UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Ramon Borges da Silva
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO PERFIL TRIPANOCIDA DE NOVOS
DERIVADOS IMIDAZÓLICOS TRISSUBSTITUÍDOS PLANEJADOS
COMO POTENCIAIS AGENTES ANTI-CHAGÁSICOS
Rio de Janeiro
2011
i
Ramon Borges da Silva
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO PERFIL TRIPANOCIDA DE NOVOS
DERIVADOS IMIDAZÓLICOS TRISSUBSTITUÍDOS PLANEJADOS
COMO POTENCIAIS AGENTES ANTI-CHAGÁSICOS
Dissertação de Mestrado realizada
no Laboratório de Síntese Orgânica
(Farmanguinhos/Fiocruz)
e
apresentada ao Programa de PósGraduação em Química, Instituto de
Química, Universidade Federal do
Rio
de
Janeiro,
como
requisito
parcial à obtenção do título de
Mestre em Ciências (Química).
Orientador: Carlos Alberto Manssour Fraga (LASSBio/FF/UFRJ)
Orientador: Edson Ferreira da Silva (Farmanguinhos/Fiocruz)
Rio de Janeiro
2011
ii
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DO PERFIL TRIPANOCIDA DE NOVOS
DERIVADOS IMIDAZÓLICOS TRISSUBSTITUÍDOS PLANEJADOS
COMO POTENCIAIS AGENTES ANTI-CHAGÁSICOS
Ramon Borges da Silva
Dissertação de Mestrado realizada no Laboratório de Síntese Orgânica
(Farmanguinhos/Fiocruz) e apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (Química).
Aprovada por:
_____________________________________
Carlos Alberto Manssour Fraga (LASSBio-FF-UFRJ)
_____________________________________
Edson Ferreira da Silva (Farmanguinhos-Fiocruz)
_____________________________________
Rodrigo Octavio Mendonça Alves de Souza (IQ-UFRJ)
_____________________________________
Claudio Viegas Junior (UNIFAL)
_____________________________________
Ayres Guimarães Dias (UERJ)
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
S586
Silva, Ramon Borges da.
Síntese e avaliação do perfil tripanocida de novos derivados
imidazólicos trissubstituídos planejados como potenciais agentes
anti-chagásicos / Ramon Borges da Silva. - Rio de Janeiro:
UFRJ/ IQ, 2011.
133 f.: il.
Dissertação (Mestre em Ciências) - Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Instituto de Química, Programa de PósGraduação em Química, Rio de Janeiro, 2010.
Orientadores: Carlos Alberto Manssour Fraga e Edson
Ferreira da Silva.
1. Imidazol. 2. Tripanocida. 3. Megazol. I. Fraga, Carlos
Alberto Manssour. (Orient.). II. Silva, Edson Ferreira da.
(Orient.). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Química, Programa de Pós-Graduação em Química. IV. Título.
CDD:543
iv
“Filho meu, não te esqueças da minha lei, e o teu coração guarde os
meus mandamentos. Porque eles aumentarão os teus dias e te acrescentarão
anos de vida e paz. Não te desamparem a benignidade e a fidelidade; ata-as
ao teu pescoço; escreve-as na tábua do teu coração. E acharás graça e bom
entendimento aos olhos de Deus e do homem. Confia no SENHOR de todo o
teu coração, e não te estribes no teu próprio entendimento. Reconhece-o em
todos os teus caminhos, e ele endireitará as tuas veredas. Não sejas sábio a
teus próprios olhos; teme ao SENHOR e aparta-te do mal. Isto será saúde para
o teu âmago, e medula para os teus ossos. Filho meu, não rejeites a correção
do SENHOR, nem te enojes da sua repreensão. Porque o SENHOR repreende
aquele a quem ama, assim como o pai ao filho a quem quer bem. Bemaventurado o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire
conhecimento; Porque é melhor a sua mercadoria do que artigos de prata, e
maior o seu lucro que o ouro mais fino. Mais preciosa é do que os rubis, e tudo
o que mais possas desejar não se pode comparar a ela. Vida longa de dias
está na sua mão direita; e na esquerda, riquezas e honra. Os seus caminhos
são caminhos de delícias, e todas as suas veredas de paz. É árvore de vida
para os que dela tomam, e são bem-aventurados todos os que a retêm. O
SENHOR, com sabedoria fundou a terra; com entendimento preparou os céus.
Pelo seu conhecimento se fenderam os abismos, e as nuvens destilam o
orvalho. Filho meu, não se apartem estas coisas dos teus olhos: guarda a
verdadeira sabedoria e o bom siso; Porque serão vida para a tua alma, e
adorno ao teu pescoço. Então andarás confiante pelo teu caminho, e o teu pé
não tropeçará. Quando te deitares, não temerás; ao contrário, o teu sono será
suave ao te deitares. Não temas o pavor repentino, nem a investida dos
perversos quando vier. Porque o SENHOR será a tua esperança; guardará os
teus pés de serem capturados. Não deixes de fazer bem a quem o merece,
estando em tuas mãos a capacidade de fazê-lo.”
BIBLIA SAGRADA, LIVRO DE PROVÉRBIOS- CAP.3
v
Esta Dissertação é dedicada a minha mãe
Maria José Borges da Silva por todo empenho e
perseverança, a minha esposa Juliana Almeida
Borges, a minha família e aos meus amigos
vi
AGRADECIMENTOS
•
Agradeço em primeiro lugar a Deus por tudo que tem feito na minha
vida.
•
Aos meus professores Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga e Dr.
Edson Ferreira da Silva pela orientação e oportunidade de aprender
mais sobre esta ciência.
•
Ao professor Antônio Carlos Carreira Freitas, por me despertar o
interesse pela química.
•
À Central Analítica de Farmanguinhos pela realização dos espectros
de RMN, LC-MS.
•
À
Dra.
Solange
Lisboa
de
Castro
por
realizar
os
testes
farmacológicos, e sua aluna Kelly por toda ajuda.
•
Aos integrantes das Sínteses 1 e 2 e da Planta Piloto: Samir,
Alessandra, Renato Carvalho, Priscila, Vanessa, Marcelle Ferreira,
Marcele Moreth, Emerson, Silvio, Daniele, Claudinha, Cristiane,
Walcimar, Vitor, Claudio, Lourdes, Mônica Peralta, Mônica Gomes,
Wilson, Diego e Sandra
•
Aos amigos Bruno Bonato, Jônatas, Flávio Freitas, July Andrea,
Vinícius Luíz, Ligia Balbino e Leonardo Lameira.
•
À Farmanguinhos por fornecer suporte técnico e financeiro para a
execução deste trabalho.
E desde já, a banca examinadora por aceitar o convite.
vii
RESUMO
DA
SILVA,
Ramon
TRIPANOCIDA
Borges.
DOS
SÍNTESE
NOVOS
E
AVALIAÇÃO
DERIVADOS
DO
PERFIL
IMIDAZÓLICOS
TRISSUBSTITUÍDOS PLANEJADOS COMO POTENCIAIS AGENTES ANTICHAGÁSICOS. Rio de Janeiro 2011. Dissertação (Mestrado em Química).
Instituto de Química Universidade Federal do Rio de Janeiro
No âmbito de uma linha de pesquisa que visa obter novos protótipos
úteis na terapia de doenças tropicais, este trabalho teve como objetivos: o
planejamento, a síntese e a avaliação da atividade tripanocida de uma nova
família de derivados imidazólicos trissubstituídos. Estes derivados hetrociclicos
foram planejadas estruturalmente, explorando o conceito de hibridação
molecular entre duas arilidrazonas derivadas do megazol, e.g. a brazilizona A,
que apresentou potente atividade tripanocida. A metodologia sintética
empregada neste trabalho para a obtenção da nova família de derivados
imidazólicos trissubstituídos mostrou-se adequada, permitindo a obtenção dos
compostos-alvos em rendimentos globais que variam de 22-71%. A atividade
tripanocida foi investigada sob a forma infectiva tripomastigota, permitindo
assim,
identificar
o
derivado
2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-
biimidazol-3'-ol, o qual apresentou significativa atividade biológica IC50= 23,9
µM, quando comparado ao benznidazol, usado como substância de referência
Palavras-chave: Imidazol, Tripanocida, Megazol
viii
ABSTRACT
DA
SILVA,
Ramon
Borges.
SÍNTESE
E
AVALIAÇÃO
DO
PERFIL
TRIPANOCIDA DOS NOVOS DERIVADOS IMIDAZÓLICOS IMIDAZÓLICOS
TRISSUBSTITUÍDOS PLANEJADOS COMO POTENCIAIS AGENTES ANTICHAGÁSICOS. Rio de Janeiro 2011. Dissertação (Mestrado em Química).
Instituto de Química Universidade Federal do Rio de Janeiro
Within a line of research that seeks new prototypes useful for treatment
of tropical diseases, this study aims the design, the synthesis and the
evaluation of trypanocidal activity of a new family of trisubstituted imidazole
derivatives. These heterocyclic derivatives were structurally planned by
exploring the concept of molecular hybridization between two arylhydrazones
derived from megazol, e.g. brazilizona A, which presented potent trypanocidal
activity. The synthetic methodology employed in this work to obtain a new family
of trisubstituted imidazole derivatives was adequate, allowing the achievement
of target compounds in overall yields ranging from 22-71%. The trypanocidal
activity was investigated in the infective trypomastigote form, thus allowing to
identify the derivative 2'-(4-bromophenyl)-1-methyl-5 '-phenyl-1H, 3'H-2, 4'biimidazol-3' -ol, which showed significant biological activity (IC50= 23,9 µM)
when compared to benznidazole, used as standard drug.
Keywords: Imidazole, trypanocidal, Megazol
ix
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Síntese
de
Farmanguinhos
-Fiocruz-
sob
a
orientação dos Professores Dr. Carlos Alberto
Manssour Fraga e Dr. Edson Ferreira da Silva.
x
ÍNDICE
Pág.
RESUMO
viii
ABSTRACT
ix
Lista de figuras
xiv
Lista de esquemas
xix
Lista de tabelas
xx
Lista de abreviaturas e siglas
xxi
Anexo de espectros
xxiii
1- INTRODUÇÃO
1
1.1 Doença de Chagas
1
1.2 Quimioterapia da doença de Chagas
7
1.2.1 Compostos nitro heterocíclicos
8
1.2.2 Nifurtimox (2) e benznidazol (3)
8
1.2.3- Megazol
16
1.2.4- Brazilizona A
25
xi
26
2- OBJETIVOS
2.1
Planejamento
estrutural
dos
novos
derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos
26
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
29
3.1 Análise retrossintética
29
3.2 Obtenção do enol-benzoato (21)
30
3.3 Obtenção da ceto-oxima (20)
31
3.4 Síntese dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-
35
19)
3.5 Avaliação do perfil tripanocida
46
4- CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
48
5- PARTE EXPERIMENTAL
49
5.1. Informações gerais
49
5.2. Metodologia sintética
50
5.2.1- Síntese do composto enol-benzoato (21)
50
5.2.2- Síntese do composto ceto-oxima (20)
51
5.2.3-
Síntese
dos
novos
derivados
imidazólicos
2,4,552
Trissubstituídos (10-19)
5.3- Protocolo biológico
62
5.3.1 Avaliação da atividade tripanocida "in vitro" sobre a forma
62
xii
tripomastigota de T. cruzi.
6- REFERÊNCIAS
63
7- ANEXOS: ESPECTROS
70
xiii
Pág.
LISTA DE FIGURAS
em
2
Figura 2: As duas principais formas do Trypanosoma cruzi em
2
Figura
O
1:
ciclo
de
vida
do
Trypanosoma
cruzi
<http://www.who.int/tdrold/diseases/chagas/lifecycle.htm>
hospedeiros
vertebrados:
A,
tripomastigota
(formas
sanguíneas
aderidas a células musculares cardíacas); B, amastigota (formas
intracelulares
cardíacas,
presentes
onde
se
no
citoplasma
multiplicam).
de
Fotos:
células
(A)
musculares
Helene
Barbosa,
IOC/Fiocruz; (B) Mirian Claudia Pereira, IOC/Fiocruz.
Figura 3: Radiografias do tórax de um paciente chagásico (A), e de um
3
paciente sadio (B), ilustrando o tamanho do coração.
Figura 4: Sinal de Romaña de uma menina procedente de área
endêmica no Brasil.
4
Figura 5: Estrutura química da nitrofurazona (1)
7
nitro-heterocíclicos
8
Figura 7: Reações de nitroredutases do tipo 1 e 2 com derivados nitro-
10
Figura
6:
Estrutura
química
dos
derivados
nifurtimox (2) e benznidazol (3).
heterocíclicos.
xiv
Figura 8: Mecanismo de ação proposto para os fármacos nifurtimox (2)
11
e benznidazol (3).
Figura 9: Esquema geral de redução de nitrofuranos por nitroredutases
12
do tipo I
Figura 10: Redução do nifurtimox (2) mediada por nitroredutases do
13
tipo I gerando nitrila insaturada de cadeia aberta (4). A- HPLC
(rastreamento λ=340 nm). B- Espectro de massa do pico único obtido
após HPLC. As m/z de 256 e 278 correspondem respectivamente ao
metabólito +H e +Na derivado do nifurtimox (2)- C- Espectro de
absorção na região do UV do produto da nitrila insaturada (4).
(Wilkinson, 2011)
Figura 11: Espectrrometria de massas em tandem da nitrila insaturada
14
(4). A- ESI positivo do ion da nitrila insaturada (4) ; B- Estrutura dos
precursores da nitrila insaturada (4); C- ESI negativo do ion da nitila
insaturada (4); D- Estrutura do precursor e fragmentos do ESI negativo.
Figura 12: Citotoxidade de nitrilas insaturadas de cadeia aberta.
15
Resposta dose dependente da forma sanguinea de T.brucei (■) e
células de mamíferos THP-1 (♦) para nifurtimox (linha sólida) e nitrila
insaturada (OCN) (4) (linha pontilhada).
Figura 13: Estrutura química do megazol (6)
16
Figura 14: Espectro de ERS obtido durante incubação anaeróbia de
18
microssomas de fígado de rato com compostos nitro-heterocíclicos: (A)
xv
nifurtimox (2); (B) megazol (6); e (C) benznidazol (3) (Tsuhako e cols.,
1989).
Figura 15: Redução dos compostos em condições anaeróbias por
19
microssomos de fígado de rato. (•) nifurtimox (2); e (o) megazol (6)
(0,2mM). O gráfico mostra o espectro da absorção de luz visível do
megazol (6) antes (___) e depois (- - - ) da adição de ditionato de sódio.
Figura 16: Dados de ERS obtidos durante a redução do megazol com
20
ferredoxina em: (A) condições anaeróbias; (B) aeróbias; (C) simulação
computacional de (A).
Figura 17: Estrutura química do metronidazol (7)
21
Figura 18: Nitro-ânion radicais do megazol (6) (B) e do nifurtimox (2)
22
(A). Espectro de ERS dos nitro-aniôns radicais após incubação com
microssomos de T.cruzi.
Figura 19: Inibição dose-dependente de [3H]- leucina incorporada por
23
formas amastigotas de T.cruzi. (▲) controle, (●) 300 µM benznidazol
(3), (□) 50 µM megazol (6), (○) 25 µM megazol e (∆) 12,5 µM megazol.
Figura 20: Efeito do megazol (4) sobre a quantidade de tióis em formas
epimastigota do T. cruzi. A meia-vida da tripanotiona é 88 min.
Controle-T(SH)2 (■), T(SH)2-megazol (•), GSH-controle (▲), GSHmegazol (ο).
xvi
24
Figura 21: Estrutura química da brazilizona A (8) e do derivado 3,5-tert-
25
butil,4-OH (9)
Figura 22: Estrutura geral dos novos derivados imidazólicos 2,4,5-
26
trissubstituídos (10-19)
Figura 23: Planejamento estrutural dos novos derivados 2,4,5-triaril-
27
imidazólicos (10-19)
Figura 24: Estutura química dos novos derivados imidazólicos 2,4,5-
28
trissubstituídos (10-19).
Figura 25: Análise retrossintética proposta para a obtenção dos
29
derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19)
Figura 26: Espectro no IV referente à ceto-oxima (20)
33
Figura 27: Espectro de RMN 1H da ceto-oxima (20), (500 MHz, DMSO-
34
d6/TMS)
Figura 28: Espectro de RMN 13C da ceto-oxima (20) (100 MHz, DMSOd6/TMS).
xvii
34
Figura 29: Espectro no IV do derivado imidazólico 2,4,5-trissubstituído
39
(12).
Figura 30: Espectro de RMN-1H do derivado imidazólico 2,4,5-
41
Trissubstituído fluorado (11) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
Figura 31: Espectro de RMN-1H do derivado imidazólico 2,4,5-
42
trissubstituído bromado (13) (500 MHz, DMSO-d6/TMS).
Figura 32: Espectro de RMN-13C do derivado imidazólico 2,4,5-
44
trissubstituído (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS).
Figura 33: Espectro de RMN-13C DEPT do derivado imidazólico 2,4,5-
45
trissubstituído (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS).
Figura 34: Estrutura molecular do composto imidazólico para-bromado
45
(13) obtido por difração de raios-X.
Figura 35: Redução do perfil de atividade através das modificações na
fenila dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19)
xviii
47
Pág.
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Metodologia sintética do derivado enol-benzoato (21)
30
Esquema 2: Proposta de mecanismo para a reação de obtenção do
31
enol-benzoato (21).
Esquema 3: Esquema de síntese da ceto-oxima (20) a partir do enol-
31
benzoato (21).
Esquema 4: Proposta de mecanismo para a reação de obtenção da
32
ceto-oxima na forma Z (20).
Esquema 5: Esquema de síntese dos novos derivados imidazólicos
35
2,4,5-trissubstituídos (10-19).
Esquema 6: Proposta de mecanismo para a reação de obtenção dos
derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19).
xix
36
Pág.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Prevalência da infecção por Trypanossoma cruzi em países da
6
América Latina em 1980-85 e 2005 e efeitos de iniciativas de controle ou
eliminação da doença de Chagas.
Tabela 2- Percentagem de cura em grupos de camundongos inoculados com
17
cepas de T. cruzi tratados com megazol (6), benznidazol (3), nitrofurazona (1) e
nifurtimox (2), por via oral.
Tabela 3- Constantes de eficácia catalítica da redução enzimática de
21
nitrocompostos por diferentes redutases.
