandos
Fator de comparação
Seletividade
Estabilidade
Capacidade
Custo
Toxicidade
Naturais
Muito alta
Baixa a média Baixa a média
Médio a alto
Sinteticos
Médio a alta
Alta
Baixo a médio Em estudo
Alta
Baixa
13
Introdução
A principal vantagem dos ligandos biológicos é a sua elevada seletividade e afinidade.
No entanto, devido à sua natureza biológica e aos métodos de produção, estes ligandos
tendem a ser caros e instáveis e, por isso, o seu uso torna-se limitado em situações envolvendo
variações de temperatura ou outras condições adversas, como o pH ou o uso de certos
solventes orgânicos. Condições de esterilização e limpeza, que são centrais para todo o
processo de produção de um produto biológico, provocam a degradação do ligando
imobilizado, encurtando assim o seu tempo de vida e originando a contaminação do produto
final com lixiviados potencialmente tóxicos ou imunogénicos. Para além disso, existe também
a possível contaminação proveniente da fonte biológica (por exemplo, com DNA ou com um
vírus hospedeiro), conduzindo a uma baixa capacidade de ligação de proteínas, aumentando
assim o custo do produto final [5-7,29]. Outra desvantagem destes ligandos, inerente à sua
instabilidade química, é o fato de dificilmente poderem ser reutilizados e requererem
condições mais rigorosas de armazenamento do que os ligandos sintéticos [30].
Os ligandos sintéticos ou pseudo-específicos parecem ultrapassar eficazmente a
maioria dos problemas discutidos acima. No entanto, este tipo de ligandos pode apresentar
uma redução da seletividade/afinidade relativamente à dos ligandos biológicos. Outras
preocupações que surgem relativamente a este tipo de ligandos, dizem respeito à sua
toxicidade e biocompatibilidade, tornando necessários estudos experimentais aprofundados
que permitam maior conhecimento sobre a influência destas propriedades na utilização dos
ligandos sintéticos em técnicas de separação e purificação [5].
Este tipo de ligandos é muitas vezes realizado por alterações estruturais específicas de
corantes pré-existentes, de modo a otimizar condições de ligação e eluição, originando
ligandos robustos e não suscetíveis à desnaturação. Os ligandos sintéticos são também mais
estáveis sob fortes condições de eluição do que os respetivos corantes de partida [6].
Os exemplos mais conhecidos de ligandos sintéticos são os corantes têxteis. A maioria
destes ligandos, incluindo o corante azul Cibacron F3G-A, contém uma triazina substituída,
com sistemas de anéis aromáticos policíclicos e grupos doadores ou recetores de eletrões. Os
corantes de triazina imitam a ligação de substratos naturais heterocíclicos aniónicos tais como
os ácidos nucleicos, os nucleótidos, vitaminas e coenzimas e, provavelmente, representam o
primeiro exemplo de ligandos para ligação a proteínas. No entanto, a seletividade, a pureza e
a toxicidade dos corantes comerciais limitam a sua utilização na área biofarmacêutica, o que
tem levado à pesquisa de corantes biomiméticos e à adoção de técnicas racionais de design
molecular [2,7,29].
14
Introdução
A CA recorrendo à utilização de métodos computacionais ou de química combinatória
para o design de corantes e outros ligandos para um alvo particular, é conhecida
como CA biomimética. Esta abordagem, relativamente recente, tem-se revelado
de grande interesse como ferramenta para a purificação de proteínas para produtos
farmacêuticos [20].
1.1.5 Imobilização dos ligandos
São vários os métodos disponíveis para a imobilização de ligandos à matriz de suporte.
A escolha do método e das condições apropriadas de acoplamento dependem da matriz e do
ligando, devendo ser compatível com ambos [22].
Em geral, o processo de imobilização de um ligando divide-se em três etapas [23]:
1. Ativação da matriz, de modo a torná-la reativa em relação aos grupos funcionais
do ligando;
2. Ligação do ligando à matriz;
3. Desativação ou bloqueio dos grupos ativos residuais.
No caso de ligandos reativos eletrófilos, as etapas 1 e 3 não se aplicam, resumindo-se
o processo à ligação direta do corante à matriz (etapa 2).
A ativação é definida como um processo de modificação química da matriz, com o
objetivo de que esta se torne reativa e se una ao ligando por meio de ligações covalentes. O
objetivo deste processo é ligar, de um modo eficiente e firme, um ligando específico a uma
matriz insolúvel, para que nenhum deles sofra efeitos adversos, nem adicione nenhuma
característica não específica ao sistema de separação [21,24]. Para tal, a imobilização deve ser
realizada na região menos crítica da molécula do ligando, para assegurar uma interferência
mínima na interação específica entre o ligando imobilizado e as moléculas alvo. As condições
químicas e experimentais aplicadas podem causar deterioração das moléculas do ligando (o
que pode significar perda da atividade ou funcionalidade) durante os passos de ativação ou
acoplamento, pelo que estas devem ser cuidadosamente selecionadas [22].
A ativação consiste, normalmente, na introdução de um grupo eletrófilo na matriz, que
vai reagir com um grupo nucleófilo do ligando (por exemplo, um grupo amina, tiol ou
hidroxilo). Em alternativa, mas menos frequentemente, a matriz com grupos nucleófilos
imobiliza um ligando possuindo grupos eletrófilos [23].
15
Introdução
Apesar de existirem vários processos de ativação o seu uso é limitado a aplicações em
larga escala. O tempo requerido para imobilizar um ligando a um suporte pré-ativado,
especialmente quando o ligando é uma molécula biológica frágil tornando-se instável durante
processos de imobilização de longa duração, e a contaminação do produto final com o
ligando, devido a processos de lixiviação, são fatores decisivos na escolha do método de
imobilização [6].
Muitos dos corantes reativos são imobilizados na matriz por reação direta entre os
grupos reativos (principalmente grupos hidroxilo) da matriz e as moléculas de corante (por
substituição de átomos de cloro ou flúor dos grupos triazinilo dos corantes) [22].
1.1.5.1 Métodos de ativação da matriz
Existem muitos processos químicos de ativação uma vez que existem muitas matrizes
e ligandos de interesse e, ao mesmo tempo, não existe um método eficiente igual para as
diversas aplicações. Quando se escolhe um método de ativação há que partir do pressuposto
de que é quase sempre mais fácil ajustar a ativação da matriz de acordo com o ligando
desejado do que adaptar o ligando à matriz depois de ativada previamente por um dado
método [21].
No esquema 1 são mostradas algumas das principais estratégias de ativação para
matrizes com grupos hidroxilo [21,23].
1.1.5.2 Braços espaçadores
Muitas vezes os sítios ativos de moléculas biológicas estão localizados profundamente
dentro da estrutura tridimensional da molécula, o que pode causar um importante
impedimento estereoquímico entre o ligando e a molécula alvo, originando uma interação
enfraquecida ou mesmo nenhuma interação em concreto [8,22,23,27].
Um ligando que é imobilizado diretamente a um material polimérico de suporte pode
não se afastar suficientemente da superfície da matriz para alcançar o local de ligação numa
molécula de proteína. Isto raramente acontece com os ligandos de elevado peso molecular
mas pode ocorrer com ligandos de menor peso molecular [21,24].
16
Introdução
Esquema 1 - Estratégias de ligação para matrizes com grupos hidroxilo.
17
Introdução
Esquema 1 - Estratégias de ligação para matrizes com grupos hidroxilo (cont.).
Nestas circunstâncias, braços espaçadores são frequentemente aplicados entre a matriz
e o ligando para garantir a sua acessibilidade à molécula alvo, sendo especialmente úteis para
ligandos de reduzidas dimensões em relação às macromoléculas (por exemplo, proteínas de
elevado peso molecular) [25]. Estas moléculas espaçadoras consistem, usualmente, em
cadeias lineares hidrocarbonadas, com funcionalidades em ambas as extremidades, de modo a
permitir a ligação simultânea à matriz e ao ligando. O processo é dividido em duas fases:
numa primeira, uma das extremidades é ligada quimicamente à matriz, usando técnicas de
imobilização tradicionais e, numa segunda fase, a outra extremidade é unida ao ligando
18
Introdução
através de uma segunda ligação covalente. O resultado é um ligando imobilizado, afastado do
esqueleto da matriz por uma distância igual ao comprimento do espaçador [21-23].
Com materiais de suporte rígidos um espaçador pode proporcionar grande
flexibilidade tridimensional, permitindo ao ligando imobilizado mover-se de forma a
estabelecer a orientação adequada para a ligação à proteína [21].
A figura 4 ilustra a diferença na interação de uma macromolécula com o ligando na
presença e na ausência de um braço espaçador.
(A)
(B)
Figura 4 - Efeito de um braço espaçador na interação macromolécula-ligando: (A) ligando diretamente ligado à
matriz; (B) o braço espaçador permite o acesso do ligando ao local de ligação da macromolécula.
Um aspeto importante a ter em conta na escolha do braço espaçador é o comprimento
da cadeia: se esta for demasiado curta, o braço é ineficaz e o ligando não se liga ao analito;
cadeias demasiado longas podem aumentar o potencial de interações hidrofóbicas não
específicas, o que pode afetar a hidrofilicidade relativa do ligando imobilizado,
principalmente quando se trata de um ligando pequeno e de baixo peso molecular. As
interações hidrofóbicas não específicas são indesejáveis na CA pois reduzem a
seletividade da separação. Optar por cadeias com constituintes mais polares, tais como aminas
secundárias, amidas, grupos éter ou hidroxilo, ajuda a manter minimizados os efeitos
hidrofóbicos.
É igualmente importante considerar os efeitos iónicos que uma molécula espaçadora
pode transmitir a um suporte. Os espaçadores com grupos amina primários terminais devem
19
Introdução
ser completamente ligados a um ligando ou bloqueados por uma molécula não relevante (ex.
anidrido acético), de modo a impedirem a criação de uma carga positiva no suporte, a qual
pode ser responsável por interações não específicas consideráveis com proteínas. Espaçadores
com carga negativa causam, geralmente, menos ligações não específicas com proteínas do que
aqueles que apresentam cargas positivas mas o bloqueio dos grupos espaçadores em excesso é
sempre conveniente [19,21,27].
1.1.5.2.1 Tipos de espaçadores
Em teoria, qualquer molécula pequena pode funcionar como um espaçador
intermediário entre a matriz e o ligando. No entanto, a maior parte dos espaçadores são
constituídos por moléculas com não mais de 10 átomos de comprimento. Considera-se que as
melhores escolhas são aquelas em que os espaçadores são moléculas que têm funcionalidades
apropriadas de ligação em ambos os extremos e um caráter globalmente hidrofílico.
Alguns dos espaçadores mais comuns encontram-se ilustrados na figura 5 [21,23].
Figura 5 - Exemplos de espaçadores comuns.
De referir, em particular, o 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano, o qual, para além de
fornecer um espaçador que afasta bastante o ligando da matriz devido à sua extensão, também
pode ser usado na produção de um espaçador de terminação amina se os grupos oxiranos
forem tratados com aminas. O resultado é um espaçador hidrofílico, contendo grupos
20
Introdução
hidroxilo secundários resultantes da abertura de epóxidos, uma ligação éter, que é
relativamente estável, e um grupo amina primária terminal para derivatizações posteriores.
Para isso o procedimento normal é ligar este espaçador à matriz através de um método
adequado e depois a matriz ativada é tratada com hidróxido de amónio formando uma amina
primária terminal.
Este espaçador é extremamente útil para efetuar a ligação de pequenos ligandos
contendo grupos ácido carboxílico ou outros compostos que se possam ligar quimicamente a
aminas [21].
1.1.6 Principais aplicações da cromatografia de afinidade
A CA pode ser usada, de uma forma geral, em diferentes processos, tais como a
purificação e a concentração de uma substância a partir de uma mistura, a redução da
quantidade de uma substância na mistura inicial e o conhecimento dos compostos biológicos
que têm capacidade para fazer ligações com determinadas substâncias.
A purificação de ácidos nucleicos, a purificação de proteínas a partir de extratos
isentos de células e a purificação dos constituintes do sangue, são algumas das
importantes aplicações da CA, com especial destaque para a separação e purificação de
proteínas, sendo potencialmente o método mais seletivo para a purificação destas
biomoléculas [3,7]. A CA para proteínas tem atualmente uma variedade de aplicações
que vão desde o estudo de interações de ligação proteína-medicamento à redução da
concentração de proteínas de abundância elevada para melhorar a deteção/quantificação de
proteínas diluídas numa amostra [19]. Outras aplicações desta técnica recorrem ao
uso de enzimas imobilizadas ou de inibidores de enzimas. Enzimas imobilizadas têm sido
utilizadas na indústria para processos que envolvem produtos farmacêuticos e alimentares,
bem como em aplicações agrícolas e ambientais. A utilização de enzimas imobilizadas
nestes campos depende tanto da atividade catalítica da enzima como da especificidade da sua
ligação. Alternativamente, a enzima pode ser utilizada como um ligando de afinidade
para purificação de um inibidor da enzima. A terceira aplicação possível para uma
enzima imobilizada consiste na sua utilização como um sequestrante para remover
impurezas [8].
21
Introdução
De acordo com o tipo de ligando usado, a CA apresenta hoje em dia diversas
aplicações, tornando-se uma técnica de separação cada vez mais importante no estudo de
amostras biológicas e agentes farmacêuticos [20].
Um grupo importante de ligandos de bioafinidade, que inclui as proteínas de ligação à
imunoglobulina, é usado numa técnica cromatográfica designada por cromatografia por
imunoafinidade. Uma utilização deste tipo de cromatografia é a purificação, por afinidade, de
anticorpos a partir do soro do sangue. Dois exemplos comuns de ligandos usados na
cromatografia por imunoafinidade são a proteína A e a proteína G. Estes ligandos têm a
capacidade de se ligar à região ativa de vários tipos de imunoglobulinas, ou anticorpos (que se
dividem em cinco classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), o que torna estes ligandos úteis para a
purificação de anticorpos e para a deteção ou utilização de anticorpos em diversos métodos
analíticos. Por exemplo, a proteína G ou proteína A/G (que resulta da combinação de
domínios de ligação de ambas as proteínas A e G) podem ser utilizadas no isolamento de
anticorpos da classe IgG de cabra, mas as proteínas A, G, ou A/G também podem ser usadas
para o isolamento de anticorpos IgG de coelho [8,31].
As lectinas são outra classe de ligandos que têm sido amplamente utilizados em CA,
dando origem a um tipo de cromatografia, conhecido como CA de lectina. As lectinas são
proteínas do sistema não imune que têm a capacidade de reconhecer e ligar-se a
determinados resíduos de hidratos de carbono, sendo vulgarmente utilizadas no
isolamento de compostos biológicos que contêm este tipo de resíduos, tais como
polissacarídeos, glicoproteínas e glicolípidos [8,31]. A CA de lectina é uma das técnicas mais
poderosas para o estudo da glicosilação como uma modificação pós translacional de
proteínas [19].
A CA com boronatos, que usa ligandos como, por exemplo, o ácido bórico,
tem sido explorada para a separação de uma grande variedade de compostos, incluindo
nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, glicoproteínas e
enzimas.
Este
tipo
de
cromatografia
está
na
base
dos
primeiros
relatos
de
aplicações quantitativas de CA em laboratório clínico. Estes relatos descrevem a
quantificação de hemoglobina glicosilada para a avaliação da gestão da diabetes a longo
prazo [8,20,31].
Os corantes sintéticos são outro grupo de ligandos que podem ser empregues em
CA dando origem a um método conhecido como CA com corantes. Por exemplo,
colunas contendo corantes de triazina são normalmente utilizados para purificar a albumina e
22
Introdução
outras proteínas do sangue, juntamente com várias enzimas e proteínas de interesse como
agentes farmacêuticos [20].
1.2 Cromatografia de afinidade com corantes
Uma grande variedade de proteínas, incluindo, enzimas, anticorpos e hormonas, tem
sido usada em diversas aplicações médicas e industriais e, dependendo da sua aplicação final,
estas proteínas requerem diferentes graus de pureza [32].
Nos últimos 20 anos, os medicamentos à base de proteínas tornaram-se armas
importantes na guerra contra algumas doenças [33]. Aproximadamente 1,049 milhões de
gramas de medicamentos à base de proteínas foram produzidas em todo o mundo em 1999 e a
sua produção subiu para 1,150 milhões de gramas em 2004 [34]. Dentro de uma década,
estima-se que aproximadamente 25% de todos os medicamentos em países desenvolvidos
sejam desta categoria, em especial com o aumento do número de alvos terapêuticos [34].
Dada a elevada necessidade de proteínas terapêuticas puras, a indústria biotecnológica poderá,
em breve, vir a sofrer de falta de capacidade de produção desses agentes [35]. Para combater
essa necessidade, serão necessárias técnicas melhoradas nos métodos de purificação de
proteínas para permitir processos cada vez mais eficientes e com elevados rendimentos
[29,35]. Além disso, com o impacto da genómica e da proteómica, com capacidade para
revolucionar a descoberta e desenvolvimento de fármacos, os cientistas estão confrontados
com o desafio de estudar grandes bibliotecas de proteínas para analisar o funcionamento
molecular das células, exigindo por isso também métodos melhorados para a purificação de
proteínas [29,36,37].
Uma vez que a CA é, potencialmente, o método mais seletivo para a purificação de
proteínas [3,7], uma forma de atender a essas necessidades passa por desenvolver ligandos de
afinidade mais eficientes, em termos de estabilidade e de custos, para o isolamento e
purificação de proteínas.
Uma ampla variedade de moléculas funcionais, incluindo enzimas, cofatores,
coenzimas, anticorpos, aminoácidos, oligopeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e
oligonucleótidos pode ser utilizada como ligandos. Estes ligandos são extremamente
específicos, na maioria dos casos. No entanto, eles são caros, devido ao alto custo de
produção e exigem extensos passos de purificação, diminuindo o rendimento do processo.
23
Introdução
Uma vez que estes ligandos bioespecíficos são química e biologicamente instáveis é difícil
imobilizar certos ligandos na matriz com a manutenção da sua atividade biológica inicial.
Precauções adicionais são também necessárias no seu uso (durante os passos de adsorção e
eluição) e armazenamento.
Os compostos sintéticos tais como corantes e agentes biomiméticos que apresentam
estruturas e comportamentos químicos idênticos a determinados ligandos naturais têm sido
considerados como uma das alternativas importantes para a CA bioespecífica, de modo a
contornar muitos dos seus inconvenientes. Corantes como ligandos são capazes de se ligar à
maioria dos tipos de proteínas e enzimas, em alguns casos de uma maneira extremamente
específica. Estes ligandos são resistentes à degradação química e biológica e encontram-se
comercialmente disponíveis, apresentando um baixo custo devido ao seu processo simples de
síntese. A sua estabilidade química dá-lhes a vantagem de permitir que as colunas
cromatográficas possam ser reutilizadas muitas vezes. São facilmente imobilizadas numa
variedade de matrizes, especialmente em matrizes que possuem grupos hidroxilo, através
dos seus grupos funcionais. Embora todos os corantes sejam de natureza sintética, são ainda
classificados como ligandos de afinidade porque interagem com os locais ativos de
muitas proteínas imitando a estrutura dos substratos, cofatores ou agentes de ligação para as
proteínas [2,22,29,30,38].
Vários corantes, obtidos a partir da indústria têxtil, foram originalmente utilizados
como ligandos em CA. Estes corantes têxteis reativos têm sido usados para a purificação de
proteínas em sistemas de afinidade corante-ligando, uma vez que se ligam a uma variedade de
proteínas de uma forma seletiva e reversível [22]. A maior parte dos corantes reativos, muitas
vezes referidos como corantes de triazina ou triazínicos, utilizados como sistemas de corantes
de afinidade, consistem num cromóforo (geralmente baseado numa antraquinona, grupo azo
ou ftalocianina) responsável pela cor, e que, por definição, deve ter uma estrutura
conjugada de duplas ligações para absorver no visível, ligado a um grupo reativo
(frequentemente um anel mono ou diclorotriazínico). O cloreto de cianurilo (1,3,5triclorotriazina), que é a substância de base utilizada na síntese destes corantes, constitui
também o local do corante que possui grupos responsáveis por estabelecer ligações covalentes
com o suporte insolúvel, proporcionando uma imobilização eficaz, por exemplo, em suportes
possuidores de grupos hidroxilo. A presença de átomos eletronegativos faz com que
os três átomos de carbono presentes no cloreto de cianurilo sejam carregados positivamente e,
portanto, muito sensíveis a ataques nucleófilicos. Estes corantes têm também grupos ácido
24
Introdução
sulfónico para proporcionar a solubilidade desejada da molécula em meios aquosos. Estes
grupos são carregados negativamente a todos os valores de pH. Alguns corantes contêm
grupos carboxilo, amino, cloro ou grupos de complexação com metais. A maioria contém
átomos de azoto, tanto dentro como fora do anel aromático [8,21,22,29,39].
As duas maiores famílias de corantes reativos utilizadas com sucesso em CA são a do
Cibacron e a do Procion H [21,22,38]. A única diferença entre estas duas séries é a posição
do grupo sulfonato no anel de anilina, que se encontra na posição orto no Cibacron e na
posição meta ou para no Procion H [22].
1.2.1 Breve história da cromatografia de afinidade com corantes
A descoberta de corantes como ligandos ocorreu acidentalmente na década de 1960
[40]. Naquela época, investigadores, ao tentar purificar a enzima piruvato cinase a partir de
uma coluna de filtração em gel, na presença de Dextran-Blue, um conjugado do corante
triazínico Cibacron Blue F3G-A, imobilizado covalentemente em Sefadex G-200, usado para
determinar o volume vazio, ficaram intrigados ao observar um comportamento anómalo, pois
o corante eluia ao mesmo tempo que a enzima a purificar [22,30,40].
Mais tarde, descobriu-se que isto era causado pela ligação entre a enzima e o corante,
provocando assim a eluição do corante em conjunto com a enzima. Tal levou à
primeira aplicação deste corante em CA, quando Staal e seus colaboradores, em 1971,
utilizaram uma coluna de Dextran-Blue para purificar a piruvato cinase de eritrócitos
humanos [41]. Depois disso, este conceito foi aplicado à purificação de uma variedade de
proteínas [22].
Ao longo das últimas décadas, os corantes triazinicos têm encontrado grande aplicação
como ligandos gerais para a purificação de proteínas, como, por exemplo, a albumina do
plasma sanguíneo, bem como oxidoredutases, descarboxilases, enzimas glicolíticas,
nucleases, hidrolases, liases, sintetases e transferases. Muitos suportes contendo este tipo de
corantes como ligandos estão disponíveis comercialmente a partir de fornecedores como a
Sigma-Aldrich e a GE Healthcare Life Sciences. Exemplos comuns desses suportes incluem o
CB3GA-Agarose, o Blue-Trisacryl, o Reactive Brown 10-Sepharose, o Reactive Green 19Sepharose, o Reactive Red 120-Sepharose e o Reactive Yellow 3-Sepharose [8,22].
25
Introdução
1.2.2 Cibacron Blue F3G-A e corantes relacionados
A estrutura química do Cibacron Blue F3G-A é apresentada na figura 6.
