UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA DE
CARNEIROS SANTA INÊS DURANTE O PRIMEIRO
ANO DE VIDA
DESENVOLVIMENTO TESTICULAR, PRODUÇÃO ESPERMÁTICA
E PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL
Carlos Eduardo Azevedo Souza
Médico Veterinário
FORTALEZA-CE
2003
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA DE
CARNEIROS SANTA INÊS DURANTE O PRIMEIRO
ANO DE VIDA
DESENVOLVIMENTO TESTICULAR, PRODUÇÃO ESPERMÁTICA
E PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL
AUTOR: CARLOS EDUARDO AZEVEDO SOUZA
ORIENTADOR: Prof° ARLINDO DE ALENCAR ARARIPE N. MOURA,
PhD.
Dissertação
apresentada
à
Coordenação do Programa de PósGraduação em Zootecnia, como prérequisito para obtenção do título de
Mestre em Zootecnia – Área de
Concentração: Reprodução de Ovinos.
FORTALEZA-CE
Janeiro de 2003
2
S714a Souza, Carlos Eduardo Azevedo
Avaliação da função reprodutiva de carneiros santa inês
durante o primeiro ano de vida: estudo do desenvolvimento
testicular, produção espermática e caracterização das
proteínas do plasma seminal. / Carlos Eduardo Azevedo
Souza– Fortaleza, 2003.
xxii, 160f.:il.
Orientador: Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe
Noronha Moura.
1. Ovinos - Puberdade 2. Ovinos - Sêmen. 3. Ovinos Plasma seminal de ovinos
CDD 636.38
Fi cha ca t alog rá fica pr epa ra da pela Se ção
de Ca taloga ção e cl assi fi cação da
Bi blio teca Central da UFC
3
Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestre em Zootecnia, outorgado pela
Universidade
Federal
do
Ceará,
e
encontra-se
à
disposição
dos
interessados na Biblioteca Central da referida Universidade.
A citação de qualquer trecho da dissertação é permitida, desde
que seja feita de conformidade com as normas da ética científica.
____________________________________________________
CARLOS EDUARDO AZEVEDO SOUZA
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 12/03/2003
____________________________________________________
Prof° Dr. ARLINDO DE ALENCAR ARARIPE N. MOURA
ORIENTADOR
____________________________________________________
Prof. Dr. AIRTON ALENCAR DE ARAÚJO
CONSELHEIRO (UECE/UFC)
____________________________________________________
Prof. Dr. JOSÉ TADEU OLIVEIRA
CONSELHEIRO (UFC)
4
EPÍGRAFE
“Apenas observando o que
vemos na natureza podemos
errar.
experimento
Somente
o
pode
nos
revelar a verdade.”
Galileu Galilei
5
Ao
grande
amor
da
minha
vida,
Alethéia, por todos os momentos bons e
ruins que passamos sempre unidos. Por
nunca me deixar desistir, mesmo diante
dos maiores obstáculos.
OFEREÇO
Aos meus pais Augusto e Fátima, e
minha querida avó Nair pelo apoio
para
superar
e
transpor
as
dificuldades que ocorreram durante
mais
uma
conquista.
Por
terem
sempre acreditado em mim, mesmo
quando eu mesmo duvidava.
DEDICO
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força que me impulsionou nunca deixando desistir.
Aos meus Pais (Augusto e Fátima) e irmãos (Lia, Rodrigo, Augusto Jr. e Ana), pela
compreensão e amor em todos os momentos de renúncia, ausência e impaciência.
À minha amada noiva e grande amiga Alethéia Carízia Baracho de Lima, pelo
companheirismo e amor imprescindíveis, estando sempre ao meu lado, mesmo nas
maiores turbulências. Que Deus possa abençoá-la em todos os seus desafios, pois, sem
seu apoio incondicional, a realização desse trabalho não teria sido possível.
Ao meu orientador prof. Arlindo Alencar Araripe Moura, pelos ensinamentos
profissionais e de vida que me foram passados.
Ao professor Airton Alencar Araújo, pela paciência e disponibilidade em colaborar com
esse trabalho.
Aos professores José Neuman Miranda Neiva e José Tadeu de Oliveira pelo grande
apoio neste desafio.
A todos os professores pelos conhecimentos, os quais posso me utilizar em favor dos
animais.
Aos meus amigos: Regiane Santos, Alexandre Rodrigues, Ana Kellen Lima, Noelita Melo,
Arnaud e Danielle Azevedo, Ana Cristina Holanda, Josefa Deis, Diones Oliveira Santos,
Almir Chalegre, Simone Aparecida e a todos com quem sempre pude contar.
À banca examinadora pela atenção dispensada na correção deste trabalho.
A todas as pessoas que estiveram comigo nesta longa jornada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia – UFC pela formação durante esse curso.
E a todos os animais, a quem prometo especial dedicação.
O meu sincero obrigado!