Tabela
4:
Propriedades fisico-quimicas e
rendimentos
dos
derivados
37
imidazólicos 2,4,5-trisssubstituidos (10-19)
Tabela 5: Principais dados de EM-ESI e IV para novos derivados imidazólicos
38
2,4,5-trissubstituídos (10-19)
Tabela 6: Deslocamentos químicos em ppm dos hidrogênios dos anéis A, B, C
40
e D dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19).
Tabela 7: Deslocamentos químicos em ppm dos carbonos dos derivados imidazólicos
43
2,4,5-trissubstituídos (10-19).
Tabela 8: Atividade tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota dos
novos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos (10-19)
xx
46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µM
Micromolar
ADME
Absorção, distribuíção, metabolismo e eliminação
Ar
Anel aromático
CCF
Cromatografia em camada fina
DMSO-d6
Dimetil Sulfóxido deuterado
DNA
Ácido desoxirribonucléico
e.g.
Por exemplo
EM
Espectrometria de massas
EROs
Espécies Reativas de Oxigênio
ERS
Espectroscopia de Ressonância de Spin
ESI
Ionização por eletrospray
g
Grama
CLAE
Cromatografia Liquída de Alta Eficiência
Hz
Hertz
i.e.
Isto é
IC50
Crescimento inibitório de 50 %
IGF
Interconversão de Grupos Funcionais
IV
Infravermelho
J
Constante de acoplamento
xxi
LAFEPE
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco
mg
Miligrama
Nfx
Nifurtimox
NTR
Nitrorredutase
OMS
Organização Mundial de Saúde
OPAS
Organização Pan americana de Saúde
P.F.
Ponto de Fusão
P.M
Peso molecular
ppm
Partes por milhão
RMN 13C
Ressonância magnética nuclear de carbono treze
RMN 1H
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
SOD
Superóxido dismutase
T. cruzi
Trypanosoma cruzi
T.brucei
Trypanosoma brucei
T[S]2
Tripanotiona disulfeto
T[SH]2
Tripanotiona ditiol
TbNTR
Nitrorredutases de Trypanosoma brucei
TcNTR
Nitrorredutases de Trypanosoma cruzi
UV
Ultra violeta
WHO
World Health Organization (Organização mundial da saúde)
Pág.
xxii
ANEXO DE ESPECTROS
E.1- Espectro de massas do enol-benzoato (21).
70
E.2- Espectro de RMN 1H do enol-benzoato (21) (500 MHz, DMSO-
71
d6/TMS).
13
E.3- Espectro de RMN
C do enol-benzoato (21) (125 MHz, DMSO-
72
d6/TMS)
E.4- Espectro de massas da ceto-oxima (20).
73
E.5- Espectro no IV da ceto-oxima (20).
73
E.6- Espectro de RMN 1H da ceto oxima (20) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
74
13
E.7- Espectro de RMN
C da ceto oxima (20) (100 MHz, DMSO-
75
d6/TMS)
E.8- Espectro de massas do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-
76
biimidazol-3'-ol (10)
1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-
76
E.10- Espectro de RMN 1H do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-
77
E.9-
Espectro
no
IV
do
biimidazol-3'-ol (10)
biimidazol-3'-ol (10) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.11- Espectro de RMN
13
C do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-
78
biimidazol-3'-ol (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS).
E.12- Espectro de RMN
13
C DEPT do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-
2,4'-biimidazol-3'-ol (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
xxiii
79
E13- Espectro de massas do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-
80
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (11)
E.14- Espectro no IV do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-
80
2,4'-biimidazol-3'-ol (11)
E.15- Espectro de RMN 1H
do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-
81
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (11) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.16- Espectro de RMN
13
C do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-
82
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (11) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.17- Espectro de massas do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
83
2,4'-biimidazol-3'-ol (12).
E.18- Espectro no IV do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-
83
biimidazol-3'-ol (12)
E.19- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
84
2,4'-biimidazol-3'-ol (12) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.20- Espectro de RMN
13
C do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
85
2,4'-biimidazol-3'-ol (12) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.21- Espectro de massas do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
86
2,4'-biimidazol-3'-ol (13)
E.22- Espectro no IV do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-
86
biimidazol-3'-ol (13)
E.23- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H2,4'-biimidazol-3'-ol (13) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
xxiv
87
E.24- Espectro de RMN 13C do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
88
2,4'-biimidazol-3'-ol (13) (125 MHz, DMSO-d6/TMS
E.25- Espectro de massas do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-
89
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (14)
E.26- Espectro no IV do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-1H,3'H-
89
2,4'-biimidazol-3'-ol (14)
E.27- Espectro de RMN 1H do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-
90
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (14) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
13
C do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-
E.28- Espectro de RMN
91
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (14) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.29- Espectro de massas do 2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
92
2,4'-biimidazol-3'-ol (15)
E.30- Espectro no IV do 2'-(4-metóxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-
92
biimidazol-3'-ol (15)
E.31- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
93
2,4'-biimidazol-3'-ol (15) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.32- Espectro de RMN
13
C do 2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
94
2,4'-biimidazol-3'-ol (15) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.33- Espectro de massas do 2'-(4-hidroxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
95
2,4'-biimidazol-3'-ol (16)
E.34- Espectro no IV do 2'-(4-hidroxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-
95
biimidazol-3'-ol (16)
E.35- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-hidroxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
xxv
96
2,4'-biimidazol-3'-ol (16) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.36- Espectro de RMN 13C do 2'-(4-hidróxi fenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-
97
2,4'-biimidazol-3'-ol (16) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.37- Espectro de massas do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-
98
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17)
E.38- Espectro no IV do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-
98
1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17)
E.39- Espectro de RMN 1H do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-
99
fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.40- Espectro de RMN
13
C do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-
100
fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.41- Espectro de massas do 2'-(3-hidroxi-4-metóxifenil)-1-metil-5-nitro-
101
5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18)
E.42- Espectro no IV do 2'-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-
101
fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18)
E.43- Espectro de RMN 1H do 2'-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-nitro-
102
5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
E.44- Espectro de RMN
13
C do 2'-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-
103
nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18) (125 MHz, DMSO-d6/TMS
E.45- Espectro de massas do 2'-(4-hidróxi-3-metóxi-5-nitrofenil)-1-metil5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19)
xxvi
104
E.46- Espectro no IV do 2'-(4-hidróxi-3-metóxi-5-nitrofenil)-1-metil-5-
104
nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19)
E.47. Espectro de RMN 1H do do 2'-(4-hidroxi-3-metoxi-5-nitrofenil)-1-
105
metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19) (400 MHz, DMSOd6/TMS)
E.48- Espectro de RMN
13
C do do 2'-(4-hidroxi-3-metoxi-5-nitrofenil)-1-
metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19) (100 MHz, DMSOd6/TMS)
xxvii
106
1-INTRODUÇÃO
1.1-Doença de Chagas
A doença de Chagas ou tripanossomose americana, descoberta pelo
pesquisador brasileiro Carlos Chagas em 1909, é uma zoonose causada pelo
parasito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T.cruzi), endêmico na América
Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) existem 16-18
milhões de pessoas infectadas e cerca de 120 milhões de pessoas estão em
áreas de risco, com 200 mil novos casos e mais de 14 mil mortos todos os
anos na América Latina (Ferreira, 2008).
A maior parte dos casos de infecção em seres humanos (80-90% dos
casos), ou em outros vertebrados, é produzida pelo contato da pele ou
mucosas com fezes ou urinas de insetos hematófagos infectados por T.cruzi. A
infecção pode ser causada por transfusão com sangue que esteja infectado, ou
ainda pode ter um caráter congênito, que representam cerca de 5-20% e 5-8%
dos casos, respectivamente. (Dias, 2000).
Ao longo do seu ciclo de vida, o T. cruzi apresenta diferentes estágios de
desenvolvimento, com diversas alterações morfológicas: epimastigota, forma
encontrada no inseto, além das formas tripomastigota e amastigota,
responsáveis pela multiplicação e disseminação da infecção no homem (Figura
1) (de Souza, 1984). No intestino do inseto, os parasitos proliferam na forma
epimastigota
e
se
diferenciam
em
formas
infectivas,
tripomastigotas
metacíclicas, na porção final do intestino. No homem o ciclo da doença de
Chagas inicia-se quando o barbeiro elimina formas tripomastigotas de T.cruzi
junto com suas fezes (Figura 2A). Morfologicamente, a forma celular infectiva é
alongada e apresenta um flagelo que facilita seu movimento.
Após a entrada no organismo do hospedeiro vertebrado, ocorre a
infecção de células próximas ao local da picada. Dentro da célula, as formas
tripomastigotas assumem um aspecto ovóide e sem flagelo, chamada forma
amastigota (Figura 2B), a qual se multiplica rapidamente. O grande número de
parasitos provoca o rompimento celular e os tripanossomídeos entram na
corrente sanguínea e no sistema linfático. Nesse momento, as formas
amastigota assumem novamente a forma flagelada e passam a ser
1
denominadas tripomastigotas sanguíneos, tipo ocorrente nos vertebrados.
Assim, espalham-se pelo organismo do hospedeiro e infectam mais células em
novos ciclos de reprodução, causando lesões principalmente no tecido
cardíaco e outros músculos lisos, que podem provocar graves problemas,
como a insuficiência cardíaca, devido ao aumento do tamanho do coração
(Figura 3) e podem também culminar ao óbito (Rey, 2001).
Figura 1: O ciclo de vida do Trypanosoma cruzi
Figura 2: As duas principais formas do Trypanosoma cruzi em hospedeiros
vertebrados: A, tripomastigota (formas sanguíneas aderidas a células
musculares cardíacas); B, amastigota (formas intracelulares presentes no
citoplasma de células musculares cardíacas, onde se multiplicam). Fotos: (A)
Helene Barbosa, IOC/Fiocruz; (B) Mirian Claudia Pereira, IOC/Fiocruz.
2
B
A
Figura 3: Radiografias do tórax de um paciente chagásico (A), e de um
paciente sadio (B), ilustrando o tamanho do coração.
Em muitos indivíduos, independente do mecanismo de transmissão, a
infecção chagásica dura de 4 a 10 dias na fase aguda, podendo variar até
algumas semanas e é geralmente assintomática, provavelmente porque a
carga parasitária é pequena. Quando os principais sintomas aparecem,
incluem: febre prolongada, mal-estar, aumento do fígado, baço e os gânglios
linfáticos, edema subcutâneo (localizado ou generalizado) e no caso da
transmissão vetorial ocorre o inchaço na região da picada (chamado de
chagoma), que no caso de ocorrer próximo aos olhos, leva o inchaço das
pálpebras que caracterizam o sinal de Romaña (Figura 4). Nesta fase da
doença, o tratamento ainda é possível, mas em geral a mesma passa
despercebida e a pessoa não sente mais do que o leve incômodo da picada
(WHO, 2002 e Rassi, 2000).
A evolução da fase crônica da doença de Chagas varia entre a ausência
de sinais e sintomas (forma indeterminada) para doença grave e eventual
morte prematura. As manifestações clinicas típicas desta fase estão
relacionadas com o envolvimento patológico do coração, esôfago e cólon, e
são agrupadas em três diferentes formas; cardíaca, digestiva e cardiodigestiva.
A forma cardíaca é a mais grave e freqüente manifestação da doença de
Chagas crônica. Desenvolve-se em 20-30% dos indivíduos infectados e,
normalmente, leva a alterações do sistema de condução, bradiarritmias e
3
taquiarritmias, insuficiência cardíaca, tromboembolismo e morte súbita (Rassi,
2000 e Martin-Neto, 2010).
Figura 4: Sinal de Romaña de uma menina procedente de área
endêmica no Brasil.
Um
estudo
epidemiológico
realizado
na
década
de1980
e,
posteriormente, em 2005 constatou que 100 milhões de pessoas, ou seja, 25%
de todos os habitantes da América Latina estavam em uma área de risco de
infecção e 17,4 milhões foram infectados em 18 países endêmicos entre 19801985 (Tabela 1). Segundo estimativas da Organização Pan-Americana em
2005, cerca de 109 milhões de habitantes estavam em uma área de risco de
contaminação, o que corresponde a 20% da população na América Latina.
Um outro relato importante foi a redução da incidência de novos casos
da doença de Chagas (700.000 por ano em 1990 versus 41.200 por ano em
2006) e do número de mortos (cerca de 50.000 por ano em 1990 versus 12.500
por ano em 2006). A redução do número de novos casos e de mortes
4
resultantes da doença de Chagas nos últimos 20 anos deve-se aos programas
de melhoria no controle de vetores e o rastreamento obrigatório dos bancos de
sangue na América Latina (Rassi, 2010).
Os resultados epidemiológicos observados no Brasil nos últimos anos
podem ser considerados muito favoráveis em termos da eliminação da principal
espécie vetora (Triatoma infestans) e do controle da transmissão por
transfusão de sangue e apresentam substancial impacto na redução da
incidência da doença. Dados descritos na Tabela 1 mostram que na década de
80 haviam 6,18 milhões de pessoas infectadas no Brasil e em 2005 esse
número caiu para 1,9 milhões de pessoas.
Mesmo com a melhoria do controle de transmissão e infecção pelo
T.cruzi, ainda há uma necessidade de buscar novas alternativas na
quimioterapia da Doença de Chagas pelo fato dos fármacos disponíveis
atualmente serem pouco eficazes.
O alto custo de investimento e o pequeno poder de compra dos
pacientes são fatores determinantes para a falta de interesse da indústria
farmacêutica na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos úteis no
tratamento de doenças tropicais. Dentre os 1.061 novos fármacos desenvolvi
dos de 1975 até 1994, menos que 2,7% são para doenças tropicais (Trouiller e
cols., 2000), estes dados mostram que é de responsabilidade do Governo e de
centros
de
pesquisas,
onde
a
população
sofre
com
este
mal,
o
desenvolvimento de novos fármacos potentes e seguros para o controle destas
doenças.
5
Tabela 1: Prevalência da infecção por Trypanossoma cruzi em países da América
Latina em 1980-85 e 2005 e efeitos de iniciativas de controle ou eliminação da
doença de Chagas.
1980-85
Indivíduos
Infectados
2005
Indivíduos
com risco
de infecção
Indivíduos
Infectados
Indivíduos
com risco de
infecção
América do Sul (publicado em 1991)
Argentina
2,64 milhões (10%)
23%
1,6 milhões (4,1%)
19%
Bolívia
1,3 milhões (24%)
32%
620 mil (6,8%)
35%
Brasil
6,18 milhões (4,2%)
32%
1,9 milhões (1,0%)
12%
Chile
1,46 milhões(16,9%)
63%
160 mil (1,0%)
5%
Paraguai
397 mil (21,4)
31%
21,7 mil (2,5%)
58%
Uruguai
37 mil (3,4%)
33%
21,7 mil (0,7%)
19%
América do Sul (publicado em 1997)
Colômbia
900 mil (30%)
11%
436,6 mil (1%)
11%
Equador
30 mil (10,7%)
41%
230 mil (1,7%)
47%
Peru
621 mil (9,8%)
39%
192 mil (0,7%)
12%
Venezuela
1,2 milhões (72%)
72%
310 mil (1,2%)
18%
-
2 mil (0,7%)
50%
América Central (publicado em 1997)
-
Belize
Costa Rica
130 mil (11,7%)
45%
23 mil (0,5%)
23%
El Salvador
900 mil (20%)
45%
232 mil (3,4%)
39%
Guatemala
1,1 milhões (16,6%)
54%
250 mil (2,0%)
17%
Honduras
300 mil (15,2%)
47%
220 mil (3,1%)
49%
-
58,6 mil (1,1%)
25%
47%
21 mil (0,01%)
31%
1,1 milhões (1%)
28%
7,7milhões(1,4%)
20%
-
Nicaragua
Panama
200 mil (17,7%)
-
-
17,4 milhões (4,3%)
25%
México
Total
- = dados não avaliados
6
1.2- Quimioterapia da doença de Chagas
Ao longo do tempo, a história da quimioterapia da doença de Chagas
pode ser dividida em três fases: a primeira fase começa com a descoberta da
doença em 1909 pelo pesquisador Carlos Chagas e vai até a publicação do
“Manual de Doenças Tropicais e Infectuosas” em 1935, durante esse período
não teve grandes avanços quanto à descoberta de fármacos com atividade
tripanocida. Já na segunda fase, compreendida entre 1936 a 1960, numerosas
substâncias foram experimentadas empiricamente no tratamento da doença,
gerando resultados controversos. Por sua vez, a terceira fase, a partir de 1961,
foi caracterizada por estudos que demonstraram claramente, através de
modelos experimentais de infecção com T. cruzi em camundongos, a eficácia
de alguns compostos como, por exemplo, a nitrofurazona (1), uma 5-nitro-2furaldeido-semicarbazona que na dose diária de 100 mg/Kg em esquema
terapêutico de duração prolongada (53 dias em média) curava mais de 95%
dos camundongos com a fase crônica da Doença de Chagas. Na etapa de
ensaios clínicos, foi constatado que a nitrofurazona (1) poderia ser eficaz na
terapia da doença, mas os pacientes não eram capazes de tolerar os efeitos
colaterais nas doses e no tempo necessário para a cura. Entretanto, a
descoberta da nitrofurazona (1) deu início a uma nova era na terapia da doença
de Chagas. (Coura & de Castro, 2002)
Figura 5: Estrutura química da nitrofurazona (1)
7
1.2.1- Compostos nitro heterocíclicos
Compostos nitro-heterocíclicos constituem atualmente uma importante
classe terapêutica no combate a doença de Chagas devido as suas destacadas
atividades antiparasitárias, “in vitro” e “in vivo”.
1.2.2- Nifurtimox (2) e Benznidazol (3)
No início da década de 1970, dois compostos nitro-heterociclícos
surgiram trazendo novas perspectivas para o tratamento da doença de Chagas,
tanto pela eficácia na fase aguda, quanto pela tolerância. O nifurtimox (2), 3metil-4-(5´-nitrofurfurilidenoamino)tetraidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dióxido
benznidazol
(3),
N-benzil-2-nitroimidazol-1-acetamida,
e
o
comercializados,
respectivamente, com os nomes Lampit® (Bayer) e Rochagan® (Roche). Na
década de 80 a comercialização do Nifurtimox (2) foi descontinuada,
primeiramente no Brasil e depois na Argentina, Chile e Uruguai.
Figura 6: Estrutura química dos derivados nitro-heterociclicos nifurtimox (2) e
benznidazol (3).