Estruturalmente, podem ser distinguidas quatro partes nas moléculas individuais (A a D): um
grupo antraquinona (parte A), encontra-se ligado a um anel de triazina (parte C), por um anel
de ácido diaminobenzenossulfónico (parte B); apresenta ainda um anel terminal
aminossulfónico (parte D) [42].
Hoje em dia são conhecidas interações entre este corante e uma grande variedade quer
de enzimas, quer de proteínas [42,43].
Figura 6 - Estrutura do Cibacron Blue F3G-A.
Embora o corante Cibacron Blue F3G-A tenha sido objeto de maior atenção pelo fato
de ter sido o primeiro a ser utilizado como ligando em CA, outros corantes do tipo triazínico
foram surgindo ao longo do tempo (figura 7) [44,45]. A maior parte desses corantes apresenta
estrutura similar ao Cibacron Blue F3G-A.
Um grupo interessante de corantes usados como ligandos, que não assenta em grupos
triazínicos, é a série Remazol da Hoechst, que se fixa à matriz através de grupos ativos
vinilsulfona [22].
Apesar da ampla aplicação dos corantes têxteis em CA, devido às vantagens distintas
sobre o uso de ligandos biológicos, a preocupação relativamente à seletividade, pureza,
toxicidade e velocidade de fluxo durante a separação de biomoléculas quando se utiliza
este tipo de ligandos tem limitado a sua utilização até à data, com algumas exceções
notáveis, como a purificação da albumina do soro humano ou a purificação de proteínas
farmacêuticas [7,8].
26
Introdução
Figura 7 - Estruturas de alguns corantes usados em CA.
Uma estratégia para evitar as desvantagens dos corantes têxteis enquanto ligandos
consiste em conceber, adaptar ou reformular a estrutura destes corantes com vista à síntese de
novos corantes com melhor afinidade e especificidade [2,22]. Em princípio, isto pode ser
alcançado através da conceção de corantes sintéticos que mimetizam a estrutura e a ligação de
ligandos biológicos a proteínas alvo. Este novo tipo de ligandos é denominado de corantes
biomiméticos, os quais devem não só apresentar uma alta especificidade para a proteína alvo
mas também reter a maior parte das vantagens dos corantes têxteis comerciais
(frequentemente denominados como corantes convencionais) [2,7].
Alguns itens que devem ser considerados na conceção de ligandos biomiméticos
incluem a especificidade do ligando para a proteína de interesse, a reversibilidade da interação
27
Introdução
do ligando com a proteína e a estabilidade do ligando de acordo com as condições de
funcionamento desejadas (incluindo a sua estabilidade relativamente a agentes biológicos que
possam aparecer na amostra) [8].
Este conceito foi aplicado pela primeira vez por Lowe e colaboradores [44,46] no
início da década de 1980, quando utilizaram este tipo de ligandos, com sucesso, para o
isolamento de uma enzima específica.
O primeiro corante biomimético (figura 8), o Benzamidino Yellow, foi preparado
ligando benzamidina a um anel de clorotriazina através de um grupo reativo
diaminometilbenzeno e foi utilizado para a separação específica da tripsina e da quimotripsina
[47].
Figura 8 - Estrutura do corante catiónico Benzamidino Yellow.
Muitos outros estudos se seguiram utilizando corantes biomiméticos como ligandos de
afinidade [7,22]. Muitos destes ligandos foram obtidos através de pequenas alterações na
estrutura dos compostos triazínicos, como é o caso de um análogo do Cibacron Blue F3G-A,
possuindo grupos carboxilo, fosfato, hidroxilo, amida ou amónio como substituintes no anel
aromático terminal, utilizado num estudo detalhado da interação com a álcool desidrogenase
de fígado de cavalo e a sua consequente separação. Estes resultados proporcionaram uma base
sólida para o desenvolvimento da produção de corantes biomiméticos [7].
Estes corantes biomiméticos pioneiros são designados de primeira geração [2] por
resultarem essencialmente do conhecimento do tipo de ligações preferidas de enzimas ou
proteínas alvo a ligandos naturais, de dados de cristalografia de raios-X de proteínas e de
dados de RMN e/ou de outras informações bioquímicas úteis disponíveis [2,7,8]. Este tipo de
dados e o conhecimento das coordenadas a três dimensões são muito úteis quando se tenta
projetar um ligando específico para ligação a uma dada macromolécula. Em princípio, o
complexo ligando-proteína é passível de formar estruturas cristalinas permitindo o seu estudo;
28
Introdução
no entanto, nem sempre isso é possível, sendo muitas vezes difícil conseguir a estrutura
cristalina necessária para a obtenção da informação desejada [2].
A capacidade de combinar o conhecimento de dados de cristalografia de raios-X e de
RMN de estruturas proteicas alvo, a partir de bancos de dados apropriados, e a consequente
identificação de um potencial local de ligação da proteína com ferramentas computacionais
avançadas permitiu a síntese de moléculas pré-definidas de modo a obter modelos racionais
de ligandos de afinidade mais viáveis, poderosos, lógicos e rápidos [7]. Na verdade, esta
tecnologia computacional, especialmente na área de modelagem molecular contemporânea e
na área da bioinformática, marcou uma nova era no design de ligandos, oferecendo a
possibilidade de uma realidade “virtual” para muitos complexos ligando-proteína.
Esta abordagem deve ter em consideração não só a viabilidade e facilidade da síntese
química, mas também a imitação da forma molecular e das interações provenientes de
estruturas gerais de outros ligandos biológicos conhecidos para o alvo (por exemplo,
substratos ou inibidores), bem como a distribuição e articulação de grupos funcionais
específicos, conhecidos como reativos, com uma ampla classe de alvos [2,7,8]. Há dois
fatores importantes para o sucesso dos ligandos baseados em estruturas de design: em
primeiro lugar, a capacidade de prever corretamente a configuração do ligando e, em segundo,
a capacidade de prever corretamente a sua afinidade de ligação com o alvo desejado [3].
As primeiras aplicações de corantes como ligandos biomiméticos recorrendo à
modelagem molecular e à bioinformática tinham como alvo uma enzima de interesse
analítico, a L-malato desidrogenase de coração bovino [48,49].
Alguns projetos bem-sucedidos utilizando este tipo de ligandos têm sido descritos
[5,50] como, por exemplo, o corante de antraquinona usado como ligando biomimético para a
purificação da L-lactato desidrogenase de coração de bovino [50]. O ligando é um análogo do
corante têxtil Cibacron Azul F3G-A.
Os novos corantes biomiméticos usados como ligandos, projetados para as enzimas
mencionadas anteriormente, também encontram aplicação para a purificação de outras
enzimas cujos substratos partilham características comuns [2].
Hoje em dia, a CA com corantes biomiméticos é usada para purificar proteínas
terapeuticamente úteis [51].
A figura 9 mostra exemplos de estruturas deste novo tipo de ligandos.
29
Introdução
Figura 9 - Estruturas de corantes biomiméticos usados em CA [2,5,52].
1.2.3 Interação entre corantes como ligandos de afinidade e proteínas
O mecanismo de ligação dos corantes às proteínas é complexo, sendo incerta a total
natureza da interação corante-proteína. O corante tem de se aproximar da área da molécula de
proteína responsável pela ligação ao substrato, podendo ser o local ativo ou mesmo outra
parte da molécula, e tem de ser capaz de se ligar a esses sítios em virtude da sua similaridade
com um substrato natural [53]. O sítio de ligação de uma proteína é um arranjo
estereoquímico único de grupos iónicos, polares e hidrofóbicos na sua estrutura
tridimensional, onde as cadeias polipeptídicas provavelmente exibem maior flexibilidade. As
moléculas de corante, usadas como ligando, participam na interação não covalente com a
proteína para alcançar uma ligação forte e específica [22].
A primeira estrutura cristalina que forneceu informações de raio-X detalhadas sobre as
interações corante-proteína foi o complexo Cibacron Blue F3G-A – álcool desidrogenase do
fígado de cavalo [8]. Demonstrou-se que este corante se liga à enzima álcool desidrogenase de
fígado de cavalo num local NAD+ e que este local apresenta estrutura equivalente aos anéis de
adenina e ribose desta enzima. Assim, foi proposto que o corante é um análogo da ADPribose e interage com o nucleótido encontrado nos sítios de ligação das enzimas
correspondentes (AMP, IMP, ATP, NAD+, NADP+ e CTP [8,22].
Várias técnicas de espetrometria de UV/Vis, IV, RMN, RPE e dicroísmo circular têm
sido utilizados para explicar as interações corante-proteína. Estes estudos vieram confirmar
que tanto a estrutura do corante como da biomolécula são importantes e que as interações
podem resultar de uma combinação de vários tipos de forças eletrostáticas [22].
30
Introdução
1.2.4 Cromatografia de afinidade com cianinas
As cianinas constituem uma classe da família dos corantes polimetínicos, cuja
estrutura geral está representada na figura 10. Estes corantes podem ser definidos como sais
monoácidos em que dois núcleos heterocíclicos, com pelo menos um átomo de azoto, estão
ligados por uma cadeia de ligações duplas conjugadas, pelo que a cadeia possui
necessariamente um número ímpar de átomos de carbono. Um dos núcleos heterocíclicos
funciona como doador e outro como aceitador de eletrões. Assim, cada composto é
considerado como um híbrido de ressonância de duas estruturas canónicas e nenhuma fórmula
única é a sua representação completa. No entanto, para simplificação, a estrutura é
normalmente apresentada como possuindo um átomo de azoto terciário e o outro quaternário
[53-57].
Figura 10 - Fórmula de estrutura geral das cianinas.
Esta classe de corantes absorve numa gama muito larga do espetro eletromagnético,
desde 340 a 1400 nm, ou seja, desde o ultravioleta até ao infravermelho [56], passando por
todas as cores da região do visível, estando a sua cor intensa relacionada com a interação de
ressonância entre os átomos de azoto nos extremos da cadeia conjugada, envolvendo o
movimento da carga positiva [53-55]. O comprimento de onda de absorção das cianinas é
influenciado essencialmente por dois fatores: o primeiro, que é o que tem o efeito mais
significativo, diz respeito à natureza do anel heterocíclico e ao número de ligações duplas
conjugadas entre os dois azotos, isto é, ao comprimento da cadeia polimetínica; o outro está
relacionado com a simetria, ou não, dos anéis heterocíclicos presentes, com a natureza dos
grupos N-alquilo e com os substituintes presentes tanto na cadeia metínica como nos anéis.
Outras variações importantes com repercussão nas propriedades das cianinas são a natureza
do contra-ião, que vai condicionar a solubilidade e a facilidade de cristalização das cianinas, e
a rigidificação do sistema conjugado, que, em geral, aumenta a sua estabilidade bem como o
comprimento de onda de absorção [53-55].
31
Introdução
De uma maneira geral, a síntese de cianinas [55,57-59] envolve várias etapas que
consistem em simples adições de reagentes nucleófilos e eletrófilos, precedidas ou seguidas
de reações de eliminação, via desprotonação, e remoção de grupos de saída. Os precursores
chave são sais de amónio quaternários de heterociclos possuidores de grupos metilo quase
sempre na posição 2 [60] que, na presença de bases, originam bases metilénicas nucleófilas.
Esta classe de corantes apresenta algumas propriedades características e que são
importantes para algumas das suas aplicações, tais como, uma absortividade molar máxima,
εmáx, muito elevada, com valores de cerca de 30000 M-1cm-1 para monometinocianinas e
250000 M-1cm-1 para cadeias maiores. No entanto, para cadeias a partir das
heptametinocianinas, estes valores começam a diminuir.
As cianinas são um exemplo de uma classe de corantes cujas inúmeras e diversificadas
aplicações [57,59,61-63] derivam, quase exclusivamente, das suas propriedades fotoquímicas
e fotofísicas resultantes das transições eletrónicas do seu estado fundamental π para os seus
diferentes estados excitados, e das transições entre estes [53]. Entre essas aplicações contam-se o uso destes corantes como sensibilizadores de peliculas fotográficas, como meio de
gravação em discos óticos, em tintas industriais, para capturar energia solar, em sistemas de
laser, em sistemas de fotossíntese artificial, em proteómica, como materiais fotorrefrativos,
como agentes antitumorais (na terapia fotodinâmica, resultando de processos como a
produção de oxigénio singuleto) e como sondas fluorescentes para sistemas biológicos
[57,61,62,64].
Outra aplicação das cianinas, não resultante de fenómenos derivados das transições
eletrónicas mas do fato de poderem, potencialmente, estabelecer interações seletivas com
biomoléculas, é o uso desta classe de corantes como ligandos em CA.
Não obstante as cianinas terem múltiplas e extensas aplicações como corantes
funcionais em diversas áreas, a sua utilização como ligandos para CA e a sua imobilização em
suportes cromatográficos tem sido muito pouco explorada. A relativa facilidade de síntese de
diferentes cianinas estruturalmente complexas e possuidoras de um conjunto variado de
particularidades estruturais com potencial para interagir de diferentes modos com substratos
naturais, tornam-as atrativas para este objetivo [53]. A combinação de tipos específicos de
interações hidrófobas, hidrofílicas, iónicas e interações π-π exibidas pelas diferentes porções
destes corantes, poderá permitir estabelecer uma interação seletiva desejável com
biomoléculas a purificar, fazendo das cianinas candidatos adequados para ligandos de
afinidade [65].
32
Introdução
Os primeiros estudos que envolveram este tipo de corantes mostraram que as cianinas
podem ser imobilizadas covalentemente em suportes como a celulose [61,66]. Nesses estudos
verificou-se que existem aminocianinas (figura 11) capazes de se ligarem a celulose
microcristalina, por meio de um agente de ligação polifuncional - o cloreto de cianurilo [66].
Figura 11 - Estrutura da primeira cianina imobilizada em suportes de celulose.
Na primeira aplicação destes corantes catiónicos como ligandos em CA, procedeu-se à
imobilização de um corante cianínico do tipo isotiocianato-funcionalizado (figura 12), em gel
de agarose e analisou-se a capacidade deste corante, como ligando de afinidade, para purificar
algumas proteínas padrão (albumina de soro bovino (BSA), tripsina e quimotripsina) [67].
Verificou-se então que esta cianina, como ligando, apresentava comportamentos
cromatográficos diferentes para as três proteínas em estudo. A influência da composição da
fase móvel no comportamento cromatográfico destas proteínas foi também estudada e
concluiu-se que a pseudo-afinidade entre estas proteínas e os géis à base da cianina utilizada
era fortemente dependente da composição da fase móvel.
Foi assim demonstrado que a cromatografia de pseudo-afinidade utilizando suportes
contendo cianinas como ligandos parece proporcionar uma abordagem muito interessante para
a purificação de proteínas.
Figura 12 - Estrutura da primeira cianina usada como ligando de afinidade.
Nos últimos anos tem sido explorado o uso de cianinas como ligandos de afinidade
[4,68,69]. A figura 13 mostra a estrutura da tiacarbocianina usada nestes trabalhos.
33
Introdução
Figura 13 - Estrutura da tiacarbocianina usada em estudos de CA.
A utilização de suportes contendo esta tiacarbocianina como ligando permitiram
comprovar a sua eficácia na separação da BSA, da quimotripsina e da lisozima, a partir de
uma mistura artificial, como resultado de interações de afinidade entre estas proteínas e o
corante [68].
1.2.5 Cromatografia de afinidade com cianinas esquarílicas
Os corantes esquarílicos são derivados 1,3-dissubstituídos do ácido esquárico (3,4-dihidroxi-1,2-dioxociclobut-3-eno). Estes corantes foram sintetizados pela primeira vez na
década de 1960 por Treibs e Jacob [70]. Apresentam estruturas polimetínicas e, por isso, são
ocasionalmente classificadas como corantes cianínicos, porque as suas estruturas
-conjugadas são bastante semelhantes às das cianinas [71]. Há, no entanto, uma diferença
importante entre as estruturas eletrónicas das cianinas e dos corantes esquarílicos, que é o seu
caráter zwitteriónico [57,72]. Estes corantes contêm um anel central de quatro membros,
deficiente em eletrões, e dois grupos terminais doadores de eletrões [71,73,74]. A estrutura
geral das cianinas esquarílicas é apresentada na figura 14.
A análise cristalográfica de raios-X de vários corantes esquarílicos mostrou que os
comprimentos de ligação C-C envolvidos no sistema π-conjugado têm um caráter entre
ligação simples e dupla, indicando uma extensa deslocalização de eletrões ao longo de toda a
molécula, o que conduz à ressonância apresentada por estes compostos [71,75].
Figura 14 - Estrutura geral dos corantes esquarílicos.
34
Introdução
Os corantes esquarílicos simétricos, ou seja, aqueles que possuem grupos 1,3substituintes idênticos, resultam, de uma forma geral, da condensação de um equivalente
molar de ácido esquárico com dois equivalentes molares de uma base metilénica aromática ou
heteroaromática eletrodoadora, numa mistura azeotrópica de butan-1-ol/benzeno ou butan-1-ol/tolueno [76,77]. Os núcleos heterocíclicos mais frequentes são os anéis de quinolina,
benzotiazole, benzoselenazole, benzimidazole, benzoxazole e indole. Quando é necessária
catálise básica, a reação é usualmente realizada na presença de butan-1-ol/piridina [78]. A
síntese de corantes esquarílicos assimétricos ocorre por passos e envolve duas condensações
sequenciais de um ácido esquárico di-substituído, normalmente um éster dialquilesquarato,
com dois diferentes grupos doadores de eletrões, aromáticos ou heterocíclicos, geralmente sob
refluxo em butan-1-ol/benzeno [79,80].
Nos últimos anos, a família dos corantes esquarílicos tem recebido considerável
atenção devido às suas propriedades específicas [56], tais como boa estabilidade fotoquímica,
elevada fotocondutividade e bandas de absorção estreitas e intensas (ε > 105 M-1cm-1) na
região do visível e do infravermelho próximo [74,81]. A maioria destes corantes exibe
emissão intensa no extremo visível perto da região do infravermelho [82]. Estas e outras
propriedades têm tornado estes corantes muito atrativos para diversas aplicações tecnológicas,
principalmente na área da fotónica [71,73,83-85], como fotorreceptores xerográficos [86],
sensibilizadores para células solares orgânicas [87] ou como meios óticos de gravação [88].
Ultimamente, há um interesse crescente desta classe de corantes como sensores para a
determinação de metais [82,89], em ensaios biológicos como marcadores de diferentes
biomoléculas [90], como sondas para deteção de proteínas [91] e como sensibilizadores para
terapia fotodinâmica do cancro [74, 77, 92].
Como consequência da aplicação extensiva de compostos esquarílicos como corantes
funcionais, a sua modificação estrutural tornou-se uma área ativa de pesquisa e tem sido
focada principalmente na variação da natureza e da substituição dos grupos terminais da
cadeia polimetínica [93]. A funcionalização do anel esquárico central, por outro lado, tem
sido muito menos explorada e restringida, no essencial, à síntese de corantes
aminoesquarílicos [81,93,94] e corantes ditioesquarílicos [95]. A figura 15 apresenta alguns
exemplos da diversidade estrutural de corantes esquarílicos.
Tendo em conta que os resultados obtidos nos estudos anteriormente mencionados, em
que corantes cianínicos usados como ligandos em CA se revelaram bastante promissores e
que os corantes esquarílicos, tal como as cianinas em geral, apresentam uma diversidade
35
Introdução
estrutural que lhes permite promover diferentes interações com biomoléculas, e, portanto, ter
potencial aplicação como ligandos em CA, o presente trabalho tem como objetivo a síntese de
diferentes
corantes
esquarílicos
e
posterior
desenvolvimento
de
novos
suportes
cromatográficos, contendo esses corantes como ligandos, para serem utilizados em CA de
biomoléculas.
Figura 15 - Exemplos de alguns corantes esquarílicos.
36
Capítulo 2
Discussão de resultados
Discussão de resultados
2.1 Preâmbulo
Em função da estratégia planeada para este trabalho, foram sintetizados, numa
primeira fase, uma série de corantes esquarílicos simétricos substituídos com um grupo
pendente alquilamino no anel central de quatro membros, responsável pela ligação dos
corantes à Sepharose. Com o objetivo de obter corantes com maior mobilidade espacial
quando ligados à Sepharose, incrementando potencialmante a interação corante-proteína,
foram sintetizados, numa segunda fase, alguns corantes esquarílicos assimétricos, cuja ligação
à Sepharose foi efetuada através de um grupo N-carboxietilo presente apenas num dos anéis
heteroaromáticos terminais.
Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados experimentais obtidos ao
longo do presente trabalho, encontrando-se divididos em duas partes. Na primeira parte são
descritos e discutidos os métodos da síntese dos corantes esquarílicos pretendidos, bem como
a sua caracterização estrutural. Em geral, para cada composto sintetizado é descrito o ponto de
fusão, os espetros no IV, UV/Vis, de RMN de 1H e 13C e de massa [(ESI-TOF), EMAR (ESI-TOF) ou EMAR (FAB)]. Na segunda parte deste capítulo são apresentados e discutidos os
resultados respeitantes à imobilização de alguns destes corantes à Sepharose CL-6B,
utilizando diferentes agentes de ativação, bem como os comportamentos de alguns dos
suportes cromatográficos preparados na separação de proteínas, testados no Laboratório de
Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira
Interior.
2.2 Síntese de corantes esquarílicos simétricos
Os corantes aminosquarílicos 17a-c, 18b, 19b e 21b a serem utilizados como ligandos
nas matrizes cromatográficas foram sintetizados por substituição de um dos átomos de
oxigénio do anel esquárico dos correspondentes precursores zwitteriónicos 8a-c, 9b e 10b,
obtidos por condensação de um equivalente molar de ácido esquárico (7) com dois equivalentes molares de bases metilénicas, com uma diamina apropriada (esquema 2). A substituição
foi realizada via os intermediários O-metilados 11a-c, 12b e 13b e usadas diaminas monoprotegidas com um grupo Boc de modo a evitar reações de dupla substituição nucleófilica.
38
Discussão de resultados
Esquema 2 - Síntese geral dos corantes aminoesquarílicos simétricos.
39
Discussão de resultados
A hidrólise ácida dos compostos 14a-c, 15b, 16b e 20 forneceu, finalmente, os corantes
aminoesquarílicos pretendidos.
2.2.1 Síntese dos sais heterocíclicos quaternários 4a-c, 5b e 6b
Os sais quaternários de amónio 4a-c, 5b e 6b foram facilmente sintetizados fazendo
reagir uma solução de 2-metilbenzotiazole (1), 2-metilbenselenazole (2) e 2-metilquinolina
(3), respetivamente, com um excesso do reagente alquilante apropriado (1-iodobutano, 1iodo-hexano ou 1-iododecano), numa proporção de 1:3, em MeCN, a refluxo, de acordo com
o método referido na literatura [60]. Os sais resultantes foram facilmente separados das
misturas reacionais por precipitação com Et2O. O processo de alquilação pode ser aplicado
repetidamente às águas-mães contendo o 2-metilbenzoazole que ficou por reagir, após
evaporação do solvente de precipitação, a fim de alcançar rendimentos convenientes.
Os cristais recolhidos apresentavam-se cromatograficamente puros e, por conseguinte,
não foi necessária purificação adicional por recristalização. Os rendimentos obtidos foram
bastante bons (entre 75% e 94%), verifcando-se que, em geral, vão diminuindo à medida que
aumenta o tamanho da cadeia N-alquílica. Este fato foi já referido anteriormente na literatura
[69] e resulta da crescente dificuldade verificada na precipitação do produto, no meio
reacional, à medida que o tamanho da cadeia N-alquílica é aumentado.