7
SUMÁRIO
Pági na
LISTA DE TABELAS .......................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS ....................................................................... x
LISTA DE ABREVIAÇÕES ........................................................... xiv
RESUMO ..................................................................................... xvii
ABSTRACT ................................................................................... xx
1 - INTRODUÇÃO ......................................................................... 01
2 - REVISÃO DE LITERATURA .................................................... 05
2.1. Desenvolvimento Testicular em Ovinos .......................................... 05
2.1.1. Estrutura Testicular ................................................................. 05
2.1.2. Cinética e Quantificação da Espermatogênese ............................ 08
2.2. Proteínas do Plasma Seminal ........................................................ 16
2.2.1. Proteínas Ligadoras de Fosfolipídeos ........................................ 18
2.2.2. Proteínas Ligadoras de Heparina .............................................. 20
2.2.3. Prostaglandina D Sintetase ....................................................... 23
2.2.4. Osteopontina ........................................................................... 26
2.2.5. Fosfolipase A2 ......................................................................... 29
2.2.6. Sistema Kalikreína-Cininas ....................................................... 30
2.2.7. Clusterina ............................................................................... 33
2.2.8. Lactoferrina ............................................................................ 36
2.2.9. Proteínas não identificadas ....................................................... 37
3 - MATERIAL E MÉTODOS ......................................................... 40
3.1. Localização do Experimento e Manejo dos Animais ........................ 40
3.2. Desenvolvimento Corporal e Testicular .......................................... 40
8
3.3. Estudo da Puberdade .................................................................... 41
3.4. Avaliação do Sêmen ..................................................................... 41
3.5. Determinação da Concentração de Testosterona no Plasma ............. 43
3.6. Avaliação das Proteínas do Plasma Seminal ................................... 44
3.6.1. Quantificação da Concentração de Proteína Total ....................... 44
3.6.2. Caracterização das Proteínas por PAGE-SDS ............................. 45
3.7. Avaliação Testicular .................................................................... 46
3.7.1. Avaliação Morfológica ............................................................. 46
3.7.2. Avaliação Histológica .............................................................. 46
3.8. Análise Estatística ....................................................................... 48
4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................. 50
4.1. Desenvolvimento Ponderal ............................................................ 50
4.1.1. Peso Corporal ......................................................................... 50
4.1.2. Perímetro Torácico .................................................................. 51
4.2. Biometria Testicular .................................................................... 52
4.2.1. Circunferência Escrotal ............................................................ 52
4.2.2. Comprimento e Diâmetro Testiculares ........................................ 56
4.2.3. Peso Testicular ........................................................................ 59
4.2.4. Volume Testicular .................................................................... 61
4.2.5. Densidade Testicular ................................................................ 62
4.3. Concentração Periférica de Testosterona ....................................... 63
4.4. Parâmetros Seminais .................................................................... 65
4.4.1. Volume Ejaculado .................................................................... 65
4.4.2. Motilidade Massal.................................................................... 67
4.4.3. Motilidade............................................................................... 68
4.4.4. Concentração Espermática ........................................................ 71
9
4.4.5. Patologias Espermáticas ........................................................... 73
4.5. Parâmetros Bioquímicos do Sêmen ................................................ 74
4.5.1. pH Seminal .............................................................................. 74
4.5.2. Proteínas Seminais Totais ......................................................... 76
4.5.3. Perfil Eletroforético do Plasma Seminal ..................................... 80
4.6. Puberdade ................................................................................... 84
4.7. Histologia Testicular .................................................................... 91
4.7.1. Biometria dos Túbulos Seminíferos ............................................ 91
4.7.2. Tipos Celulares ....................................................................... 93
4.7.3. Relações entre os Tipos Celulares ........................................... 100
4.7.4. Diâmetro dos Tipos Celulares ................................................. 102
4.8. Correlações ............................................................................... 104
4.8.1. Desenvolvimento Ponderal ...................................................... 104
4.8.2. Desenvolvimento Reprodutivo .................................................. 109
5 - CONCLUSÕES ....................................................................... 120
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................ 122
7 - ANEXOS ................................................................................ 159
10
LISTA DE TABELAS
Pági na
TABELA 1. Biometria testicular de carneiros da raça Santa Inês abatidos
às 50 semanas de idade .......................................................................... 63
TABELA 2. Parâmetros produtivos e reprodutivos de carneiros da raça
Santa Inês à puberdade .......................................................................... 86
TABELA 3. Número por seção transversal e por testículo e produção diária
de células germinativas de carneiros da raça Santa Inês abatidos às 50
semanas de idade .................................................................................. 95
11
LISTA DE FIGURAS
Pági na
FIGURA 1. Variação do peso vivo em função da idade, em carneiros da raça Santa
Inês....................................................................................................... 50
FIGURA 2. Variação do perímetro torácico em função da idade, em carneiros da raça
Santa Inês ............................................................................................... 51
FIGURA 3. Variação da circunferência escrotal em função da idade, em carneiros da
raça Santa Inês......................................................................................... 52
FIGURA 4. Variação do comprimento testicular em função da idade, em carneiros da
raça Santa Inês......................................................................................... 58
FIGURA 5. Variação do diâmetro testicular em função da idade, em carneiros da raça
Santa Inês ............................................................................................... 58
FIGURA 6. Variação da relação comprimento/diâmetro testicular em função da
idade, em carneiros da raça Santa Inês ........................................................... 59
FIGURA 7. Concentrações plasmáticas basais de testosterona em função da idade,
em ovinos da raça Santa Inês ....................................................................... 64
FIGURA 8. Volume ejaculado de sêmen colhido por eletroejaculação em função da
idade, em ovinos da raça Santa Inês............................................................... 66
FIGURA 9. Variação na motilidade massal do sêmen em função da idade, em
carneiros da raça Santa Inês......................................................................... 68
FIGURA 10. Variação na motilidade do sêmen em função da idade, em carneiros da
raça Santa Inês......................................................................................... 69
12
FIGURA 11. Variação na motilidade progressiva do sêmen em função da idade, em
carneiros da raça Santa Inês......................................................................... 70
FIGURA 12. Variação no vigor espermático em função da idade, em carneiros da
raça Santa Inês......................................................................................... 71
FIGURA 13. Variação na concentração espermática em função da idade, em
carneiros da raça Santa Inês......................................................................... 72
FIGURA 14. Variação no percentual de alterações morfológicas do sêmen em função