Os resultados obtidos com ambos os fármacos variam de acordo com a
fase da doença de Chagas, a dose e o período de tratamento, a idade e a
origem geográfica dos pacientes. Bons resultados foram alcançados na fase
aguda, nos casos de infecção crônica recente (crianças menores de 12 anos),
infecção congênita e acidentes de laboratório. Para o tratamento na fase aguda
e nos casos congênitos, recomenda-se 8 a 10 mg / kg por dia de nifurtimox (2)
ou 5 a 7,5 mg / kg por dia de benznidazol (3), durante 30 a 60 dias
consecutivamente e divididas em duas ou três doses diárias. Pacientes com
menos de 40 kg podem tomar até 12 mg / kg por dia de nifurtimox (2) e até 7,5
8
mg / kg por dia de benznidazol (3) em um período de 30 a 60 dias (OPAS /
OMS, 1998). Para a infecção crônica recente (crianças menores de 12 anos),
ou pessoas infectadas nos últimos 10 anos, o tratamento deve ser feito com 8
mg / kg por dia de nifurtiomx (2) ou 5 mg / kg por dia de benznidazol (3) durante
30 a 60 dias. No caso de infecção acidental o tratamento deve começar
imediatamente e dura apenas 10 a 15 dias consecutivos. Casos de infecções
crônicas tardias sem manifestação clínica ou com leves manifestações
cardíacas ou digestivas devem ser tratados durante 60 a 90 dias, de acordo
com a tolerância aos fármacos disponíveis, com o objetivo de prevenir ou
reduzir a evolução da doença de Chagas para formas mais graves, fato este
que ainda não está definitivamente comprovado.
Nifurtimox (2) e benznidazol (3) não devem ser indicados para pacientes
grávidas, em casos de doenças graves associadas com a doença de Chagas,
como infecções sistêmicas, cardíacas, respiratórias, insuficiência renal ou
hepática, neoplasias e hemopatias sem possibilidades de tratamento, pessoas
idosas e debilitadas.
Os mais freqüentes efeitos colaterais do tratamento com nifurtimox (2)
são: perda de peso, alterações psíquicas, excitabilidade ou sonolência e
manifestações digestivas como náuseas, vômitos e ocasionalmente cólicas
intestinais e diarréias. As reações adversas com o benznidazol (3), podem ser
classificadas em três grupos: (i) sintomas de hipersensibilidade, e.g. dermatites
dermatites com erupções cutâneas, febre e edema generalizado, (ii) depressão
da medula óssea, púrpura trombocitopênica e agranulocitose, que é a
manifestação mais grave, (iii) polineuropatia, parestesia e polineurite dos
nervos periféricos.
Estudos indicam que os mecanismos de ação do nifurtimox (2) e o
benznidazol (3) envolvem a formação de radicais livres e/ou metabólitos
eletrofílicos. (Maya, 2007). O grupo nitro (NO2) presente nestas moléculas é
reduzido ao grupo amino (NH2) pela ação de enzimas do tipo nitrorredutases,
que pode ser do tipo I e do tipo II (Wilkinson, et. al., 2011) (Figura 7), com a
formação de vários radicais livres intermediários e seus metabólitos
eletrofílicos.
9
Figura 7: Reações de nitrorredutases do tipo 1 e 2 com derivados nitroheterocíclicos.
Este processo, iniciado pela reação catalisada pela NADPH citocromo
P450 redutase, opera em moléculas com o grupo R-NO2, levando a formação
de um intermediário nitroânion radicalar (R-NO2.-). (Moreno, 1982). Este radical
sofre reciclagem com o oxigênio molecular e isso reduz parcialmente e
regenera a forma oxidada da substância (Mason & Holtzman, 1975). No caso
do nifurtimox (2), o radical reduz o oxigênio molecular (O2) formando o ânion
superóxido (O2·-) e regenerando o grupo NO2 num processo conhecido como
ciclo redox. O ânion superóxido (O2.-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) na
presença de Fe+3 através de reação de Haber-Weiss (Figura 8), forma o radical
hidroxila (.OH). Estes radicais livres, principalmente a hidroxila (.OH) se ligam a
lipídeos, proteínas e ao DNA, promovendo danos às suas estruturas
moleculares. (Díaz de Toranzo, 1988).
Quando o nifurtimox (2) é adicionado a células infectadas por T.cruzi, um
padrão correspondente ao nitro ânion (NO2.-) aparece no espectro de ESR
(Ressonância de Spin Eletrônico). Além disso, a concentração de nifurtimox (2)
(10-20 µM) em que a cultura de formas epimastigotas de T.cruzi é inibida, é
similar ao exigido para a produção máxima do ânion superóxido (O2.-) e a
presença de peróxiodo de hidrogênio (H2O2) (Do Campo, 1984). Estes e outros
experimentos sugerem que a redução intracelular do nifurtimox (2), gerando o
nitro ânion radical, seguida pelo ciclo redox, e produção do ânion superóxido
(O2.-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) é o principal mecanismo de ação contra
o T. cruzi.
10
N
N
H
N
O
NO2
O
O
N
S
N
O
NO2
CH3
3
2
2H+
Nitroredutases
Proteinas
Lipideos
DNA
Haber-Weiss
2+
OH. + OH- Fe
R-NH2
O2-.
SOD ciclo
redox
O2-. + H2O2
O2
H2O
GSH
T(SH)2 redutase
R-NO / R-NHOH
Nitroredutases
Redução de nitro
compostos
GSSG
T(S)2
R-NO2-.
Metabólitos
Eletrofílicos
R-NH2
Redução de nitro compostos
Tióis conjugados
Tióis conjugados
Figura 8: Mecanismo de ação proposto para os fármacos nifurtimox (2) e
benznidazol (3). (Adaptado de Maya, 2007)
O efeito tripanocida do benznidazol (3) não depende de radicais de
oxigênio, tal como o do nifurtimox (2). A formação das espécies ânion
superóxido (O2.-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em concentrações que
inibem o crescimento da forma epimastigota de T.cruzi não foram observados
com
testes realizados para o benznidazol (3). Então é provável que os
metabólitos reduzidos do benznidazol (3) estejam envolvidos nos seus efeitos
tripanocidas por ligação covalente a macromoléculas do T.cruzi (Díaz de
Toranzo, 1988; Maya, 2004). É descrito ainda que o benznidazol (3) aumenta a
fagocitose e lisa o T. cruzi através de um mecanismo dependente de interferongama (IFN-γ) (Romanha, 2002) e inibe o crescimento do T. cruzi através da
inibição da enzima NADH-fumarato redutase. (Turrens, 1996).
Um estudo realizado por Wilkinson e colaboradores (2011), com o
objetivo de determinar o papel das nitroredutases no mecanismo de ação do
nifurtimox (2), mostrou que baixos níveis no consumo de oxigênio foram
detectados na redução deste composto. De fato, as nitrorredutases são
enzimas predominantemente insensíveis ao oxigênio, que catalisam a redução
do anel heterocíclico do nitrofurano em condições aeróbias e anaeróbias. Este
fenômeno produziu a abertura do anel furano do nifurtimox (2) levando à
11
formação de uma nitrila insaturada que apresenta citotoxidade equivalente para
células mamíferas e parasitárias, ao contrário do perfil apresentado do
nifurtimox (2).
A atividade de nitrorredutases do tipo I pode levar a formação de vários
produtos (Figura 9). Essas nitrorredutases do tipo I reduzem o grupo nitro de
nitrofuranos para gerar hidroxilamina passando por um intermediário nitroso. A
hidroxilamina ainda pode ser metabolizada para formar: I- íon nitrênio; II- a
amina, ou; III- nitrila insaturada e saturada de cadeia aberta. Para identificar
quais metabólitos são produzidos pelo nifurtimox (2), este nitrofurano foi
enzimaticamente
reduzido
por
nitrorredutases
de
T.cruzi
(TcNTR)
e
nitrorredutases de T.brucei (TbNTR) em condições aeróbicas e anaeróbicas.
Em todos os casos, a análise de LC-MS do produto resultante rendeu um único
analíto (Figura 10A) cujo espectro de massa continha um par de íons
moleculares [M+H]+ e [M+Na]+ com pesos moleculares de 256 e 278
respectivamente (Figura 10B). Examinando o espectro de absorbância do
produto de redução, podem ser observadas características semelhantes ao
metabólito do derivado nifurtimox (2) produzidos pela ação de radiólises (figura
10C).
H
N
O
N
O
O
R
Ion nitrênio
O
R
2e
nitrofurano
N
O
O
nitroso
R
2e
H
N
HO
O
R
H
N
H
2e
hidroxilamina
O
R
amina
-H2O
N
O
R
nitrila
insaturada
(4)
2e
N
O
R
nitrila
saturada
(5)
Figura 9: Esquema geral de redução de nitrofuranos por nitroredutases do tipo
I ( Wilkinson, 2011)
12
O perfil de absorbância no espectro de UV permitiu identificar o produto
de redução como a nitrila insaturada (4), resultante da desidratação da furil
hidroxilamina e subseqüente abertura do anel furano do nifurtimox (2).
Posteriormente foi observado uma redução da cadeia insaturada pela forma
TcNTR gerando um produto final saturado (5). Entretanto, esta última reação
ocorreu com uma velocidade muito lenta, requerendo um tempo de incubação
muito longo (> 24 h). Além disso, durante a redução do nifurtimox (2) para a
nitrila insaturada de cadeia aberta (4) mediada por NTR, fica implícito que os
intermediários nitroso e hidroxilamina devem ser formados (Figura 9). No
entanto, os picos correspondentes a esses derivados nunca foram detectados,
mesmo quando se usam concentrações subestequiométrica de NADH,
indicando que estes intermediários transientes sofrem fácil redução e, como tal
contribuem para a rápida conversão do nifurtimox (2) a nitrila insaturada (4).
N
O
N N
4
H 3C
S O
O
m/z= 254
Figura 10: Redução do nifurtimox (2) mediada por nitroredutases do tipo I
gerando nitrila insaturada (4). A- HPLC (rastreamento λ=340 nm). B- Espectro
de massa do pico único obtido após HPLC. As m/z de 256 e 278 correspondem
respectivamente ao metabólito +H e +Na derivado do nifurtimox (2). CEspectro de absorção na região do UV do produto da nitrila insaturada (4).
(Wilkinson, 2011)
13
O produto de redução do nifurtimox (2) foi inequivocadamente
caracterizado como uma nitrila insaturada (4), utilizando espectrometria de
massas em tandem. A espectrometria de massas utilizando a técnica de
ionização por eletrospray (ESI) com ion positivo do produto purificado deu
origem a dois íons com massas de 170 e 131, correspondendo a pesos
moleculares de 147 e 108 ([M + Na]), respectivamente (Figura 11A). Estes
fragmentos são provenientes da quebra da ligação fraca N-N gerando assim
uma nitrila de cadeia aberta e uma desidrotiomorfolina (Figura 11B). Quando os
experimentos foram realizados utilizando ESI-MS negativo, o espectro mostrou
uma série de picos preditos para a nitrila insaturada (4), começando com a
detecção da estrutura parental com relação m/z 254. O pico principal tem m/z
227 e corresponde ao esqueleto central da estrutura parental. Outros picos que
apresentam relação m/z compatíveis com a proposta de fragmentos da nitrila
insaturada (4), também foram observados (Figura 11D).
Figura 8: Espectrometria de Massas em Tandem. AFigura 11: Espectrrometria de massas em tandem da nitrila insaturada (4). AESI positivo do ion da nitrila insaturada (4) ; B- Estrutura dos precursores da
nitrila insaturada (4); C- ESI negativo do ion da nitila insaturada (4); DEstrutura do precursor e fragmentos do ESI negativo.
14
Para avaliar se a nitrila insaturada (4) derivada do nifurtimox (2)
apresentava citotoxidade, o produto de redução foi purificado e testado como
inibidor da proliferação de formas sanguineas de Trypanosoma brucei em
células de mamíferos (Figura 12). A concentração da nitrila insaturada (4)
capaz de inibir 50% do crescimento do parasita (IC50) foi ligeiramente superior
ao determinado para o nifurtimox (2) (IC50 de 5.3 ± 1.0 µM para o produto
reduzido versus 2.9 ± 1,0 µM para o nifurtimox). Em contraste, as células de
mamíferos foram relativamente resistentes ao nifurtimox (2), mas apresentaram
% Crescimento
aumento da susceptibilidade à ação de metabólitos derivados da TbNTR.
Figura 12: Citotoxidade da nitrila insaturada (4). Resposta dose dependente da
forma sanguinea de T.brucei (■) e células de mamíferos THP-1 (♦) para
nifurtimox (linha sólida) e nitrila insaturada (OCN) (4) (linha pontilhada).
Comparando o IC50 do nifurtimox (2) (30 ± 1.0 µM) com o da nitrila
insaturada (4) i.e. 5.4 ± 1.1 µM pode-se concluir que o derivado reduzido do
nifurtimox não apresenta seletividade para T.brucei, sugerindo que são os
intermediários da etapa de redução mediada por nitroredutases no patógeno
que são responsáveis pela diferença de citotoxidade entre células mamíferas e
parasitárias. Quanto à citotoxidade da nitrila saturada (5), nenhum efeito
significativo no crescimento de células de mamíferos e parasitárias foram
observados nas concentrações testadas correspondentes.
A importância da redução do nifurtimox (2) ao seu produto tóxico
mediada por nitroredutases foi claramente demonstrado usando células de
T.brucei que expressavam elevados niveis de TbNTR. Estes parasitas foram
15
aproximadamente 10 vezes mais susceptíveis ao nifurtimox que os respectivos
controles (células com elevados níveis de TbNTR tem um IC50 de 0,34 ± 0,02
µM comparadas com 2,51 ± 0,09 µM observados para os controles),
considerando que eles apresentam níveis similares de suscteibilidade das
nitrilas insaturadas (4) (3,71 ± 0,51 µM para T.brucei super-expressando
TbNTR comparado com 3.65 ± 0,16 µM dos controles). Juntos, esses dados
mostram que a nitrila insaturada (4) resultante da redução do nifurtimox (2)
mediada por TbNTR e TcNTR, contribuem para a toxicidade de nitrofuranos e
que a presença de nitrorredutases do tipo I no parasita é responsável pela
toxicidade seletiva do nifurtimox contra esses patógenos.
1.2.3- Megazol (6)
Poucos compostos sintéticos têm os marcantes efeitos curativos no
tratamento da doença de Chagas como o megazol [2-amino-5- (1-metil-5-nitro2-imidazol-2-il)1,3,4 tiadiazol] (6) (Berkelhammer & Asato, 1968), uma 1,3,4tiadiazola nitroimidazólica que, em experimentos com ratos contaminados com
cepas de T. cruzi Y e colombiana, apresentou maior índice de cura comparado
ao tratamento similar empregado aos padrões nitrofurazona (1), nifurtimox (2) e
benznidazol (3) (Tabela 2) (Filardi & Brener, 1982).
Figura 13: Estrutura química do megazol (6)
16
Tabela 2- Percentagem de cura em grupos de camundongos inoculados com
cepas de T. cruzi tratados com megazol (6), benznidazol (3), nitrofurazona (1) e
nifurtimox (2), por via oral.
Cepa de
T. cruzi
Fármaco
-1
Dose (mg.kg )
o
N . Doses
25
50
Megazol (6)
100
50♦
Y
500Τ
Nitrofurazona (1)
100
Benznidazol (3)
100
25
Nifurtimox (2)
500Τ
50
Megazol (6)
Colombiana
100
Nifurtimox (2)
50
♦ Tratamento começou 5 dias depois da inoculação, quando
dose única dada no dia após a inoculação
No. curados/
No .tratados
% cura
20
9/18
50,0
20
19/19
100,0
20
17/17
100,0
20
17/20
85,0
1
8/9
88,8
20
5/18
27,7
20
5/17
29,4
20
1/17
5,8
1
0/10
0,0
20
13/15
85,6
20
14/14
100,0
20
0/15
0,0
a parasitemia estava aparente./ Τ,
O metabolismo do megazol (6) não é muito conhecido e, apesar de sua
natureza nitro-heterocíclica, alguns autores divergem sobre a redução
metabólica do grupo nitro por nitrorredutases como sendo de fundamental
importância para a atividade tripanocida. Tsuhako e cols. (1989) constataram
que na presença de NAD(P)H/frações celulares de T.cruzi (cepa Y) ou na
presença de NAD(P)H/microssomos de fígado de rato (Figura 10), o megazol
(6) não foi capaz de produzir a respectiva espécie nitro-ânion radical (Figura
14, B).
17
Figura 14: Espectro de ERS obtido durante incubação anaeróbia de
microssomas de fígado de rato com compostos nitro-heterocíclicos: (A)
nifurtimox (2); (B) megazol (6); e (C) benznidazol (3) (Tsuhako e cols., 1989).
A ineficiência da microssoma de fígado de rato em reduzir o megazol (6)
foi confirmada por experimentos demonstrando o lento desaparecimento da
banda correspondente ao cromóforo nitro, avaliado por espectroscopia de
absorção da luz visível (Figura 15). Apesar das nitroredutases de T. cruzi não
serem bem caracterizadas (Marr e DoCampo, 1986, Kuwahara e cols., 1984,
Henderson e cols., 1988), os resultados observados (Figura 10) demonstram
que NADPH citocromo P450 redutase (Em = -0,328 mV) (McLane e cols., 1983)
também é ineficiente em promover a redução do grupo nitro do megazol (6) ao
nitro-ânion radical correspondente (Figura 14 B).
18
Figura
15:
Redução
dos
compostos
em
condições
anaeróbias
por
microssomos de fígado de rato. (•) nifurtimox (2); e (o) megazol (6) (0,2mM). O
gráfico mostra o espectro da absorção de luz visível do megazol (6) antes (___)
e depois (- - - ) da adição de ditionato de sódio.
Sob estas condições experimentais o nitro-ânion do megazol (6) não foi
detectado, enquanto que os radicais correspondentes do nifurtimox (2) e
benznidazol (3) foram expressivamente formados (Figura 14). Porém, na
presença de NADPH e ferredoxin: NADP+ oxiredutase (Em = -0,442mV) (Batie
& Kamin, 1981), o radical nitro-ânion do megazol (6) foi facilmente detectado
por espectroscopia de ressonância de spin (ERS) direta sob condições
anaeróbias (Figura 16A), e foi bem caracterizada por simulação computacional
(Figura 16C) do espectro experimental (Figura 16A) (Rao e cols., 1987).
Confirmando estes dados, Tsuhako e cols. (1989) demonstram que a redução
metabólica do megazol (6) gera o nitro-ânion radical (B), mas requer enzimas
com baixo potencial de redução, sugerindo que a atividade tripanocida do
megazol (6) não está relacionada com o processo de biorredução metabólica,
19
mostrando um mecanismo de ação diferente daquele apresentado pelos
fármacos nifurtimox (2) e do benznidazol (3).