Os espetros no IV apresentam, invariavelmente, bandas fracas características da
vibração das ligações C-H aromáticas, em torno de 3000 cm-1; bandas de intensidade média
entre 2948-2861 cm-1, correspondentes às ligações C-H alifáticas; e bandas de intensidade
média entre 1573-1552 cm-1, características da vibração das ligações C=C aromáticas.
Todos os compostos 4a-c, 5b e 6b apresentam características espetroscópicas de
acordo com a estrutura apresentada.
2.2.2 Síntese dos corantes esquarílicos 8a-c, 9b e 10b
Os corantes esquarílicos 8a-c, 9b e 10b, foram obtidos por condensação de dois
equivalentes molares dos sais quaternários 4a-c, 5 e 6 com um equivalente molar de ácido
40
Discussão de resultados
esquárico (7), numa mistura de n-BuOH/piridina (9/1), a refluxo, de acordo com o método
descrito na literatura [93].
O mecanismo de formação destes corantes envolve um intermediário inicial éster
monobutílico do ácido esquárico (esquema 3). O ataque nucleofílico subsequente da base
metilénica, seguido da eliminação de butanol, origina o intermediário mono-substituído do
ácido esquárico. O ataque de outra base metilénica, seguido de desidratação, resulta
finalmente no corante esquarílico [96].
Os corantes sintetizados, obtidos sob a forma de cristais, foram isolados da mistura
reacional por precipitação com Et2O apresentando-se cromatograficamente puros.
Esquema 3 - Mecanismo de formação de corantes esquarílicos.
41
Discussão de resultados
Todos os compostos 8a-c, 9b e 10b apresentavam características espetroscópicas
cabalmente consistentes com as estruturas propostas.
Os espetros no IV apresentam bandas características da vibração das ligações C-H
alifáticas entre 2923-2848 cm-1 (fracas), observando-se igualmente bandas de intensidade
média, entre 1573-1586 cm-1, correspondentes à vibração das ligações C=C aromáticas.
Também é de referir a presença de uma banda forte, entre 1238-1222 cm-1, que poderá ser
atribuída à vibração da ligação C-O. De salientar a inexistência de uma banda de um grupo
C=O característica de uma cetona cíclica de quatro membros, o que é consistente com
ressonância atribuída à estrutura típica destes corantes.
Os espetros de 1H RMN dos compostos 8a-c, 9b e 10b apresentam os sinais esperados
para a totalidade dos protões presentes. Contudo, é de realçar a presença de um sinal de dois
protões, sob a forma de singuleto, que surge tipicamente com desvio químico entre 6,02 e
5,76 ppm, atribuído aos protões da cadeia polimetínica (CH=C), indicativo da equivalência
química e magnética destes protões e, portanto, da simetria apresentada pelas moléculas
destes corantes [94b]. Mercê desta simetria, os sinais dos protões das duas cadeias Nalquílicas de cada composto também aparecem ao mesmo desvio químico.
Relativamente aos comprimentos de onda do máximo de absorção destes compostos
verifica-se que, para os corantes 8a-c, se situam entre 650 e 652 nm. Tal como seria de
esperar, o comprimento da cadeia N-alquílica praticamente não afeta o valor do λmáx (gráfico
1) [81].
1,2
652
1
Abs
0,8
651
0,6
0,4
8a
8b
652
0,2
8c
0
500
600
700
800
λ (nm)
Gráfico 1 – Espetros de absorção no UV/Vis dos compostos 8a-c possuindo diferentes cadeias N-alquílicas.
A alteração da natureza do heterociclo em corantes possuindo a mesma cadeia
N-alquílica origina variação do comprimento de onda do máximo de absorção (gráfico 2), na
42
Discussão de resultados
ordem: benzotiazole < benzoselenazole < quinolina. Enquanto nos dois primeiros heterociclos
este desvio batocrómico resulta do aumento da basicidade do heteroátomo, no caso da
quinolina é consequência do aumento da extensão do sistema π-conjugado [59].
Os valores de massa exata obtidos para estes compostos estão dentro dos limites tido
como aceitáveis.
0,8
668
0,6
Abs
C6H13
651
N
710
O
8b
0,4
9b
0,2
X
X
O
10b
N
0
500
600
700
800
λ (nm)
C6H13
8b: X = S; 9b: X = Se; 10: X = CH=CH.
Gráfico 2 – Espetros de absorção no UV/Vis dos compostos 8b, 9b e 10b, possuindo diferentes heterociclos.
2.2.3 Síntese dos corantes esquarílicos O-metilados 11a-c, 12b e 13b
A síntese dos corantes esquarílicos catiónicos 11a-c, 12b e 13b foi realizada por
metilação dos corantes esquarílicos 8a-c, 9b e 10b, respetivamente, com um excesso de
quatro equivalentes molares de trifluorometanossulfonato de metilo (CF3SO3CH3), em
CH2Cl2 seco, em agitação à temperatura ambiente e sob atmosfera de N2, de acordo com o
método referido na literatura [81,93]. Os corantes esquarílicos 11a-c, 12b e 13b foram obtidos
com rendimentos entre 63% e 95%.
Todos os compostos 11a-c, 12b e 13b apresentavam características espetroscópicas de
acordo com a estrutura atribuída.
Nos espetros no IV destes compostos, assim como nos compostos precursores 8a-c, 9b
e 10b, observam-se as bandas características da vibração das ligações C-H alifáticas entre
2954-2855 cm-1 (fracas), assim como as bandas relativas à vibração da ligação C-O (variando
entre médias e fortes) que se encontram entre 1265-1251 cm-1. No entanto, contrariamente ao
que se verificava para os corantes zwiteriónicos precursores, nos espetros dos compostos
11a-c, 12b e 13b é possível observar as bandas da vibração do grupo C=O (fracas e médias)
entre 1763-1714 cm-1.
43
Discussão de resultados
Nos espetros de 1H RMN dos compostos 11a-c, 12b e 13b observam-se os sinais
correspondentes a todos os protões esperados. Tal como foi observado para os respetivos
precursores, o espetro de 1H RMN dos corantes O-metilados apresenta um único sinal
correspondente a dois protões na forma de singuleto a um desvio químico entre 6,21 e 5,74
ppm, atribuído aos protões CH=C da cadeia polimetínica, indicando mais uma vez a simetria
da molécula [94b]. É de realçar neste espetro o aparecimento de um sinal de três protões na
forma de singuleto, a um desvio químico tipicamente entre 4,74-4,54 ppm, originado pelos
protões do grupo metoxilo introduzido.
Relativamente aos comprimentos de onda dos máximos de absorção dos compostos
11a-c, 12b e 13b é observado em todos os casos um desvio hipsocrómico (entre18 e 36 nm)
relativamente aos precursores 8a-c, 9b e 10b, provocado, muito provavelmente, pelo caráter
eletroatrator do átomo de oxigénio do grupo metoxilo presente no auxocromo. No entanto, a
forma destas bandas é idêntica à dos corantes anteriores (intensas e estreitas).
As massas exatas encontradas para os compostos 11a-c, 12b e 13b estão dentro dos
limites tido como aceitáveis.
2.2.4 Síntese dos corantes aminoesquarílicos 14a-c, 15b, 16b e 20b
A síntese dos corantes esquarílicos 14a-c, 15b, 16b e 20b foi realizada por
substituição nucleófila dos grupos metoxilo presentes nos corantes esquarílicos 11a-c, 12b e
13b por diaminas apropriadas monoprotegidas com o grupo Boc, em CH2Cl2 anidro, em
agitação à temperatura ambiente e sob atmosfera de N2 (N-Boc-etilenodiamina no caso dos
compostos 14a-c, 15b e 16b e N-Boc-hexanodiamina no caso do composto 20b). Em todos os
casos foi usado um excesso da amina em relação ao material de partida.
Foram usadas diaminas monoprotegidas de forma a evitar a formação de misturas
contendo compostos de monoadição e de diadição, dado o caráter bidentado destas diaminas
livres [97].
Devido à dificuldade em precipitar o composto 14c, este foi obtido com um
rendimento baixo (8%) e, uma vez que só uma pequena parte foi obtida na forma cristalina, a
reação seguinte foi realizada a partir do produto bruto da reação.
Todos os compostos 14a-c, 15b, 16b e 20b apresentavam características
espetroscópicas consistentes com a estrutura proposta.
44
Discussão de resultados
No que diz respeito ao espetro no IV destes compostos, observam-se as bandas
características deste tipo de compostos, como as bandas da vibração das ligações C-H
alifáticas entre 2973-2836 cm-1 (fracas), estando, provavelmente, a banda das ligações C-H
aromáticas sobreposta com aquelas. Apresentam ainda as bandas relativas à vibração da
ligação C=O, de intensidade fraca, a cerca de 1700 cm-1. O fato da banda do grupo carbonilo
aparecer com uma intensidade fraca poderá ter origem, pelo menos parcialmente, na
introdução do átomo de azoto da amina cujo caráter eletrodoador origina duas estruturas de
ressonância (esquema 4), fazendo com que a ligação C-O adquira um carater intermédio entre
o de ligação covalente dupla e o de ligação covalente simples.
Esquema 4 – Estrutura de ressonância do anel de quatro membros dos corantes aminoesquarílicos.
Após análise dos espetros de 1H RMN, foram identificados os sinais correspondentes a
todos os protões das moléculas. O aumento do número de sinais nos espetros destes
compostos sugere uma perda de simetria molecular, tal como é claramente indicado pela
separação dos sinais dos protões da cadeia polimetínica (CH=C), os quais surgem agora,
contrariamente ao observado nos espetros dos corantes precursores, como dois singuletos de
um protão cada, a desvios químicos diferentes, situados tipicamente entre 6,16 e 5,85 ppm
para um dos protões e entre 6,04 e 5,65 ppm para o outro. Esta não-equivalência de ambientes
químicos deve resultar do impedimento à livre rotação do grupo amina, como resultado das
estruturas de ressonância referidas anteriormente, originando um campo magnético local não
homogéneo [94b]. A falta de simetria molecular que conduz à não equivalência magnética
dos vários picos é também particularmente visível nos protões metilénicos dos grupos
N-alquílicos (figura 16).
É visível o aparecimento do sinal dos protões pertencentes ao grupo terc-butilo,
sobreposto com o sinal de alguns dos protões das cadeias N-alquílicas, entre 1,52 e 1,26 ppm.
É ainda de salientar o aparecimento dos sinais dos protões lábeis correspondentes aos dois
grupos NH de cada molécula, um a desvios químicos entre 8,97 e 8,89 ppm e o outro a
desvios químicos entre 7,29 e 7,19 ppm, os quais trocam ambos com D2O.
45
Discussão de resultados
Composto 8a
CH=C
NCH2
Composto 11a
OCH3
CH=C
NCH2
Composto 14a
CH=C
CH=C
NCH2
NCH2
400,13 MHz, DMSO-d6
Figura 16 - Espetros de 1H RMN dos compostos 8a, 11a e 14a.
Relativamente aos comprimentos de onda do máximo de absorção, para todos os
compostos 14a-c, 15b, 16b e 20b é observado um desvio batocrómico (entre 25 e 34 nm)
relativamente aos corantes precursores 11a-c, 12b e 13b, promovido pelo caráter eletrodoador
dos grupos aminados introduzidos no auxocromo. O grupo N-Boc presente na cadeia aminada
ligada ao anel central de 20b e 14b parece não ter qualquer influência no comprimento de
onda do máximo de absorção dos compostos, não obstante as duas cadeias diferirem de quatro
átomos de carbono, provavelmente por se localizar, em ambos os casos, relativamente longe
do ponto de ligação do auxocromo ao sistema cromofórico.
46
Discussão de resultados
As massas exatas encontradas para os compostos 14a-c, 15b, 16b e 20b estão dentro
dos limites tido como aceitáveis.
2.2.5 Síntese dos corantes aminoesquarílicos 17a-c, 18b, 19b e 21b
Com a substituição de um dos átomos de oxigénio do anel central dos corantes por um
grupo alquilamina (via Boc) espera-se, por um lado, que estes compostos aumentem a sua
solubilidade em meio aquoso e que possam estabelecer interações com substratos biológicos,
proporcionadas por um número acrescido de ligações de hidrogénio. Por outro lado, o grupo
alquilamina consitui um braço espaçador que permite a ligação do corante à matriz de
agarose. Os grupos aminados são comumente usados como espaçadores, sendo parcialmente
ligados à matriz. Neste caso, trata-se de uma estratégia menos clássica, pois o espaçador já faz
parte do ligando.
A escolha de grupos aminados para a síntese destes compostos foi feita tendo em conta
o número de carbonos da sua cadeia, começando com a escolha de uma diamina com dois
átomos de carbono na tentativa de diminuir o tamanho do braço espaçador e minimizar as
interações hidrofóbicas. Para efeitos de comparação tentou-se sintetizar um composto
idêntico, variando a extensão da cadeia carbonada do grupo diamina, que neste caso possuía
seis carbonos.
Os compostos 17a-c, 18b, 19b e 21b foram obtidos através da desproteção da amina
por hidrólise ácida do respetivo grupo Boc. Para isso fizeram-se reagir os compostos
14a-c, 15b, 16b e 20b com um excesso de ácido trifluoroacético, na presença de
1,3-dimetoxibenzeno, em CH2Cl2, em agitação à temperatura ambiente e sob atmosfera
de N2.
A hidrólise ácida do Boc é levada a cabo eficazmente com ácido trifluoroacético, puro
ou em combinação com diclorometano, na proporção de 1:1 [98]. O mecanismo desta
hidrólise [99] inicia-se com a protonação do átomo de oxigénio do grupo carbamato, podendo
esta protonação ser feita apenas num único passo ou envolver várias protonações
intermediárias, seguida da consequente formação de um ácido carbâmico, com perda do
carbocatião terc-butil (esquema 5). O ácido carbâmico é novamente protonado dando origem
à diamina desprotegida com libertação de CO2. No entanto, como o carbocatião terc-butil
libertado pode reagir facilmente com nucleófilos, como neste caso a amina que fica livre,
47
Discussão de resultados
formando adutos, esta reação é feita na presença de 1,3-dimetoxibenzeno [100] que funciona
como armadilha para este tipo de carbocatiões [101].
Esquema 5 - Mecanismo geral de hidrólise ácida do grupo Boc.
De modo a promover a troca do contra-ião, os produtos resultantes da hidrólise dos
grupos N-Boc foram tratados com solução aquosa de Kl a 14%, dando origem aos compostos
17a-c, 18b, 19b e 21b. Este passo é realizado para que o corante aminoesquarílico final seja
mais facilmente cristalizável, tornando mais simples a sua purificação.
Contudo, não foi possível obter o composto 21b puro pois a mistura reacional resultou
demasiado complexa e, mesmo após várias tentativas de purificação, não se conseguiu isolar
o composto desejado. O tamanho da cadeia alifática da amina poderá estar na origem quer de
processos intramoleculares, quer de adição a moléculas O-metiladas, levando à complexidade
observada. Os compostos 17a-c, 18b e 19b foram obtidos com rendimentos razoáveis (42%78%), após recristalização.
Todos os compostos 17a-c, 18b e 19b apresentam características espetroscópicas
consistentes com as estruturas propostas.
Relativamente aos espetros no IV, observam-se, em todos os casos, bandas
características da vibração das ligações N-H, entre 3451 e 3398 cm-1, (largas e de fraca
intensidade), bandas características da vibração das ligações C-H alifáticas, entre 2941-2821
cm-1 (fracas), podendo as bandas características das ligações C-H aromáticas estarem
sobrepostas com estas. Apresentam ainda as bandas da vibração do grupo C=O, de
intensidade fraca, entre 1690-1623 cm-1.
48
Discussão de resultados
Nos espetros de 1H RMN de cada um destes compostos observa-se, de uma maneira
geral, os sinais dos protões lábeis, tal como nos dos seus percursores, mas que agora surgem
como um sinal de um protão, na forma de singuleto largo, correspondente ao grupo NH, a
desvio químico entre 8,90 e 8,78 ppm, e a um desvio químico entre 8,78 e 8,00 ppm,
sobreposto com os sinais dos protões aromáticos, correspondente aos dois protões do grupo
NH2, também na forma de singuleto largo, trocando com D2O. Para além da observação do
sinal dos protões da amina primária livre, o desaparecimento do sinal correspondente aos
nove protões do grupo terc-butilo é adicionalmente indicativo da perda do grupo Boc.
Continuam a ser visíveis nestes espetros os sinais dos protões da cadeia polimetínica (CH=C)
na forma de dois singuletos de um protão cada, com  entre 6,25 e 5,94 ppm para um e 5,94 e
5,70 ppm para o outro, revelando, mais uma vez, a falta de simetria molecular e a consequente
diferença do ambiente magnético local dos protões metínicos, pelas razões já referidas para os
compostos 14a-c, 15b, 16b e 20b.
Os espetros de 13C-RMN estão de acordo com a estrutura proposta para cada composto
com exceção do composto 18b, onde não foi possível identificar qualquer pico por se ter
decomposto em solução, como comprovado posteriormente por c.c.f..
Com a perda do grupo Boc o λmáx dos corantes 17a-c, 18b e 19b permaneceu idêntico
ao dos seus precursores 14a-c, 15b e 16b.
As massas exatas encontradas para os compostos 17a-c, 18b e 19b estão dentro dos
limites tido como aceitáveis.
2.3 Síntese de corantes esquarilicos assimétricos
Os corantes esquarílicos assimétricos 25a-d foram preparados de acordo com o
percurso sintético ilustrado no esquema 6, usual para corantes esquarílicos assimétricos [71].
O dibutilesquarato 22, facilmente preparado aquecendo a refluxo ácido esquárico (7) em
n-BuOH, foi feito reagir com os iodetos de benzotiazólio 4a-d, para originar os ésteres
monossubstituídos do ácido esquárico 23a-d. A hidrólise destes últimos com uma solução
aquosa de NaOH a 40%, seguida da protonação dos sais de sódio resultantes com HCl origina
os intermediários monossubstituídos 24a-d. Finalmente, a condensação catalisada por base
deste últimos com brometo de N-carboxietilbenzotiazólio 4e, em n-BuOH/piridina, originou
os corantes esquarílicos 25a-d pretendidos.
49
Discussão de resultados
Esquema 6 - Síntese geral dos corantes assimétricos.
2.3.1 Síntese dos sais heterocíclicos quaternários 4d e 4e
O sal quaternário de amónio 4d foi obtido fazendo reagir uma solução de
2-metilbenzotiazole (1) com um excesso de 1-iodoetano, na proporção de 1:3, como descrito
para os sais 4a-c em 2.2.1. O sal quaternário de amónio 4e resultou da alquilação do
50
Discussão de resultados
2-metilbenzotiazole (1) com um excesso de ácido 3-bromopropanóico, em acetonitrilo e em
refluxo.
As características espetroscópicas dos compostos 4d e 4e apresentam-se de acordo
com as estrutura atribuídas.
Para ambos os sais as bandas características no IV são, em geral, idênticas às bandas
apresentadas para os restantes sais 4a-c discutidos em 2.2.1. No caso do sal 4e, é de realçar o
aparecimento de uma banda a cerca de 1700 cm-1, característica da vibração da ligação C=O
presente neste composto.
O rendimento de 4d é de 93% evidenciando mais uma vez que, em geral, quanto
menor a cadeia alquílica, maior é o rendimento obtido como referido anteriormente (2.2.1).
2.3.2 Síntese da 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22)
O composto 22 foi preparado facilmente por reação do ácido esquárico (7) com
n-BuOH, a refluxo, de acordo com o método usual referido na literatura [102]. O composto
22, obtido na forma de um óleo castanho, com rendimento de 70%, apresentava-se
cromatograficamente puro e foi utilizado no passo seguinte sem necessidade de purificação
adicional.
2.3.3 Síntese dos ésteres monossubstituídos do ácido esquárico 23a-d
As reações de ésteres dialquílicos do ácido esquárico com bases metilénicas levam à
formação de ésteres monossubstituídos do ácido esquárico [103]. Desta forma, para obter os
compostos monossubstituídos 23a-d fez-se reagir os sais quaternários 4a-d com quantidades
equimolares de dibutilesquarato (22), em Et2O, de acordo com o procedimento usual descrito
na literatura [104]. No entanto, embora a reação seja realizada na proporção de 1:1 e o
produto maioritátio desta reação seja o composto desejado 23, observa-se também,
invariavelmente, a formação de outro composto, de cor vermelha (λmáx 522nm), devendo
tratar-se do composto 1,2-dissubstituído, como referido na literatura [105].
Todos os compostos 23a-d apresentam características espetroscópicas consistentes
com as estruturas atribuídas.
Na análise dos espetros no IV são visíveis bandas fracas características da vibração
das ligações C-H alifáticas, entre 2966 e 2926 cm-1, bandas igualmente fracas, entre
51
Discussão de resultados
1770 e 1768 cm-1, correspondentes à vibração da ligação C=O, e também bandas de
intensidade média, entre 1700 e 1698 cm-1, indicando a existência da porção ciclobuteno na
molécula.
Os sinais nos espetros de 1H RMN e de 13C RMN estão de acordo com a estrutura dos
vários compostos. É de realçar a presença dos sinais dos protões metílicos e metilénicos
indicativos da existência de apenas um grupo OBu e de um sinal de um único protão da
cadeia polimetínica (CH=C), surgindo na forma de um singuleto a cerca de 5,55 ppm, que
evidencia também tratar-se de um composto de monoadição. Quando comparado o sinal do
protão da cadeia polimetínica destes compostos com o sinal correspondente nos corantes
simétricos 8a-c, 9b e 10b, verifica-se que, neste caso, surge a um desvio químico inferior, o
que pode ser explicado pelo fato do átomo de azoto presente no anel heterocíclico não se
encontrar carregado positivamente e, por isso, o protão da cadeia polimetínica se encontrar
mais blindado.
O comprimento de onda do máximo de absorção destes compostos é de 441 nm, um
valor significativamente inferior aos dos corantes dissubstituídos, como seria de esperar,
devido à diminuição óbvia da extensão do cromóforo.
As massas exatas encontradas para os compostos 23a-d estão dentro dos limites tidos
como aceitáveis.
2.3.4 Síntese dos ácidos esquáricos monossubstituídos 24a-d
Os compostos 24a-d foram preparados por hidrólise básica (NaOH aquoso a 40%) dos
correspondentes precursores 24a-d e subsequente protonação dos sais de sódio obtidos com
HCl 2M, de acordo com o método descrito na literatura [104].
O método convencional de síntese de corantes assimétricos envolve, necessariamente, a
hidrólise básica do intermediário monobutilesquarato [106], uma vez que a condensação
direta de uma base metilénica com aquele intermediário resulta não no composto
1,3-dissubstituído mas antes no seu isómero constitucional 1,2-dissubstituído [79c, 105].
Os compostos 24a-d foram obtidos com bons rendimentos, entre 83% e 95%,
apresentando-se cromatograficamente puros, tendo sido assim usados na reação seguinte sem
purificação adicional.