da idade, em carneiros da raça Santa Inês........................................................ 73
FIGURA 15. Variação no pH do sêmen em função da idade, em carneiros da raça
Santa Inês ............................................................................................... 74
FIGURA 16. Variação na concentração protéica do sêmen em função da idade, em
carneiros da raça Santa Inês......................................................................... 76
FIGURA 17. Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de
ovinos da raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A – G correspondem a
diferentes animais. H corresponde aos marcadores moleculares, variando de 10 a 250
kDa....................................................................................................... 80
FIGURA 18. Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de
ovinos da raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A e D correspondem a
animais com menor população de células de Sertoli. B, C, F e G são amostras
pertencentes àqueles animais com maior população destas células. H corresponde aos
marcadores moleculares, variando de 10 a 250 kDa. A seta corresponde à banda do
fragmento de 74,3 kDa............................................................................... 82
13
LISTA DE ABREVIAÇÕES
µg - micrograma
µl - microlitro
ABP – proteína ligadora de andrógenos
ACE – enzima conversora da angiotensina
BSA – albumina sérica bovina
BSP – proteína seminal bovina
C – concentração espermática
CE – circunferência escrotal
CES – ciclo do epitélio seminífero
cm - centímetro
CS – célula de Sertoli
CT – comprimento testicular
CT50 – comprimento testicular às 50 semanas
DHT - dihidrotestosterona
DT – diâmetro testicular
DT50 – diâmetro testicular às 50 semanas
DTM – diâmetro tubular médio
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
FAA – antígeno associado à fertilidade
FSH – hormônio folículo estimulante
g - grama
g/d – gramas por dia
GAG - glicosaminoglicanos
GnRH – hormônio liberador de gonadotrofinas
GSH - glutationa
HAP – proteína com afinidade pela heparina
HBP – proteína ligadora de heparina
HDL – lipoproteína de alta densidade
HE – hematoxilina-eosina
IA – inseminação artificial
14
IGF-I – fator de crescimento semelhante à insulina I
kDa - kiloDalton
kg - quilograma
L – comprimento tubular total
LF - lactoferrina
LH – hormônio luteinizante
mA - miliAmpere
ml - mililitro
MM – motilidade massal
MMP-2 – metaloproteinase 2 da matriz
MOP – motilidade espermática progressiva
MOT – motilidade espermática
mRNA – ácido ribonucléico mensageiro
N – contagem celular real
NC – contagem celular por secção transversal de túbulo seminífero
ng - nanograma
nm - nanômetro
NS – contagem de células de Sertoli por secção tubular transversal
NTS – população real de células de Sertoli
OPN - osteopontina
P – peso corporal
PA – peso ao abate
PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida
PB – proteína bruta
PCQ – peso de carcaça quente
PES – proteína epididimal específica
PGDS – prostaglandina D sintetase
pH – potencial hidrogeniônico
Pi – pontos de interesse
PLA2 – fosfolipase A2
PROT – concentração total de proteína no sêmen
PT – perímetro torácico
Pt – total de pontos
PV – peso vivo
15
RC – rendimento de carcaça quente
RCD – relação comprimento/diâmetro testicular
RIA - radioimunoensaio
rpm – rotações por minuto
RT-PCR – transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase
SDS – dodecil-sulfato de sódio
Sem. – semanas
SRD – sem raça definida
T - testosterona
TIMP-2 – inibidor tecidual da metaloproteinase 2
TS – secção transversal de túbulo seminífero
V - volt
VI – volume intersticial
Vt – volume do compartimento de interesse
VT – volume testicular
VTS – volume dos túbulos seminíferos
16
RESUMO
Este estudo teve como objetivos determinar as relações entre aspectos do
desenvolvimento testicular, concentrações de testosterona, produção espermática e a
expressão de proteínas no plasma seminal de carneiros da raça Santa Inês durante o
primeiro ano de vida, bem como parâmetros quantitativos da espermatogênese aos 12
meses de idade. Entre 8 e 48 sem. de vida, 16 animais foram mantidos em
confinamento, avaliando-se semanalmente o perímetro torácico (PT), a circunferência
escrotal (CE), o comprimento (CT) e diâmetro testiculares (DT) e o processo de
desprendimento entre o pênis e o prepúcio. Uma vez iniciado o desprendimento
peniano, os animais foram submetidos semanalmente a coletas de sêmen por
eletroejaculação e, com a produção dos primeiros espermatozóides, avaliou-se a
motilidade massal (MM), motilidade (MOT), motilidade progressiva (MOP), vigor,
concentração espermática e a percentagem de células com defeitos. Amostras de sêmen
também foram centrifugadas, separando-se o plasma seminal para determinação da
concentração protéica total e do perfil protéico através de eletroforese desnaturante em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Às 50 sem. de idade, os animais foram abatidos
(56,3 ± 3,5 kg) e amostras dos testículos, fixadas em fluido de Bouin para avaliação dos
túbulos seminíferos. O peso dos animais evoluiu de 12,3 ± 0,7 kg às 8 sem. para 54,3 ±
1,6 kg às 48 sem. e a CE, de 9,8 ± 0,5 para 32,1 ± 0,4 cm no mesmo período,
apresentando evolução significativa somente até as 36 sem. de idade. Às 50 sem., o peso
da carcaça quente foi de 24,5 ± 3,8 kg, correspondendo a um rendimento de 48,6% em
relação ao peso ao abate. As concentrações de testosterona elevaram-se gradualmente de
0,37 ± 0,07 ng/mL às 9 sem. para 1,35 ± 0,23 ng/mL às 32 sem. e atingiu um valor
máximo (2,99 ± 0,23 ng/mL) às 42 sem., mas com decréscimo após esta fase. Os
primeiros espermatozóides foram detectados no ejaculado, em média, às 23,05 ± 0,94
17
sem., mas os primeiros espermatozóides móveis, somente às 23,94 ± 0,98 sem. O
desprendimento entre o pênis e o prepúcio completou-se às 25,87 ± 0,72 sem. de vida.
Os valores relativos à motilidade espermática (MM, MOT, MOP e VIG) mostraram
uma fase de evolução rápida entre 18 e 30 sem. de idade, embora com maior
estabilização após esta idade. A concentração espermática só apresentou crescimento
significativo a partir de 30 sem., atingindo cerca de 1 x 109 células/mL entre 42 e 44
sem. de idade. O percentual de defeitos totais foi reduzido de cerca de 88% às 15 sem.
para aproximadamente 15% às 36 sem., mas com decréscimos graduais ainda após esta
idade. A concentração protéica total do plasma seminal elevou-se até às 48 sem., mas os
aumentos foram mais pronunciados entre 15 e 18 sem. (3,0 ± 0,0 para 14,2 ± 3,5
mg/mL) e entre 38 e 48 sem. (14,9 ± 1,2 para 19,95 ± 0,9 mg/mL). Com relação à
análise eletroforética unidimensional, uma ampla gama de proteínas foi detectada (de
5,9 a 170 kDa). Em todas as idades, as proteínas de massa molecular abaixo de 10 kDa
foram as mais abundantes e aquelas com massa molecular de 8,7 a 9,5 kDa; 16 a 16,6
kDa e 21 kDa estavam sempre presentes entre 15 e 33 sem. As proteínas com massa
molecular acima de 70 kDa apresentaram grande variação entre animais e entre idades.
No entanto, uma banda de 86 kDa foi detectada em animais a partir de 30 sem., quando
os parâmetros seminais começaram a apresentar melhoras significativas. Às 28 sem.,
animais com maior motilidade massal e motilidade progressiva (acima de 2,5 e 62%,
respectivamente) apresentaram uma banda de 64 kDa e, às 30 sem., essa proteína passou
a ser expressa por um maior número de animais, coincidindo com variações mais
significativas dos parâmetros seminais. Uma outra banda (74,3 kDa) foi secretada no
plasma seminal às 33 sem. apenas pelos animais que apresentavam maior população de
células de Sertoli por testículo. Às 50 sem. de idade, o epidídimo dos carneiros pesou
29,9 ± 1,2 g e o testículo, 191,2 ± 7,4 g. Os túbulos seminíferos representaram 79,7% do
volume do parênquima testicular e, para cada secção transversal de túbulo, observou-se
18
em média 1,4 ± 0,1 espermatogônias A1, 5,2 ± 0,6 espermatogônias B; 21,7 ± 1,8
espermatócitos em leptóteno; 44,9 ± 1,9 espermatócitos em paquíteno e 145,7 ± 7,1
espermátides arredondadas e 14,9 ± 0,4 células de Sertoli (SC). Os animais
apresentaram 7,7 x 109 SC por testículo e 41,05 x 106 células de Sertoli por g de
parênquima testicular. O peso vivo correlacionou-se com a CE até 42 sem. de idade (r =
0,58 a 0,86) e, entre 33 e 48 sem., com os pesos testicular (r = 0,49 a 0,63) e epididimal
(r = 0,50 a 0,55). A circunferência escrotal esteve correlacionada com a idade em que se
completou o desprendimento peniano (r = -0,43 a -0,93), com a idade em que surgiram
os primeiros espermatozóides no ejaculado (r = -0,48 a -0,93) e com vários parâmetros
seminais a partir de 26 sem. (r > 0,50). Às 50 sem., foram identificadas associações
significativas entre a população de células de Sertoli (r = 0,37 a 0,45) e germinativas (r
= 0,46 a 0,61) e medidas testiculares. Além disso, animais mais precoces apresentaram
melhor qualidade seminal e maior circunferência escrotal, mas as correlações
envolvendo as concentrações de testosterona foram expressivas somente em idades
próximas à puberdade. O aumento da concentração protéica no plasma seminal pode
está relacionado às diversas funções exercidas por essas proteínas na maturação
epididimal e metabolismo espermático.