Figura 16: Dados de ERS obtidos durante a redução do megazol com
ferredoxina em: (A) condições anaeróbias; (B) aeróbias; (C) simulação
computacional de (A).
Para avaliar o processo de redução do megazol (6), Viodé e
colaboradores (1999) fizeram um estudo usando três enzimas, citocromo b2,
ADR e citocromo P-450 que apresentam diferentes potenciais redox, e
compararam com resultados encontrados para o nifurtimox (2) e o metronidazol
(7). A atividade do citocromo b2 foi mensurada pelo monitoramento do consumo
de oxigênio e das enzimas ADR e citocromo P-450 foram determinados pela
oxidação de NADPH.
Os dados apresentados na tabela 3 mostram a velocidade da redução
dos nitrocompostos por via aeróbica. Esta redução foi seguida pela formação
de espécies radicalares de oxigênio que não apresentam efeito sobre a
atividade da enzima. Os resultados obtidos indicam que as três enzimas
catalisam a redução de nitrocompostos. A redução realizada pela enzima
citocromo b2 do nifurtimox (2) e do megazol (6) ocorreram com velocidades
similares, já com a citocromo P-450 redutase a reação com o nifurtimox (2) foi
mais rápida por uma ordem de magnitude. Por sua vez, com a enzima ADR a
reação de redução do nifurtimox (2) também foi mais veloz quando comparada
ao megazol (6). Os valores de Km para estas enzimas (Tshako e cols., 1989)
20
bem como para outras redutases indicam que a eficiência catalítica está
correlacionada com o potencial de redução dos correspondentes nitrocompostos.
Os valores de Kcat/Km indicam que o megazol (6) possui uma redução
enzimática mais lenta que o nifurtimox (2) e o metronidazol (7), e que sua
elevada atividade tripanocida não está relacionada a primeira etapa do
processo redutivo.
Figura 17: Estrutura química do metronidazol (7)
Tabela 3- Constantes de eficácia catalítica
nitrocompostos por diferentes redutases.
Nitrocompostos
E71 (mV)
Nifurtimox
redução enzimática
Megazol
Enzimas
L-lactase cit. C redutase
ADR
Cit. P-450 redutase
T. cruzi LipDH
Pig heart LipDH
T. cruzi TR
GR humana
da
de
Metronidazol
Kcat/Km [M-1 . Seg-1]
2,8X103
5,0X104
2,0X104
7,6X102
3,0X102
1,5X103
≤14
4,7X103
3,0X103
2,0X103
2,3X103
4,3X103
1,8X103
≤5
ND
3,0X102
ND
ND
ND
ND
ND
As atividades de ADR e citocromo P-450 redutase representam a razão da
oxidação do NADPH a 25o C. As atividades da L-lactase citocromo C redutase
foram determinadas por comparação do consumo de O2. Os valores de Kcat das
outras enzimas foram obtidos por associação dos ensaios de citocromo C. ND =
não determinado.
21
Experimentos de ressonância por spin eletrônico (ESR), técnica
espectroscópica
utilizada
para
detectar
elétrons
desemparelhados,
evidenciaram a produção enzimática, em condições anaeróbias, do nitro-ânion
radical do megazol (6), e o resultado foi comparado ao nitro-ânion radical do
nifurtimox (2), usado como referência (Figura 18).
Os espectros correspondentes estão de acordo com os publicados para
o nifurtimox (2) e aqueles obtidos para o megazol (6) após redução pela
ferrodoxina: NADP+ oxirredutase (Tsuhako e cols., 1989). O sinal obtido no
ERS para a redução do megazol (6), mesmo em uma intensidade menor, sob
as mesmas condições, foi observado por mais tempo que a espécie obtida para
o nifurtimox (2). A meia-vida determinada sob as mesmas condições foram 10
e 3 minutos, respectivamente.
Figura 18: Nitro-ânion radicais do megazol (6) (B) e do nifurtimox (2) (A).
Espectro de ERS dos nitro-aniôns radicais após incubação com microssomos
de T.cruzi.
A geração do nitro-ânion radical pela citocromo P-450 redutase e
microssomos de fígado de rato também confirmam que esta redução ocorre
significantemente, uma vez que o ânion radical pode se acumular sob
condições anaeróbias.
22
De Castro & Meirelles (1990) estudaram o mecanismo de ação do
megazol (6) através da incorporação de precursores de macromoléculas
(leucina, uridina, timidina). Nestas condições o megazol (6) mostrou um potente
efeito na inibição da [3H] leucina (Figura 19) e uma inibição parcial de [3H]
timidina e [3H] uridina, sugerindo uma atividade seletiva na biossíntese de
proteínas. O benznidazol (3) e o nifurtimox (2), mesmo em altas concentrações,
3
6
1 mol ( H3)- Leucina incorporada/10 células
não causaram alteração na incorporação padrão.
minutos
Figura 19: Inibição dose-dependente de [3H]- leucina incorporada por formas
amastigotas de T.cruzi. (▲) controle, (●) 300 µM benznidazol (3), (□) 50 µM
megazol (6), (○) 25 µM megazol e (∆) 12,5 µM megazol.
Maya e cols. (2003) testaram a possibilidade de metabólitos de
nitrorredução do megazol (4), como a espécie nitroso (R-NO), funcionarem
como eletrófilos sequestradores de bionucleófilos do parasito. Por esta razão,
foi investigado o efeito do megazol (6) sobre a quantidade de tióis livres, como
por exemplo, a tripanotiona [T(SH)2] e a glutationa (GSH).
23
Quantidade de tiol
nMol/g
Tempo (min.)
Figura 20: Efeito do megazol (4) sobre a quantidade de tióis em formas
epimastigota do T. cruzi. A meia-vida da tripanotiona é 88 min. Controle-T(SH)2
(■), T(SH)2-megazol (•), GSH-controle (▲), GSH-megazol (ο).
O megazol (6) causou um decréscimo progressivo da quantidade de tiol
do parasito em duas horas, com meia vida de 88 minutos para T(SH)2 e maior
que 200 min. para GSH (Figura 20), mostrando-se um eficiente sequestrador
de tióis, particularmente por T(SH)2, que é um co-fator de desintoxicação da
enzima
tripanotiona
redutase,
essencial
para
a
sobrevivência
do
Trypanossoma, diferentemente do perfil evidenciado para o nifurtimox (2) que
não é capaz de inibir eficientemente a T(SH)2.
A utilização do megazol (6) foi descontinuada devido à alta toxicidade e
mutagenicidade induzida pela sua administração em animais. Entretanto, sua
destacada atividade antiparasitária, aliada à capacidade de capturar resíduos
tióis endógenos do T.cruzi por seus metabólitos de biorredução, tem
caracterizado este protótipo como referência para o desenvolvimento de
análogos nitroimidazólicos com atividade tripanocida e destituídos de seu
comportamento mutagênico. (Maya, 2003)
24
1.2.4- Brazilizona A
Carvalho e colaboradores (2004) com o objetivo de contornar a alta
toxicidade e mutagenicidade do megazol (6), desenvolveram duas séries de
análogos N-arilidrazôincos do megazol (6), os quais apresentaram uma
destacada atividade anti-chagásica. O derivado brazilizona A (8) se mostrou
duas vezes mais potente que o megazol (6) em testes realizados sobre a forma
tripomastigota. A brazilizona A (8) teve um IC50= 5,3 µM, enquanto que o
megazol (6) apresentou um IC50= 9,9 µM. Por sua vez, a avaliação da atividade
tripanocida do correspondente isóstero da brazilizona A (8), obtido pela troca
do anel imidazólico por uma fenila demonstrou a relevância do anel
heterocíclico, uma vez que (8) apresentou um destacado perfil de atividade,
quando comparado ao derivado 3,5-tert-butil,4-OH (9), que apresentou IC50=
33,2 µM.
Figura 21: Estrutura química da brazilizona A (8) e do derivado 3,5-tert-butil,4OH (9)
Apesar de cálculos teóricos demonstrarem que a brazilizona A (5) tem
um bom potencial para absorção in vivo (CARVALHO et al., 2008), não foram
observadas diminuição na parasitemia nem de mortalidade em dois regimes
diferentes de tratamento em testes realizados com murinos (SALOMÃO et al.,
2010). Este resultado corroborou os estudos farmacocinéticos realizados que
indicavam uma rápida eliminação da brazilizona A (8), quando administrada por
via oral.
25
2- OBJETIVOS
No âmbito de uma linha de pesquisa que visa obter novos protótipos que
possam trazer um caráter inovador na terapia da doença de Chagas, este
trabalho tem os seguintes objetivos:
• Sintetizar uma nova família de derivados 1-N-hidoxi-imidazólicos 2,4,5trissubstituídos funcionalizados (Figura 22), planejados, através do uso de
estratégias de modificação molecular como isosterismo de anéis, simplificação
molecular e hibridação molecular
• Determinar sua potência como tripanocida, “in vitro” contra as formas
tripomastigotas de T.cruzi, utilizando protocolos consolidados na literatura;
Figura 22: Estrutura geral dos novos derivados imidazólicos 2,4,5trissubstituídos (10-19)
2.1- Planejamento estrutural dos novos derivados imidazólicos
2,4,5-trissubstituídos
Os novos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) inéditos,
foram planejados a partir de modificações moleculares na estrutura dos
protótipos 1,4,3-tiadiazólicos tripanocidas (8) e (9).
26
Figura
23: Planejamento estrutural dos
novos
derivados
2,4,5-triaril-
imidazólicos (10-19)
Na Figura 23 podemos observar que a parte nitroimidazólica (A) da
Brazilizona
A
(8)
foi
preservada
nos
derivados
imidazólicos
2,4,5-
trissubstituídos (10-19), uma vez que esse núcleo é de fundamental
importância para a atividade contra o T.cruzi. Já o núcleo 1,3,4-tiadiazólico
(B1) da Brazilizona A (8) foi objeto da uma troca isostérica pelo núcleo
imidazólico (B2).
Os novos derivados 2,4,5-triaril-imidazólicos (10-19) foram planejados
como híbridos moleculares das arilidrazonas (8) e (9), após aplicação da
estratégia de simplificação molecular da sub-unidade hidrazona (E), com a
intenção de atingir dois possíveis alvos moleculares distintos no T.cruzi. (Figura
23). (Barreiro e Fraga, 2008)
A partir deste planejamento foram sintetizados diferentes derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) com variação dos substituintes fenila
(C), afim de avaliar como o efeito eletrônico dos diferentes substituintes ligados
ao grupamento fenila (C) poderia influenciar o perfil antiparasitário desta nova
série de compostos imidazólicos (10-19) (Figura 24).
27
O2N
N
N
H3C
OH
N
W
N
10-19
=
W
10
F
11
Br
13
Cl
12
OH
OCH3
15
OH
16
HO
17
NO2
14
OH
OCH3
18
O2N
OCH3
OH
19
Figura 24: Estutura química dos novos derivados imidazólicos 2,4,5trissubstituídos (10-19).
Todos os derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) serão
avaliados “in vitro” em triagem contra formas tripomastigotas de T.cruzi em
colaboração com a Dra. Solange Lisboa de Castro (IOC-Fiocruz).
28
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Análise Retrossintética
A metodologia sintética proposta para a preparação da nova classe dos
derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) inéditos, foi baseada na
análise retrossintética descrita na Figura 25.
Figura 25: Análise retrossintética proposta para a obtenção dos derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19)
O percursor ceto-oxima (20), identificado através de duas desconexões
C-N (etapa a, Figura 25), é o composto chave desta rota de síntese dos
derivados imidazólicos-alvos (10-19), explorando a reação de condensação
com os aldeídos aromáticos correspondentes, seguida de ciclização para a
formação dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19).
O enol-benzoato (21) foi identificado como precursor da ceto-oxima (20)
através da interconversão de grupos funcionais (IGF) (etapa b, Figura 25),
envolvendo as reações de hidrólise e nitrosação.
Finalmente, pela desconexão C=C do enol-benzoato (21) (etapa c,
Figura 25), foi possivel identificar o composto de partida 1,2-dimetil-5-nitro-
29
imidazol (22), explorando a reação de condensação com cloreto de benzoila
em meio básico.
3.2- Obtenção do enol-benzoato (21)
O enol-benzoato (21) foi obtido através da reação de condensação do
1,2-dimetil-5-nitroimidazol (19), com cloreto de benzoíla (23) em meio básico
com 90% de rendimento (Esquema 1) (Albgright, 1972). Esta reação se inicia
pelo ataque nucleofilico do carbânion formado pela desprotonação da metila
benzilica de 22 sobre a espécie eletrofilica 23, seguida de nova desprotonação
do intermediário aril-cetona para fornecer um enolato que faz novo ataque
nucleofilico sobre o cloreto de benzoila para a formação do enol-benzoato (21)
(Esquema 2).
Esquema 1: Metodologia sintética do derivado enol-benzoato (21)
30
Esquema 2: Proposta de mecanismo para a reação de obtenção do enolbenzoato (21).
3.3- Obtenção da Ceto-Oxima (20)
A ceto-oxima (20), que é a intermediária chave dessa rota sintética, foi
obtida através da reação de nitrosação do benzoato (18), usando nitrito de
sódio e ácido sulfúrico (Albright, 1972). Depois de filtrada a ceto-oxima (20) foi
suspensa em etanol para retirar vestígios de ácido benzóico, formado como
subproduto desta reação, e pode ser obtida em 80% de rendimento.
Esquema 3: Esquema de síntese da ceto-oxima (20) a partir do enol-benzoato
(21).
31
A proposta mecanística para esta reação de nitosação do benzoato (21)
(Esquema 4) inicia-se com o ataque nucleofilico do oxigênio da água a
carbonila do benzoato (21) para formar a espécie VII, que forma o enolato VIII
eliminando ácido benzóico. O enolato VII está em equlibrio com o carbânion IX
que por sua vez ataca a espécie eletrofílica VI para produzir o intermediário X
que finalmente se rearranja para produzir a ceto-oxima (20) na forma Z.
2 NaNO2 + H2SO4
I
HNO2 + Na2SO4
IV
III
II
O N OH
IV
H O
O S OH
O
II
O N OH2 + HSO4
V
H2O
N=O
VI
OH2
O
N
O2N
N
H3C
O
O
O
N
O2N
21
N
H3C
N
OH2
O2N
HO
O
N
H3C
O
VIII
VII
N
O2N
N
H3C
O
N
O2N
N
OH
20
H
N
H3C
O
N O
X
N
O2N
N
H3C
O
IX
N=O
VI
Esquema 4: Proposta de mecanismo para a reação de obtenção da cetooxima na forma Z (20).
32
No espectro na região do IV obtido para a ceto-oxima (20) não foi
possível identificar a presença do sinal característico da deformção axial
referente ao grupo hidroxila. Este fato pode ser explicado pela possível
interação intemolecualar do H da hidoxila com o N-3 do anel imidazólico,
formando assim um anel de seis membros. É possível destacar, ainda, o sinal
referente à deformação axial de (C=O) da cetona em 1647 cm-1.
4
3
N
O
2
O2 N 5
N1
CH3
6
N
20
7
9
8
13
OH
10
11
12
Figura 26: Espectro de IV do derivado ceto-oxima (20)
A análise do espectro de RMN-1H, confirmou a formação da ceto-oxima
Z (20), pela presença dos simpletos, referentes aos hidrogênios da metila, em
3,78 ppm, ao hidrogênio H-4 do anel imidazólico, em 8,21 ppm e ao hidrogênio
do grupo oxima em 13,85 ppm. O dupleto referente aos hidrogênios H-9 e H-13
da fenila monossubstituída aparece em 7,98 ppm e adicionalmente também
foram observados dois tripletos referentes aos hidrogênios H-11, em 7,71 ppm
e aos hidrogênios H-10 e H-12, em 7,58 ppm. (Figura 27).
A análise do espectro de RMN
13
C da ceto-oxima Z (20), permitiu
evidenciar que o carbono C-7 referente ao grupo carbonila, teve deslocamento
químico em 189,06 ppm, ficando assim mais desblindado que os demais sinais.
O sinal referente ao carbono C-6 aparece em 146,04 ppm, enquanto e da
metila aparece em 34,516 ppm.
33
N-CH3
4
3
N
H9, H13
O
2
O2 N 5
N1
CH3
6
N
7
9
8
13
OH
20
10
11
12
H11
H4
H10, H12
N-OH
Figura 27: Espectro de RMN 1H da ceto-oxima (20), (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
4
3
N
O
2
O2 N 5
N1
CH3
6
N
7
9
8
13
OH
10
11
12
20
N-CH3
C7
C6
Figura 28: Espectro de RMN 13C da ceto-oxima (20) (100 MHz, DMSO-d6/TMS).
34
3.4- Síntese dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19)
Os derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19), alvo deste
trabalho, foram preparados através da reação de condensação da ceto-oxima
(20) com os benzaldeídos correspondentes, utilizando acetato de amônio em
etanol, com um rendimento de (25-96%) (Wang, 2010). Os derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) foram purificados através da
recristalização em uma solução 9:1 de etanol/ água.
Esquema 5: Esquema de síntese dos novos derivados imidazólicos 2,4,5trissubstituídos (10-19).
A proposta mecanística (esquema 6) para esta reação de condensação
entre a ceto-oxima (20) e o benzaldeido, inicia-se com o ataque da amônia
(NH3) gerada “in situ” a carbonila do benzaldeido (I), gerando a correspondente
fenilmetanimina (IV). O ataque nucleofílico do átomo de nitrogênio da
fenilmetanimina (IV) com a carbonila da ceto-oxima (V) produz o intermediário
VI. A ciclização ocorre com o ataque nucleofílico do nitrogênio da oxima ao
átomo de carbono deficiente de elétrons pra formar VII e este na sequência
perde uma molécula de água formando assim, a espécie VIII. A última etapa
dessa proposta, a amônia retira um próton do intermediário VIII para formar o
anel
heterociclico
central
dos
novos
trissubstituídos (10-19).
35
derivados
imidazólicos
2,4,5-
NH4OAc
NH3
NH3
III
NO2
NO2
N
NH
CH3
N
N OH
H
NH
OH
NH2
H
II
I
IV
HOAc
O
NH3
H
O
H
+
N
H
H2O
IV
NO2
CH3
N
N
O
N
OH
H
N
HO
N
H
O
V
CH3
OH
N
N
H
NH3
VII
VI
H2O
NO2
NO2
N
N
CH3
OH
N
N
10-19
N
N
CH3
OH
N
H
NH3
N
VIII
Esquema 6: Proposta mecanistica para a reação de obtenção dos derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19).