52
Discussão de resultados
2.3.5 Síntese dos corantes esquarílicos assimétricos 25a-d
Os corantes esquarílicos assimétricos 25a-d foram finalmente obtidos por
condensação de um equivalente molar dos compostos hidrolisados 24a-d com um equivalente
molar de brometo de 3-(2-carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4e) numa mistura de
n-BuOH/piridina (9/1), a refluxo.
Todos os compostos 25a-d apresentam características espetroscópicas de acordo com
a estrutura proposta.
Os espetros no IV, além das bandas habituais, apresentam uma banda característica da
vibração da ligação O-H típica de grupo ácido carboxílico, entre 3457 e 3440 cm-1, de
intensidade fraca/média.
Nos espetros de 1H RMN observa-se a presença dos sinais correspondentes aos protões
aromáticos, entre 7,89 e 7,22 ppm, em duplicado, evidenciando a presença de duas bases
heterocíclicas distintas e, portanto, um composto dissubstituído assimétrico. Outro fato
importante indicativo da estrutura dissubstituída e assimétrica destes corantes são os sinais
dos protões da cadeia polimetínica (CH=C) que aparecem como dois singuletos de um protão
cada, a entre 5,80 e 5,83 ppm para um, e entre 5,78 e 5,77 ppm para o outro. Os sinais dos
protões das cadeias laterais também refletem a assimetria molecular, observando-se os sinais
dos protões das cadeias N-alquílicas a desvios quimicos próximos dos das cadeias análogas
dos compostos simétricos e o aparecimento dos sinais dos protões metilénicos adjacentes ao
grupo ácido carboxílico do grupo CH2CH2COOH tipicamente entre 2,72 e 2,67 ppm e os
sinais dos outros dois protões metilénicos adjacentes aos anteriores (CH2CH2COOH) entre
4,44 e 4,25 ppm. Um dado a realçar é que, contrariamente ao que se observa no espetro no IV
onde é visível a banda característica da ligação OH em todos os compostos, no espetro de 1H
RMN apenas o composto 25a apresenta o sinal correspondente ao protão ácido do grupo
COOH. Tal pode ser explicado pelo fato da posição do sinal deste protão depender do
solvente, da concentração e da presença de outros protões permutáveis. Velocidades
intermédias de troca com outros protões podem induzir sinais muito largos que, por vezes,
nem sequer são detetados [107].
Os λmáx dos compostos 25a-d são bastante superiores aos dos compostos
intermediários de mono-substituição 23a-d, refletindo o aumento do comprimento da cadeia
de ligações duplas conjugadas (gráfico 3). Para os compostos 25a-c os valores de λmáx são
semelhantes aos dos corantes simétricos 8a-c.
As massas exatas encontradas para os compostos 25a-d estão dentro dos limites tidos
como aceitáveis.
53
Discussão de resultados
1
Abs
23a
652
0,8
441
23b
0,6
23c
0,4
23d
25a
0,2
25b
0
25c
350
450
550
650
750
850
λ (nm)
25d
Gráfico 3 - Espetros de absorção no UV/Vis dos compostos 23a-d e 25a-d.
2.4 Ensaios de imobilização de corantes simétricos à Sepharose CL-6B
2.4.1 Ativação da Sepharose CL-6B com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano
Os bisoxiranos são, em geral, usados para introduzir o grupo epoxi (oxirano) em
muitos polímeros possuindo grupos hidroxilo. Dentro deste grupo o 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano é o reagente mais comummente usado para promover a ligação destes
grupos ativos em polímeros como a agarose [108]. A pH alcalino, o 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano reage rapidamente com compostos com grupos hidroxilo, através de
substituição nucleófila bimolecular, originando polímeros derivados que contêm uma
molécula que funciona como um braço espaçador de cadeia longa, hidrófilico, separando o
ligando da matriz, e que possui um oxirano reativo na outra extremidade (esquema 7).
Estas características são potencialmente úteis na cromatografis de afinidade. A ligação
entre o bisoxirano e a matriz torna-se uma ligação éter estável, enquanto a outra extremidade
proporciona o potencial de acoplamento a ligandos que contêm grupos hidroxilo, tiol ou
amina, como é o caso dos corantes utilizados como ligandos.
Assim uma suspensão de Sepharose CL-6B numa solução aquosa de NaOH 0,6 M foi
tratada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano, de acordo com o procedimento descrito na
literatura [21]. Depois de decorrido todo o processo, foi obtida a Sepharose ativada e pronta
para ser usada na imobilização dos corantes.
54
Discussão de resultados
Esquema 7 – Ativação da Sepharose CL-6B com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano.
2.4.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano com
os corantes aminoesquarílicos 17b e 17c
Com o objetivo de ligar os corantes 17b e 17c à Sepharose CL-6B ativada com
1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano, uma suspensão desta última em solução tampão de borato a
pH 10,02 foi tratada com uma solução do corante em N,N-dimetilformamida (esquema 8).
Esquema 8 – Ligação de corantes aminoesquarílicos à Sepharose ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano.
55
Discussão de resultados
Após o bloqueio dos grupos epóxido remanescentes por tratamento com solução
aquosa de etanolamina 1,0 M (pH 9,0), o gel tingido foi submetido a 24 h de extração de
Soxhlet com MeOH/acetona (1/1) a fim de remover todo o corante não ligado covalentemente.
Contudo, estes dois tingimentos não foram bem-sucedidos pois finalizada a extração
de Soxhlet ambos os géis se apresentavam praticamente brancos. Uma ineficiente ativação da
Sepharose CL-6B, ou a falta de nucleofilicidade do grupo aminado dos corantes nas condições
reacionais podem estar na origem da não fixação dos corantes aminoesquarílicos 17b e 17c à
matriz cromatográfica.
2.4.3 Ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo
O cloreto de cianurilo é um composto heterocíclico simétrico consistindo num anel de
triazina com três átomos de cloro reativos, o que lhe permite estabelecer ligações fortes entre
grupos hidroxilo da Sepharose e ligandos possuindo grupos amina, tal como os corantes em
estudo.
A ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo foi realizada tratando uma
suspensão da matriz em acetona com uma solução de cloreto de cianurilo 1,0 M no mesmo
solvente, na presença de N,N-diisopropiletilamina, a uma temperatura a 40 ºC (esquema 9), de
acordo com o procedimento descrito na literatura [21]. Depois de decorrido todo o processo,
foi obtida a Sepharose ativada e pronta para ser usada na imobilização dos corantes.
Esquema 9 – Ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo.
56
Discussão de resultados
A utilização da amina terciária é fundamental para capturar as moléculas de HCl
libertadas durante as reações de condensação.
À temperatura de 40°C apenas um dos átomos de cloro do cloreto de cianurilo se liga
aos grupos hidroxilo da Sepharose [109].
2.4.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo com os corantes
aminoesquarílicos 17a-c e 19b
Para promover a ligação dos corantes à matriz de Sepharose, uma suspensão
de Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo em acetona foi tratada com
uma solução do corante pretendido em DMF, na presença de Et3N (esquema 10). Após
os átomos de cloro ativos remanescentes serem bloqueados por tratamento com solução
tampão de Tris-HCl 1,0 M (pH 9,0), o gel tingido foi submetido a extração de Soxhlet
com MeOH/acetona (1/1) durante 24 h, a fim de remover todo o corante não ligado
covalentemente.
Os corantes utilizados inicialmente para tingimento da Sepharose foram os corantes
17a-c (tabela 6). A escolha destes corantes teve como objetivos estudar, por um lado, a
influência da variação do comprimento do grupo N-alquilo (17a-c) e, por outro, a influência
da densidade de corante imobilizado na Sepharose, na eficiência cromatográfica dos suportes
resultantes.
Todos os ensaios foram realizados com sucesso uma vez que os suportes adquiriram,
no final do processamento, uma cor azul intensa.
Estes suportes cromatográficos, juntamente com o suporte de controlo ou branco (sem
ligando imobilizado), foram testados no Laboratório de Cromatografia do Centro de
Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior para separação de
proteínas padrão como a α-quimotripsina, a lisozima e a tripsina, por CA.
Depois de estudado o efeito do gradiente de diferentes soluções de eluição, tanto no
suporte tingido como no suporte de controlo, verificou-se que a utilização de um gradiente de
(NH4)2SO4 permitia padrões muito diferentes de retenção para as proteínas carregadas nos
dois suportes, indicando assim que os ligandos imobilizados são os responsáveis pelas
interações estabelecidas.
57
Discussão de resultados
Esquema 10 – Ligação de corantes aminoesquarílicos à Sepharose ativada com cloreto de cianurilo.
De acordo com estes resultados começou por avaliar-se o efeito do tamanho das
cadeias N-alquílicas do corante usado - 4, 6 ou 10 átomos de carbono - sobre a retenção de
proteínas com matrizes preparadas com 1,4 x 10-2 mmol de cada ligando/10 mL de Sepharose
ativada (suportes 1, 2 e 5). Verificou-se que o corante 17b, contendo grupos N-hexilo
pendentes, apresentava as interações mais específicas com as proteínas. O corante 17a, com
cadeias N-butilo, revelou interações mais fracas com as proteínas, exigindo uma concentração
de (NH4)2SO4 mais elevada na eluição, o que indica menor seletividade do ligando. Pelo
58
Discussão de resultados
contrário, no suporte preparado com o corante 17c, possuindo cadeias N-decilo, foram
estabelecidas interações demasiado fortes com as proteínas, não tendo sido possível a sua
recuperação no processo de eluição.
No sentido de avaliar o efeito da densidade do ligando na interação com as proteínas,
foram preparados suportes com diferentes quantidades do corante 17b, possuindo grupos
pendentes N-hexilo, dado ter-se verificado ser o ligando mais eficiente para a separação
cromatográfica. As quantidades do ligando utilizadas no procedimento de imobilização foram
de 1,4 x 10-2 mmol (suporte 2), 4,2 x 10-2 mmol (suporte 3) e 1,4 x 10-1 mmol (suporte 4) de
corante/10 mL de Sepharose ativada. Os resultados indicaram que, em geral, foram
estabelecidas interações entre as proteínas e os suportes preparados com 4,2 x 10-2 mmol
(suporte 3) e 1,4 x 10-1 mmol (suporte 4) de ligando. No entanto, este não é um padrão de
interação desejável, dado que, após a ligação, não foi possível recuperar as proteínas retidas.
Por outro lado, os estudos da matriz preparada com 1,4 x 10-2 mmol (suporte 1) de ligando
demonstraram que as proteínas podem, por um lado, interagir com os ligandos e, por outro
lado, podem ser removidas por eluição com uma menor concentração de (NH4)2SO4.
Estes resultados levaram assim à seleção do suporte preparado com a concentração
mais baixa de 17b (suporte 2), como sendo o mais eficiente.
Tabela 6 – Ensaios preparados com os corantes 17a-c e densidade de ligando dos vários suportes
cromatográficos.
Suporte
Corante
Quantidade de corante
usado
(mmol de corante/10 mL de
Densidade do
ligando
Sepharose ativada)
(mmol de corante/g
de suporte)
Observações
1
17a
1,4 x 10-2
3,4 x 10-2
Gel azul
2
17b
1,4 x 10-2
1,8 x 10-2
Gel azul
3
17b
4,2 x 10-2
5,2 x 10-2
Gel azul
4
17b
1,4 x 10-1
1,1 x 10-1
Gel azul
5
17c
1,4 x 10-2
3,0 x 10-2
Gel azul
A densidade efetiva de ligando nos vários suportes tingidos (tabela 6) foi estimada a
partir da percentagem de azoto determinado por análise elementar, quando comparada com o
branco, ou seja, uma amostra de Sepharose ativada submetida a todo o procedimento
experimental mas na ausência de corante. Foi necessário fazer a aproximação de considerar
que a percentagem de azoto derivada do agente de ativação (cloreto de cianurilo) é o mesmo
59
Discussão de resultados
quer no suporte tingido, quer no suporte não tingido. A determinação da densidade de ligando
através da percentagem de enxofre forneceria valores mais precisos mas, infelizmente, essa
percentagem nos suportes preparados é muito próxima do limite de deteção experimental para
ser confiável ou mesmo detectável.
O suporte preparado com o corante aminoesquarilico 17b como ligando, com uma
densidade de ligando de 1,8 x 10-2 mmol/g de suporte (suporte 2), revelou-se capaz de isolar a
lisozima, a α-quimotripsina e a tripsina, a partir de uma mistura artificial, usando um
gradiente de (NH4)2SO4 entre 1 M e 0 M. Esta separação bem sucedida resultou das diferentes
interações estabelecidas entre cada uma das proteínas e o suporte, verificando-se a eluição da
lisozima em primeiro lugar, seguida da α-quimotripsina e, por último, da tripsina, tal como é
ilustrado na figura 17.
Lisozima
0,8 M
α-Quimotripsina
Tripsina
[(NH4)2SO4] (M)
Abs relativa (280 nm)
1,0 M
Figura 17 - Perfil cromatográfico da separação de uma mistura de lisozima, α-quimotripsina e tripsina, com uma
concentração de 15mg/mL cada, usando um passo de lavagem com (NH4)2SO4 1 M em Tris-HCl 10
mM (pH 8,0) e um gradiente de (NH4)2SO4 de 0,8 M a 0 M (linha a tracejado) com o suporte
preparado com o corante 17b (densidade de ligando: 1,8 x 10-2 mmol/g de suporte) (adaptado de
[110]).
A eficácia da separação da mistura de proteínas foi confirmada por eletroforese (SDSPAGE).
No sentido de estudar o efeito da variação do núcleo heterocíclico na separação
cromatográfica, estabeleceu-se usar os corantes 18b e 19b, derivados, respetivamente, do
benzoselenazole e da quinolina, ambos com as cadeias pendentes N-hexilo, como ligandos e
comparar os resultados com os obtidos com o suporte preparado com 17b (suporte 2). O
corante 18b, contudo, não foi usado no tingimento da Sepharose pois verificou-se através de
c.c.f., como referido anteriormente, que este composto depois de algum tempo em solução
apresenta decomposição. Assim, foi apenas realizado o tingimento da Sepharose com o
corante 19b (suporte 6) com a mesma concentração de partida do suporte 2 (1,4 x 10-2 mmol
60
Discussão de resultados
de corante/10 mL de Sepharose ativada), tendo-se obtido um suporte corado de azul intenso.
No entanto, depois de estudadas as interações deste suporte com as proteínas anteriores, os
resultados conseguidos não apresentaram diferenças significativas relativamente aos obtidos
com o suporte preparado com 17b, o que parece indiciar que ambos os corantes apresentam
afinidades semelhantes para as mesmas proteínas.
Outro objetivo deste trabalho passava pelo estudo do efeito do tamanho do grupo
alquilamina ligado ao anel central de quatro membros dos corantes, através da avaliação
cromatográfica de um suporte preparado com o corante 21b, possuindo um grupo pendente
central hexanodiamina, como ligando. Porém, tal não foi praticável uma vez que não foi
possível obter este corante puro, como referido anteriormente.
2.5 Ensaios de imobilização de corantes assimétricos à Sepharose CL-6B
2.5.1 Conversão dos grupos epóxido da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano em grupos amina
Suportes ativados com grupos epóxidos, nomeadamente o 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano, quando tratados com iões amónio, podem ser usados na produção de
espaçadores com aminas terminais (esquema 11).
Esquema 11 – Conversão dos grupos epóxidos em aminas.
61
Discussão de resultados
O resultado são braços espaçadores muito hidrofílicos contendo grupos hidroxilo
secundários, ligações éter à matriz estáveis e uma amina primária terminal permitindo
posterior derivatização. A matriz obtida é assim útil para acoplamento, por amidação, de
ligandos que contêm grupos ácido carboxílico, como é o caso dos corantes assimétricos
usados neste trabalho, ou outros compostos com grupos que reajam com grupos amina.
Tendo em conta precisamente a imobilização dos corantes assimétricos sintetizados,
através da formação de ligações amida à matriz cromatográfica, a Sepharose CL-6B ativada
com 1,4-bis-(2,3-epoxipropoxi)butano foi tratada com uma solução aquosa de NH4OH 1 M,
de modo a efetuar a conversão dos grupos epóxido em aminas primárias terminais.
2.5.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada em 2.5.1 com os corantes 25d
A Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano e possuindo grupos
amina terminais nos braços espaçadores, foi tratada com o corante 25d numa mistura de tampão de Na3PO4 0,1 M e DMF, de modo a efetuar a condensação entre os grupos amina presentes no suporte e os grupos ácido carboxílico do corante, mediada com EDC (esquema 12).
Esquema 12 - Ligação do corante 25d à Sepharose ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano derivatizado
com grupos amina.
62
Discussão de resultados
O gel obtido, tingido de azul muito claro, foi submetido a 24 h de extração de Soxhlet
com MeOH/acetona (1/1) a fim de remover todo o corante não ligado covalentemente. No
entanto, no final da extração, o gel apresentava-se praticamente branco, indicando a ineficácia
do tingimento.
Embora não se possa colocar de lado a hipótese da ativação da Sepharose CL-6B ter
resultado deficiente, a possível labilidade do intermediário O-acilisoureia formado
inicialmente na ativação do grupo ácido carboxílico do corante por reação com a EDC, nas
condições reacionais, terá também, muito provavelmente, um papel importante.
2.5.3 Ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina
Um braço espaçador comummente usado na ativação de matrizes para CA é a
diaminodipropilamina. Esta triamina é um espaçador mais pequeno do que o 1,4-bis(2,3epoxipropoxi)butano, possuindo uma cadeia de nove átomos com grupos amina primária em
cada extremidade, o que lhe permite estabelecer ligações em cada uma delas, e um grupo
central amina secundária. Este último confere um certo caráter hidrofílico interno ao
espaçador, fazendo com que a molécula apresente um caráter globalmente hidrofílico.
O acoplamento de qualquer molécula espaçadora com grupos amina em ambas as
extremidades a um suporte reativo a aminas requer a adição de um excesso molar
significativo do espaçador para evitar que se ligue a dois grupos hidroxilo próximos presentes
na matriz [21].
A ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina foi realizada por
tratamento da matriz, sequencialmente, com numa solução de NaIO4 0,2 M, uma mistura de
diaminodipropilamina em água desionizada contendo fosfato de sódio e cianoborohidreto de
sódio (esquema 13).
Esquema 13 – Ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina.
63
Discussão de resultados
O gel depois de lavado ficou pronto a ser usado no processo de imobilização do
corante.
A formação de grupos aldeído na matriz de Sepharose CL-6B é o primeiro passo no
processo de ativação da matriz, necessária para a imobilização do ligando. Em suportes tais
como géis à base de agarose, como por exemplo a Sepharose CL-6B, os grupos aldeído
podem ser criados por oxidação suave dos grupos hidroxilo com NaIO4. O método de
ativação resulta numa elevada densidade de grupos formilo numa matriz de agarose, que
podem então ser utilizados em procedimentos de acoplamento por aminação redutora.
Os aldeídos assim formados podem reagir com grupos amina primária e secundária
para formar bases de Schiff reversíveis. Essa interação, resultante de uma ligação imina, é
reforçada por um pH levemente alcalino, mas é facilmente quebrada em estados de equilíbrio
quimico. Estas bases de Schiff podem ser reduzidas e estabilizadas por ligações covalentes,
utilizando um agente redutor tal como o borohidreto de sódio ou o cianoborohidreto de sódio.
No entanto, o cianoborohidreto de sódio é o redutor mais usado pois reduz rapidamente as
bases de Schiff mas, ao contrário do borohidreto de sódio, não reduz os grupos aldeído [111].
Este reagente ajuda assim, efetivamente, a impulsionar a reação de acoplamento, deixando
apenas os aldeídos e removendo as bases de Schiff assim que elas são formadas.
Uma vez reduzida a base de Schiff, a amina resultante funciona como um braço
espaçador altamente estável para a imobilização de ligandos.
2.5.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina com o corante
25d
A Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina foi acoplada ao corante
esquarílico 25d, numa mistura duma solução tampão de Na3PO4 0,1 M e DMF,
por condensação entre os grupos amina primária presentes no suporte sólido e os grupos
ácido carboxílico do corante, na presença de EDC e NHS. Os grupos amina primária
remanescentes presentes na Sepharose ativada foram bloqueadas por acilação com Ac2O
(esquema 14).
Finalmente, o suporte tingido foi submetido a 24 h de extração de Soxhlet com
MeOH/acetona (1/1), para assegurar a remoção de todo o corante ligado de forma não
covalente.
64
Discussão de resultados
Esquema 14 – Ligação da amina do braço espaçador ao grupo ácido carboxílico do corante via EDC/NHS.
Nesta reação de amidação, a EDC funciona como um mediador, que reage com o
grupo ácido carboxílico para formar um intermediário O-acilisoureia, que pode ser facilmente
deslocado por ataque nucleófilo de um grupo amina primária. Uma ligação amida é formada e
a carbodiimida de partida é libertada como um derivado de ureia solúvel. O intermediário
O-acilisoureia, contudo, é instável em solução aquosa e, quando não reage com uma amina, a
hidrólise do intermediário resulta na regeneração do grupo ácido carboxílico e na formação de
ureia. A NHS é usada neste processo de amidação para aumentar a eficiência da reação de
65
Discussão de resultados
acoplamento mediada pela EDC, gerando um intermediário consideravelmente mais estável
(éster-NHS), resultante do deslocamento da porção O-acilisoureia pelo grupo hidroxilo do
NHS [112]. O éster-NHS que se forma reage subsequentemente com um grupo amina
primária para dar origem a uma ligação amida (esquema 15).
Esquema 15 – Reação de amidação mediada por EDC e NHS.
O tingimento da matriz ativada com o corante assimétrico 25d foi conseguido com
sucesso e o suporte assim preparado foi testado, conjuntamente com o suporte de controlo ou
branco (sem ligando imobilizado), no Laboratório de Cromatografia do Centro de
Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior na separação de
proteínas por CA.
Surpreendentemente, a avaliação cromatográfica destes dois suportes, sob as mesmas
condições de eluição, revelou possuírem idêntico desempenho, observando-se em ambos os
casos a separação das proteínas utilizadas.
Com base nestes resultados e levando em consideração a facilidade de preparação
e o custo inferior do suporte não tingido, este, e não o suporte preparado com o ligando,
foi usado na separação de uma mistura de BSA, RNase A e K-Caseína. A figura 18
mostra o perfil cromatográfico obtido após a injeção de uma mistura artificial destas
proteínas.
66
Discussão de resultados
Abs relativa (280 nm)
1,0 M
RNase A
K-Caseína
BSA
0,1 M
Figura 18 - Perfil cromatográfico obtido utilizando o suporte não-tingido após a injeção de uma mistura de
K-Caseína, BSA e RNase A, com uma concentração de 15mg/mL cada, utilizando Tris-HCl 10 mM
(pH 7,0) no passo inicial de lavagem, seguido de um gradiente de NaCl de 0 M até 1 M (linha
tracejada) (adaptado de [113]).
O perfil cromatográfico obtido evidencia que este suporte, nestas condições, permite
uma separação eficiente das três proteínas a partir de uma mistura. Para tal foi usada
inicialmente uma solução tampão Tris-HCl (pH 7,0), tendo sido recolhida a fração
correspondente à RNase A, seguida da utilização de um gradiente de NaCl de 0 M a 1M,
permitindo a eluição sequencial da BSA e da K-Caseína. Estes resultados sugerem claramente
que as proteínas utilizadas interagem de forma diferente com o suporte, permitindo a sua
purificação.