19
ABSTRACT
This study was conducted to determine the relationships among testicular
development, blood testosterone concentrations, sperm production and the expression of
seminal plasma proteins in Santa Inês hairy sheep during the first year of life, as well as
the quantitative aspects of spermatogenesis at 12 months of age. Between 8 and 48 wk,
sixteen lambs were confined and submitted to weekly measurements of thoracic
perimeter (TP), scrotal circumference (SC), testicular length (TL) and diameter (TD), as
well as the detachment between penis and prepuce. Once this process started, the semen
of the rams was weekly collected by electroejaculation and, as sperm production started,
we evaluated wave (WM) and progressive motility (PM), vigor, sperm concentration
and the percentage of morphologically abnormal cells. Semen samples were also
centrifuged, and seminal plasma was obtained to determine its protein concentration and
to evaluate the electrophoretic profile in polyacrylamide gels (SDS-PAGE). At 50 wk,
rams were slaughtered (56.3 ± 3.5 kg) and testicular samples, fixed in Bouin’s fluid for
evaluation of seminiferous tubules. The body weight of the animals increased from 12.3
± 0.7 kg at 8 wk to 54.3 ± 1.6 kg at 48 wk. In the same period, SC also increased from
9.8 ± 0.5 to 32.1 ± 0.4 cm. These increases were significant only until 36 wk of age. At
50 wk, carcass weight was 24.5 ± 3.8 kg, yielding 48.6% of the slaughter weight.
Testosterone concentrations increased gradually from 0.37 ± 0.07 ng/ml at 9 wk to 1.35
± 0.23 ng/ml at 32 wk, reaching a maximum value of 2.99 ± 0.23 ng/ml at 42 wk,
decreasing after this phase. The first spermatozoa in ejaculate were detected, on
average, at 23.05 ± 0.94 wk, but the firs motile spermatozoa, only at 23.94 ± 0.98 wk.
Penis detachment was complete by 25.87 ± 0.72 wk of life. Values related to sperm
motility (WM, PM and vigor) showed rapid increases between 18 and 30 wk, tending to
show some stabilization thereafter. Sperm concentration increased significantly only
20
after 30 wk, reaching approximately 1 x 109 cells/ml between 42 and 44 wk. Total
sperm defects were reduced with age, from almost 88% at 15 wk to approximately 15%
at 36 wk, but with slower decreases, even after that age. Total protein concentration in
seminal plasma increased until 48 wk, but increases were greater between 15 and 18 wk
(3.0 ± 0.0 to 14.2 ± 3.5 mg/ml) and between 38 and 48 wk (14.9 ± 1.2 to 19.95 ± 0.9
mg/ml). A wide variety of proteins was detected in the electrophoretic profile (5.9 to
170 kDa). At all ages, proteins bellow 10 kDa were the most abundant, and those with
molecular weight of 8.7 to 9.5, 16-16.6 and 21 kDa were always present between 15 and
33 wk. Proteins with molecular weight higher than 70 kDa showed large variation
among ages and individuals. However, a protein of 86 kDa was detected in the seminal
plasma after 30 wk, when seminal parameters increased steadily. At 28 wk, rams with
higher wave and progressive motility showed a protein of 64 kDa. After 30 wk, this
protein was expressed by a higher number of animals, coinciding with and improvement
in the seminal parameters and was no longer exclusive of the best samples. Another
protein, of 74.3 kDa, was secreted in the seminal plasma at 33 wk, only in the animals
that possessed the highest population of Sertoli cells per testis. At 50 wk, the epididymis
and testis weighed 29.9 ± 1.2 g and 191.2 ± 7.4 g, respectively. Seminiferous tubules
represented 79.7% of testicular parenchymal weight and, on average, each cross section
had 1.4 ± 0.1 A1 spermatogonia, 5.2 ± 0.6 B spermatogonia, 21.7 ± 1.8 leptotene
spermatocytes, 44.9 ± 1.9 pachytene spermatocytes, 145.7 ± 7.1 round spermatids, and
149 ± 0.4 Sertoli cells (CS). Also, animals had 7.7 x 109 CS/testis and 41.05 x 106 CS
per gram of parenchymal weight. Body weight was correlated with SC until 42 wk of
age (r = 0.58 to 0.86) and, between 33 and 48 wk, with testicular (r = 0.49 to 0.63) and
epididymal (r = 0.50 to 0.55) weights. Scrotal circumference showed correlation with
the age when penis detachment was complete (r = -0.43 to -0.93), when the first sperm
appeared in ejaculate (r = -0.48 to -0.93) and with various seminal parameters after 26
21
wk (r > 0.50). At 50 wk, significant associations among Sertoli cell (r = 0.37 to 0.45)
and germ cell (r = 0.46 to 0.61) populations and testicular measurements have been
found. The most precocious animals showed better semen quality and higher scrotal
circumference, but correlations with testosterone concentrations were expressive only
close to puberty. The increase in seminal plasma protein concentration may be related to
the functions of those proteins in epididymal maturation and sperm metabolism.
22
1. INTRODUÇÃO
A população ovina brasileira está estimada em 15 milhões de cabeças
(FAO, 2001) e desse total, cerca de 8 milhões localizam-se no Nordeste
(IBGE, 2001). Dentre as raças ovinas criadas no Nordeste, a Santa Inês é a de
maior expressão, devido à capacidade de adaptação à região, porte e potencial
produtivo e tem sido utilizada como raça pura ou em cruzamentos industriais
(OLIVEIRA & LIMA, 1994; SOUZA JUNIOR, 2000). Nos sistemas de
produção, a eficiência reprodutiva é um dos fatores essenciais para a
lucratividade (MATOS et al., 1992) e, portanto, a produção de cordeiros
depende
da
fertilizante.
seleção
Desse
de
modo,
reprodutores
é
testados
importante
a
e
com
inclusão
alta
de
capacidade
características
reprodutivas dentre os parâmetros utilizados em sua seleção (ISLAM &
LAND,
1977)
A
circunferência
escrotal
destaca-se
por
apresentar
herdabilidade moderada a alta, podendo contribuir para um expressivo
melhoramento genético devido às suas correlações com a produção e
qualidade
do
sêmen,
níveis
hormonais
e
características
produtivas
e
reprodutivas (LÔBO et al., 1996; MARTIN et al., 1992; YARNEY et al.,
1990; OTT & MEMON, 1980).