36
A Tabela 4 ilustra os rendimentos e as propriedades físico-quimicas dos
novos derivados imidazólicos 2,4,5-trisssubstituidos (10-19) obtidos através
desta metodologia.
Tabela 4: Propriedades fisico-quimicas e rendimentos dos derivados
imidazólicos 2,4,5-trisssubstituidos (10-19)
Fórmula
Composto
R1
R2
R3
10
H
H
H
C19H15N5O3
361,35
69
217-218
11
H
F
H
C19H14FN5O3
379,38
48
248-249
12
H
Cl
H
C19H14ClN5O3 395,80
20
249-250
13
H
Br
H
C19H14BrN5O3 440,25
65
218-219
14
H
NO2
H
C19H14N6O5
406,35
62
361-362
15
H
OCH3
H
C20H17N5O4
391,38
62
218-219
16
H
OH
H
C19H15N5O4
377,35
71
145-146
17
OH
OH
H
C20H15N5O5
393,35
42
224-225
18
OH
OCH3
H
C20H17FN5O5
407,38
45
213-214
19
OCH3
OH
NO2
C20H16N6O7
452,38
43
245-247
Molecular
P.M.
Rend.(%) P.F.(°C)
Os novos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) foram
analisados por espectrometria de massas (EM), utilizando a técnica de
eletrospray (ESI), e através de espectroscopia na região do infravermelho (IV),
como ilustrado na Tabela 5.
37
Tabela 5: Principais dados de EM-ESI e IV para novos derivados imidazólicos
2,4,5-trissubstituídos (10-19)
IV- Pastilha de KBr - υ(cm-1)
EM-ESI (m/z)
10 360,5 (M+- H, 100%)
11 378,0 (M+-H, 100%)
12 394,0 (M+-H, 100%)
13 440,3 (M+-H, 100%)
14 405,3 (M+-H, 100%)
15 390,4 (M+-H, 100%)
16 376.3 (M+-H, 100%)
3367 (ν N-O-H); 1526-1470 (ν C=C (aromático));
1368 (ν (N=O)2); 852 (ν C-N (Ar-NO2))
3284 (ν N-O-H); (ν C=C (aromático)); 1365 (ν (
N=O)2); 1225 (ν C-F); 829 (ν C-N (Ar-NO2))
3437 (ν N-O-H); 1533-1470 (ν C=C (aromático));
1364 (ν ( N=O)2); 829 (ν C-N (Ar-NO2))
3140-3056 (ν C-H (aromático)); 1533-1470 (ν C=C
(aromático)); 1364 (ν ( N=O)2); 828 (ν C-N (Ar-NO2))
1524-1465 (ν C=C (aromático)); 1349-1365 (ν (
N=O)2); 826 (ν C-N (Ar-NO2))
3448
(ν
N-O-H);
1530-1471-1488
(ν
C=C
(aromático)); 1363 (ν ( N=O)2); 825 (ν C-N (Ar-NO2))
3123-3062 (ν C-H (aromático)); 1527-1465 (ν C=C
(aromático)); 1283 (ν ( N=O)2); 827 (ν C-N (Ar-NO2))
3367 (ν O-H); 3124-3066 (ν C-H (aromático)); 1528-
17
392.2 (M+-H, 100%)
1468 (ν C=C (aromático)); 1365 (ν ( N=O)2); 827
(ν C-N (Ar-NO2))
3468 (ν O-H); 3130-3056 (ν C-H (aromático)); 1533-
18 406,4 (M+-H, 100%)
1503 (ν C=C (aromático)); 1369 (ν ( N=O)2); 827
(ν C-N (Ar-NO2))
19 451.4 (M+ -H, 100%)
3530 (ν O-H); 1555-1542 (ν C=C (aromático)); 1365
(ν ( N=O)2); 827 (ν C-N (Ar-NO2))
38
No espectro na região do IV para os novos derivados imidazólicos 2,4,5trissubstituídos (10-19) sintetizadas foi possível notar a presença da banda
entre 3284-3530 cm-1, referente à deformação axial O-H do grupo hidroxila
ligado ao anel imidazólico. É possível destacar, ainda, os sinais referentes às
deformações axiais de N-O do grupamento nitro com absorção em 13701300cm-1 e às deformações axiais C-N de ArNO2, com absorção em 825-852
cm-1.
O2 N
N
N
CH3
OH
N
Cl
N
12
Figura 29: Ilustração do espectro de IV do derivado imidazólico 2,4,5trissubstituído (12).
As estruturas químicas dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos
(10-19) foram caracterizadas através da análise de seus espectros de RMN-1H,
onde pode-se constatar que os deslocamentos químicos correspondentes aos
hidrogênios N-CH3, H-4, H-2”’ e H-6’’’, H-3’’’ e H-5’’’, H-4’’’, N-OH dos anéis
aromáticos A, B e C permanecem sem muita alteração de um derivado para o
outro. Os hidrogênios referentes a N-CH3, H-4, e N-OH aparecem como
39
simpletos, os hidrogênios H-2’’’ e H-6’’’ como dupletos e os hidrogênios H-3’’’ e
H-5’’’, H-4’’’ como tripletos e seus respectivos deslocamentos estão descritos
na Tabela 6.
No núcleo D (Tabela 6) os deslocamentos químicos e a disposição dos
hidrogênios H-2’’, H-3’’, H-4’’, H-5’’ e H-6’’ variam de acordo com o substituinte
presente no anel fenila.
Tabela 6: Deslocamentos químicos em ppm dos hidrogênios dos anéis A, B,
C e D dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19).
A, B, C
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
N-CH3
3,72 3,72
3,71
3,71
3,73
3,74
3,70 3,70
3,70
3,69
4
8,35 8,34
8,33
8,34
8,32
8,34
8,33 8,32
8,32
7,89
2”’ e 6’’’
7,57 7,56
7,55
7,55
7,56
7,56
7,53 7,53
7,53
7,54
3’’’ e 5’’’
7,34 7,34
7,33
7,33
7,33
7,32
7,32 7,32
7,33
7,32
4’’’
7,28 7,27
7,27
7,28
7,28
7,25
7,25 7,25
7,26
7,25
12,4 12,4 12,58 12,5
12,4
11,7
12,2 12,1
12,2
-
14
15
17
18
19
7,62
7,61
7,49
7,05
N-OH
D
2’’
6’’
10
11
8,16 7,39
12
13
7,60
7,75
7,92
3’’
7,54 8,19
8,17
8,10
5’’
4’’
7,80
7,47
-
-
7,98
8,15
-
-
40
16
7,97
7,08
9,3
7,17
7,51
6,90
9,2
6,85
3,81
9,89
9,3
9,2
8,26
9,28
3,90
7,61
-
7,05
3,82
-
Para os derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos halogenados (11,
12 e 13) foi observado que nas posições 3’’ e 5’’ os deslocamentos dos
hidrogênios seguiu uma ordem relacionada a eletronegatividade do átomo
substituinte, ficando os sinais do derivado fluorado (11) mais desblindados,
seguido do derivado clorado (12) e do derivado bromado (13), com
deslocamentos químicos de 8,19 ppm, 8,17 ppm e 8,10 ppm respectivamente.
No derivado fluorado (11) os hidrogênios H3’’ e H5’’ são um multipleto devido
ao acoplamento desses átomos com o flúor (Figura 30), já nos derivados
clorado (12) e bromado (13) (Figura 31) os hidrogênios 3’’ e 5’’ aparecem como
dupletos.
Figura X:
H3’’ e H5’’
NO2
5
4
N
CH3
1
N
2
3
3'
4'
5'
6'''
N
N
1''' 1'
5'''
OH
2'' 3''
2' 1''
6''
4''
F
5''
2'''
4'''
3'''
Figura 30: Espectro de RMN-1H do derivado imidazólico 2,4,5-trissubstituído
fluorado (11) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
41
Figura 31: Espectro de RMN-1H do derivado imidazólico 2,4,5-trissubstituído
bromado (13) (500 MHz, DMSO-d6/TMS).
As estruturas químicas dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos
(10-19) também foram caracterizadas através da análise de seus espectros de
RMN-13C,
onde
pode-se
constatar
que
os
deslocamentos
químicos
correspondentes aos carbonos N-CH3, C-2’’ e C-6’’, C-3’’ e C5’’ e C-4’’da fenila
D variam de acordo com substituinte ligado. Os carbonos referentes a N-CH3,
C-2, C-4, C-5, C-4’’’, C-2’’’ e C-6”’, C-3’’’ e C-5’’’ H-4, não tiveram grande
diferença no deslocamento químico de um derivado para o outro (tabela 7).
42
Tabela 7: Deslocamentos químicos em ppm dos carbonos dos derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19).
A,B,C,D
10
11
12
13
14
N-CH3
34,57
34,51
34,54
34,54
34,71
2”’ e 6’’’
125,89
125,85
125,86
125,84
125,94
2” e 6’’
127,39
127,49
127,28
127,53
a
4’’’
127,71
127,71
127,72
127,75
127,84
3’’’ e 5’’’
128,61
128,37
128,58
128,60
128,56
3’’ e 5’’
128,70
115,83
128,47
131,73
a
122,68
148,49
4’’
129,33
163,75
a
4
132,75
132,70
132,72
132,71
132,30
1’’’
137,56
137,49
137,60
137,66
138,22
2
139,97
139,95
139,94
139,97
139,54
5
141,28
141,17
141,10
142,15
140,11
a
140,72
1’’
142,25
142,42
a
A,B,C,D
15
16
17
18
19
N-CH3
34,43
34,52
34,54
34,43
34,69
2”’ e 6’’’
125,82
125,79
125,89
125,77
125,90
2” e 6’’
a
a
a
a
a
4’’’
127,38
127,51
127,49
127,53
127,46
3’’’ e 5’’’
128,43
128,54
128,54
128,57
128,44
3’’ e 5’’
111,77
115,25
146,82
148,74
149,82
4’’
157,7
158,50
145,82
146,36
144,67
4
132,63
132,75
132,75
132,78
132,70
1’’’
137,47
137,13
137,05
137,11
137,15
2
139,85
139.87
139,86
139,86
139,74
5
151,58
141,56
141,61
141,54
140,09
1’’
a
142,74
142,69
141,38
141,59
a
= carbono não detectado
43
A análise do espectro de RMN
13
C do derivado imidazólico 2,4,5-
trissubstituído (10) (Figura 32), permitiu evidenciar que o carbono da metila do
núcleo nitroimidazólico, teve deslocamento químico em 34,57 ppm. Para
distinguir os carbonos referentes aos outros núcleos foi realizado um RMN de
DEPT-135 onde foi evidenciado o desaparecimento dos carbonos quaternários
C-5, C-2, C-4’, C-5’, C-2’ e C-1’’ (Figura 33).
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
1'
4''
6''
5''
N-CH3
2'''
3'''
Figura 32: Espectro de RMN-13C do derivado imidazólico 2,4,5-trissubstituído
(10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS).
44
O2N
CH 3
OH
2
4' N 3'
1
5
N
4
N
3
6'''
5'''
4'''
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
1'
6''
4''
5''
2'''
3'''
Figura 33: Espectro de RMN-13C DEPT-135 do derivado imidazólico 2,4,5trissubstituído (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS).
A caracterização estrutural dos novos derivados imidazólicos 2,4,5trissubstituídos foi confirmado por estudos de cristalografia de raios X, como
ilustado na Figura 34, para o derivado para-bromado (13).
Figura 34: Estrutura molecular do composto imidazólico para-bromado
(13) obtido por difração de raios-X.
45
3.5- Avaliação do Perfil Tripanocida
A avaliação do perfil de atividade tripanocida contra a forma
tripomasigota em T.cruzi dos novos derivados 1-N-hidroxi-imidazólicos 2,4,5trissubstituidos (10-19), descritos na tabela 8, mostrou que o derivado mais
ativo foi o p-Br (13), seguido do derivado p-Cl (12) e do derivado p-F (11).
Tabela 8: Atividade tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota
dos novos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos (10-19)
R1
R2
R3
IC50*
Log P/ teórico**
10
H
H
H
108,2 ± 5,65 µM
2,92 ± 0,98
11
H
F
H
67,8 ± 8,39 µM
3,14 ± 1,02
12
H
Cl
H
34,6 ± 2,43 µM
3,69 ± 0,99
13
H
Br
H
23,9± 4,88 µM
3,86 ± 1,02
14
H
NO2
H
241,6 ± 37,6 µM
2,88 ± 0,99
15
H
OCH3
H
191,8 ± 25,3 µM
3,09 ± 0,99
16
H
OH
H
294,1 ± 27,98 µM
2,56 ± 0,99
17
OH
OH
H
360,5 ± 24,67 µM
2,34 ± 0,99
18
OH
OCH3
H
199,9 ± 2,02 µM
2,53 ± 1,00
19
OCH3
OH
NO2
241,8 ± 7,54 µM
3,22 ± 1,01
Bzn
-
-
-
10,8 ± 0,4 µM
0,91 ± 1,00
*Ensaio realizado sobre formas tripomastigotas sanguìneas de T.cruzi.
**Calculado usando o programa ACDLABS.
46
A presença de substituintes halogenados na posição para da fenila dos
derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos (13, 12, 11) foi de grande
importância
na atividade tripanocida. A substituição de um halogênio por
outros grupos monossubstituídos mais polares como, 4-NO2 4-OH e 4-OCH3,
resultou em significativa perda da atividade tripanocida (Figura 35). Os
derivados dissubstituidos 17 e 18 e o trissubstituído 19 não apresentaram
atividade tripanocida.
Br
Cl
F
13
12
11
10
23,9 uM
34,6 uM
67,8 uM
108,2 uM
O2N
NO2
14
241,6 uM
OCH3
15
191,8 uM
OCH3
OH
OCH3
18
199, 9 uM
OH
OH
OH
OH
19
241,8 uM
16
17
294,1 uM
360,5 uM
Figura 35: Redução do perfil de atividade através das modificações na fenila
dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19)
Provavelmente, o diferente perfil de atividade tripanocida evidenciado
para os derivados halogenados (11, 12, 13), está relacionado ao melhor perfil
de lipofilicidade que esses derivados apresentam, como ilustra o Log P teórico
descrito na Tabela 7, no entanto, os derivados imidazólicos 15 e 19 tiveram um
log P teórico maior que 3,09 e não obtiveram atividade tripanocida, indicando
que a atividade desses compostos não são atribuídos apenas pelos dados de
log P. Adicionalmente dentre esses derivados o composto imidazólico 2,4,5trissubstituído bromado 13 apresentou melhor perfil de atividade devido ao fato
do átomo de bromo apresentar maior constante de hidrofobicidade de Hansch
(πBr= + 0,86) que os correspondentes derivados imidazólicos 2,4,5trissubstituídos clorado 12 (πCl= + 0,71) e o derivado fluorado 11 (πF= + 0,14).
47
4- CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste trabalho permitiram-nos concluir que a
metodologia sintética empregada para a obtenção da nova família de derivados
imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos (10-19) mostrou-se adequada, permitindo a
obtenção dos compostos-alvo em rendimentos globais que variam de 22 a
71%.
O planejamento estrutural empregado na construção da série de
compostos imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos (10-19) foi bem sucedido, dados
os resultados obtidos nos ensaios biológicos realizados, que permitem
identificar que o derivado 13, que se mostrou mais ativo sobre a forma
tripomastigota do T.cruzi com IC50= 23,9 ± 4,88 µM.
Como perspectivas, serão feitos ensaios dos derivados imidazólicos
2,4,5-trissubstituidos mais ativos (13, 12, 11) para ver o perfil de citotoxidade,
ensaios de ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) e testes de
mutagenicidade comparativos com outros fármacos nitro-heterocíclicos.
48
5. PARTE EXPERIMENTAL
5.1- Informações Gerais
As reações foram monitoradas por cromatografia em camada fina (CCF)
em sílica gel (cromatofolhas de alumínio KieselGel 60 F245 Merck) e os
produtos visualizados com luz ultravioleta ( 254 e 365 nm).
Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e
13
C
foram obtidos em espectrômetro AC-200A (Farmanguinhos), operando de 400
a 500 MHz. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em parte por
milhão (ppm) a partir do padrão interno tetrametil-silano (TMS). As áreas dos
picos foram obtidas por integração eletrônica e suas multiplicidades foram
descritas do seguinte modo: s- simpleto; d- dupleto; dd- duplo dupleto; ttripleto; m-multipleto.
Os espectros no infravermelho (IV) foram obtidos em um espectrômetro
por transformada de Fouurier, modelo Magna IR 760. As amostras foram
examinadas sob a forma de pastilhas de brometo de potássio (KBr). Os valores
de absorção foram pulsados em número de onda, utilizando como unidade o
centímetro recíproco (cm-1).
Os espectros de massas de baixa resolução (E.M.) foram obtidos por
elétron-spray negativo/positivo com inserção direta LC/MS utilizando metanol
(100%) como diluente e injetando diretamente no probe a um fluxo de 64 ~10
µM/min. em um aparelho LC/MS micromass ZQ 4000, com representação
automática por computador (programa Masslynx). Os fragmentos descritos com
relação entre unidade de massa atômica e a carga do mesmo (m/z) e a
abundância relativa, expressa em cada fragmento, em percentagem (%).
Os pontos de fusão (P.F.) foram determinados em um aparelho BÜCHI
(B-545) e os valores obtidos não foram corrigidos.
49
5.2- Metodologia Sintética
5.2.1- Síntese do derivado enol-benzoato (21) (Albgright, 1972)
Em um balão de 250 mL, resfriado sob um banho de gelo, foram
adicionados 34 mL de acetona e 10 g (70,85 mmol, 1 eq.) de 1,2-dimetil 5nitroimidazol (22) sob agitação. Foi adicionado vagarosamente 50 mL (70,85
mmol, 1eq.) de trietilamina e posteriormente adicionou-se 24,4 mL (210,0
mmol, 3 eq) de cloreto de benzoila na reação. A temperatura foi ajustada para
20°C e foram adicionados 46 mL de acetona e a reação ficou sob agitação por
4 horas. Após este período, foi adicionado 40 mL de água e, posteriormente, a
suspensão foi filtrada em um funil de buchner e lavada com acetona, levando a
obtenção de 25 g do composto 21 com 92% de rendimento sob a forma de um
sólido de cor verde claro.
RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 4,05 (3H, s, N-CH3); 7,28 (1H, s,
H6); 7,49 (3H, m, H17, H18 e H19); 7,61 (2H, t, H11 e H13); 7,75 (1H, t, H18);
7,83 (2H, m, H16 e H20); 7,99 (1H, s, H18); 8,13 (2H; d, H10 e H14); (anexo de
espectros)
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 33,16 (CH3); 101,90 (C8);
125,39 (C11 e C13); 128,97 (C17 e C19); 130,00 (C16 e C20); 130,29 (C10 e
C14); 133,74 (C4); 138,76 (C12); 146,44 (C5); 152,24 (C2); 163,71(C8); (anexo
de espectros).
50
5.2.2- Síntese do derivado ceto-oxima (20) (Albgright, 1972)
Em um balão de 200 mL, resfriado sob um banho de gelo, foram
adicionados 56,6 mL de H2SO4 e 3,82 g de NaNO2 (55,36 mmol) sob agitação.
Após 30 minutos, foram adicionados vagarosamente 20,6 mL de ácido acético
glacial e em seguida acrescentou-se 10,0 g (28,62 mmol) de benzoato 21 na
reação. A reação ficou sob refluxo durante 3 horas e depois foi ajustada para
temperatura ambiente. Foi adicionado 66,6 mL de uma solução 10% de NaCl e
100 mL de água na reação que posteriormente foi filtrada em um funil de
buchner. O composto 20 foi suspenso em etanol e filtrado em um funil de
bucnher, obtendo assim, um sólido na cor amarela com um rendimento de
80%.
δ-ppm): 3,78 (3H, s, N-CH3); 7,58 (2H, t,
RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
H10 e H12); 7,71 (1H, t, H11); 7,98 (2H, d, H9 e H13); 8,21 (1H, s, H4); 13,85
(1H, s, N-OH) (anexo de espectros)
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,51 (CH3); 128,47 (C10’ e
C12); 130,16 (C9 e 13’); 132,24 (C4); 133,53 (C11); 135,79 (C5); 139,45 (C2);
142,46 (C8); 146,O4 (C6); 189,06 (C7); (anexo de espectros).
51
5.2.3- Síntese dos novos derivados imidazólicos 2,4,5-Trissubstituídos
(Wang, 2010)
Em um balão de 100 mL foram adicionados 0,5 g (1,82 mmol, 1 eq.) de
ceto-oxima (20), 0,850 g (11,02 mmol, 6 eq.) de NH4OAc, 0,260 g ( 1,82 mmol,
1 eq.) de benzaldeido correspondente e 12 mL de etanol sob agitação. A
temperatura foi mantida sob refluxo por 5 horas. A reação foi resfriada a
temperatura ambiente e adicionaram-se pedaços de gelo na reação. O
precipitado foi filtrado em um funil de buchner e lavado com água. Todos os
novos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituídos (10-19) foram purificados
através de recristalização em uma solução 9:1 de etanol / água.
1-Metil-5-nitro-2',5'-difenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (10)
Este derivado foi obtido em 69% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 217-218 °C.
RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,72 (3H, s, N-CH3); 7,28 (1H, t,
H-4’’’); 7,34 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,47 (1H, t, H4’’); 7,54 (2H, t, H3’’ e H5’’); 7,57
52
(2H, d, H2’’’ e H6’’’); 8,16 (2H, d, H2’’ e H6’’); 8,35 (1H, s, H4); 12,48 (1H, s, NOH); (anexo de espectros).
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,57 (N-CH3); 125,89 (C2’’’ e
C6’’’); 127,39 (C2’’ e C6’’); 127.71 (C4’’’); 128,61 (C3’’’ e C5’’’); 128,70 (C3’’ e
C5’’); 129,33 (C4’’); 132,75 (C4); 137,56 (C1’’’); 139,97 (C2); 141,28 (C5);
142,25 (C1’’); (anexo de espectros).
RMN-13C DEPT (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,50 (N-CH3); 125,81
(C2’’’ e C6’’’); 127.31 (C2’’ e C6’’); 127,63 (C4’’’); 128,55 (C3’’’ e C5’’’); 128,63
(C3’’ e C5’’); 129,25 (C4’’); 132,69 (C4).
IV (KBr) νmax cm-1: 3284 (ν N-O-H); 3130-3111-3064 (ν C-H (aromático));
1526-1470 (ν C=C (aromático)); 1368 (ν( N=O)2); 826 (ν C-N (Ar-NO2)) (anexo
de espectros).
2'-(4-Fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (11)
Este derivado foi obtido em 48% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 248-249 °C.
NO2
5
4
N
CH3
1
N
2
3
3'
4'
5'
6'''
N
OH
2''
3''
2' 1''
N
1''' 1'
6''
4''
F
5''
2'''
5'''
4'''
3'''
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,87 (3H, s, N-CH3); 7,27 (1H, t,
H-4’’’); 7,34 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,39 (2H, d,H2’’ e H6’’); 7,56 (2H, d, H2’’’ e
H6’’’); 8,19 (2H, m, H3’’ e H5’’); 8,34 (1H, s, H4); 12,49 (1H, s, N-OH); (anexo
de espectros).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,51 (N-CH3); 124,95 (C1’’);
125,85 (C2’’’ e C6’’’); 127,49 (C2’’ e C6’’); 127.71 (C4’’’); 128,37 (C3’’’ e C5’’’);
53
115,83 e 115,61 (C3’’ e C5’’); 132,70 (C4); 137,49 (C1’’’); 139,95 (C2); 141,17
(C5); 142,42 (C1’’); 163, 75 (C4’’) (anexo de espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3284 (ν N-O-H); 3136-3066 (ν C-H (aromático)); 1534-1468
(ν C=C (aromático)); 1365 (ν ( N=O)2); 1225 (ν C-F); 829 (ν C-N (Ar-NO2))
(anexo de espectros).
2'-(4-Clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (12)
Este derivado foi obtido em 20% de rendimento, na forma de um sólido
verde, com ponto de fusão de 249-250 °C.
RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,71 (3H, s, N-CH3); 7,27 (1H, t,
H-4’’’); 7,33 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,55 (2H, d, H2’’’ e H6’’’, J=7,5 Hz); 7,60 (2H, d,
H2’’ e H6’’, J=7,5 Hz); 8,17 (2H, d, H3’’ e H5’’, 8,0 Hz); 8,33 (1H, s, H4); 12,58
(1H, s, N-OH); (anexo de espectros).
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,54 (N-CH3); 125,86 (C2’’’ e
C6’’’); 127.72 (C4’’’); 128,58 (C3’’’ e C5’’’); 132,72 (C4); 137,60 (C1’’’); 139,94
(C2); 141,10 (C5); (anexo de espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: IV (KBr) νmax cm-1: 3437 (ν N-O-H); 3144-3058 (ν C-H
(aromático)); 1533-1470 (ν C=C (aromático)); 1364 (ν ( N=O)2); 829 (ν C-N (ArNO2)) (anexo de espectros).
54
2'-(4-Bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (13)
Este derivado foi obtido em 69% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 218-219 °C.
δ-ppm):: 3,71 (3H, s, N-CH3); 7,28 (1H, t,
RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
H-4’’’); 7,33 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,55 (2H, d, H2’’’ e H6’’’, J= 8,0 Hz); 7,75 (2H,
d, H2’’ e H6’’, J= 8,5 Hz); 8,10 (2H, d, H3’’ e H5’’, J= 8,0 Hz); 8,34 (1H, s, H4);
12,51 (1H, s, N-OH); (anexo de espectros).
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,54 (N-CH3); 116,15 (C5’);
122,68 (C4’’) 125,84 (C2’’’ e C6’’’); 128,60 (C3’’’ e C5’’’); 132,71 (C4); 137,66
(C1’’’); 139,97 (C2); 141,00 (C5); 141,15 (C1’’); (anexo de espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: IV (KBr) νmax cm-1: 3140-3056 (ν C-H (aromático)); 15331470 (ν C=C (aromático)); 1364 (ν ( N=O)2); 828 (ν C-N (Ar-NO2)) (anexo de
espectros).
55
1-Metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (14)
Este derivado foi obtido em 62% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 361-362 °C.
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
CH3
OH
2
4' N 3'
N
2''
2' 1''
5'
1'''
N
6''
1'
3''
4''
NO2
5''
2'''
3'''
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,73 (3H, s, N-CH3); 7,27 (1H, t,
H-4’’’); 7,33 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,57 (2H, d, H2’’’ e H6’’’); 7,80 (1H, t, H2’’, H3’’,
H5’’ ou H6’’); 7,92 (1H, t, 1H, t, H2’’, H3’’, H5’’ ou H6’’); 7,97 (1H, d, 1H, t, H2’’,
H3’’, H5’’ ou H6’’); 8,15 (1H, d, 1H, t, H2’’, H3’’, H5’’ ou H6’’); 8,33 (1H, s, H4);
12,404 (1H, s, N-OH); (anexo de espectros).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,71 (CH3); 115,52 (C4’);
125,94 (C2’’’ e C6’’’); 127,84 (C4’’’); 128,56 (C3’’’ e C5’’’); 132,30 (C4); 138,22
(C1’’’); 139,54 (C2); 140,11 (C5); 140,72 (C1’’); 148,49 (C4’’)(anexo de
espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3120-3084-3033 (ν C-H (aromático)); 1524-1465 (ν C=C
(aromático)); 1349-1365 (ν ( N=O)2); 826 (ν C-N (Ar-NO2))
espectros).
56
(anexo de
2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (15)
Este derivado foi obtido em 62% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 218-219 °C.
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,73 (3H, s, N-CH3); 3,81(3H, s,
OCH3); 7,08 (1H, t, H2’’, H3’’, H5’’ ou H6’’); 7,17 (1H, d, H2’’, H3’’, H5’’ ou H6’’,
J=8,4 Hz); 7,25 (1H, t, H-4’’’); 7,32 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,51 (2H, t, H2’’, H3’’,
H5’’ ou H6’’); 7,56 (2H, d, H2’’’ e H6’’’, J=7,2 Hz); 8,34 (1H, s, H4); 11,72 (1H, s,
N-OH); (anexo de espectros).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,43 (N-CH3); 55,72 (O-CH3);
111,77 (C3’’ e C5’’);125,82 (C2’’’ e C6’’’); 127.38 (C4’’’); 128,43 (C3’’’ e C5’’’);
132,63 (C4); 137,47 (C1’’’); 139,85 (C2); 141,58 (C5); 141,75 (C1’’); 157,7
(C4’’)(anexo de espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3448 (ν N-O-H); 3070-3054 (ν C-H (aromático)); 15301471-1488 (ν C=C (aromático)); 1363 (ν ( N=O)2); 825 (ν C-N (Ar-NO2))
(anexo de espectros).
57
2'-(4-Hidróxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (16)
Este derivado foi obtido em 71% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 145-146 °C.
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,70 (3H, s, N-CH3); 6,90 (2H, d,
H3’’ e H5’’, J= 9,2 Hz), 7,25 (1H, t, H-4’’’); 7,32 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,53 (2H, d,
H2’’’ e H6’’’, J= 7,6 Hz); 7,97 (2H, d, H2’’ e H6’’, J= 8,4 Hz); 8,36 (1H, s, H4);
9,89 (1H, s, C-OH); 12,21 (1H, s, N-OH); (anexo de espectros).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,52 (N-CH3); 115,25 (C3’’ e
C5’’); 115,09 (C4’); 119,39 (C1’’); 125,79 (C2’’’ e C6’’’); 127.51 (C4’’’); 128,54
(C3’’’ e C5’’’); 132,75 (C4); 137,13 (C1’’’); 139,87 (C2); 141,56 (C5); 142,74
(C1’’); 158,50 (C4’’) (anexo de espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3123-3062 (ν C-H (aromático)); 1527-1465 (ν C=C
(aromático)); 1283 (ν ( N=O)2); 827 (ν C-N (Ar-NO2)) (anexo de espectros).
58
2'-(3,4-Diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17)
Este derivado foi obtido em 42% de rendimento, na forma de um sólido
amarelo, com ponto de fusão de 224-225 °C.
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
CH3
OH
2
4' N 3'
N
2'' 3''
2' 1''
5'
1'''
N
6''
1'
OH
4''
OH
5''
2'''
3'''
RMN-1H (500 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,70 (3H, s, N-CH3); 6,85 (1H, d,
5’’, J= 8,0 Hz); 7,25 (1H, t, H-4’’’); 7,32 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,49 (1H, dd, H6’’,
J=8,5 Hz); 7,53 (2H, d, H2’’’ e H6’’’); 7,62 (1H, d, H2’’); 8,32 (1H, s, H4); 9,23
(1H, s, 3’’OH ou 4’’); 9,33 (1H, s, 3’’ ou 4’’OH); 12,16 (1H, s, N-OH); (anexo de
espectros).
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,54 (N-CH3); 125,89 (C2’’’ e
C6’’’); 127.49 (C4’’’); 128,54 (C3’’’ e C5’’’); 132,75 (C4); 137,05 (C1’’’); 139,86
(C2); 141,61 (C5); 142,69 (C1’’); 145,82 (C4’’), 146,82 (C3’’) (anexo de
espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3367 (ν O-H); 3124-3066 (ν C-H (aromático)); 1528-1468 (ν
C=C (aromático)); 1365 (ν ( N=O)2); 827 (ν C-N (Ar-NO2)) (anexo de
espectros).
59
2'-(3-Hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'ol (18)
Este derivado foi obtido em 45% de rendimento, na forma de um sólido
cinza, com ponto de fusão de 213 °C.
δ-ppm):: 3,70 (3H, s, N-CH3); 3,82 (3H, s,
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
OCH3); 7,05 (1H, d, H2’’, H5’’ ou H6’’); 7,26 (1H, t, H-4’’’); 7,33 (2H, t, H3’’’ e
H5’’’); 7,53 (2H, d, H2’’’ e H6’’’); 7,61 (2H, t, H2’’, H5’’ ou H6’’); 8,32 (1H, s, H4);
9,28 (1H, s, C-OH); 12,26 (1H, s, N-OH); (anexo de espectros).
δ-ppm): 34,43 (N-CH3); 55,62 (O-CH3);
RMN-13C (125 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
125,77 (C2’’’ e C6’’’); 127.53 (C4’’’); 128,57 (C3’’’ e C5’’’); 132,78 (C4); 137,11
(C1’’’); 139,86 (C2); 141,54 (C5); 141,38 (C1’’); 146,36 (C4’’), 148,74
(C3’’)(anexo de espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3468 (ν N-O-H); 3130-3056 (ν C-H (aromático)); 1533-1503
(ν C=C (aromático)); 1369 (ν ( N=O)2); 827 (ν C-N (Ar-NO2)) (anexo de
espectros).
60
2'-(4-Hidroxi-3-metoxi-5-nitrofenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (19)
Este derivado foi obtido em 43% de rendimento, na forma de um sólido
vermelho, com ponto de fusão de 245-247 °C.
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm):: 3,69 (3H, s, N-CH3); 3,90 (3H, s,
OCH3; 7,25 (1H, t, H-4’’’); 7,32 (2H, t, H3’’’ e H5’’’); 7,54 (2H, d, H2’’’ e H6’’’);
7,89 (1H, s, H4); 8,26 (2H, d, H2’’ E H6’’); (anexo de espectros).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6 / TMS (δ
δ-ppm): 34,43 (N-CH3); 55,41 (O-CH3);
125,90 (C2’’’ e C6’’’); 127.46 (C4’’’); 128,44 (C3’’’ e C5’’’); 132,70 (C4); 137,15
(C1’’’); 139,74 (C2); 140,09 (C5); 141,59 (C1’’); 149,82 (C3’’)(anexo de
espectros).
IV (KBr) νmax cm-1: 3530 (ν O-H); 1555-1542 (ν C=C (aromático)); 1365 (ν (
N=O)2); 827 (ν C-N (Ar-NO2)) (anexo de espectros)
61
5.3- Protocolo Biológico
5.3.1 Avaliação da atividade tripanocida "in vitro" sobre a forma
tripomastigota de T. cruzi. (SALOMÃO et al., 2004)
As soluções estoque dos derivados imidazólicos 2,4,5-trissubstituidos
(10-19) foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 100
mg/mL. Formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi (cepa Y) foram isoladas
de camundongos infectados e ressuspendidas em meio Eagle modificado por
Dulbecco (DME) suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os ensaios com
tripomastigotas foram realizados em placa de 96 poços e em cada poço foram
adicionados 100 µL de cada derivado imidazólico 2,4,5-trissubstituido,
previamente preparadas no dobro das concentrações desejadas, para uma
diluição seriada 1:2. O tratamento foi analisado na faixa que variou de 25 a 500
µg/ml, com concentração final do solvente nunca superior a 0,5%. A seguir,
foram acrescentados 100 µL
de suspensão de tripomastigotas numa
concentração final de 5 x 106 parasitos/mL, na ausência de sangue. Após
incubação por 24h, a 37°C, os parasitos foram quantificados em câmara de
Neubauer e o valor de IC50 calculado.
62
6- REFERÊNCIAS
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69
7- ANEXO: ESPECTROS
O
N
O2N
O
N
CH3
M/ESI (m/z)= 349,3
E.1- Espectro de massas do enol-benzoato (21).
70
10
O
4
O2 N
5
3
N
N1
CH 3
O 8
7
2
E.2- Espectro de RMN 1H do enol-benzoato (21) (500 MHz, DMSO-d6/TMS).
71
14
15 16
13
17
6
20
21
11
9
19
18
12
0 .6 8 3 2
C om m ent
G :\s i1 0 8 1 1 0 9 6 2 _ 0 1 1 0 0 1 r
16384
P o in ts C o u n t
1 9 .3 0 0
T M G 0 0 1 /0 7 - R am on O p . C h arles
F r e q u e n c y (M H z )
16384
P u ls e S e q u e n c e
3 1 A u g 2 0 1 1 1 2 :1 4 :1 4
13C
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
D a te
N u c le u s
S o lv e n t
1 0 0 .6 2
zgpg30
8369
2 3 9 8 0 .8 1
128.97
A c q u is itio n T im e (s e c )
F ile N a m e
O r ig in a l P o in ts C o u n t
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C )
132.5
132.0
131.5
131.0
Chemical Shift (ppm)
130.5
130.0
129.5
128.49
129.24
129.10
39.50
39.28
130.00
130.29
132.59
133.0
129.0
128.5
4
39.91
O2 N
39.08
133.5
10
O
128.97
134.0
133.74
133.90
DMSO-d6
5
3
N
O 8
7
2
N1
CH 3
11
9
14
15 16
13
12
17
6
20
19
18
210
200
190
180
170
160
150
33.16
40.13
38.87
101.90
128.49
45.48
140
132.59
138.76
146.44
163.71
152.24
133.74
130.00
125.39
21
130
120
110
100
90
Chemical Shift (ppm)
80
E.3- Espectro de RMN 13C do enol-benzoato (21) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
72
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
E.4- Espectro de massas da ceto-oxima (20).