A pureza das proteínas isoladas foi verificada por eletroforese (SDS-PAGE).
Uma vez que a EDC e a NHS foram utilizadas, no processo de imobilização do
corante, apenas com a finalidade de ligar a Sepharose ativada ao corante, através da formação
de uma ligação amida entre o grupo amina primária da diaminodipropilamina e o grupo ácido
carboxílico pendente do corante, a obtenção de resultados cromatográficos idênticos com o
suporte tingido e com o suporte não-tingido, sugeriu que o corante usado como ligando parece
ter, neste caso, pouca importância relativa, e que as unidades de diaminadipropilamina
aciladas sobre a Sepharose devem ser as principais responsáveis pela separação
cromatográfica observada. Assim, para confirmar esta hipótese, o passo seguinte consistiu em
preparar um suporte ativado com diaminadipropilamina mas evitando a presença
dos reagentes de amidação (EDC e NHS) e sem ser submetido à extração de Soxhlet, uma
vez que a função deste passo era o de remover o corante não ligado covalentemente ao
suporte.
Tal como esperado, o comportamento cromatográfico deste novo suporte na separação
das proteínas usadas anteriormente, sob as mesmas condições de eluição, foi igual ao do
67
Discussão de resultados
suporte de controlo, o que veio reforçar a ideia proposta de que as unidades de diaminadipropilamina aciladas sobre a Sepharose são as responsáveis pela separação observada.
2.5.5 Ativação da Sepharose CL-6B com etilenodiamina
De modo a explorar a influência do braço espaçador nos suportes contendo os corantes
assimétricos como ligandos, procedeu-se à ativação da Sepharose CL-6B com etilenodiamina,
de acordo com o processo usado em 2.5.3 para a ativação com diaminodipropilamina, de
modo a verificar se o tamanho e o tipo da amina usada influenciam o comportamento do
suporte cromatográfico.
2.5.6 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com o corante 25d
A Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina foi acoplada ao corante esquarílico
assimétrico 25d por condensação entre os grupos amina primária presentes no suporte sólido
e os grupos ácido carboxílico do corante, com EDC e NHS, de acordo com o procedimento
descrito em 2.5.4 para o tingimento da Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina
com o mesmo corante.
Do tingimento resultou um gel corado de azul, o qual, juntamente com o
correspondente suporte de controlo ou branco (sem ligando imobilizado), foi testado no
Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da
Universidade da Beira Interior, na separação de proteínas por CA.
Este estudo cromatográfico foi realizado de forma idêntica ao da avaliação dos
suportes ativados com diaminadipropilamina, mas com as proteínas lisozima, BSA e RNase
A, tendo-se igualmente verificado que o gradiente de NaCl usado era o que permitia uma
melhor separação. Tal como no caso dos suportes preparados com base na
diaminadipropilamina, verificou-se que, sob as mesmas condições de eluição, os dois suportes
preparados a partir da Sepharose ativada com etilenodiamina, tingido e não tingido,
apresentavam um desempenho de separação idêntico.
A utilização do suporte não tingido na separação de uma mistura artificial de
lisozima, BSA e RNase A permitiu o isolamento francamente eficiente das três proteínas
(figura 19).
68
Discussão de resultados
1,0 M
Abs relativa (280 nm)
Lisozima
BSA
RNase A
0,01 M
M
Figura 19 - Perfil cromatográfico obtido utilizando o suporte não-tingido após a injeção de uma mistura de
lisozima (15 mg/mL) e BSA e RNase A (30 mg/mL), utilizando Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) no passo
inicial de lavagem, seguido de um gradiente de NaCl 0 M até 1 M (linha tracejada), (adaptado de
[114]).
Tal como anteriormente, a pureza das proteínas isoladas foi confirmada por
eletroforese (SDS-PAGE).
Uma vez que, tal como no caso anterior, o suporte tingido e não tingido apresentam o
mesmo comportamento cromatográfico, foi preparado um suporte cromatográfico com base
na Sepharose ativada com etilenodiamina mas na ausência dos reagentes de amidação, no
sentido de confirmar se são as unidades de etilenodiamina aciladas presentes na Sepharose
que são responsáveis pela separação cromatográfica observada. O passo da extração de
Soxhlet foi igualmente evitado pela razão óbvia da ausência de corante na preparação do
suporte.
Surpreendentemente, neste caso, este último suporte apresenta um comportamento
cromatográfico diferente do suporte de controlo, preparado apenas sem a presença do corante
esquarílico, não se observando a separação das três proteínas.
Estes resultados parecem sugerir a hipótese de que um outro fragmento molecular,
com exceção das unidades de etilenodiamina aciladas, deverá ser responsável pela capacidade
de separação exibida pelo suporte não tingido testado anteriormente. Na tentativa de
compreender a composição estrutural deste suporte, foram preparados seis outros suportes
cromatográficos diferentes (suportes 7-12), cada um dos quais com a exclusão, seletiva, de
alguns passos ou reagentes envolvidos na preparação usual do suporte (tabela 7).
Depois de testar todos os suportes preparados, nas mesmas condições de eluição
usadas para o suporte de controlo, a primeira conclusão, baseada na avaliação do suporte 7, é
a de que a ausência do passo da extração de Soxhlet não infuencia a capacidade de separação
69
Discussão de resultados
do suporte, pois os resultados obtidos foram idênticos aos do suporte de controlo que permitiu
a separação eficiente das três proteínas.
Tabela 7 – Suportes preparados com Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina.
Suporte EDC NHS Ac2O
√
7
8
-
9
-
√
10
√
-
√
-
√
-
√
√
Extração
Soxhlet
-
-
-
-
11
√
√
-
-
12
-
-
√
-
Resultado
BSA - Não liga
RNase A – Liga, elui no segundo passo
Lisozima – Liga, elui no terceiro passo
BSA – Liga, elui no terceiro passo
RNase A – Não liga
Lisozima – Não liga
BSA - Não liga
RNase A – Não liga
Lisozima – Não liga
BSA - Não liga, elui parcialmente no
segundo passo
RNase A – Não liga
Lisozima – Liga, elui no segundo passo
BSA – Liga, elui no terceiro passo
RNase A – Não liga
Lisozima – Não liga
BSA – Não liga
RNase A – Não liga
Lisozima – elui em todos os passos
Quando se excluiu a EDC na preparação de suporte (suporte 9), houve uma alteração
do comportamento cromatográfico, observando-se que nenhuma das proteínas apresenta
interação com o suporte.
Por outro lado, quando se omitiu a NHS na preparação do suporte (suporte 10), no
respetivo perfil cromatográfico observou-se que apenas a lisozima apresenta interação com o
suporte.
Quando é removido o Ac2O da etapa final da preparação do suporte (suporte 11),
também só uma das proteínas estabelece interação com este suporte, neste caso a BSA. O
suporte 8 – apenas Sepharose ativada com a etilenodiamina, sem qualquer tratamento
70
Discussão de resultados
adicional - apresenta um comportamento cromatográfico idêntico ao suporte em cuja
preparação que foi retirado o Ac2O (suporte 11).
Finalmente, o suporte ativado com a etilenodiamina e sujeito apenas a acilação com
Ac2O (suporte 12), também apresenta um comportamento cromatográfico diferente dos
restantes, verificando-se que tanto a BSA como a RNase A não interagem com o suporte e
que a lisozima vai eluindo em todos os passos do gradiente usado.
Em geral, estes resultados indicam que a separação das proteínas em estudo era
impraticável com qualquer um dos suportes preparados referidos anteriormente (suportes 812), com exceção do suporte 7 onde o processo de extração de Soxhlet não parece ter
qualquer influência, sendo os cromatogramas obtidos com os diferentes suportes, todos
diferentes uns dos outros.
Isto pareceu claramente apontar para o fato de que cada um dos reagentes
mencionados na preparação dos suportes tem um papel essencial e específico no processo
global. Com base nesta premissa, procurou-se racionalizar um percurso mecanístico plausível
conducente à possível estrutura molecular presente na matriz, responsável pelo excelente
desempenho cromatográfico do suporte de controlo.
A presença simultânea de dois grupos carbonilo numa succinimida é conhecida por
ativar o ataque de compostos nucleofílicos, tais como aminas [115]. Tendo em conta esta
reatividade conhecida das succinimidas e as observações cromatográficas anteriores, uma
possível sequência de reações que podem ocorrer durante a preparação do suporte encontra-se
representada no esquema 16.
Os grupos aminas primárias livres presentes nas unidades de etilenodiamina ligados à
Sepharose podem atacar um dos grupos carbonilo da NHS, formando um ácido hidroxâmico
terminal, após a abertura do anel de succinimida. A EDC presente neste processo é então
capaz de promover o rearranjo de Lossen do ácido hidroxâmico para dar o isocianato
correspondente. O uso da EDC (e de outras carbodiimidas solúveis em água) como mediador
no rearranjo de Lossen de ácidos hidroxâmicos tem sido documentado na literatura [116,117].
O isocianato fica assim disponível para sofrer o ataque nucleófilo de um grupo amina livre de
uma unidade de etilenodiamina, originando um heterociclo de cadeia alargada feito a partir de
duas unidades de etilenodiamina próximas.
Nas condições experimentais utilizadas, este processo não parece abranger todos os
resíduos de etilenodiamina originalmente imobilizadas na Sepharose, uma vez que o
comportamento cromatográfico do suporte ativado com EDC + NHS + acilação (suporte 7) é
71
Discussão de resultados
diferente do observado para o suporte onde este último passo foi evitado (suporte 11). Esta
diferença aponta para a existência de alguns grupos aminas primárias livres remanescentes,
após o processo de ciclização acima mencionado.
Além disso, a hidrólise simples do isocianato sob as condições reacionais não deve
ocorrer numa extensão apreciável uma vez que o suporte ativado com a etilenodiamina e
submetido a acilação com Ac2O (suporte 12) exibe um comportamento muito diferente em
relação à separação da mistura de proteínas.
Esquema 16 – Possíveis reações que podem ocorrer durante a preparação do suporte com etilenodiamina.
72
Discussão de resultados
Anteriormente foi observado um bom desempenho na separação cromatográfica de
suportes de Sepharose contendo corantes aminoesquarílicos simétricos para uma mistura de
lisozima, α-quimotripsina e tripsina [110]. Neste caso, dada a semelhança entre os
desempenhos dos suportes cromatográficos tingido e não tingido com o corante 25d, não é
possível concluir inequivocamente que no suporte tingido o corante aminoesquarílico
assimétrico também atua como ligando de afinidade. Dependendo das velocidades relativas da
amidação e dos processos de ciclização sobre a superfície da Sepharose, três hipóteses podem
ser colocadas quanto ao papel do corante como ligando no processo de separação das
proteínas: a primeira é que o ligando pode ter uma eficiência de separação em relação à
mistura de proteínas semelhante ao suporte preparado na sua ausência; a segunda é que este
pode estar presente em quantidades de tal maneira reduzidas, que não influencia o
desempenho das outras espécies moleculares responsáveis pela separação; e como terceira
hipótese, menos provável, é que este seja completamente ineficiente e a separação seja levada
a cabo apenas pelas outras espécies moleculares formadas sobre o suporte tingido.
2.6 Conclusão
A utilização do método de síntese dos corantes aminosquarílicos simétricos via
intermediário O-metilado mostrou-se efetiva na obtenção destes compostos, tendo-se
sintetizado, em geral com bons rendimentos, um conjunto alargado de corantes possuindo
uma cadeia etilenodiamina ligada ao anel central de quatro membros, variando quer a
natureza dos núcleos heterocíclicos terminais, quer o comprimento da cadeias pendentes
laterais. Contudo, a inclusão de uma cadeia maior, a hexanodiamina, no anel esquárico central
não se revelou eficaz, resultando na obtenção de uma mixtura complexa.
Em relação à preparação dos corantes esquarílicos assimétricos, foi verificado tratar-se
igualmente de uma estratégia expedita, que permitiu obter diferentes corantes esquarílicos
assimétricos baseados no benzotiazole com rendimentos bastante satisfatórios.
Relativamente aos métodos de ativação da Sepharose verificou-se que a utilização de
cloreto de cianurilo, no caso dos corantes esquarílicos simétricos, ou de diferentes aminas, no
caso dos corantes esquarílicos assimétricos, permitiu a imobilização dos corantes com
sucesso. Quando se usa como agente de ativação o 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano,
verificou-se que não houve fixação significativa dos corantes à Sepharose, visto o gel
73
Discussão de resultados
resultante ser praticamente branco, tanto para os corantes esquarílicos simétricos como para
os assimétricos.
Os suportes cromatográficos preparados foram avaliados na separação de proteínas no
Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da
Universidade da Beira Interior.
O suporte cromatográfico preparado a partir da imobilização na Sepharose do corante
aminoesquarílico derivado do benzotiazole e possuindo cadeias laterais N-hexilo 17b, com
uma densidade de ligando de 1,8 x 10-2 mmol de corante/g de suporte, utilizando um
gradiente decrescente de (NH4)2SO4, permitiu separar eficientemente a lisozima, a αquimotripsina e a tripsina, a partir de uma mistura artificial. A comparação do comportamento
cromatográfico do suporte tingido com o de um suporte de controlo (sem corante), permitiu
concluir que, neste caso, os ligandos imobilizados são efetivamente os responsáveis pelas
interações estabelecidas. A seletividade do corante, enquanto ligando, pode resultar de
múltiplas interações fracas, como eletrostáticas, hidrofóbicas, ligações de hidrogénio e
interações de Van der Walls.
Quando se utilizou um suporte de afinidade preparado a partir da imobilização do
corante esquarílico assimétrico derivado do benzotiazole 25d em Sepharose ativada com
diaminodipropilamina, por acoplamento através de amidação mediada por EDC/NHS entre
um grupo N-carboxietilo do corante e o grupo amino primário da diaminodipropilamina,
verificou-se ser capaz de separar uma mistura artificial de BSA e RNase A e K-Caseína. O
suporte preparado na ausência do corante, com o objetivo de avaliar a importância intrínseca
do corante no processo de separação, mostrou contudo um desempenho igual ao do suporte
tingido na separação das três proteínas. O suporte em que na preparação se excluiram os
reagentes EDC e NHS, desnecessários dado não se imobilizar o corante, continuou a
apresentar um comportamento cromatográfico igual na separação destas três proteínas, o que
sugere que as unidades de diaminodipropilamina aciladas presentes sobre a Sepharose são as
responsáveis pela separação observada.
O suporte de afinidade preparado a partir da imobilização do mesmo corante
esquarílico assimétrico 25d em Sepharose ativada com etilenodiamina, igualmente por
acoplamento através de amidação mediada por EDC/NHS entre um grupo pendente
N-carboxietilo do corante e o grupo amina primário da etilenodiamina, conseguiu separar uma
mistura de BSA, lisozima e RNase A. O suporte de controlo preparado na ausência do
corante, com o objetivo de avaliar a importância intrínseca do corante no processo de
74
Discussão de resultados
separação revelou, surpreendentemente, um desempenho na separação das três proteínas ainda
melhor que o do suporte tingido. Neste caso, o suporte preparado sem a presença de EDC e
NHS apresentou um comportamento cromatográfico bastante diferente, não permitindo a
separação das proteínas mencionadas, o que veio sugerir que as entidades moleculares
responsáveis pela excelente separação observada não serão simplesmente unidades de
etilenodiamina monoaciladas.
Depois de vários ensaios realizados, com variação seletiva dos reagentes
intervenientes no processo de imobilização, tornou-se evidente a importância capital da EDC
e da NHS, e foi racionalizado um percurso mecanístico possível conducente às estruturas
moleculares presentes na superfície da matriz, responsáveis pelo excelente desempenho
cromatográfico do suporte de controlo. Este percurso parece implicar a ciclização de duas
unidades de etilenodiamina próximas presentes na superfície da Sepharose, com a inclusão de
um resíduo derivado da succinimida entre eles, por uma via envolvendo um rearranjo de
Lossen de um intermediário do ácido hidroxâmico mediado pela EDC.
Globalmente os resultados obtidos neste trabalho são bastante promissores, quer em
termos da eficácia da imobilização de corantes esquarílicos na Sepharose, quer em termos da
performance dos suportes preparados com aqueles corantes imobilizados. Os corantes
cianínicos esquarílicos mostram assim ser promissores ligandos sintéticos que podem ser
potencialmente explorados na separação de outras proteínas e até de ácidos nucleicos por CA.
75
Capítulo 3
Parte experimental
Parte experimental
3.1 Reagentes e equipamentos
Os solventes e reagentes usados foram secos e destilados, sempre que necessário, por
métodos padronizados [118].
Os reagentes cuja síntese não se encontra descrita foram adquiridos comercialmente e
eram analiticamente puros.
O cloreto de cianurilo foi purificado como descrito na literatura [21].
Éter de petróleo refere-se à fração de p.e. 40-60 °C. Sempre que sejam usados
solventes mistos é indicada a sua proporção volumétrica.
Todas as reações foram monitorizadas por c.c.f. usando placas de sílica gel de 0,25
mm de espessura Merck 60 F254, sendo o eluente usado referido para cada caso. Após eluição,
as placas cromatográficas foram observadas à luz UV nos comprimentos de onda 254 e/ou
365 nm.
Para a separação por c.c. foi utilizada sílica gel Merck 70-230 (0,063-0,200 mm), em
coluna de vidro.
Os p.f. foram determinados em tubos capilares abertos num aparelho de pontos de
fusão Bϋchi-535 ou num microscópio binocular URA Technic acoplado a uma placa aquecida
e não foram corrigidos.
Os espetros no IV foram registados num espetrofotómetro Unicam Research Series
FTIR. Quando descritos, os dados obtidos são indicados da seguinte forma: estado físico da
amostra (KBr - em pastilhas de brometo de potássio); νmáx (cm-1) e tipo de banda.
Os espetros no UV/Vis foram realizados num espetrofotómetro de duplo feixe Perkin-Elmer Lambda 25. Foram utilizadas células de quartzo de 1 cm de percurso ótico. Quando
descritos, os dados obtidos são indicados da seguinte forma: λmáx (nm), log ε.
Os espetros de 1H RMN e de
13
C RMN foram obtidos num espetrómetro Bruker
Avance III 400 ou num espetrómetro Bruker ARX 400. Na descrição de cada espetro os dados
obtidos são indicados da seguinte forma: solvente; δ (ppm) relativamente ao sinal do SiMe4
ou a sinais residuais dos solventes usados; área relativa [nH (como número de protões a que
corresponde o sinal)]; multiplicidade do sinal; J (Hz); confirmação de protões labéis após
troca com D2O.
Os EMAR (FAB), realizados usando uma matriz de álcool 3-nitrobenzílico (3-ANB),
e os EMAR (ESI-TOF) e EM (ESI-TOF) foram obtidos num espetrómetro de massa
Micromass VG Autopsec M. Os dados obtidos em cada espetro são indicados da seguinte
77
Parte experimental
forma: m/z do ião molecular; fórmula molecular e massa exata calculada para o ião molecular
correspondente.
A agitação da Sepharose foi efetuada de forma suave com a ajuda de um agitador
orbital IKA Yellow Line OSS Basic.
3.2 Síntese de sais heterocíclicos
3.2.1 Síntese do iodeto de 3-butil-2-metilbenzotiazólio (4a)
Uma solução de 2-metilbenzotiazole (1) (3,40 mL, 26,7 mmol) e 1-iodobutano (9,15 mL, 80,5 mmol) em acetonitrilo (100 mL) foi aquecida
a refluxo. A evolução da reação foi seguida por c.c.f. (CH2Cl2/MeOH,
9/1) até consumo completo do material de partida (6 dias). A mistura
reacional foi então arrefecida num banho de gelo e adicionado éter etílico
para precipitação do produto. O precipitado foi recolhido por filtração a pressão reduzida e os
cristais obtidos lavados com éter etílico. O filtrado foi concentrado por evaporação a pressão
reduzida para retirar o éter etílico e colocado de novo a refluxo por mais 6 dias. Este
procedimento foi repetido mais duas vezes tendo-se obtido o composto 4a com rendimento de
88%, na forma de cristais beges, apresentando: p.f. 181,6-182,9 °C; IV (KBr) νmáx: 2941méd,
2929méd, 2861méd, 1573fr, 1519fr, 1480fr, 1465méd, 1438méd, 1385fr, 1345méd, 1278fr,
1237fr, 1197méd, 1116fr, 1063fr, 955fr, 767f, 713méd.
3.2.2 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-metilbenzotiazólio (4b)
Fez-se reagir 2-metilbenzotiazole (1) (3,40 mL, 26,7 mmol) com 1-iodo-hexano (11,9 mL, 80,6 mmol) de acordo com o procedimento descrito
em 3.2.1 (7 dias). Após tratamento da mistura reacional como referido
foi obtido o composto 4b com rendimento de 80%, na forma de cristais
beges, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo com os
descritos na literatura [60].
78
Parte experimental
3.2.3 Síntese do iodeto de 3-decil-2-metilbenzotiazólio (4c)
Fez-se reagir 2-metilbenzotiazole (1) (3,40 mL, 26,7 mmol) com 1-iododecano (17,2 mL, 80,4 mmol) de acordo com o procedimento
descrito em 3.2.1 (7 dias). Após tratamento da mistura reacional como
referido foi obtido o composto 4c com rendimento de 75%, na forma de
cristais beges, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo
com os descritos na literatura [60].
3.2.4 Síntese do iodeto de 3-etil-2-metilbenzotiazólio (4d)
Fez-se reagir 2-metilbenzotiazole (1) (3,40 mL, 26,7 mmol) com 1-iodoetano (7,85 mL, 80,5 mmol) de acordo com o procedimento
descrito em 3.2.1 (5 dias). Após tratamento da mistura reacional como
referido foi obtido o composto 4d com rendimento de 93%, na forma de
cristais beges, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo
com os descritos na literatura [60].
3.2.5 Síntese do brometo de 3-(2-carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4e)
Fez-se reagir 2-metilbenzotiazole (1) (3,40 mL, 26,7 mmol) com ácido 3-bromopropanóico (12,3 g, 80,4 mmol) de acordo com o procedimento
descrito em 3.2.1 (3 dias). Após tratamento da mistura reacional como
referido foi obtido o composto 4e com rendimento de 71%, na forma de
cristais beges, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo
com os descritos na literatura [65].
3.2.6 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-metilbenzoselenazólio (5b)
Fez-se reagir 2-metilbenzoselenazole (2) (4,00 g, 20,4 mmol) com 1-iodo-hexano (9,10 mL, 61,7 mmol) de acordo com o procedimento
descrito em 3.2.1 (6 dias). Após tratamento da mistura reacional como
referido foi obtido o composto 5b com rendimento de 78%, na forma de
cristais beges, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo
com os descritos na literatura [60].
79
Parte experimental
3.2.7 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-metilquinolínio (6b)
Fez-se reagir 2-metilquinolina (3) (3,80 mL, 28,1 mmol) com 1-iodo-hexano (12,4 mL, 84,0 mmol) de acordo com o procedimento descrito
em 3.2.1 (4 dias). Após tratamento da mistura reacional como referido
foi obtido o composto 6b com rendimento de 94%, na forma de cristais
amarelos, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo com os
descritos na literatura [60].