Em ovinos, a circunferência escrotal apresenta correlações com a
produção espermática, capacidade de serviço e desenvolvimento sexual (OTT
& MEMON, 1980; YARNEY et al., 1990; SOUZA et al., 2001), comprimento,
largura e diâmetro testicular (SOUZA et al., 2001; MOURA et al., 1999;
SOUZA & COSTA, 1992; FREITAS et al., 1991), diâmetro dos túbulos
seminíferos, peso epididimal, (OSINOWO et al., 1992) Isto se deve, em parte,
ao fato de grande parte do volume testicular (aproximadamente 85%) ser
1
ocupada
pelos
túbulos
seminíferos,
responsáveis
pela
espermatogênese
(WROBEL et al., 1995).
Contudo, outros critérios além da circunferência escrotal devem ser
levados em consideração quando da avaliação reprodutiva do carneiro. A
análise da qualidade seminal é utilizada para definição de critérios mínimos
aceitáveis para a seleção de reprodutores. A motilidade e morfologia
espermática são as características seminais mais utilizadas para se avaliar o
potencial reprodutivo do macho (GODFREY et al., 1990; CORREA et al.,
1997). Entretanto, SMITH et al. (1981) não encontraram relação significativa
entre os parâmetros de avaliação da qualidade seminal individualmente e a
fertilidade a campo dos animais, indicando que esta deveria ser estimada pela
combinação de vários parâmetros. Ainda assim, estes parâmetros apresentam
capacidade limitada na avaliação do potencial reprodutivo (RODRIGUEZMARTINEZ & LARSSON, 1998; ZHANG et al., 1998; KJAESTAD et al.,
1993). A razão da limitação destes testes para se predizer a fertilidade de um
animal está relacionada ao fato de que estes exames não levam em
consideração a habilidade dos espermatozóides de sofrer alterações funcionais
importantes para o processo de fertilização (AMMAN & HAMMERSTEDT,
1993). Mesmo técnicas desenvolvidas mais recentemente como a análise
computadorizada do sêmen e o teste de integridade acrossômica usadas para
complementar à análise seminal não apresentam altas correlações com índices
de fertilidade (BUDWORTH et al., 1988; JANUSKAUSKAS et al., 2000ab).
Portanto, a observação de que reprodutores com circunferência
escrotal e características seminais semelhantes ainda podem apresentar
diferenças de 20 a 25% nos índices de fertilidade (LARSON & MILLER,
2
2000)
tem
estimulado
a
busca
por
outros
marcadores
de
fertilidade
(HENAULT & KILLIAN, 1996).
O
plasma
seminal
influencia
a
capacidade
fecundante
dos
espermatozóides. Seu conteúdo abrange secreções oriundas dos testículos,
epidídimos e glândulas sexuais acessórias (ampolas, glândulas vesiculares e
bulbo-uretrais) e serve como meio de transporte para os espermatozóides
durante a ejaculação e sobrevivência no trato genital feminino (EVANS &
MAXWELL,
1987),
previne
a
capacitação
espermática
prematura
(YANAGIMACHI, 1994) e protege as células espermáticas contra danos
peroxidativos (SCHÖNECH et al., 1996). Além do mais, o fluido seminal é o
meio natural para completar a maturação espermática através de processos
hormonais e enzimáticos (BARRIOS et al., 2000). Durante o trânsito
epididimário
proteínas
do
e
na
ejaculação,
plasma
seminal
os
que
espermatozóides
podem
adquirem
influenciar
sua
inúmeras
fertilidade
(YANAGIMACHI, 1994; KILLIAN et al., 1993; MILLER et al., 1990).
A influência potencial das proteínas seminais sobre a reprodução
chamou atenção devido a inúmeros estudos mostrando que sua expressão está
relacionada significativamente às taxas de não-retorno ao estro, classificação
andrológica (FOUCHÉCOURT et al., 2002; BRAUNDMEIER & MILLER,
2001; PARENT et al., 1999; BRANDON et al., 1999; CANCEL et al., 1998,
1999; GERENA et al., 1998; KILLIAN et al., 1993), capacidade dos
espermatozóides fertilizarem oócitos in vitro (HENAULT et al., 1995;
HENAULT & KILLIAN, 1996) e à motilidade espermática (AMMAN et al.,
1987; DIAMANDIS et al., 1999).
Contudo, a deficiência de índices reprodutivos confiáveis em rebanhos
Santa Inês dificulta a adoção desses parâmetros como critério para a seleção
3
de reprodutores. De fato, esta tem se dado, principalmente, baseada na
avaliação de padrões raciais de pelagem, tipo e conformação e, em alguns
casos, dados de ganho de peso. Dessa forma, um estudo detalhado do
desenvolvimento sexual e proteínas seminais destes reprodutores pode definir
critérios para seleção daqueles animais mais precoces e com melhor
fertilidade. Dado que parâmetros como a circunferência escrotal apresenta
alta herdabilidade e está relacionada com a fertilidade e idade à puberdade
das fêmeas, a seleção de melhores reprodutores também teria um efeito
positivo sobre a fertilidade do rebanho como um todo.
Nesse contexto, o conhecimento dos parâmetros de desenvolvimento
sexual e do perfil protéico do plasma seminal em fases reprodutivas críticas,
bem como suas associações, poderiam contribuir para sua utilização como
marcadores
moleculares
para
fertilidade,
auxiliando
na
seleção
de
reprodutores mais férteis na raça Santa Inês.
Portanto, os objetivos desse trabalho foram:
•
Determinar as relações entre a biometria testicular, puberdade,
concentrações basais de testosterona, produção espermática e
aspectos quantitativos da espermatogênese em carneiros da raça
Santa Inês durante o primeiro ano de vida;
•
Determinar, através de eletroforese em SDS-PAGE, a massa
molecular das proteínas do plasma seminal, verificando a
relação entre sua expressão e características reprodutivas.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Desenvolvimento Testicular em Ovinos.
2.1.1. Estrutura Testicular
As principais funções do testículo estão relacionadas à secreção
hormonal e espermatogênese. Esta última é um processo contínuo, que resulta
na produção diária de espermatozóides a partir das células-tronco da linhagem
germinativa, denominadas espermatogônias (CASTRO et al., 1997). Os
testículos passam da cavidade abdominal para a bolsa escrotal, onde se
mantêm a uma temperatura de 2 a 6°C abaixo da corporal, por volta dos 80
dias de prenhez nos ovinos (GIER & MARION, 1970; WAITES, 1970;
KASTELIC et al., 1996) e pesam cerca de 200 a 300 gramas em animais
adultos (0,7% do peso corporal), sendo cobertos por uma cápsula fibrosa
chamada tunica albuginia, que contém as artérias e veias testiculares
(AMMAN, 1970; EVANS & MAXWELL, 1987). Em seu interior localiza-se a
maior parte da massa testicular, composta por seu parênquima.