E.5- Espectro no IV da ceto-oxima (20).
73
4
3
N
O
2 6
O2N 5
N1
CH 3
N
20
E.6- Espectro de RMN 1H da ceto oxima (20) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
74
7
9
8
13
OH
10
11
12
E.7- Espectro de RMN 13C da ceto oxima (20) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
75
O2N
N
N
CH3
OH
N
N
M/ESI (m/z)= 361,35
E.8- Espectro de massas do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-biimidazol3'-ol (10)
E.9- Espectro no IV do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol
(10)
76
24 M ar 2 011
A c q u is itio n T im e (s e c )
D a te
F ile N a m e
1 .0 2 2 4
C om m ent
P O X I 0 8 0 0 2 /1 0 - R a m on o p . C h arle s
1 3 D e c 2 0 1 0 1 6 :0 5 :1 4
C :\U s e rs \S in te s e4 \D o c u m e n ts \R am on \D is s ertaç ão d e M es tra d o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ron to s p ara T es e\P O X I 0 8 0 0 2 -1 0 _ 0 1 0 0 0 1 r
F r e q u e n c y (M H z )
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
P o in ts C o u n t
S o lv e n t
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C )
5 0 0 .1 3
8
16384
D M S O -D 6
2 0 .4 0 0
1H
8192
zg3 0
8 0 1 2 .8 2
N u c le u s
O r ig in a l P o in ts C o u n t
P u ls e S e q u e n c e
S w e e p W id th (H z )
2.490
3.424
3.725
7.583
7.568
7.557
7.542
7.526
7.490
7.476
7.461
7.358
7.343
7.329
7.295
7.280
7.265
8.170
8.155
8.354
8.354
8.170
8.155
7.583
7.568
7.557
7.542
7.526
7.490
7.476
7.343
7.329
12.484
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
0.98
8.5
8.4
2.00
8.3
8.2
4.08
8.1
8.0
7.9
7.8
Chemical Shift (ppm)
7.7
7.6
1.00
14
13
1.08
7.5
3.02
12
11
10
9
7.3
4'''
7.2
8.86
8
5'
1'''
2.06 1.01
7.4
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
2'' 3''
2' 1''
N
1'
4''
6''
5''
2'''
3'''
3.00
7
Chemical Shift (ppm)
6
5
4
3
2
E.10- Espectro de RMN 1H do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (10) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
77
1
0
A c q u is itio n T im e (s e c )
D a te
F ile N a m e
0 .5 4 5 6
P O X I 0 8 0 0 2 /1 0 - R am on
C om m ent
1 3 D ec 2 0 1 0 0 7 :5 2 :0 2
C :\U s ers \S in tes e4 \D oc u m en ts \R am on \D is s ertaç ão d e M es trad o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ron tos p ara T es e\P O X I 0 8 \P O X I 0 8 0 0 2 -1 0 _ 0 1 1 0 0 1 r
F r e q u e n c y (M H z )
O r ig in a l P o in ts C o u n t
P u ls e S e q u e n c e
S w e e p W id th (H z )
1 2 5 .7 6
16384
zgpg30
3 0 0 3 0 .0 3
13C
16384
D M S O -D 6
2 1 .6 0 0
N u c le u s
P o in ts C o u n t
S o lv e n t
T e m p e ra tu re (d e g r e e C )
125.890
127.391
127.712
128.703
128.615
128.426
129.330
39.996
39.835
39.660
39.500
39.325
39.165
38.990
34.573
115.876
132.755
133.105
142.258
141.282
139.970
137.565
133.105
132.755
129.330
128.703
128.426
127.712
127.391
125.890
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
134
160
152
144
136
133
128
132
120
131
112
130
129
Chemical Shift (ppm)
104
96
128
127
126
125
88
80
Chemical Shift (ppm)
72
64
56
48
40
32
5'
1'''
124
4'''
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
N
6''
1'
4''
5''
2'''
3'''
24
16
E.11- Espectro de RMN 13C do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
78
2'' 3''
2' 1''
8
0
A c q u is itio n T im e (s e c )
0 .5 4 5 6
D a te
1 3 D ec 2 0 1 0 0 7 :5 2 :5 2
P O X I 0 8 0 0 2 /1 0 - R am on op . C h arles
F ile N a m e
C :\U s ers \S in tes e4 \D oc u m en ts \R am on \D is s ertaç ão d e M es trad o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ron tos p ara T es e\P O X I 0 8 \P O X I 0 8 0 0 2 -1 0 _ 0 1 2 0 0 1 r
F r e q u e n c y (M H z )
1 2 5 .7 6
N u c le u s
13C
O r ig in a l P o in ts C o u n t
16384
P o in ts C o u n t
16384
P u ls e S e q u e n c e
d ep t1 3 5
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
3 0 0 3 0 .0 3
T e m p e ra tu r e (d e g re e C ) 2 1 .7 0 0
34.501
132.697
129.257
128.630
128.557
127.639
127.318
125.817
C om m ent
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
1'
4''
6''
5''
2'''
3'''
DMSO-d6
160
152
144
136
128
120
112
104
96
88
80
Chemical Shift (ppm)
72
64
56
48
40
32
24
16
8
E.12- Espectro de RMN 13C DEPT do 1-metil-5-nitro-2',5'-difenIl-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (10) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
79
0
O2 N
N
N
CH3
OH
N
F
N
M/ESI (m/z)= 379,34
E13- Espectro de massas do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (11)
E.14- Espectro no IV do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (11)
80
A c q u i s it io n T im e ( s e c )
D a te
F ile N a m e
3 .9 5 8 4
C om m ent
P O X I0 1 0 0 1 /1 0 - R a m o n O p . R a f a e lla
1 3 D e c 2 0 1 0 0 8 :1 5 :1 0
C :\U s e r s \S in te s e 4 \ D o c u m e n ts \R a m o n \D is s e r ta ç ã o d e M e s tr a d o \E S P E C T R O S \R M N \P O X I P r o n to s p a r a T e s e \P O X I 0 1 0 0 1 - 1 0 _ 0 1 0 0 0 1 r
F re q u e n c y (M H z )
N u m b e r o f T r a n s ie n t s
P o i n ts C o u n t
S o lv e n t
T e m p e ra tu re (d e g re e C )
4 0 0 .1 5
32
32768
D M S O -D 6
2 7 .0 0 0
1H
32768
zg30
8 2 7 8 .1 5
N u c le u s
O r ig in a l P o in t s C o u n t
P u ls e S e q u e n c e
S w e e p W id th (H z )
2.490
3.387
3.722
7.277
7.321
7.340
7.363
7.408
7.554
7.572
8.199
8.206
8.221
7.386
NO2
7.259
7.277
7.295
7.321
8.345
7.363
7.386
7.408
7.554
7.572
8.185
8.199
8.206
8.221
8.345
7.340
12.491
DMSO-d6
5
4
CH3
1
N
2
N
3
3'
4'
5'
0.92
2.00
8.5
2.00
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6'''
5.08
7.5
14
13
2.96
12
11
10
9
7.13
8
2'' 3''
2' 1''
N
6''
4''
F
5''
2'''
4'''
0.89
OH
1''' 1'
5'''
7.0
Chemical Shift (ppm)
N
3'''
3.00
7
Chemical Shift (ppm)
6
5
4
3
2
1
0
E.15- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (11) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
81
A c q u is itio n T im e (s e c )
0 .6 8 3 2
F ile N a m e
C :\U s ers \S in te s e 4 \D oc u m e n ts \R am on \D is s e rta ç ã o d e M es tra d o \E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ro n to s p a ra T e s e\P O X I 0 1 \P O X I0 1 0 0 1 -1 0 _ 0 1 1 0 0 1 r
P O X I0 1 0 0 1 /1 0 - R am o n O p . R a f ae lla
C om m ent
1 3 D e c 2 0 1 0 1 5 :4 6 :2 8
D a te
F r e q u e n c y (M H z )
1 0 0 .6 2
N u c le u s
13C
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
15388
O r ig in a l P o in ts C o u n t
16384
P o in ts C o u n t
16384
P u ls e S e q u e n c e
zgpg30
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
2 3 9 8 0 .8 1
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C ) 2 7 .0 0 0
115.832
115.614
40.126
39.907
39.704
39.500
39.282
39.078
38.874
34.510
115.832
115.614
124.953
125.855
129.681
129.594
128.576
127.703
141.421
141.174
139.952
137.494
132.969
132.707
129.681
129.594
128.576
127.703
125.855
124.953
132.969
132.707
137.494
161.294
139.952
141.421
141.174
163.752
DMSO-d6
NO2
5
4
N
CH3
1
N
2
3
3'
4'
5'
6'''
184
176
168
135
160
130
125
Chemical Shift (ppm)
152
E.16- Espectro de RMN
144
136
128
120
120
112
104
115
96
88
Chemical Shift (ppm)
13
110
80
64
56
48
40
32
2'' 3''
2' 1''
N
4''
6''
F
5''
2'''
4'''
72
OH
1''' 1'
5'''
140
N
3'''
24
16
8
0
C do 2'-(4-fluorfenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (11) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
82
O2N
N
N
CH3
OH
N
Cl
N
M/ESI (m/z)= 395,8
E.17- Espectro de massas do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (12).
E.18- Espectro no IV do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol3'-ol (12)
83
A c q u is itio n T im e (s e c )
0 .8 1 9 2
D a te
2 5 M ar 2 0 1 1 1 1 :2 5 :3 6
F ile N a m e
C :\U s ers \S in tes e4 \D es ktop \P O X I0 3 0 0 1 -0 9 H _ 0 0 0 0 0 1 r
P O X I 0 3 0 0 1 /1 0 - R am on O p . R afaella
F r e q u e n c y (M H z )
5 0 0 .1 3
N u c le u s
1H
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
16
O rig in a l P o in ts C o u n t
8192
P o in ts C o u n t
16384
P u ls e S e q u e n c e
zg 3 0
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
1 0 0 0 0 .0 0
T e m p e ra tu r e (d e g r e e C ) 2 5 .0 0 0
C om m en t
2.490
3.324
3.714
7.279
O2N
7.351
7.336
7.322
7.294
7.279
7.264
7.559
7.544
7.613
7.598
8.180
8.164
8.336
8.180
8.164
7.613
7.598
7.559
7.544
7.351
7.336
7.322
12.584
DMSO-d6
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
2.24
2.29
8.2
8.1
8.0
7.9
7.8
7.7
Chemical Shift (ppm)
2.36
7.6
7.5
1.00
15
14
13
2.35
7.4
11
10
9
2'' 3''
2' 1''
5'
N
1'''
1'
4''
6''
Cl
5''
2'''
3'''
1.23
7.3
7.2
1.00
12
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
3.38
8
7
Chemical Shift (ppm)
6
5
4
3
2
1
0
E.19- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (12) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
84
-1
A c q u is itio n T im e (s e c )
0 .5 4 5 6
F ile N a m e
C :\U s ers \S in tes e4 \D es k top \P O X I0 3 0 0 1 -0 9 C _ 0 0 0 0 0 1 r
P O X I 0 3 0 0 1 /1 0 - R am on O p . R afaella
C om m ent
D a te
2 5 M ar 2 0 1 1 1 6 :2 2 :2 0
F re q u e n c y (M H z )
1 2 5 .7 6
N u c le u s
13C
16384
P u ls e S e q u e n c e
zg p g 3 0
N u m b e r o f T ra n s ie n ts
10388
O rig in a l P o in ts C o u n t
16384
P o in ts C o u n t
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
3 0 0 3 0 .0 3
T e m p e ra tu re (d e g re e C ) 2 5 .0 0 0
125.861
127.289
127.245
127.726
39.996
39.835
39.675
39.500
39.340
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39.004
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128.863
128.776
128.586
128.470
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128.193
132.944
132.828
132.726
133.571
133.863
141.107
139.941
137.609
133.863
132.944
132.828
132.726
128.863
128.776
128.586
128.368
127.726
127.289
125.861
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
160
134
133
152
144
132
136
131
128
130
129
Chemical Shift (ppm)
120
112
128
104
127
96
126
125
88
80
Chemical Shift (ppm)
4'''
124
72
64
56
48
40
32
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
4''
6''
1'
5''
2'''
3'''
24
16
8
E.20- Espectro de RMN 13C do 2'-(4-clorofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (12) (125 MHz, DMSO-d6/TMS)
85
Cl
0
O2N
N
N
CH 3
OH
N
Br
N
M/ESI (m/z)= 440,25
E.21- Espectro de massas do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (13)
E.22- Espectro no IV do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol3'-ol (13)
86
A c q u is itio n T im e (s e c )
1 .0 2 2 4
F ile N a m e
C :\U s e rs \S in te s e 4 \D e s k to p \P ro to n _ 0 0 0 0 0 1 r
P O X I0 7 0 0 1 /1 0 A - R a m o n O p . R a f a e lla
O r ig in a l P o in ts C o u n t
8192
C o m m en t
16384
P o in ts C o u n t
2 2 M a r 2 0 1 1 1 5 :2 4 :3 6
D a te
F r e q u e n c y (M H z )
5 0 0 .1 3
N u c le u s
1H
N u m b e r o f T ra n s ie n ts
32
P u ls e S e q u e n c e
zg30
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
8 0 1 2 .8 2
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C ) 2 5 .0 0 0
2.490
3.321
3.717
7.282
7.353
7.339
7.324
7.297
7.282
7.268
7.560
7.544
7.762
7.745
8.112
8.096
8.345
8.345
8.112
8.096
7.762
7.745
7.560
7.544
7.353
7.339
7.324
12.515
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
0.85
2.00
8.5
2.00
2.00
8.0
2.00 1.00
7.5
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
6''
1'
4''
Br
5''
2'''
3'''
7.0
Chemical Shift (ppm)
0.95
14
13
10.22
12
11
10
9
8
3.00
7
Chemical Shift (ppm)
6
5
4
3
2
1
E.23- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (13) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
87
0
18 A pr 2011
A c q u is it io n T im e ( s e c )
0 .5 4 5 6
P O X I0 7 0 0 1 /1 0 A - R a m o n O p . R a f a e lla
F ile N a m e
C :\U s er s \S in tes e 4 \D o c u m en ts \R a m o n \D is s er ta ç ã o d e M e s tr a d o \E S P E C T R O S \R M N \P O X I P r o n to s p a r a T e s e \P O X I 0 7 \P O X i 0 7 C _ 0 0 0 0 0 1 r
F r e q u e n c y (M H z )
1 2 5 .7 6
N u c le u s
13C
N u m b e r o f T r a n s ie n t s
6588
O r ig in a l P o in t s C o u n t
16384
P o in t s C o u n t
16384
P u ls e S e q u e n c e
zgpg30
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id t h ( H z )
3 0 0 3 0 .0 3
C om m en t
2 2 M a r 2 0 1 1 1 5 :0 6 :5 2
D a te
T e m p e r a t u r e ( d e g r e e C ) 2 5 .0 0 0
39.996
39.835
39.675
39.500
39.340
39.165
39.004
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131.735
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141.150
DMSO-d6
1
5
116.153
122.683
125.846
127.755
127.537
129.126
128.601
131.735
132.886
132.711
137.667
139.970
141.150
141.005
O2N
4
N
3
6'''
5'
5'''
4'''
142
160
140
152
138
144
136
136
134
128
132
120
130
128
Chemical Shift (ppm)
112
104
126
124
96
122
120
88
80
Chemical Shift (ppm)
118
72
116
64
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
1'
6''
Br
5''
2'''
3'''
114
56
48
40
32
24
16
E.24- Espectro de RMN 13C do 2'-(4-bromofenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (13) (125 MHz, DMSO-d6/TMS
88
4''
8
0
O2N
N
N
CH 3
OH
N
N
NO2
M/ESI (m/z)= 406,35
E.25- Espectro de massas do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (14)
E.26- Espectro no IV do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (14)
89
A c q u is itio n T im e (s e c )
3.9 5 8 4
F ile N a m e
C :\U s ers \S in tes e4 \D es ktop \P O XI0 2 2 D _ 0 1 0 0 0 1 r
P O XI 0 2 0 0 1 /1 0 R am on op . C h arles
F re q u e n c y (M H z )
4 0 0 .1 5
N u c le u s
1H
N u m b e r o f T ra n s ie n ts
16
O rig in a l P o in ts C o u n t
32768
P o in ts C o u n t
32768
P u ls e S e q u e n c e
zg 3 0
So lv e n t
D M S O -D 6
Sw e e p W id th (H z )
8 2 7 8 .1 5
T e m p e ra tu re (d e g re e C ) 2 7 .0 0 0
C om m ent
2 9 A p r 2 0 1 1 1 5 :4 6 :2 4
D a te
-0.012
2.490
3.326
3.730
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7.319
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7.281
7.264
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7.562
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7.968
7.965
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7.906
7.828
7.825
7.807
7.790
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8.333
8.333
8.165
8.145
7.984
7.968
7.925
7.807
7.581
7.562
7.356
7.338
7.319
7.299
12.404
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
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8.5
8.4
8.3
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1.13 1.14
8.1
8.0
1.14
7.9
7.8
7.7
Chemical Shift (ppm)
1.01
13
2.26
7.6
1.11 1.14
12
11
10
9
8
2.30 1.13
7.5
7.4
7.3
7.2
7.1
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
6''
1'
4''
NO2
5''
2'''
3'''
7.0
2.30
3.31
7
6
Chemical Shift (ppm)
5
4
3
2
1
0
-1
E.27- Espectro de RMN 1H do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (14) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
90
A c q u is i t i o n T im e ( s e c )
0 .6 8 3 2
D a te
0 2 M a y 2 0 1 1 0 7 :3 2 :5 2
F i le N a m e
C :\U s e r s \S in t e s e 4 \D e s k to p \P O X I0 2 2 D _ 0 1 1 0 0 1 r
P O X I 0 2 0 0 1 /1 0 R a m o n o p . C h a r le s
F re q u e n c y (M H z )
1 0 0 .6 2
N u c le u s
13C
N u m b e r o f T r a n s ie n t s
16384
O r ig in a l P o in t s C o u n t
16384
P o in t s C o u n t
16384
P u ls e S e q u e n c e
zgpg30
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id t h ( H z )
2 3 9 8 0 .8 1
T e m p e r a t u r e ( d e g r e e C ) 2 7 .0 0 0
C om m ent
34.394
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140.723
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DMSO-d6
O2N
1
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N
3
6'''
5'''
4'''
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160
152
144
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112