3.3 Síntese de corantes esquarílicos simétricos
3.3.1 Síntese do 4-[(3-butilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8a)
Uma solução de iodeto de 3-butil-2-metilbenzotiazólio (4a) (1,00 g, 3,00 mmol) e ácido esquárico
(7) (0,171 g, 1,50 mmol) em n-BuOH/piridina - 9/1
(100 mL) foi aquecida a refluxo durante 7 h. A
evolução
da
reação
foi
seguida
por
c.c.f.
(CH2Cl2/MeOH, 9/1). Uma vez a reação completa,
adicionou-se Et2O à mistura reacional arrefecida, tendo-se recolhido o precipitado por
filtração a pressão reduzida e lavado os cristais resultantes com H2O destilada e éter de
petróleo. Foi obtido o composto 8a com um rendimento de 87%, sob a forma de cristais
esverdeados, apresentando: p.f. 265 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 652
(5,34). IV (KBr) νmáx: 2955fr, 1586méd, 1452f, 1411f, 1345méd, 1291fr, 1237f, 1170f, 1090f,
1074méd, 942fr, 808fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,86 (2H, d, J = 7,4, ArH), 7,55
(2H, d, J = 8,2, ArH), 7,45 (2H, t, J = 7,3, ArH), 7,27 (2H, t, J = 7,8, ArH), 5,79 (2H, s,
CH=C), 4,25 (4H, t, J = 7,4, NCH2(CH2)2CH3), 1,73-1,65 (4H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1,471,38 (4H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0,95 (6H, t, J = 7,4, N(CH2)3CH3). EM (ESI-TOF) m/z:
488,17 (M+, 100%).
80
Parte experimental
3.3.2 Síntese do 4-[(3-hexilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8b)
Uma solução de iodeto de 3-hexil-2-metilbenzotiazólio (4b) (2,85 g, 7,89 mmol) e ácido esquárico
(7) (0,450 g, 3,94 mmol) foi feita reagir de acordo
com o procedimento descrito em 3.3.1 (7 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi
obtido o composto 8b com rendimento de 81%, na
forma de cristais esverdeados, apresentando dados físicos e espetroscópicos de acordo com os
referidos na literatura [93].
3.3.3 Síntese do 4-[(3-decilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8c)
Uma solução de iodeto de 3-decil-2-metilbenzotiazólio (4c) (2,90 g, 6,95 mmol) e ácido esquárico
(7) (0,396 g, 3,47 mmol) foi feita reagir de acordo
com o procedimento descrito em 3.3.1 (7 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi
obtido o composto 8c com rendimento de 74%, na
forma de cristais azuis, apresentando: p.f. 178-179 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx
(log ε): 652 (5,31). IV (KBr) νmáx: 2928fr, 2848fr, 1586méd, 1452f, 1411f, 1358fr, 1291fr,
1223f, 1090méd, 1063méd, 942fr, 821fr, 740fr. 1H RMN (400,13 MHz, CDCl3) δ: 7,53 (2H,
d, J = 7,8, ArH), 7,37 (2H, t, J = 7,6, ArH), 7,20 (2H, t, J = 7,6, ArH), 7,13 (2H, d, J = 8,1,
ArH), 6,05 (2H, s, CH=C), 4,57 (4H, t, J = 7,6, NCH2(CH2)8CH3), 1,81 (4H, quinteto, J = 7,4,
NCH2CH2(CH2)7CH3), 1,44-1,21 (28H, m, N(CH2)2(CH2)7CH3), 0,87 (6H, t, J = 6,8,
N(CH2)9CH3). EM (ESI-TOF) m/z: 656,36 (M+, 100 %).
3.3.4 Síntese do 4-[(3-hexilbenzoselenazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (9b)
Uma solução de iodeto de 3-hexil-2-metilbenzoselenazólio (5b) (1,90 g, 4,65 mmol) e ácido esquárico (7) (0,266 g, 2,33 mmol) foi feita reagir de
acordo com o procedimento descrito em 3.3.1 (3 h).
Após tratamento da mistura reacional como referido
foi obtido o composto 9b com rendimento de 65%,
81
Parte experimental
na forma de cristais azuis, apresentando dados físicos e espetroscópicos idênticos aos
referidos na literatura [93].
3.3.5 Síntese do 4-[(1-hexilquinolin-3-io-2-il)metilideno]-2-[(1-hexil-1H-quinolinilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (10b)
Uma solução de iodeto de 3-hexil-2-metilquinolínio (6b) (1,75 g, 4,93 mmol) e ácido esquárico
(7) (0,281 g, 2,46 mmol) foi feito reagir de
acordo com o procedimento descrito em 3.3.1 (24
h). Após tratamento da mistura reacional como
referido foi obtido o composto 10b com
rendimento de 62%, na forma de cristais avermelhados, apresentando dados físicos e
espetroscópicos de acordo com os referidos na literatura [93].
3.3.6 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-butil-2-[3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11a)
Fez-se reagir 4-[(3-butilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8a) (0,200 g, 0,410
mmol) com excesso de trifluorometanossulfonato
de metilo (0,190 mL, 1,67 mmol), em CH2Cl2 seco
(80 mL), à temperatura ambiente e sob atmosfera de
N2. A evolução da reação foi seguida por c.c.f. (CH2Cl2/MeOH, 9/1) até consumo completo
do material de partida (4 h). A mistura reacional foi então lavada, sequencialmente, com uma
solução aquosa de NaHCO3 a 5% e com H2O. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio
anidro e o solvente removido parcialmente a pressão reduzida. À solução resultante foi
adicionado Et2O e a mistura arrefecida num banho de gelo. O sólido precipitado obtido foi
recolhido por filtração a pressão reduzida, lavado com éter de petróleo e recristalizado de uma
mistura de CH2Cl2/Et2O, tendo-se obtido o composto 11a com um rendimento de 63%, sob a
forma de cristais azuis, apresentando: p.f. 263 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx
(log ε): 633 (5,40). IV (KBr) νmáx: 2928fr, 2861fr, 1714méd, 1698méd, 1478f, 1452f,
1358méd, 1264f, 1143fr, 1023fr, 888fr, 740fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,03
(2H, d, J = 7,8, ArH), 7,76 (2H, d, J = 8,3, ArH), 7,57 (2H, t, J = 7,6, ArH), 7,42 (2H, t, J =
82
Parte experimental
7,5, ArH), 6,04 (2H, s, CH=C), 4,54 (3H, s, OCH3), 4,44 (4H, sl, NCH2(CH2)2CH3), 1,77-1,65
(4H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1,44-1,38 (4H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0,93 (6H, t, J = 7,2,
N(CH2)3CH3). EM (ESI-TOF) m/z: 503,18 ([M - CF3SO3]+, 100 %).
3.3.7 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11b)
Fez-se reagir 4-[(3-hexilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8b) (2,46 g, 4,51
mmol) com excesso de trifluorometanossulfonato
de metilo (1,535 mL, 13,57 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.3.6 (5 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 11b com rendimento de
83%, na forma de cristais azuis, apresentando dados físicos e espetroscópicos idênticos aos
referidos na literatura [93].
3.3.8 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-decil-2-[3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11c)
Fez-se reagir 4-[(3-decilbenzotiazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (8c) (1,69 g, 2,57
mmol) com excesso de trifluorometanossulfonato
de metilo (0,875 mL, 7,74 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.3.6 (24 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 11c com rendimento de
85%, na forma de cristais azuis, apresentando: p.f. 140 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2,
99/1) λmáx (log ε): 633 (5,34). IV (KBr) νmáx: 2925méd, 2855méd, 1763fr, 1656fr, 1475f,
1458f, 1359méd, 1255f, 1142f, 1030méd, 990méd, 823fr, 751fr. 1H RMN (400,13 MHz,
CDCl3) δ: 7,63 (2H, d, J = 7,6, ArH), 7,48 (2H, t, J = 7,7, ArH), 7,38-7,31 (4H, m, ArH), 5,97
(2H, s, CH=C), 4,61 (3H, s, OCH3), 4,35 (4H, sl, NCH2(CH2)8CH3), 1,82 (4H, quinteto, J =
8,1, NCH2CH2(CH2)7CH3), 1,49-1,38 (4H, m, N(CH2)2CH2(CH2)6CH3), 1,32-1,18 (24H, m,
N(CH2)3(CH2)6CH3), 0,85 (6H, t, J = 6,9, N(CH2)9CH3). EMAR (FAB) (3-ANB) m/z:
671,36912 ([M - CF3SO3]+, C41H55N2O2S2+; calc. 671,36995).
83
Parte experimental
3.3.9 Síntese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzoselenazól-3-io (12b)
Fez-se reagir 4-[(3-hexilbenzoselenazol-3-io-2-il)metilideno]-2-[(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (9b) (0,500 g,
0,783 mmol) com excesso de trifluorometanossulfonato de metilo (0,270 mL, 2,39 mmol) de
acordo com o procedimento descrito em 3.3.6 (2 h).
Após tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 12b com
rendimento de 76%, na forma de cristais roxos, apresentando dados físicos e espetroscópicos
de acordo com os referidos na literatura [93].
3.3.10 Síntese do trifluorometanossulfonato de 1-hexil-2-[3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]quinolín-3-io (13b)
Fez-se reagir 4-[(1-hexilquinolin-3-io-2-il)metilideno]-2-[(1-hexil-1H-quinolinilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (10b) (0,500 g, 0,939
mmol) com excesso de trifluorometanossulfonato
de metilo (0,320 mL, 2,82 mmol) de acordo com
o procedimento descrito em 3.3.6 (5 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi
obtido o composto 13b com rendimento de 95%, na forma de cristais verdes escuros,
apresentando dados físicos e espetroscópicos idênticos aos referidos na literatura [93].
3.3.11 Sintese do trifluorometanossulfonato de 3-butil-2-3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (14a)
A uma solução de trifluorometanossulfonato
de
3-butil-2-[3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ili-
denometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11a) (0,400 g, 0,613
mmol) em CH2Cl2 anidro (100 mL), sob
agitação à temperatura ambiente e atmosfera
84
Parte experimental
de N2, foi adicionado excesso de N-Boc-etilenodiamina (0,195 mL, 1,23 mmol). A evolução
da reação foi seguida por c.c.f. (CH2Cl2/MeOH, 9/1) até consumo completo do material de
partida (6 h). Uma vez terminada a reação, o solvente foi removido parcialmente a pressão
reduzida e foi adicionado ao resíduo remanescente igual volume de éter de petróleo. O sólido
precipitado foi recolhido por filtração a pressão reduzida, lavado com éter de petróleo e
recristalizado de CH2Cl2/éter de petróleo, tendo-se obtido o composto 14a com um
rendimento de 88%, sob a forma de cristais roxos, apresentando: p.f. 207,5-209,3 ºC. UV/Vis
(MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 658 (5,39). IV (KBr) νmáx: 2973fr, 2836fr, 1705fr, 1513fr,
1458f, 1444f, 1355fr, 1253f, 1192méd, 1164méd, 1130fr, 1027fr, 986fr, 746fr. 1H RMN
(400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,91 (1H, sl, NH), 8,01-7,95 (2H, m, ArH), 7,74-7,70 (2H, m,
ArH), 7,57-7,50 (2H, m, ArH), 7,41-7,36 (2H, m, ArH), 7,21 (1H, sl, NH), 6,15 (1H, s,
CH=C), 6,03 (1H, s, CH=C), 4,46 (2H, sl, NCH2(CH2)2CH3), 4,28 (2H, sl, NCH2(CH2)2CH3),
3,62 (2H, sl, NHCH2CH2NHBoc), 3,22 (2H, sl, NHCH2CH2NHBoc), 1,77-1,70 (4H, m,
NCH2CH2CH2CH3), 1,43-1,34 (13H, m, N(CH2)2CH2CH3 + C(CH3)3), 0,97-0,91 (6H, m,
N(CH2)3CH3). EM (ESI-TOF) m/z: 631,30 ([M - CF3SO3]+, 100 %).
3.3.12 Sintese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól -3-io (14b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de
3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io (11b) (1,32 g, 1,85
mmol) com excesso de N-Boc-etilenodiamina
(0,440 mL, 2,77 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.3.11 (5 h). Após tratamento da mistura reacional como referido
foi obtido o composto 14b com rendimento de 71%, na forma de cristais roxos apresentando:
p.f. 184,2-185,8 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 658 (5,35). IV (KBr) νmáx:
2941fr, 2861fr, 1707fr, 1626fr, 1533fr, 1438f, 1358méd, 1237f, 1183méd, 1143méd,
1036méd, 982méd, 754fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,89 (1H, sl, NH, troca com
D2O), 8,01-7,95 (2H, m, ArH), 7,73-7,70 (2H, m, ArH), 7,57-7,50 (2H, m, ArH), 7,41-7,34
(2H, m, ArH), 7,19 (1H, sl, NH, troca com D2O), 6,14 (1H, s, CH=C), 6,03 (1H, s, CH=C),
4,46 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 4,27 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 3,64-3,58 (2H, m,
85
Parte experimental
NHCH2CH2NHBoc),
3,22-3,16
(2H,
m,
NHCH2CH2NHBoc),
1,74-1,68
(4H,
m,
NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,37-1,29 (21H, m, N(CH2)2(CH2)3CH3 + C(CH3)3), 0,88-0,84 (6H, m,
N(CH2)5CH3). EM (ESI-TOF) m/z: 687,34 ([M - CF3SO3]+, 100 %).
3.3.13 Sintese do trifluorometanossulfonato de 3-decil-2-3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (14c)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 3-
-decil-2-[3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11c) (0,500 g, 0,609
mmol) com excesso de N-Boc-etilenodiamina
(0,145 mL, 0,913 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.3.11 (6 h). Após tratamento da mistura reacional como referido
foi obtido o composto 14c com rendimento de 8%, na forma de cristais roxos apresentando:
p.f. 80,3-82,7 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 658 (5,24). IV (KBr) νmáx:
2928méd, 2861fr, 1626fr, 1519méd, 1438f, 1358méd, 1237f, 1170méd, 1036fr, 982fr, 808fr,
754fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,93 (1H, sl, NH, troca com D2O), 8,01-7,95
(2H, m, ArH), 7,70 (2H, sl, ArH), 7,57-7,49 (2H, m, ArH), 7,41-7,31 (2H, m, ArH), 7,20 (1H,
sl, NH, troca com D2O), 6,16 (1H, s, CH=C), 6,04 (1H, s, CH=C), 4,46 (2H, sl,
NCH2(CH2)8CH3), 4,27 (2H, sl, NCH2(CH2)8CH3), 3,61 (2H, sl, NHCH2CH2NHBoc), 3,22
(2H, sl, NHCH2CH2NHBoc), 1,74 (4H, sl, NCH2CH2(CH2)7CH3), 1,37-1,20 (37H, m,
N(CH2)2(CH2)7CH3 + C(CH3)3), 0,84 (6H, sl, N(CH2)9CH3). EM (ESI-TOF) m/z: 799,47 ([M CF3SO3]+, 82 %), 371,70 (100 %).
3.3.14 Sintese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzoselenazól-3-io (15b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 3-
-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzoselenazól-3-io (12b) (0,470 g,
0,585
mmol)
com
excesso
de
N-Boc-
etilenodiamina (0,120 mL, 0,761 mmol) de
86
Parte experimental
acordo com o procedimento descrito em 3.3.11 (4 h). Após tratamento da mistura reacional
como referido foi obtido o composto 15b com rendimento de 66%, na forma de cristais roxos
apresentando: p.f. 169,9-170,8 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 677 (5,31). IV
(KBr) νmáx: 2933fr, 2862fr, 1704fr, 1621fr, 1558fr, 1519fr, 1434f, 1347fr, 1245f, 1175méd,
1134méd, 1027fr, 980méd, 754fr, 637fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,97 (1H, sl,
NH, troca com D2O), 8,04 (1H, d, J = 7,7, ArH), 8,00 (1H, d, J = 7,6, ArH), 7,64-7,62 (2H, m,
ArH), 7,53-7,46 (2H, m, ArH), 7,33-7,26 (2H, m, ArH), 7,19 (1H, t, J = 5,3, NH, troca com
D2O), 6,14 (1H, s, CH=C), 6,02 (1H, s, CH=C), 4,40 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 4,24 (2H, sl,
NCH2(CH2)4CH3),
3,64-3,58
(2H,
m,
NHCH2CH2NHBoc),
3,23-3,18
(2H,
m,
NHCH2CH2NHBoc), 1,76-1,68 (4H, m, NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,40-1,25 (21H, m,
N(CH2)2(CH2)3CH3 + C(CH3)3), 0,88-0,82 (6H, m, N(CH2)5CH3). EMAR (ESI-TOF) m/z:
783,22796 ([M- CF3SO3]+, C39H51N4O3Se2+; calc. 783,22941).
3.3.15 Síntese do trifluorometanossulfonato de 1-hexil-2-3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilquinolín-3-io (16b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 1-
-hexil-2-[3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]quinolín-3-io (13b) (0,300 g, 0,429 mmol)
com excesso de N-Boc-etilenodiamina (0,100
mL, 0,644 mmol) de acordo com o procedimento descrito em 3.3.11 (7 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 16b com rendimento de
95%, na forma de cristais verdes, apresentando: p.f. 182,1-183,2 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2,
99/1) λmáx (log ε): 708 (5,33). IV (KBr) νmáx: 2954fr, 2855fr, 1693fr, 1628fr, 1558fr,
1465méd, 1457méd, 1331méd, 1301méd, 1264méd, 1156f, 1089fr, 1023fr. 1H RMN (400,13
MHz, DMSO-d6) δ: 8,99 (1H, d, J = 9,2, CH=CH), 8,94 (1H, s, NH, troca com D2O), 8,87
(1H, d, J = 9,3, CH=CH), 7,97 (1H, d, J = 9,1, CH=CH), 7,88 (1H, d, J = 9,4, CH=CH), 7,807,67 (6H, m, ArH), 7,45 (1H, t, J = 7,0, ArH), 7,40 (1H, t, J = 7,2, ArH), 7,19 (1H, s, NH,
troca com D2O), 5,85 (1H, s, CH=C), 5,65 (1H, s, CH=C), 4,35 (4H, sl, NCH2(CH2)4CH3),
3,69 (2H, sl, NHCH2CH2NHBoc), 3,19 (2H, s, NHCH2CH2NHBoc), 1,74 (4H, sl,
NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,52-1,26 (21H, m, N(CH2)2(CH2)3CH3 + C(CH3)3), 0,90 (6H, m,
N(CH2)5CH3).
13
C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 206,9, 175,1, 166,7, 156,6, 156,4,
87
Parte experimental
155,0, 151,4, 150,5, 139,5, 139,2, 136,3, 135,1, 133,0, 132,7, 129,6, 129,4, 125,7, 125,4,
125,2, 125,0, 124,7, 124,4, 122,3, 120,1, 116,7, 116,4, 93,5, 93,3, 78,6, 48,3, 48,2, 43,8, 41,6,
31,5, 31,1, 28,6, 26,2, 26,1, 22,6, 14,4, 14,3, EMAR (ESI-TOF) m/z: 675,42474 ([MCF3SO3]+, C43H55N4O3; calc. 675,42687).
3.3.16 Síntese do iodeto de 3-butil-2-[3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io (17a)
A uma solução de trifluorometanossulfonato de 3-butil-2-3-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-
-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io
(14a)
(0,200 g, 0,256 mmol) em CH2Cl2 (5 mL), em
agitação à temperatura ambiente e sob atmosfera de
N2, foi adicionado excesso de ácido trifluoroacético (5,0 mL, 65 mmol) e 1,3dimetoxibenzeno (0,50 mL, 3,8 mmol). A evolução da reação foi seguida por c.c.f.
(CH2Cl2/MeOH, 9/1) até consumo completo do material de partida (2 h). A mistura reacional
foi então neutralizada com uma solução aquosa saturada fria de NaHCO3 e, em seguida,
lavada com H2O fria. A fase orgânica, após separação por decantação, foi seca sobre Na2SO4
anidro e o solvente removido parcialmente sob pressão reduzida. Após adição de éter de
petróleo ao resíduo, o sólido precipitado resultante foi recolhido por filtração sob pressão
reduzida e lavado com éter de petróleo. Este sólido foi dissolvido em MeOH (10 mL) e à
solução resultante foi adicionada uma solução aquosa de KI a 14% (10 mL). Após cerca de 1
h à temperatura ambiente, o corante precipitado foi recolhido por filtração a pressão reduzida,
lavado com H2O e com éter de petróleo e recristalizado de CH2Cl2/éter de petróleo, tendo-se
obtido o composto 17a com um rendimento de 78%, sob a forma de cristais roxos,
apresentando: p.f 249 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 657 (5,17). IV
(KBr) νmáx: 3424fr, 2914fr, 2821fr, 1640fr, 1452f, 1358méd, 1250f, 1197méd, 1156méd,
1130méd, 982fr, 823fr, 754fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,78 (1H, sl, NH, troca
com D2O), 8,00 (2H, sl, ArH), 7,73 (2H, sl, ArH), 7,62-7,35 (6H, sl, ArH + NH2, troca com
D2O), 6,19 (1H, s, CH=C), 5,88 (1H, s, CH=C), 4,43 (2H, sl, NCH2(CH2)2CH3), 4,33 (2H, sl,
NCH2(CH2)2CH3), 3,85 (2H, sl, NHCH2CH2NH2), 3,13 (2H, sl, NHCH2CH2NH2), 1,75 (4H,
sl, NCH2CH2CH2CH3), 1,42 (4H, sl, N(CH2)2CH2CH3), 0,95 (6H, sl, N(CH2)3CH3). 13C RMN
(100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 173,7, 163,4, 161,3, 160,0, 157,1, 155,3, 140,7, 127,9, 127,8,
127,5, 125,1, 124,7, 123,0, 122,7, 113,6, 113,4, 86,5, 46,3, 45,7, 41,5, 29,4, 29,2, 19,4, 13,8.
EMAR (ESI-TOF) m/z: 531,22498 ([M - I]+, C30H35N4OS2+; calc. 531,22468).
88
Parte experimental
3.3.17 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-aminoetilamino]-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io (17b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-
-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (14b) (0,400
g,
0,477
mmol)
com
excesso
de
ácido
trifluoroacético (10,0 mL, 131 mmol) e 1,3dimetoxibenzeno (1,0 mL, 7,6 mmol) de acordo com o procedimento descrito em 3.3.16 (3 h).
Após tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 17b com
rendimento de 63%, na forma de cristais roxos, apresentando: p.f 232 ºC (dec.). UV/Vis
(MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 658 (5,27). IV (KBr) νmáx: 3451fr, 2914fr, 2821fr, 1640fr,
1559fr, 1452f, 1358méd, 1250f, 1156méd, 982fr, 835fr, 740fr. 1H RMN (400,13 MHz,
DMSO-d6) δ: 8,90 (1H, s, NH, troca com D2O), 8,01-7,94 (2H, m, ArH), 7,73-7,66 (2H, m,
ArH), 7,58-7,52 (2H, m, ArH), 7,43-7,35 (2H, m, ArH), 6,24 (1H, s, CH=C), 5,94 (1H, s,
CH=C), 4,37 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 4,30 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 3,66 (2H, sl,
NHCH2CH2NH2), 2,92 (2H, sl, NHCH2CH2NH2), 1,73 (4H, sl, NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,441,22 (12H, m, N(CH2)2(CH2)3CH3), 0,86 (6H, sl, N(CH2)5CH3).