O parênquima testicular, do ponto de vista morfofuncional, divide-se
em dois compartimentos distintos. O primeiro deles é composto pelos túbulos
seminíferos, que ocupam de 85 a 86% do volume testicular ovino (QUEIROZ
& CARDOSO, 1989; WROBEL et al., 1995), os quais são estruturas
enoveladas contendo em seu interior o epitélio germinativo (SETCHELL,
1978). O outro compartimento consiste no espaço intertubular, composto por
tecido conjuntivo, onde se localizam os vasos sanguíneos, linfáticos, nervos e
as células de Leydig (SETCHELL, 1991).
5
O crescimento testicular em carneiros segue uma curva sigmóide, com
duas fases características (SALGUEIRO & NUNES, 1999; SOUZA et al.,
2001). Nas fases pré-púbere e púbere, a circunferência escrotal aumenta
rapidamente de tamanho (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1990; MOURA
et al., 1999; SANFORD et al., 2000), paralelamente ao peso do animal
(NOTTER et al., 1985; SOUZA et al., 2000), devido principalmente ao rápido
desenvolvimento do parênquima testicular (FRANÇA & RUSSELL, 1998). Por
outro lado, a fase de pós-puberdade é caracterizada por um lento crescimento
testicular, tendendo a estabilização (SOUZA et al. 2000).
O desenvolvimento e função do epitélio germinativo estão ligados ao
desenvolvimento da parte somática do testículo (HOCHEREAU-DE-REVIERS
et al., 1987), estando a taxa de crescimento testicular relacionada ao momento
em que as células de Leydig tornam-se funcionais. De fato, as células
somáticas são essenciais para a função normal do sistema reprodutivo
(RUSSELL et al., 1994). Em carneiros, o volume total de tecido intersticial
está correlacionado positivamente com a produção de células germinativas
seja por testículo ou por célula de Sertoli (HOCHEREAU-DE-REVIERS et
al., 1993). Já a população das células de Sertoli está relacionada ao tamanho
adulto dos testículos e à produção espermática (FRANÇA & RUSSELL,
1998).
Os cordeiros nascem com cerca de 250 x 10 6 células de Sertoli
indiferenciadas ou de pré-Sertoli por testículo (KILGOUR et al., 1998). Entre
o nascimento e a puberdade, este número aumenta cerca de 500%, e pode ser
influenciado por fatores tais como a raça do animal, estação de nascimento,
nutrição e ambiente hormonal (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987).
6
Entre duas e oito semanas de vida, o volume testicular de cordeiros é
de cerca de 1,5cm³, ocupado em cerca de 50% pelos túbulos seminíferos, os
quais apresentam um diâmetro médio de 50µm. O epitélio seminífero é
composto por células de Sertoli indiferenciadas e pré-espermatogônias I,
localizadas no centro dos túbulos seminíferos. Entre 8 e 13 semanas, o
volume testicular atinge 5cm³, com os túbulos ocupando ainda 50% do
volume, mas o diâmetro tubular mede cerca de 60µm (STEGER & WROBEL,
1996). As células de Sertoli indiferenciadas multiplicam-se, num processo
mediado pelo FSH (KILGOUR et al., 1998) e formam uma camada contínua
ao redor dos túbulos. As pré-espermatogônias I migram para a periferia dos
túbulos, e originam-se delas as primeiras pré-espermatogônias II (STEGER &
WROBEL, 1996).
No período compreendido entre 13 e 18 semanas de idade, o volume
testicular ultrapassa 15cm³, com cerca de 60% ocupados pelos túbulos
seminíferos. O diâmetro tubular evolui para 80µm. As células de suporte já
apresentam características típicas das células de Sertoli, e formam as
primeiras junções entre si, ainda incompletas (STEGER & WROBEL, 1996).
Por ocasião da puberdade, com aproximadamente 18 a 24 semanas, a
circunferência escrotal atinge cerca de 18 cm (SOUZA et al., 2001). O
volume testicular supera os 25cm³ e o diâmetro tubular ultrapassa 100µm,
ocupando cerca de 63% do volume da gônada. As células de Sertoli param de
multiplicar-se e se diferenciam (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987) e
suas junções intercelulares separam os compartimentos basal e adluminal. A
espermatogênese
inicia-se
nesta
fase,
com
a
formação
das
primeiras
espermatogônias A (STEGER & WROBEL, 1996).
7
A fase de pós-puberdade é caracterizada por um crescimento mais
lento da circunferência escrotal, tendendo a estabilização (YARNEY &
SANFORD, 1993; SOUZA et al., 2001). Esse crescimento lento se deve ao
fato de que mesmo após a maturidade sexual, os túbulos seminíferos ainda
apresentam pequenos crescimentos em seu comprimento (FRANÇA, 1987). O
volume testicular bem como o diâmetro tubular acompanha esse ritmo.
Contudo, os túbulos já ocupam seu volume adulto, cerca de 84 a 86% do
testículo (WROBEL et al., 1995; STEGER & WROBEL, 1996). As células de
Sertoli passam a ligar-se mutuamente, formando a barreira hemato-testicular e
participando dos eventos cíclicos do epitélio seminífero (RUSSELL et al.,
1990; STEGER & WROBEL, 1996). Correlação positiva e significativa foi
descrita entre o número total de células de Sertoli e de espermatogônias A1
por testículo (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987), confirmando que a
eficiência
da
produção
espermatogênica
é
estabelecida
no
início
da
os
fenômenos
espermatogênese (JOHNSON et al., 1994).
2.1.2. Cinética e Quantificação da Espermatogênese
Estudos
morfológicos
nos
permitem
compreender
fisiológicos a partir da associação entre forma e função. Apesar desta
associação ser mais nítida no âmbito macroscópico (BIELLI, 1999), como por
exemplo, a circunferência escrotal como indicadora da atividade testicular,
em nível histológico isto é menos evidente. A cinética espermatogênica
estuda o conjunto de processos citológicos e histológicos que ocorrem no
interior dos túbulos seminíferos (SANTOS, 1999). O conhecimento desta
8
cinética se mostra de grande importância para a caracterização da atividade
testicular de uma dada espécie.
A
espermatogênese
precisamente
é
sincronizado,
um
processo
através
do
qual
altamente
organizado
espermatogônias
e
diplóides
dividem-se por mitose para manter sua população e produzem ciclicamente
espermatócitos,
os
quais
sofrem
meiose
e
produzem
espermatozóides
haplóides (JOHNSON et al., 1991; SHARPE, 1994; JOHNSON et al., 2000), o
qual dura 49 dias em ovinos, iniciando-se após a puberdade (COUROT et al.,
1970).