104
96
88
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Chemical Shift (ppm)
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72
64
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40
32
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
4''
6''
1'
NO2
5''
2'''
3'''
24
16
8
0
C do 1-metil-5-nitro-2'-(4-nitrofenil)-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (14) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
91
O2N
N
N
CH3
OH
N
N
OCH3
M/ESI (m/z)= 391,38
E.29- Espectro de massas do 2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (15)
E.30- Espectro no IV do 2'-(4-metóxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol3'-ol (15)
92
3 .9 5 8 4
C om m ent
P O X I 0 4 0 0 1 /0 9 - R a m o n op . C h a rle s
1 5 F e b 2 0 1 1 1 4 :3 7 :5 8
C :\U s e rs \S in tes e 4 \D o c u m en ts \R a m o n \D is s e rtaç ão d e M e s trad o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I\P O X I0 4 0 0 1 -0 9 _ 0 1 0 0 0 1 r
4 0 0 .1 5
N u c le u s
1H
16
O r ig in a l P o in ts C o u n t
32768
32768
P u ls e S e q u e n c e
zg30
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
8 2 7 8 .1 5
2 7 .0 0 0
A c q u is itio n T im e (s e c )
D a te
F ile N a m e
F r e q u e n c y (M H z )
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
P o in ts C o u n t
S o lv e n t
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C )
2.490
3.340
3.815
3.734
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7.512
7.495
8.340
7.576
7.558
7.530
7.512
7.339
7.322
7.303
7.190
7.169
7.089
11.728
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
2.20
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7.7
7.6
2.18
2.23
7.5
7.4
7.3
Chemical Shift (ppm)
1.08
1.08
7.2
13
12
5'''
7.1
1.00
14
1.11
7.0
1.00
11
10
9
6.9
4'''
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8
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
1'
6''
4''
OCH3
5''
2'''
3'''
6.59
7
Chemical Shift (ppm)
6
5
4
3
2
1
E.31- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (15) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
93
0
0 .6 8 3 2
C om m ent
P O X I 0 4 0 0 1 /0 9 - R a m o n op . C h ar les
1 6 F e b 2 0 1 1 1 5 :0 2 :0 4
C :\U s e rs \S in te s e 4 \D oc u m e n ts \R am o n \D is s e r taç ão d e M es tra d o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I\P O X I0 4 0 0 1 - 0 9 _ 0 1 1 0 0 1 r
1 0 0 .6 2
N u c le u s
13C
16384
O r ig in a l P o in t s C o u n t
16384
16384
P u ls e S e q u e n c e
zgpg30
D M S O -D 6
S w e e p W id t h ( H z )
2 3 9 8 0 .8 1
2 7 .0 0 0
A c q u is it io n T im e (s e c )
D a te
F ile N a m e
F re q u e n c y (M H z )
N u m b e r o f T r a n s ie n t s
P o in t s C o u n t
S o lv e n t
T e m p e ra tu re (d e g re e C )
34.437
40.126
39.922
39.718
39.500
39.296
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111.773
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114.712
117.767
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120.182
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128.430
127.383
125.826
133.347
132.635
131.544
131.369
137.479
139.850
141.756
141.581
157.700
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
145
184
176
140
168
160
135
152
130
125
Chemical Shift (ppm)
144
136
128
120
120
115
112
110
104
105
96
88
Chemical Shift (ppm)
72
64
56
48
40
5'
1'''
4'''
80
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
32
2'' 3''
2' 1''
N
6''
1'
4''
5''
2'''
3'''
24
16
8
E.32- Espectro de RMN 13C do 2'-(4-metoxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (15) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
94
OCH3
0
O2N
N
N
CH 3
OH
N
OH
N
M/ESI (m/z)= 377,35
E.33- Espectro de massas do 2'-(4-hidroxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (16)
E.34- Espectro no IV do 2'-(4-hidroxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol3'-ol (16)
95
A c q u is itio n T im e (s e c )
D a te
F ile N a m e
3 .9 5 8 4
C om m ent
P O X I 0 5 0 0 3 /1 1 B - R am on O p . C h arles
0 1 J u n 2 0 1 1 1 0 :0 1 :5 8
C :\U s ers \S in tes e4 \D oc u m en ts \R am on \D is s ertaç ão d e M es trad o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ron tos p ara T es e\P O X I 0 5 \P O X I0 5 0 0 3 -1 1 B _ 0 0 0 0 0 1 r
F r e q u e n c y (M H z )
N u m b e r o f T ra n s ie n ts
P o in ts C o u n t
S o lv e n t
T e m p e r a tu r e (d e g re e C )
4 0 0 .1 5
16
32768
D M S O -D 6
2 7 .0 0 0
1H
32768
zg 3 0
8 2 7 8 .1 5
N u c le u s
O rig in a l P o in ts C o u n t
P u ls e S e q u e n c e
S w e e p W id th (H z )
-0.013
2.490
3.335
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7.530
7.341
7.324
7.305
7.276
7.259
7.241
6.915
6.892
7.549
7.530
7.987
7.966
8.336
9.898
12.212
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
0.97
2.00
8.5
8.0
1.00
14
2.02
13
11
10
1'''
N
1'
4''
6''
OH
5''
2'''
3'''
7.0
0.97 2.04
9
5'
2'' 3''
2' 1''
2.05
7.5
Chemical Shift (ppm)
1.02
12
2.03 1.03
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
8
5.25
2.07
7
Chemical Shift (ppm)
3.00
6
5
4
3
2
1
E.35- Espectro de RMN 1H do 2'-(4-hidroxifenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (16) (400 MHz, DMSO-d6/TMS)
96
0
A c q u is itio n T im e (s e c )
0 .6 8 3 2
F ile N a m e
C :\U s ers \S in tes e4 \D oc u m e n ts \R am on \D is s e rtaç ã o d e M es tra d o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ron tos p a ra T e s e\P O X I 0 5 \P oX I 0 5 C _ 0 0 0 0 0 1 r
P O X I 0 5 0 0 3 /1 1 B - R am on O p . E lian e
C om m ent
1 5 J u n 2 0 1 1 1 4 :5 0 :4 4
D a te
F r e q u e n c y (M H z )
1 0 0 .6 2
N u c le u s
13C
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
2270
O r ig in a l P o in ts C o u n t
16384
P o in ts C o u n t
16384
P u ls e S e q u e n c e
zg p g 3 0
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
2 3 9 8 0 .8 1
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C ) 2 7 .0 0 0
40.126
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39.500
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141.567
139.879
158.500
DMSO-d6
O2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
2'' 3''
2' 1''
N
6''
1'
4''
OH
5''
2'''
3'''
0.77
160
152
144
136
128
120
112
104
96
88
80
Chemical Shift (ppm)
72
64
56
48
40
32
24
16
8
E.36- Espectro de RMN 13C do 2'-(4-hidroxi fenil)-1-metil-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (16) (100 MHz, DMSO-d6/TMS)
97
0
O2N
N
N
CH 3
OH
N
OH
N
OH
M/ESI (m/z)= 393,35
E.37- Espectro de massas do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H2,4'-biimidazol-3'-ol (17)
E.38- Espectro no IV do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'biimidazol-3'-ol (17)
98
A c q u is itio n T im e (s e c )
1 .0 2 2 4
F ile N a m e
C :\U s ers \S in tes e4 \D es k top \P roton _ 0 0 0 0 0 1 r
P O X I1 1 0 0 1 /1 1 B - R am on O p . R af aella
O rig in a l P o in ts C o u n t
8192
C om m ent
16384
P o in ts C o u n t
D a te
3 1 M ar 2 0 1 1 0 9 :1 6 :1 8
F re q u e n c y (M H z )
5 0 0 .1 3
N u c le u s
1H
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
32
P u ls e S e q u e n c e
zg30
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
8 0 1 2 .8 2
T e m p e r a tu re (d e g r e e C ) 2 5 .0 0 0
2.490
3.328
3.706
6.864
6.848
O2 N
6.864
6.848
8.329
7.624
7.541
7.526
7.500
7.483
7.338
7.323
7.307
7.272
7.257
7.338
7.323
7.307
7.272
7.257
7.243
7.541
7.526
7.500
7.483
7.624
7.620
9.338
9.236
12.162
DMSO-d6
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
1.00
7.8
7.7
7.6
2.00
1.00
7.5
2.00
7.4
1.00
14
13
12
11
10
1.00
CH3
OH
2
4' N 3'
N
5'
1'''
OH
2'' 3''
2' 1''
N
1'
4''
6''
OH
5''
2'''
3'''
1.00
7.3
7.2
Chemical Shift (ppm)
7.1
2.00
0.85
9
7.0
7.31
8
6.9
6.8
6.7
6.6
1.00
7
Chemical Shift (ppm)
3.00
6
5
4
3
2
1
0
E.39- Espectro de RMN 1H do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17) (500 MHz, DMSO-d6/TMS)
99
0 .5 4 5 6
C om m ent
3 1 M a r 2 0 1 1 0 8 :4 2 :0 8
C :\U s e r s \S in te s e 4 \D e s k to p \C a r b o n o _ 0 0 0 0 0 1 r
13C
O r ig in a l P o in t s C o u n t
zgpg30
S o lv e n t
2 5 .0 0 0
A c q u is it io n T im e ( s e c )
D a te
F ile N a m e
N u c le u s
P u ls e S e q u e n c e
T e m p e ra tu re (d e g re e C )
P O X I1 1 0 0 1 /1 1 B - R a m o n O p . R a f a e lla
1 2 5 .7 6
16384
3 0 0 3 0 .0 3
F re q u e n c y (M H z )
P o in t s C o u n t
S w e e p W id t h ( H z )
16384
D M S O -D 6
18.569
34.544
38.990
39.165
39.325
39.500
39.660
39.835
39.996
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115.089
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119.170
119.695
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128.543
56.043
114.871
115.089
119.170
115.629
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119.695
133.309
125.802
127.493
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128.543
132.769
139.868
137.055
139.868
133.309
141.617
142.695
141.617
142.695
145.202
145.202
146.820
146.820
DMSO-d6
O2 N
1
5
4
N
3
6'''
150
145
140
135
130
Chemical Shift (ppm)
125
120
115
5'''
110
152
144
136
E.40- Espectro de RMN
128
120
112
104
96
88
80
Chemical Shift (ppm)
13
72
64
56
48
40
OH
2'' 3''
2' 1''
5'
N
1'''
1'
6''
4''
OH
5''
2'''
4'''
160
CH3
OH
2
4' N 3'
N
3'''
32
24
16
8
0
C do 2'-(3,4-diidroxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (17) (125 MHz, DMSO-
d6/TMS)
100
O2 N
N
N
CH3
OH
N
N
OH
OCH3
M/ESI (m/z)= 407,38
E.41- Espectro de massas do 2'-(3-hidroxi-4-metóxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18)
E.42- Espectro no IV do 2'-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18)
101
3 .9 5 8 4
C om m ent
2 3 M a r 2 0 1 1 0 8 :1 8 :1 8
C : \U s e r s \S in te s e 4 \D e s k to p _ 0 1 0 0 0 1 r
1H
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
32768
P u ls e S e q u e n c e
8 2 7 8 .1 5
T e m p e r a tu r e ( d e g r e e C )
A c q u is it io n T im e ( s e c )
D a te
F ile N a m e
N u c le u s
P o in ts C o u n t
S w e e p W id t h (H z )
P O X I 0 9 0 0 1 /1 1 B - R a m o n O p . C h a r le s
4 0 0 .1 5
32768
D M S O -D 6
F r e q u e n c y (M H z )
O r ig i n a l P o in ts C o u n t
S o lv e n t
16
zg30
2 7 .0 0 0
2.490
3.329
3.703
3.823
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7.062
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7.279
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7.326
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8.328
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7.041
7.062
7.243
7.261
7.279
7.307
7.326
7.344
7.524
7.543
7.598
7.620
7.639
9.288
12.261
DMSO-d6
O 2N
1
5
4
2.03
7.8
7.7
7.6
2.25
2.20
7.5
7.4
7.3
Chemical Shift (ppm)
1.08
N
1.06
7.2
7.1
7.0
6.9
3
6'''
6.8
5'''
4'''
1.00
14
13
1.03
12
11
10
1.00
9
4.43
8
4.47
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
OH
2'' 3''
2' 1''
5'
1'''
N
1'
4''
6''
OCH 3
5''
2'''
3'''
6.53
7
Chemical Shift (ppm)
6
5
4
3
2
1
0
E.43- Espectro de RMN 1H do 2'-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18) (400 MHz, DMSOd6/TMS)
102
A c q u is itio n T im e (s e c )
D a te
F ile N a m e
0 .5 4 5 6
P O X I0 9 0 0 1 /1 0 A - R a m o n O p . R af a ella
C om m ent
2 3 M a r 2 0 1 1 1 0 :0 6 :5 6
C :\U s e rs \S in te s e 4 \D oc u m e n ts \R a m o n \D is s erta ç ã o d e M es trad o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P ro n to s p a ra T e s e \P oX I 0 9 0 0 1 -1 1 B C _ 0 0 0 0 0 1 r
F r e q u e n c y (M H z )
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
P o in ts C o u n t
S o lv e n t
T e m p e r a tu r e (d e g r e e C )
1 2 5 .7 6
2771
16384
D M S O -D 6
2 4 .9 0 0
13C
16384
zg p g 3 0
3 0 0 3 0 .0 3
N u c le u s
O r ig in a l P o in ts C o u n t
P u ls e S e q u e n c e
S w e e p W id th (H z )
39.996
39.835
39.660
39.500
39.325
39.165
39.004
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118.908
121.138
55.621
111.985
125.773
115.322
114.594
128.572
127.537
118.908
121.138
128.572
127.537
125.773
133.250
132.784
133.250
132.784
137.113
137.113
139.868
142.389
141.544
139.868
146.368
142.389
141.544
146.368
148.744
148.744
DMSO-d6
O 2N
1
5
4
N
3
6'''
5'''
4'''
150
168
160
145
152
140
144
E.44- Espectro de RMN
135
136
13
128
130
Chemical Shift (ppm)
120
112
125
120
104
96
115
110
88
80
Chemical Shift (ppm)
72
64
56
48
40
32
CH 3
OH
2
4' N 3'
N
OH
2'' 3''
2' 1''
5'
1'''
N
6''
1'
4''
OCH 3
5''
2'''
3'''
24
16
8
0
C do 2'-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (18) (125 MHz, DMSO-
d6/TMS
103
O2N
N
N
CH 3
OH
N
N
OCH 3
OH
NO 2
M/ESI (m/z)= 452,38
E.45- Espectro de massas do 2'-(4-hidróxi-3-metóxi-5-nitrofenil)-1-metil-5-nitro5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19)
E.46- Espectro no IV do 2'-(4-hidróxi-3-metóxi-5-nitrofenil)-1-metil-5-nitro-5'fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19)
104
A c q u is it io n T im e ( s e c )
3 .9 5 8 4
F ile N a m e
C :\U s er s \S in tes e 4 \D oc u m en ts \R am on \D is s er taç ã o d e M es tra d o\E S P E C T R O S \R M N \P O X I P r on to s p ar a T e s e\P O X I 0 6 \P O X I0 6 0 0 1 - 0 9 H _ 0 0 0 0 0 1 r
P O X I 0 6 0 0 1 /0 9 - R am on O p . C h a rles
C om m ent
3 1 M ar 2 0 1 1 0 9 :1 6 :2 8
D a te
F r e q u e n c y (M H z )
4 0 0 .1 5
N u c le u s
1H
N u m b e r o f T r a n s ie n ts
16
O r ig in a l P o in t s C o u n t
32768
P o in t s C o u n t
32768
P u ls e S e q u e n c e
zg30
S o lv e n t
D M S O -D 6
S w e e p W id th (H z )
8 2 7 8 .1 5
T e m p e r a t u r e (d e g r e e C ) 2 7 .0 0 0
-0.013
2.490
3.336
3.696
3.900
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7.325
7.307
7.279
7.262
7.245
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7.532
7.550
7.532
7.342
7.325
7.307
7.279
7.262
7.891
7.891
8.285
8.252
8.285
8.252
DMSO-d6
O2N
N
N
1.84
1.00
8.5
2.00
8.0
1.96
N
OCH3
OH
OH
N
1.02
7.5
CH3
NO2
7.0
Chemical Shift (ppm)
8.07
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
3.00
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
Chemical Shift (ppm)
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
E.47. Espectro de RMN 1H do do 2'-(4-hidróxi-3-metóxi-5-nitrofenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19) (400
MHz, DMSO-d6/TMS)
105
P O X I 0 6 0 0 1 /0 9 - R a m o n O p . C h a r le s
1 0 0 .6 2
16384
D M S O -D 6
56.413
113.629
114.735
116.102
118.212
34.460
F re q u e n c y (M H z )
O r ig in a l P o in t s C o u n t
S o lv e n t
9841
zgpg30
2 7 .0 0 0
125.907
127.464
113.629
128.482
114.735
132.701
116.102
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118.212
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125.907
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127.464
132.701
128.482
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140.091
141.590
136.527
137.022
139.742
144.674
140.091
141.590
144.674
149.824
149.824
133.152
0 .6 8 3 2
C om m en t
3 1 M a r 2 0 1 1 1 4 :0 9 :5 6
C :\ U s e r s \ S in te s e 4 \D e s k to p \P O X I0 6 0 0 1 - 0 9 C _ 0 0 0 0 0 1 r
13C
N u m b e r o f T r a n s ie n t s
16384
P u ls e S e q u e n c e
2 3 9 8 0 .8 1
T e m p e ra tu re (d e g re e C )
A c q u is it io n T im e ( s e c )
D a te
F i le N a m e
N u c le u s
P o in ts C o u n t
S w e e p W id t h ( H z )
O2N
N
N
CH3
N
OCH3
OH
OH
N
NO2
155
160
150
152
145
144
140
136
E.48- Espectro de RMN
128
135
130
Chemical Shift (ppm)
120
112
125
104
96
120
115
88
80
Chemical Shift (ppm)
13
110
72
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24
16
8
0
C do do 2'-(4-hidróxi-3-metóxi-5-nitrofenil)-1-metil-5-nitro-5'-fenil-1H,3'H-2,4'-biimidazol-3'-ol (19) (100
MHz, DMSO-d6/TMS)
106