13
C RMN (100,62 MHz,
DMSO-d6) δ: 174,2, 163,9, 161,7, 160,4, 157,7, 155,8, 141,2, 128,2, 128,1, 128,0, 125,6,
125,2, 123,5, 123,2, 114,1, 113,8, 87,0, 47,0, 46,3, 42,7, 31,4, 31,2, 27,8, 27,5, 26,2, 22,5,
14,3. EMAR (ESI-TOF) m/z: 587,28859 ([M - I]+, C34H43N4OS2+; calc. 587,28728).
3.3.18 Síntese do iodeto de 3-decil-2-[3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io (17c)
Devido às dificuldades encontradas no isolamento
do trifluorometanossulfonato de 3-decil-2-3-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (14c) na forma cristalina, a síntese de 17c foi realizada a partir do
produto bruto dessa reação. Assim, fez-se reagir 14c não purificado (0,289 g, 0,304 mmol)
com excesso de ácido trifluoroacético (10,0 mL, 131 mmol) e de 1,3-dimetoxibenzeno (1,0
mL, 7,6 mmol) de acordo com o procedimento descrito em 3.3.16 (1 h). Após tratamento da
89
Parte experimental
mistura reacional como referido foi obtido o composto 20a com rendimento de 50%, na forma
de cristais roxos, apresentando: p.f. 217 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε):
658 (5,26). IV (KBr) νmáx: 3398méd, 2914fr, 2834fr, 1690fr, 1559fr, 1465f, 1358fr, 1250f,
1205méd, 1143méd, 982fr, 808fr, 754fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,90 (1H, sl,
NH, troca com D2O), 8,00 (4H, sl, ArH + NH2, troca com D2O), 7,76-7,70 (2H, m, ArH),
7,58-7,55 (2H, m, ArH), 7,45-7,35 (2H, m, ArH), 6,25 (1H, s, CH=C), 5,87 (1H, s, CH=C),
4,44 (2H, sl, NCH2(CH2)8CH3), 4,34 (2H, sl, NCH2(CH2)8CH3), 3,91-3,85 (2H, m,
NHCH2CH2NH2), 3,16 (2H, sl, NHCH2CH2NH2), 1,75 (4H, sl, NCH2CH2(CH2)7CH3), 1,421,18 (28H, m, N(CH2)2(CH2)7CH3), 0,84 (6H, t, J = 6,7, N(CH2)9CH3).
13
C RMN (100,62
MHz, DMSO-d6) δ: 174,3, 163,9, 161,8, 160,6, 157,6, 155,8, 141,2, 128,5, 128,3, 128,0,
125,6, 125,2, 123,5, 123,2, 114,1, 113,9, 87,0, 46,9, 46,3, 41,7, 31,7, 31,2, 29,4, 29,3, 29,2,
29,1, 27,8, 27,6, 26,5, 22,5, 14,4, 9,1. EMAR (ESI-TOF) m/z: 699,41268 ([M - I]+,
C42H59N4OS2+; calc. 699,41248).
3.3.19 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzoselenazól-3-io (18b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 3-hexil-
-2-3-(3-hexil-3H-benzoselenazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzoselenazól-3-io (15b)
(0,200 g, 0,215 mmol) com excesso de ácido
trifluoroacético (5,0 mL, 65 mmol) e de 1,3-dimetoxibenzeno (0,50 mL, 3,8 mmol) de acordo com o procedimento descrito em 3.3.16 (1 h).
Após tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 18b com
rendimento de 75%, na forma de cristais roxos, apresentando: p.f. 164,8 ºC (dec.). UV/Vis
(MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 677 (5,27). IV (KBr) νmáx: 3432fr, 2941fr, 2855fr, 1628fr,
1558fr, 1434f, 1347méd, 1238f, 1160méd, 1128méd, 980fr, 784fr, 745fr. 1H RMN (400,13
MHz, DMSO-d6) δ: 8,05 (1H, d, J = 7,1, ArH), 8,00 (1H, d, J = 7,3, ArH), 7,66-7,62 (2H, m,
ArH), 7,60-7,48 (2H, m, ArH), 7,34-7,28 (2H, m, ArH), 6,37 (1H, s, CH=C), 6,12 (1H, s,
CH=C), 4,34 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 4,28 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 3,65 (2H, sl,
NHCH2CH2NH2), 2,90 (2H, sl, NHCH2CH2NH2), 1,71 (4H, sl, NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,411,30 (12H, m, N(CH2)2(CH2)3CH3), 0,86 (6H, sl, N(CH2)5CH3). EMAR (ESI-TOF) m/z:
683,17460 ([M - I]+, C34H43N4OSe2+; calc. 683,17683).
90
Parte experimental
3.3.20 Síntese do iodeto de 1-hexil-2-[3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2-(2-aminoetilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]quinolín-3-io (19b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 1-hexil-2-3-(1-hexil-1H-quinolin-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)etilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilquinolín-3-io
(16b)
(0,150 g, 0,182 mmol) com excesso de ácido trifluoroacético (1,0 mL, 13 mmol) e de 1,3-dimetoxibenzeno (0,50 mL, 3,8 mmol) de acordo com
o procedimento descrito em 3.3.16 (3 h). Após tratamento da mistura reacional como referido
foi obtido o composto 19b com rendimento de 42%, na forma de cristais verdes,
apresentando: p.f. 173,8 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 708 (5,32). IV
(KBr) νmáx: 3448fr, 2914fr, 2839fr, 1623fr, 1558fr, 1503fr, 1465méd, 1449fr, 1410fr, 1331fr,
1291fr, 1253méd, 1156f, 1036fr, 986fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 8,97 (1H, d, J =
9,2, CH=CH), 8,87 (1H, d, J = 9,3, CH=CH), 7,97 (1H, d, J = 9,0, CH=CH), 7,85-7,67 (7H,
m, CH=CH + ArH), 7,46-7,38 (2H, m, ArH), 5,94 (1H, s, CH=C), 5,70 (1H, s, CH=C), 4,39
(2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 4,26 (2H, sl, NCH2(CH2)4CH3), 3,67 (2H, sl, NHCH2CH2NH2),
2,93 (2H, sl, NHCH2CH2NH2), 1,71 (4H, sl, NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,51-1,33 (12H, m,
N(CH2)2(CH2)3CH3), 0,89 (6H, sl, N(CH2)5CH3).
13
C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ:
175,0, 166,9, 156,7, 154,9, 151,4, 150,3, 139,5, 139,2, 136,3, 134,9, 133,0, 132,7, 129,6,
129,3, 125,7, 125,4, 125,1, 124,9, 116,7, 116,3, 93,9, 48,7, 48,2, 47,0, 42,9, 31,5, 27,4, 26,9,
26,3, 26,1, 22,7, 22,6, 14,4. EMAR (ESI-TOF) m/z: 575,37288 ([M - I]+, C38H47N4O+; calc.
575,37444).
3.3.21 Sintese do trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)hexilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (20b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-metoxi-4-oxociclobut-2-eniledenometil]benzotiazól-3-io (11b) (0,100 g, 0,141
mmol) com excesso de N-Boc-hexanodiamina
(0,046 g, 0,212 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.3.11 (4 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 20b com rendimento de
72%, na forma de cristais roxos, apresentando: p.f. 86,9-87,7 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2,
99/1) λmáx (log ε): 660 (5,23). IV (KBr) νmáx: 2932fr, 2863fr, 1709fr, 1625fr, 1558fr, 1446f,
91
Parte experimental
1355méd, 1245f, 1160méd, 1137méd, 1027fr, 981fr, 754fr, 636fr. 1H RMN (400,13 MHz,
DMSO-d6) δ: 8,86 (1H, sl, NH), 8,00 (1H, d, J = 7,5, ArH), 7,93 (1H, d, J = 7,3, ArH), 7,71
(1H, d, J = 7,8, ArH), 7,65 (1H, d, J = 8,5, ArH), 7,55-7,50 (2H, m, ArH), 7,39-7,33 (2H, m,
ArH), 6,76 (1H, sl, NH), 6,22 (1H, s, CH=C), 5,87 (1H, s, CH=C), 4,34-4,30 (4H, m,
NCH2(CH2)4CH3), 3,62 (2H, sl, NHCH2(CH2)5NHBoc), 2,90 (2H, sl, NH(CH2)5CH2NHBoc),
1,78-1,65 (6H, m, NCH2CH2(CH2)3CH3 + NHCH2CH2(CH2)4NHBoc), 1,35-1,29 (27H, m,
N(CH2)2(CH2)3CH3 + NH(CH2)2(CH2)3CH2NHBoc + C(CH3)3), 0,0,85 (6H, sl, N(CH2)5CH3).
13
C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 173,4, 163,1, 161,3, 159,4, 157,1, 155,5, 155,3, 140,6,
127,8, 127,5, 125,0, 124,5, 122,9, 122,6, 122,2, 119,0, 113,5, 113,0, 86,5, 86,4, 77,2, 54,8,
46,3, 45,8, 43,5, 30,9, 30,8, 29,4, 28,1, 27,2, 26,9, 26,0, 25,9, 25,7, 25,6, 21,9, 13,7. EMAR
(ESI-TOF) m/z: 743,40000 ([M- CF3SO3]+, C43H59N4O3S2; calc. 743,40231).
3.3.22 Síntese do iodeto de 3-hexil-2-[3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-(6-aminohexilamino)-4-oxociclobut-2-enilidenometil]benzotiazól-3-io (21b)
Fez-se reagir trifluorometanossulfonato de 3-hexil-2-3-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-2-[2-(ter-butoxicarbonilamino)hexilamino]-4-oxociclobut-2-eniledenometilbenzotiazól-3-io (20b) (0,130
g, 0,145 mmol) com excesso de ácido trifluoroacético (5,0 mL, 65 mmol) e de 1,3-dimetoxibenzeno
(0,50 mL, 3,8 mmol) de acordo com o procedimento descrito em 3.3.16 (4 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido obteve-se uma mistura complexa, cujas
tentativas de purificação não permitiram isolar o composto desejado.
3.4 Síntese de corantes esquarílicos assimétricos
3.4.1 Síntese da 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22)
Dissolveu-se ácido esquárico (7) (2,00 g, 17,5 mmol) em n-BuOH (50 mL)
e aqueceu-se sob refluxo. A evolução da reação foi seguida por c.c.f.
(CH2Cl2/MeOH, 9/1) até consumo completo do material de partida (3 h). À
mistura reacional, depois de arrefecida à temperatura ambiente, foi
adicionado Et2O (75 mL) e a mistura resultante lavada, sequencialmente, com H2O fria,
solução aquosa saturada fria de NaHCO3 e, novamente, com H2O fria. A fase orgânica foi
então seca sobre Na2SO4 anidro e o solvente removido sob pressão reduzida, tendo-se obtido o
92
Parte experimental
composto 22 com um rendimento de 70%, sob a forma de um óleo acastanhado. Este óleo
apresentava-se cromatograficamente puro e foi usado no passo seguinte sem purificação
adicional.
3.4.2 Síntese da 3-butoxi-4-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23a)
Uma mistura de 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22) (1,12
g, 4,94 mmol), iodeto de 3-butil-2-metilbenzotiazólio (4a) (1,65
g, 4,94 mmol) e trietilamina (0,76 mL, 5,4 mmol) em EtOH (50
mL) foi aquecida a refluxo. A evolução da reação foi seguida
por c.c.f. (CH2Cl2/MeOH, 9/1) até consumo completo do
material de partida (5 h). Uma vez a reação completa, o solvente foi então removido a pressão
reduzida e o sólido resultante foi purificado por c.c. (AcOEt/n-hexano, 1/3), tendo-se obtido o
composto 23a com um rendimento de 72%, sob a forma de cristais amarelos, apresentando:
p.f. 130,9-132,7 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 441 (4,95). IV (KBr) máx:
2964fr, 1768fr, 1698méd, 1551méd, 1504f, 1472méd, 1425méd, 1347méd, 1301méd,
1277méd, 1191fr, 1051fr, 784fr, 754fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,81 (1H, d, J =
7,6, ArH), 7,48 (1H, d, J = 8,2, ArH), 7,41 (1H, t, J = 7,4, ArH), 7,22 (1H, t, J = 7,5, ArH),
5,55 (1H, s, CH=C), 4,72 (2H, t, J = 6,6, OCH2(CH2)2CH3), 4,17 (2H, t, J = 7,4,
NCH2(CH2)2CH3), 1,79 (2H, quinteto, J = 7,1, OCH2CH2CH2CH3), 1,65 (2H, quinteto, J =
7,5, NCH2CH2CH2CH3), 1,48-1,37 (4H, m, O(CH2)2CH2CH3 + N(CH2)2CH2CH3), 0,96-0,91
(6H, m, N(CH2)3CH3 + O(CH2)3CH3).
13
C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 192,3, 184,9,
184,4, 171,8, 159,1, 140,9, 127,1, 125,7, 123,5, 122,3, 112,1, 78,8, 72,8, 44,8, 31,5, 28,5,
19,3, 18,1, 13,6, 13,5. EMAR (ESI-TOF) m/z: 358,14646 ([M + H]+, C20H24NO3S+; calc.
358,14714).
3.4.3 Síntese da 3-butoxi-4-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23b)
Fez-se reagir 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22) (0,920 g,
4,07 mmol), iodeto de 3-hexil-2-metilbenzotiazólio (4b) (1,47 g,
4,07 mmol) e trietilamina (0,63 mL, 4,5 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.4.2 (4 h). Depois de purificado o
sólido resultante por c.c. como descrito, foi obtido o composto
93
Parte experimental
23b com um rendimento de 73%, sob a forma de cristais amarelos, apresentando: p.f. 113,8115,2 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 441 (4,96). IV (KBr) máx: 2955fr,
1768fr, 1698méd, 1550méd, 1495f, 1418méd, 1355méd, 1308méd, 1269méd, 1184fr, 1152fr,
754fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,81 (1H, d, J = 7,7, ArH), 7,48 (1H, d, J = 8,1,
ArH), 7,41 (1H, t, J = 7,3, ArH), 7,21 (1H, t, J = 7,4, ArH), 5,54 (1H, s, CH=C), 4,72 (2H, t, J
= 6,6, OCH2(CH2)2CH3), 4,16 (2H, t, J = 7,5, NCH2(CH2)4CH3), 1,78 (2H, quinteto, J = 7,1,
OCH2CH2CH2CH3), 1,66 (2H, quinteto, J = 7,4, NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,48-1,25 (8H, m,
N(CH2)2(CH2)3CH3 + O(CH2)2CH2CH3), 0,94 (3H, t, J = 7,4, (O(CH2)3CH3), 0,85 (3H, t, J =
7,1, N(CH2)5CH3). 13C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 192,3, 184,9, 184,3, 171,8, 159,1,
140,8, 127,1, 125,7, 123,4, 122,3, 112,0, 78,7, 72,7, 44,9, 31,4, 30,7, 26,1, 25,5, 21,9, 18,1,
13,7, 13,4. EMAR (ESI-TOF) m/z: 386,17778 ([M + H]+, C22H28NO3S+; calc. 386,17844).
3.4.4 Síntese da 3-butoxi-4-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23c)
Fez-se reagir 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22) (1,00 g;
4,42 mmol), iodeto de 3-decil-2-metilbenzotiazólio (4c) (1,85 g,
4,42 mmol) e trietilamina (0,68 mL, 4,9 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.4.2 (4 h). Depois de purificado o
sólido resultante por c.c. como descrito, foi obtido o composto
23c com um rendimento de 71%, sob a forma de cristais amarelos, apresentando: p.f. 101,7-113,2 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 442 (4,89). IV (KBr) máx: 2926fr,
1772fr, 1698méd, 1548méd, 1482f, 1415méd, 1349méd, 1307méd, 1275méd, 1192méd,
744fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,81 (1H, d, J = 7,0, ArH), 7,48 (1H, d, J = 8,1,
ArH), 7,41 (1H, t, J = 8,0, ArH), 7,23 (1H, t, J = 8,0, ArH), 5,55 (1H, s, CH=C), 4,72 (2H, t, J
= 6,6, OCH2(CH2)2CH3), 4,16 (2H, t, J = 7,5, NCH2(CH2)8CH3), 1,82-1,74 (2H, m,
OCH2CH2CH2CH3), 1,72-1,60 (2H, m, NCH2CH2(CH2)7CH3), 1,46-1,23 (16H, m,
N(CH2)2(CH2)7CH3 + O(CH2)2CH2CH3), 0,94 (3H, t, J = 7,4, O(CH2)3CH3), 0,84 (3H, t, J =
6,8, N (CH2)9CH3). 13C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 192,3, 184,9, 159,1, 140,8, 127,1,
125,7, 123,4, 122,3, 112,0, 78,8, 72,7, 44,9, 31,5, 31,2, 28,7, 28,5 26,1, 25,8, 22,0, 18,1, 13,9,
13,4. EMAR (ESI-TOF) m/z: 442,24017 ([M + H]+, C26H36NO3S+; calc. 442,24104).
94
Parte experimental
3.4.5 Síntese da 3-butoxi-4-(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona
(23d)
Fez-se reagir 3,4-dibutoxiciclobut-3-en-1,2-diona (22) (1,00 g,
4,42 mmol), iodeto de 3-etil-2-metilbenzotiazólio (4d) (1,35 g,
4,42 mmol) e trietilamina (0,68 mL, 4,9 mmol) de acordo com o
procedimento descrito em 3.4.2 (2 h). Depois de purificado o
sólido resultante por c.c. como descrito, foi obtido o composto
23d com um rendimento de 75%, sob a forma de cristais amarelos, apresentando: p.f. 142,3-143,9 ºC. UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 441 (4,93). IV (KBr) máx: 2965fr,
1770fr, 1700méd, 1551méd, 1507f, 1472méd, 1427méd, 1349méd, 1305méd, 1279méd,
1235fr, 1199fr, 1120fr, 1050fr, 751fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,82 (1H, d, J =
7,8, ArH), 7,49 (1H, d, J = 8,2, ArH), 7,42 (1H, t, J = 7,8, ArH), 7,23 (1H, t, J = 7,5, ArH),
5,56 (1H, s, CH=C), 4,73 (2H, t, J = 6,6, OCH2(CH2)2CH3), 4,22 (2H, q, J = 7,1, NCH2CH3),
1,79 (2H, quinteto, J = 7,1, OCH2CH2CH2CH3), 1,44 (2H, sext, J = 7,5, O(CH2)2CH2CH3),
1,25 (3H, t, J = 7,1, NCH2CH3), 0,95 (3H, t, J = 7,4, O(CH2)3CH3). 13C RMN (100,62 MHz,
DMSO-d6) δ: 192,9, 185,4, 185,0, 172,4, 159,4, 140,9, 127,9, 126,4, 124,0, 122,7, 112,4,
79,1, 73,3, 40,7, 32,0, 18,7, 14,0, 12,1. EMAR (ESI-TOF) m/z: 330,11555 ([M + H]+,
C18H20NO3S+; calc. 330,11584).
3.4.6 Síntese do 4-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24a)
Uma solução de 3-butoxi-4-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23a) (0,870 g, 2,43 mmol) em
EtOH (15 mL) foi aquecida a refluxo. De seguida, foi adicionada
solução aquosa de NaOH a 40% (0,30 mL). A evolução da
reação foi seguida por c.c.f. (CH2Cl2/MeOH, 9/1) até consumo
completo do material de partida (50 minutos). A mistura reacional foi então arrefecida à
temperatura ambiente e adicionado HCl aquoso 2 M (3,40 mL). A mistura resultante foi
concentrada a pressão reduzida e adicionou-se algumas gotas de Et2O. O precipitado formado
foi recolhido por filtração sob pressão reduzida e lavado com Et2O, tendo-se obtido o
composto 24a com rendimento de 83%, na forma de cristais alaranjados, o qual foi usado na
reação seguinte sem purificação adicional.
95
Parte experimental
3.4.7 Síntese da 4-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24b)
Fez-se reagir 3-butoxi-4-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23b) (1,00 g, 2,59 mmol) com NaOH
aquoso a 40% (0,35 mL) de acordo com o procedimento descrito
em 3.4.6 (35 minutos). Após tratamento da mistura reacional
como descrito, foi obtido o composto 24b com rendimento de
85%, na forma de cristais alaranjados, o qual foi usado na reação seguinte sem purificação
adicional.
3.4.8 Síntese da 4-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24c)
Fez-se reagir 3-butoxi-4-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23c) (1,28 g, 2,88 mmol) com NaOH
aquoso a 40% (0,40 mL) de acordo com o procedimento descrito
em 3.4.6 (1 h). Após tratamento da mistura reacional como
referido, foi obtido o composto 24c com rendimento de 95%, na
forma de cristais alaranjados, o qual foi usado na reação seguinte sem purificação adicional.
3.4.9 Síntese da 4-(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona
(24d)
Fez-se reagir 3-butoxi-4-(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)ciclobut-3-en-1,2-diona (23d) (0,860 g, 2,60 mmol) com NaOH
aquoso a 40% (0,30 mL) de acordo com o procedimento descrito
em 3.4.6 (30 minutos). Após tratamento da mistura reacional
como referido, foi obtido o composto 24d com rendimento de
91%, sob a forma de cristais alaranjados, que foram assim usados na reação seguinte sem
purificação adicional.
96
Parte experimental
3.4.10 Síntese do 2-[(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25a)
Uma solução de 4-(3-butil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24a)
(0,300 g, 0,992 mmol) e brometo de 3-(2carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4) (0,300 g,
0,992 mmol) em n-BuOH/piridina (9/1) (50 mL)
foi aquecida a refluxo durante 3 h. A evolução da
reação foi seguida por c.c.f. (CH2Cl2/MeOH, 9/1). Uma vez a reação completa, deixou-se
arrefecer a mistura reacional à temperatura ambiente e adicionou-se Et2O, tendo o precipitado
formado sido recolhido por filtração a pressão reduzida e lavado com H2O e Et2O. Foi obtido
deste modo o composto 25a com rendimento de 61%, na forma de cristais azuis,
apresentando: p.f. 284 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 652 (5,33). IV
(KBr) máx: 3440fr, 1457méd, 1425f, 1355fr, 1308fr, 1238f, 1097méd, 1054méd, 964fr, 832fr.
1
H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 12,62 (1H, sl, CO2H), 7,88 (1H, d, J = 7,6, ArH), 7,83
(1H, d, J = 7,9, ArH), 7,57 (1H, d, J = 8,2, ArH), 7,53 (1H, d, J = 8,3, ArH), 7,48-7,40 (2H,
m, ArH), 7,30-7,22 (2H, m, ArH), 5,81 (1H, s, CH=C), 5,77 (1H, s, CH=C), 4,44 (2H, t, J =
7,4, NCH2), 4,27 (2H, t, J = 7,2, NCH2), 2,72 (2H, t, J = 7,2, NCH2CH2CO2H), 1,69 (2H,
quinteto, J = 7,3, NCH2CH2CH2CH3), 1,44-1,37 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0,94 (3H, t, J =
7,4, N(CH2)3CH3). 13C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 171,7, 158,7, 140,7, 127,1, 123,9,
123,7, 122,4, 112,6, 112,3, 85,2, 84,9, 45,3, 44,9, 42,3, 41,3, 31,3, 29,0, 19,3, 16,9, 13,6.