A espermatogênese pode ser funcionalmente dividida em três fases: a
fase proliferativa, a meiose e a espermiogênese. A fase proliferativa, também
denominada espermatocitogênese, é aquela na qual as espermatogônias-tronco
sofrem
divisões
visando
repor
mitóticas,
sua
espermatogônias
A,
resultando
população,
as
e
quais
em
dão
se
outra
origem
espermatogônia-tronco
à
diferenciam
outra
em
população
de
espermatogônias
intermediárias e B, e originam espermatócitos primários tetraplóides em préleptoteno (COURTENS, 1983; RUSSELL et al., 1990; JOHNSON et al.,
2000).
Estes espermatócitos se proliferam e entram em divisão meiótica,
permitindo a troca de genes entre cromossomos homólogos, gerando,
sucessivamente
espermatócitos
arredondadas
haplóides.
arredondadas
se
Na
diferenciam
secundários
fase
em
diplóides
espermiogênica,
espermátides
e
espermátides
as
espermátides
alongadas,
envolvendo
achatamento nuclear, condensação da cromatina e paralisação da transcrição,
além do desenvolvimento do flagelo e formação do acrossoma a partir do
complexo
de
Golgi,
sendo
liberadas
no
lúmen
tubular
na
forma
de
9
espermatozóides (espermiação) (COURTENS, 1983; RUSSELL et al., 1990;
JOHNSON et al., 2000).
Durante a formação do acrossoma, o Complexo de Golgi, ao mesmo
tempo rico em glicosil-transferases (LETTS et al., 1974) e contínuo com o
retículo endoplasmático (HERMO et al., 1979) secreta numerosas vesículas
contendo grânulos de natureza glicoprotéica (SUZI et al., 1971), onde se pode
detectar a presença de galactose e fucose. As microvesículas se fundem para
formar uma vesícula pró-acrossômica limitada por uma membrana assimétrica
(MOLLENHAUER et al., 1976) contendo um grânulo acrossômico denso
(GURAYA, 1971) composto por enzimas, tais como acrosima, hialuronidase,
fosfatases, β-galactosidase e ativador do plasminogênio (CHANG et al., 1974;
KANNAN, 1974; BROWN, 1975; TAITZOGLOU et al., 2001).
No carneiro, as espermatogônias se dividem a cada 10,4 dias, e
poderiam gerar, oito dias depois, em teoria 64 espermatócitos I, cuja prófase
dura 14 dias. Estes entram em meiose, a qual dura cerca de 24 horas,
originando potencialmente 256 espermátides que gerarão, após 14 dias, igual
número de espermatozóides (COURTENS, 1983).
Entretanto, o rendimento máximo da espermatogênese depende da
população de células de Sertoli, a qual é definida entre 40 e 80 dias de idade,
antes da puberdade (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987; SHARPE,
1994). Uma vez cessada a replicação das células de Sertoli, a produção
espermática depende do número total de espermatogônias e do número de
gerações entre a primeira geração das espermatogônias e a formação dos
espermatócitos primários (COUROT et al., 1970). No carneiro, reconhecem-se
seis gerações de espermatogônias sendo três do tipo A, uma intermediária e
duas do tipo B. Entretanto, a perda de células germinativas pode chegar à
10
cerca de 50% em relação ao potencial de produção de espermatozóides no
carneiro (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1976; JOHNSON et al., 1991),
ocorrendo degeneração celular, principalmente por apoptose, principalmente
das espermatogônias e espermatócitos (BILLING et al., 1996; SANTOS,
1999; YOUNG et al., 2001).
Estas perdas relacionam-se principalmente a flutuações hormonais
decorrentes de alterações fotoperiódicas (LINCOLN, 1989; BILLING et al.,
1996; YOUNG & NELSON, 2001), sendo as mudanças na secreção de FSH as
mais importantes (FURUTA et al., 1994) ou de restrições alimentares
(NELSON et al., 1992). Além disso, a morte celular por apoptose é o
principal mecanismo de eliminação de células defeituosas no processo
espermatogênico (BILLING et al., 1996).
Ao avaliar-se uma seção de túbulos seminíferos, pode-se observar que
as células germinativas estão agrupadas em camadas, e que determinados
tipos celulares estão associados com outros, associações essas que aparecem
ciclicamente ao longo dos túbulos (RUSSELL et al., 1990). Essas associações
cíclicas de células germinativas morfologicamente integradas com as demais
são denominadas estágios do ciclo do epitélio seminífero (CES), que é
definido como uma série de associações celulares ordenadas que ocorrem num
dado segmento tubular (RUSSELL et al., 1990; SANTOS, 1999; JOHNSON et
al., 2000). Sendo um fenômeno temporal, a duração do CES pode ser estimada
em dias e mantém-se constante para uma dada espécie (SANTOS, 1999). No
carneiro, estudos têm mostrado que o CES dura cerca de 10,4 a 10,6 dias em
animais lanados (ORTAVANT, 1956; HOCHEREAU-DE-REVIERS et al.,
1964) e 10,5 dias em animais deslanados (CARDOSO & QUEIROZ, 1988).
11
ORTAVANT et al. (1977) dividiram o CES com base na meiose em
fase pré-meiótica, compreendendo os eventos ocorridos entre a espermiação e
a metáfase da primeira meiose, fase meiótica e fase pós-meiótica, incluindo
os eventos desde o final da meiose até a espermiação. A fase pré-meiótica,
ocupa cerca de 50% do CES em carneiros, enquanto a fase meiótica dura
apenas de 7 a 8% (ORTAVANT, 1956; CARDOSO & QUEIROZ, 1988).
Entretanto, a maneira mais usual de classificação do CES baseia-se na
avaliação morfológica das espermátides, especialmente seu núcleo (FRANÇA
& RUSSELL, 1998) juntamente com eventos meióticos, e resulta na divisão
do CES em oito estágios, senda a espermiação a divisora de dois ciclos
(WROBEL et al., 1995; JOHNSON et al., 2000).
No estágio 1, duas gerações de espermatócitos estão presentes.
Aqueles em pré-leptóteno são encontrados principalmente na região basal, e
também na região intermediária. Estas células apresentam inúmeras pontes
citoplasmáticas entre si, perdendo contato com a lâmina basal. Ultraestruturalmente pode-se observar inúmeras mitocôndrias e ribossomos livres.
O retículo endoplasmático rugoso é incomum, e composto de finos túbulos,
enquanto o complexo de Golgi consiste de lamelas e sáculos localizados na
região perinuclear. A região nuclear é caracterizada por heterocromatina de
padrão reticular, com um pequeno nucléolo. Elas apresentam um diâmetro
nuclear de 7,68 µm e volume celular de 622 µm³, constituindo cerca de 5% do
epitélio tubular (WROBEL et al., 1995).
Espermatócitos em paquíteno, maiores, com 1.943,43 µm³, cujo núcleo
mede
10,70µm.