EMAR (ESI-TOF) m/z: 504,11613 (M+, C27H24N2O4S2+; calc. 504,11720).
3.4.11 Síntese do 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-2-[(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25b)
Uma mistura de 4-(3-hexil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24b)
(0,200 g, 0,605 mmol) e brometo de 3-(2carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4) (0,183 g,
0,605 mmol) foi feita reagir de acordo com o
procedimento descrito em 3.4.10 (5 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 25b com rendimento de
97
Parte experimental
64%, na forma de cristais azuis, apresentando: p.f. 270 ºC (dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2,
99/1) λmáx (log ε): 652 (5,25). IV (KBr) máx: 3455méd, 2347fr, 1457f, 1425f, 1355fr, 1304fr,
1234f, 1191méd, 1098méd, 1051fr, 957fr, 832fr, 792fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ:
7,87 (1H, d, J = 7,8, ArH), 7,83 (1H, d, J = 7,6, ArH), 7,55 (2H, t, J = 8,7, ArH), 7,47-7,40
(2H, m, ArH), 7,29-7,22 (2H, m, ArH), 5,80 (1H, s, CH=C), 5,77 (1H, s, CH=C), 4,43 (2H, t,
J = 8,0, NCH2), 4,25 (2H, t, J = 7,1, NCH2), 2,67 (2H, sl, NCH2CH2CO2H), 1,70 (2H,
quinteto, J = 7,3, NCH2CH2(CH2)3CH3), 1,40-1,23 (6H, m, N(CH2)2(CH2)3CH3), 0,86 (3H, t,
J =7,0, N(CH2)5CH3).
13
C RMN (100,62 MHz, DMSO-d6) δ: 179,4, 176,0, 174,7, 171,7,
158,6, 157,5, 140,9, 140,7, 127,5, 127,3, 127,1, 123,9, 123,7, 122,4, 122,2, 112,6, 112,3, 85,2,
84,9, 45,4, 41,3, 31,3, 30,8, 26,8, 25,6, 21,9, 13,8. EMAR (ESI-TOF) m/z: 532,14739 (M+,
C29H28N2O4S2+; calc. 532,14850).
3.4.12 Síntese do 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-2-[(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25c)
Uma mistura de 4-(3-decil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24c)
(1,06 g, 2,75 mmol) e brometo de 3-(2carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4) (0,831 g,
2,75 mmol) foi feita reagir de acordo com o
procedimento descrito em 3.4.10 (5 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi recolhido o precipitado obtido por filtração
e lavado com H2O e éter de petróleo. Após recristalização de MeOH/CH2Cl2/Et2O foi obtido
o composto 25c com rendimento de 30%, na forma de cristais azuis, apresentando: p.f. 262 ºC
(dec.). UV/Vis (MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 653 (5,21). IV (KBr) máx: 3456fr, 1707fr,
1542fr, 1457f, 1425f, 1355méd, 1308méd, 1238f, 1186méd, 1098méd, 1051fr, 957fr, 831fr,
745fr. 1H RMN (400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,88 (1H, d, J = 7,9, ArH), 7,82 (1H, d, J = 7,7,
ArH), 7,57-7,52 (2H, m, ArH), 7,47-7,40 (2H, m, ArH), 7,29-7,22 (2H, m, ArH), 5,80 (1H, s,
CH=C), 5,77 (1H, s, CH=C), 4,44 (2H, t, J = 7,3, NCH2), 4,26 (2H, t, J = 7,4, NCH2), 2,71
(2H, t, J = 7,2, NCH2CH2CO2H), 1,74-1,65 (2H, m, NCH2CH2(CH2)7CH3), 1,39-1,23 (14H,
m, N(CH2)2(CH2)7CH3)), 0,84 (3H, t, J = 6,9, N(CH2)9CH3). 13C RMN (100,62 MHz, DMSOd6) δ: 179,4, 176,0, 174,7, 171,7, 158,7, 157,5, 140,9, 140,7, 127,5, 127,3, 127,1, 123,9,
98
Parte experimental
123,7, 122,4, 122,2, 112,6, 112,3, 85,2, 84,9, 45,4, 41,3, 31,3, 31,2, 28,8, 28,6, 26,8, 25,9,
22,0, 13,9, 13,7. EMAR (ESI-TOF) m/z: 558,21023 (M+, C33H36N2O4S2+; calc. 588,21110).
3.4.13 Síntese do 4-[(3-(2-carboxietil)benzotiazol-3-io-2-il)metileno]-2-[(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilideno)metil]-3-oxociclobut-1-en-1-olato (25d)
Uma mistura de 4-(3-etil-3H-benzotiazol-2-ilidenometil)-3-hidroxiciclobut-3-en-1,2-diona (24d)
(0,108 g, 0,394 mmol) e brometo de 3-(2carboxietil)-2-metilbenzotiazólio (4) (0,119 g,
0,394 mmol) foi feita reagir de acordo com o
procedimento descrito em 3.4.10 (21 h). Após
tratamento da mistura reacional como referido foi obtido o composto 25d com um rendimento
de 41%, sob a forma de cristais azuis, apresentando: p.f. 297 ºC (dec.). UV/Vis
(MeOH/CH2Cl2, 99/1) λmáx (log ε): 651 (5,38). IV (KBr) máx: 3457fr, 1454méd, 1427f,
1358méd, 1305fr, 1234f, 1182méd, 1094méd, 1049méd, 962fr, 830fr, 777fr. 1H RMN
(400,13 MHz, DMSO-d6) δ: 7,89 (1H, d, J = 7,1, ArH), 7,84 (1H, d, J = 7,3, ArH), 7,57-7,45
(4H, m, ArH), 7,29-7,25 (2H, m, ArH), 5,83 (1H, s, CH=C), 5,78 (1H, s, CH=C), 4,44 (2H, sl,
NCH2), 4,33 (2H, sl, NCH2), 2,71 (2H, sl, NCH2CH2CO2H), 1,30 (3H, sl, NCH2CH3). EMAR
(ESI-TOF) m/z: 477,09253 ([M + H]+, C25H21N2O4S2+; calc. 477,09372).
3.5 Ensaios de imobilização de corantes simétricos em Sepharose CL-6B
3.5.1 Ativação da Sepharose CL-6B com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano [21]
Uma suspensão de Sepharose CL-6B em EtOH (25 mL de gel seco) foi colocada num
funil de placa porosa e lavada com H2O (250 mL) sob pressão reduzida. O gel foi de seguida
suspenso numa solução aquosa de NaOH 0,6 M (19 mL) e adicionado NaBH4 (37,5 mg). À
mistura anterior em agitação orbital lenta à temperatura ambiente, foi adicionado, gota a gota,
1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano (20 mL) e a mistura deixada em agitação durante a noite. O
gel foi recolhido num funil de placa porosa, lavado abundantemente com H2O (500 mL) sob
pressão reduzida, ressuspenso em H2O e guardado no frigorífico.
99
Parte experimental
3.5.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano com
os corantes 17b e 17c [21]
A Sepharose CL-6B ativada anteriormente com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano (5
mL de gel seco) foi transferida para um balão de Erlenmeyer e suspensa numa solução tampão
de borato a pH 10,02 (5 mL). De seguida foi adicionado o corante (30 mg) dissolvido em
DMF (7 mL). A mistura resultante foi colocada em agitação orbital à temperatura ambiente
durante 24 h. O gel foi transferido para um funil de placa porosa e lavado a pressão reduzida,
sequencialmente, com H2O (40 mL), acetona (20 mL), CH2Cl2 (20 mL), MeOH (20mL) e
novamente com H2O (20 mL). O gel obtido foi transferido para um balão de Erlenmeyer e
suspenso numa solução aquosa de etanolamina 1,0 M (pH 9) (5 mL), ficando a mistura em
agitação orbital durante 6 h. O gel foi então recolhido num funil de placa porosa e lavado a
pressão reduzida com H2O (20 mL), solução aquosa de NaCl 1,0 M (20 mL) e acetona (20
mL). A Sepharose corada obtida foi colocada num extrator de Soxhlet e extraída com uma
mistura de MeOH/acetona (1/1) durante 24 h. O gel, praticamene branco, foi suspenso em
acetona e guardado no frigorífico.
3.5.3 Ativação da Sepharose CL-6B com cloreto de cianurilo [21]
Uma suspensão de Sepharose CL-6B em EtOH (100 mL de gel seco) foi colocada num
funil de placa porosa e lavada, sob pressão reduzida, sequencialmente com H2O/acetona
(70/30) (500 mL), H2O/acetona (30/70) (500 mL) e, por fim, com acetona (1 L). O gel foi
suspenso em acetona (100 mL) num balão de fundo redondo, sob agitação muito suave,
aquecido a 40°C, tendo então sido adicionada uma solução de N,N-diisopropiletilamina em
acetona 2,0 M (20 mL). A mistura resultante foi deixada naquelas condições durante 30
minutos. De seguida foi adicionada uma solução de cloreto de cianurilo em acetona 1,0 M (20
mL). Ao fim de 1 h em agitação lenta o gel foi transferido para um funil de placa porosa e
lavado, sob pressão reduzida, com acetona (1 L). A Sepharose ativada foi armazenada em
acetona e mantida no frigorífico.
3.5.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo com os corantes
17a-c e 19b
A Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo (10 mL de gel seco) foi
transferida para um balão de Erlenmeyer e foi adicionada acetona (10 mL) e trietilamina (1,95
L). De seguida foi adicionada uma solução de corante (tabela 8) em DMF (6 mL). A mistura
100
Parte experimental
resultante foi colocada em agitação orbital à temperatura ambiente durante 24 h. O gel foi
então recolhido num funil de placa porosa e lavado, a pressão reduzida, sequencialmente, com
H2O (40 mL), acetona (20 mL), CH2Cl2 (20 mL), MeOH (20mL) e com H2O (20 mL). O gel
foi transferido para um balão de Erlenmeyer, suspenso numa solução tampão de Tris/HCl 1,0
M (pH 9) (10 mL), e a mistura deixada em agitação orbital durante 1 h, à temperatura
ambiente. O gel foi novamente colocado num funil de placa porosa e lavado com H2O (50
mL) e acetona (50 mL) a pressão reduzida. A Sepharose corada obtida foi colocada num
extrator de Soxhlet e extraída com uma mistura de MeOH/acetona (1/1) durante 24 h. O gel
tingido de azul foi armazenado em acetona e guardado no frigorífico.
Tabela 8 – Tingimentos realizados com Sepharose CL-6B ativada com cloreto de cianurilo.
Suporte
Corante
Quantidade de corante usado
(mmol de corante/10 mL de Sepharose ativada)
1
17a
1,4 x 10-2
2
17b
1,4 x 10-2
3
17b
4,2 x 10-2
4
17b
1,4 x 10-1
5
17c
1,4 x 10-2
6
19b
1,4 x 10-2
A densidade efetiva de ligando nos vários suportes tingidos (tabela 9) foi estimada a
partir da percentagem de azoto determinado por análise elementar, quando comparada com o
branco, ou seja, uma amostra de Sepharose ativada submetida a todo o procedimento
experimental mas na ausência de corante.
3.6 Ensaios de imobilização de corantes assimétricos à Sepharose CL-6B
3.6.1 Conversão dos grupos epóxido da Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3epoxipropoxi)butano em grupos amina [21]
A Sepharose CL-6B ativada com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano (10 mL de gel seco)
foi transferida para um funil de placa porosa e lavada, sob pressão reduzida, com uma solução
aquosa de NH4OH 1 M, sendo de seguida transferida para um balão de Erlenmeyer e suspensa
101
Parte experimental
Tabela 9 – Análise elementar e densidade de ligando dos vários suportes cromatográficos.
Densidade do ligando
Suporte
Corante
%N
%C
%H
%S
(mmol de corante/g de suporte)
Branco
-
0,77
43,07
12,72
<
-
1
17a
0,96
45,90
6,52
<
3,4 x 10-2
2
17b
0,87
43,13
6,24
<
1,8 x 10-2
3
17b
1,06
47,79
6,79
<
5,2 x 10-2
4
17b
1,39
45,29
6,85
0,56*
1,1 x 10-1
5
17c
0,93
44,39
6,23
<
3,0 x 10-2
< valor inferior ao limite de deteção
* valor muito próximo do limite de deteção
na mesma solução aquosa de NH4OH 1 M (10 mL). A mistura foi colocada em agitação muito
suave, a uma temperatura de 40°C, durante 3 h. Depois de arrefecido, o gel foi colocado
novamente num funil de placa porosa e lavado, a pressão reduzida, sequencialmente, com
H2O, solução aquosa de NaCl 1 M e novamente com H2O. Por fim, foi suspenso em H2O e
guardado no frigorífico.
3.6.2 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada em 3.6.1 com o corante 25d
A Sepharose CL-6B ativada anteriormente (3.6.1) (10 mL de gel seco) foi colocada
num balão de Erlenmeyer e foi adicionada uma solução de corante (0,007 g, 0,014 mmol) em
tampão Na3PO4 0,1 M (10 mL) e DMF (6 ml), seguida da adição de EDC (0,30 g, 1,57
mmol). A mistura resultante foi mantida sob agitação orbital suave, à temperatura ambiente,
durante 3 h. O gel tingido foi recolhido por filtração sob pressão reduzida e lavado,
abundantemente, com H2O, solução aquosa de NaCl 1 M, H2O, acetona, CH2Cl2, MeOH, H2O
e com AcONa aquoso 0,2 M, por esta ordem. A Sepharose corada foi colocada num extrator
de Soxhlet e extraída com uma mistura de MeOH/acetona (1/1) durante 24 h. O gel obtido,
que se apresentava praticamente branco, foi armazenado em acetona e guardado no
frigorífico.
3.6.3 Ativação da Sepharose CL-6B com diaminodipropilamina [21]
Uma suspensão de Sepharose CL-6B em EtOH (50 mL de gel seco) foi colocada num
funil de placa porosa e lavada, sob pressão reduzida, abundantemente com H2O. O gel foi,
102
Parte experimental
suspenso numa solução aquosa de NaIO4 0,2 M (50 mL) e colocado em agitação orbital, à
temperatura ambiente, durante 1 h. Após recolha num funil de placa porosa, o gel foi lavado,
a pressão reduzida, com H2O (500 mL) e suspenso numa solução tampão de Na3PO4 0,1 M
(pH 7) (50 mL).
A uma solução de diaminodipropilamina (10,65 mL, 76,13 mmol) em água (50 mL),
arrefecida em gelo e sob agitação, foi adicionado HCl concentrado até pH 7 e, em seguida,
adicionado Na3PO4 sólido de modo a obter uma concentração de 0,1 M (de acordo com o
volume final de solução) (3,04 g, 8,00 mmol). O pH da solução foi novamente ajustado a 7
com HCl concentrado.
À solução anterior foi então adicionado o gel de Sepharose, depois de separado por
filtração a pressão reduzida da suspensão no tampão de Na3PO4. De seguida foi adicionado
NaCNBH4 (0,60 g, 9,55 mmol) e a mistura foi deixada em agitação orbital à temperatura
ambiente durante 4 h. O gel foi então recolhido num funil de placa porosa e lavado a pressão
reduzida, sequencialmente, com H2O (1 L), NaCl aquoso 1 M (500 mL) e novamente com
H2O (500 mL). Por fim, o gel foi suspenso em H2O e guardado no frigorífico.
3.6.4 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina com o corante
25d
A Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina (10 mL de gel seco) foi
colocada num funil de vidro de placa porosa e cuidadosamente lavada, sob pressão reduzida,
sequencialmente com H2O e tampão Na3PO4 0,1 M (pH 7,3). O gel foi então transferido para
um balão de Erlenmeyer e foi adicionada uma solução do corante 25d (0,007 g, 0,014 mmol)
em tampão Na3PO4 0,1 M (10 mL) e DMF (6 ml), seguido da adição de EDC (0,60 g, 3,13
mmol) e NHS (0,36 g, 3,13 mmol). A mistura resultante foi mantida sob agitação orbital
suave, à temperatura ambiente, durante 3 h. O gel tingido foi recolhido por filtração sob
pressão reduzida e lavado abundantemente com H2O, solução aquosa de NaCl 1 M, H2O,
acetona, CH2Cl2, MeOH, H2O e com AcONa aquoso 0,2 M, por esta ordem. Em seguida, a
uma suspensão do gel numa solução aquosa de AcONa 0,2 M (10 mL), arrefecida em banho
de gelo e sob agitação orbital, foi adicionado Ac2O frio (5 mL). Após 30 minutos foi
adicionado mais Ac2O (5 mL) e a mistura foi mantida à temperatura ambiente durante um
período adicional idêntico. O gel foi então colocado num funil de vidro de placa porosa e
lavado, sob pressão reduzida, cuidadosamente, com H2O e acetona. A Sepharose corada foi
colocada num extrator de Soxhlet e extraída com uma mistura de MeOH/acetona (1/1) durante
24 h. O gel obtido tingido de azul foi armazenado em acetona e guardado no frigorífico.
103
Parte experimental
De modo a otimizar as condições que permitissem incrementar a eficácia do
tingimento com o corante 25d, foram ainda realizados vários ensaios, de acordo com o
procedimento anterior, experimentando variações nas concentrações dos reagentes de
acoplamento intervenientes (EDC, NHS), no reagente utilizado para bloquear os grupos
amina livres remanescentes (Ac2O ou Tris/HCl) ou ainda sujeitando ou não o gel tingido à
extração com solventes em Soxhlet. Na tabela seguinte são resumidos os vários ensaios
realizados.
Tabela 10 - Tingimentos realizados com Sepharose CL-6B ativada com diaminodipropilamina.
EDC (g)
NHS (g)
Tris/HCl
Ac2O
Extração
Soxhlet
Observações
0,30
-
-
-
√
gel amarelo
0,30
0,18
√
-
√
gel verde
0,60
0,36
√
-
√
gel verde
0,60
0,36
√
-
-
gel verde
0,60
0,36
-
√
√
gel azul
3.6.5 Ativação da Sepharose CL-6B com etilenodiamina
Procedeu-se à ativação da Sepharose CL-6B com etilenodiamina de acordo com o
procedimento descrito em 3.6.3.
3.6.6 Tingimento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com o corante 25d
Procedeu-se ao tingimento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com o
corante 25d de acordo com o procedimento descrito em 3.6.4. No final, foi obtido um gel
corado de azul.
3.6.7 Tratamento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com EDC/NHS, Ac2O
e extração Soxhlet
Na tentativa de compreender a composição estrutural do suporte de Sepharose CL-6B
ativada com etilenodiamina, foram ainda preparados seis suportes cromatográficos diferentes,
104
Parte experimental
cada um dos quais com a exclusão, seletivamente, de alguns passos ou reagentes envolvidos
na preparação do suporte de acordo com o procedimento anterior 3.6.6 mas sempre na
ausência do corante (tabela 10).
Tabela 11 – Tratamento da Sepharose CL-6B ativada com etilenodiamina com EDC/NHS, Ac2O e extração
Soxhlet.
Suporte
EDC
NHS
AC2O
Extração Soxhlet
7
√
√
√
-
8
-
-
-
-
9
-
√
√
-
10
√
-
√
-
11
√
√
-
-
12
-
-
√
-
3.7 Realização de ensaios em branco
Para cada tingimento com os diferentes corantes foram realizados os respetivos
ensaios em branco (ausência do corante).
105
Capítulo 4
Bibliografia
Bibliografia
4 Bibliografia
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selective reducing agent", J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 2897-2904.
[112] Grabarek, Z.; Gergely, J. "Zero-length crosslinking procedure with the use of active
esters", Anal. Biochem. 1990, 185, 131-135.
[113] Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. (resultados não publicados).
[114] Graça, V. C.; Silva, M. S.; Reis, L. V.; Sousa, F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.; Santos,
P. F. "Ethylenediamine-derived ligands immobilized on Sepharose to separate BSA,
lysozyme and RNase A" (submetido para publicação).
[115] Katritzky, A. R.; Yao, J. C.; Qi, M.; Chou, Y. T.; Sikora, D. J.; Davis, S. "Ring
opening reactions of succinimides", Heterocycles 1998, 48, 2677-2691.
[116] Narendra, N.; Chennakrishnareddy, G.; Sureshbabu, V. V. "Application of
carbodiimide mediated Lossen rearrangement for the synthesis of a-ureidopeptides and
peptidyl ureas employing N-urethane α-amino/peptidyl hydroxamic acids", Org.
Biomol. Chem. 2009, 7, 3520-3526.
115
Bibliografia
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water-soluble carbodiimides. A Lossen rearrangement", J. Am. Chem. Soc. 1968, 90,
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[118] Perrin, D. D.; Armarego, W. L. F.; Perrin, D. R.; "Purification of laboratory
chemicals." 2ª ed. Oxford: Pergamon; 1980.
116
ANEXO A
ANEXO A
Publicações no âmbito deste trabalho:
Artigos científicos em revistas indexadas no Scientific Citation Index:
1) Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. "Protein purification by aminosquarylium cyanine dye-affinity
chromatography", Biomed. Chromatogr. 2013 DOI 10.1002/bmc.2978
2) Graça, V. C.; Silva, M. S.; Reis, L. V.; Sousa, F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Santos, P. F. "Ethylenediamine-derived ligands immobilized on Sepharose to
separate BSA, lysozyme and RNase A" (submetido para publicação em Chemical
Engineering Research and Design)
Comunicações em forma de Painel:
1) Graça, V. C.; Silva, M. S.; Reis, L. V.; Sousa, F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Santos, P. F. "Ethylenediamine-derived ligands immobilized on Sepharose to
separate BSA, lysozyme and RNase A" 10º Encontro Nacional de Química
Orgânica, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 4 a 6 de Setembro
de 2013, Lisboa, Portugal.
2) Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa,
F.
"Lysozyme,
α-chymotrypsin
and
trypsin
purification
by
aminosquarylium cyanine dyes-affinity chromatography" VII Annual CICS
Symposium, 1 e 2 de Julho, 2013, Covilhã, Portugal.
3) Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. "N-(aminoalkyl)acetamides as novel affinity ligands for the purification
of biomolecules" 9th European Congress of Chemical Engineering / 2nd
European Congress of Applied Biotechnology, 21-25 Abril de 2013, The Hague,
Holanda.
117
ANEXO A
4) Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. "Aminosquarylium cyanines as ligands in dye-affinity chromatography
for protein purification" 32 th international Symposium on the Separation of
Proteins, Peptides and Polynucleotides, 23-26 Setembro de 2012, Istambul,
Turquia.
Comunicaçoes Orais:
1) Graça, V. C.; Silva, M. S.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. "Novos corantes esquarílicos para cromatografia de afinidade" VI
Jornadas de Bioquímica, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 10-11
Abril, 2013, Vila Real, Portugal.
2) Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. "N-(Aminoalquil)acetamidas como novos ligandos de afinidade na
separação de BSA, lisozima e RNase A". XVIII Encontro Luso-Galego de
Química, 28-30 Novembro de 2012, Vila Real, Portugal
3) Silva, M. S.; Graça, V. C.; Reis, L. V.; Santos, P. F.; Almeida, P.; Queiroz, J. A.;
Sousa, F. "Affinity interactions in proteins purification using immobilized aminos
cyanine dyes" VI Annual CICS Symposium, 3 Julho, 2012, Covilhã, Portugal.
118