Eles
estão
localizados
próximo
ao
lúmen
e
seu
desenvolvimento se dá durante a maior parte da prófase meiótica. Os volumes
citoplasmáticos e nucleares crescem continuamente. A cromatina distribuída
12
pelo núcleo, com pequenas quantidades de heterocromatina localizadas na
membrana
nuclear
endoplasmático
interna,
rugoso
forma
juntamente
cisternas
com
o
achatadas
nucléolo.
na
O
retículo
periferia
celular,
enquanto o retículo liso ocupa a maior parte do citoplasma restante, na forma
de túbulos interconectados. As mitocôndrias apresentam cristas aumentadas e
se agrupam em uma matriz intermitocondrial densa, enquanto o complexo de
Golgi também se desenvolve (WROBEL et al., 1995).
Por fim, uma geração de espermátides na fase cap está envolvida nos
processos laterais das células de Sertoli. Estas células mostram-se com núcleo
reduzido comparadas àquelas na fase de Golgi, com redução no número de
nucléolos. No fim dessa fase, o núcleo está periférico, com um grande
complexo de Golgi no pólo celular. As cisternas do retículo endoplasmático
liso se tornam vesiculares, com um conteúdo nevoado. Este estágio ocupa
cerca de 18% do CES, e o epitélio do túbulo mede cerca de 79µm (WROBEL
et al., 1995).
No estágio 2, o epitélio apresenta cerca de 17,4µm de espessura.
Espermatócitos em leptóteno, com o dobro do volume celular (1.303 µm³) e
nuclear (9,72µm) daqueles em pré-leptóteno, apresentam heterocromatina
concentrada em uma das metades do núcleo, e mitocôndrias ovóides isoladas,
com pequenos aumentos no retículo endoplasmático rugoso e complexo de
Golgi. Estas células atravessam a barreira hemato-testicular, e a primeira
geração de espermatócitos atinge o paquíteno.
As espermátides entram na fase acrossômica, e estão situadas nos
processos apicais das células de Sertoli, com seus acrossomas localizados
basalmente, iniciando o alongamento nuclear. Estas células continuam o
processo de polarização iniciado na fase cap. A manchete, uma estrutura
13
temporária que está relacionada ao intercâmbio de proteínas nucleares durante
as alterações nucleares, aparece no início dessa fase, e desaparece no final.
As mitocôndrias isoladas tendem a se agrupar, iniciando-se ainda os
processos
autolíticos
no
citoplasma,
com
uma
redução
do
volume
citoplasmático. Organelas, como o retículo endoplasmático e o complexo de
Golgi, perdem seu formato normal e se desintegram, havendo invasão de
extensões do citoplasma da células de Sertoli no citoplasma das espermátides
no final dessa fase (COURTENS & LOIR, 1981; WROBEL, 1995).
No terceiro estágio, aqueles leptótenos do estágio anterior atingem o
zigóteno, atravessando a barreira hemato-testicular e entrando na região
adluminal. Seu aspecto é muito parecido com o dos leptótenos, entretanto,
complexos sinaptonemais são observados, e persistem até o início do
diplóteno. O retículo endoplasmático rugoso desenvolve-se e suas cisternas
penetram
entre
lisossomais.
as
Estas
mitocôndrias
células
agrupadas,
medem
cerca
e
de
podem
10,03µm
ocorrer
e
corpos
1.360µm³,
respectivamente para o diâmetro nuclear e volume celular. Já os paquítenos
entram em diplóteno, as maiores células germinativas, atingindo 2.994µm³ de
volume celular. A distribuição de organelas e de cromatina são idênticas
àquela
dos
paquítenos,
com
um
diâmetro
nuclear
de
11,39µm.
As
mitocôndrias começam a isolar-se, liberando sua densa matriz no citoplasma
(WROBEL et al., 1995).
O estágio quatro compreende a fase de meiose, indo da metáfase da
primeira divisão meiótica até o final da segunda divisão. As células mais
comuns são espermatócitos secundários e espermátides arredondadas recémformadas. Os espermatócitos secundários têm vida breve e ocorrem apenas
nesse estágio. Seu volume celular (1.369,68µm³) e nuclear (342µm³) são
14
aproximadamente, a metade daquele dos diplótenos. A membrana nuclear
apresenta ligeiras protuberâncias características e o retículo endoplasmático é
abundante. As mitocôndrias apresentam cristas dilatadas distribuídas ao
acaso. Neste estágio, encontram-se ainda espermatócitos em final de zigóteno
ou início do paquíteno e espermátides alongadas (WROBEL et al., 1995).
Uma vez que os estágios 5, 6 e 7 apresentam curta duração e não
diferem significativamente entre si, foram agrupados em um só. Este estágio é
caracterizado por uma única geração de espermatócitos e duas gerações de
espermátides. As espermátides recém-formadas estão na fase de Golgi,
apresentando dimensões semelhantes às dos espermatócitos secundário, com
núcleo central e esférico. A cromatina apresenta-se granulada e com até três
nucléolos. O retículo endoplasmático liso predomina, formando túbulos
curtos, enquanto as mitocôndrias distribuem-se ao acaso. Já as espermátides
mais velhas estão em fase de maturação. Este fenômeno inicia-se no estágio 4
e vai até a espermiação. Ele envolve alterações, tais como o desenvolvimento
da peça intermediária, com mitocôndrias organizadas em 40 a 45 voltas em
espiral. O citoplasma é reduzido por um processo de autólise, acompanhado
por intensas alterações no núcleo (LOIR & COURTENS, 1979; WROBEL et
al., 1995).
Durante o estágio 8, ocorre a espermiação das espermátides maduras,
que marca o limite entre dois ciclos do epitélio seminífero. A geração de
espermátides jovens do estágio anterior entra na fase de cap, e os
espermatócitos encontram-se em paquíteno, e reinicia-se o ciclo no estágio 1
(WROBEL et al., 1995).
15
2.2. Proteínas do Plasma Seminal.
A disponibilidade de reprodutores testados, com elevado potencial
reprodutivo é essencial para garantir a eficiência reprodutiva e a produção de
crias. Nesse contexto, a busca por indicadores da fertilidade masculina tem
sido o foco de vários estudos conduzidos nos últimos anos. A avaliação da
motilidade e concentração espermática são freqüentemente utilizadas para
avaliar a qualidade seminal, mas fornece informações limitadas sobre sua
fertilidade em potencial (ELLIOT, 1978; GRAHAM et al., 1980; CORREA et
al., 1997; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ & LARSSON, 1998; ZHANG et al.,
1998; BRAHMKSHTRI et al., 1999). Outros critérios, como a análise
computadorizada do sêmen e a integridade acrossômica ajudam a estimar a
qualidade seminal e têm sido relacionadas às taxas de não retorno, mas as
correlações são baixas (BUDWORTH et al., 1988; KJAESTAD et al., 1993;
JANUSKAUSKAS
et
al.,
2000ab).
De
fato,
a
maioria
dos
atuais
procedimentos de análise seminal não consegue explicar toda a fertilidade em
potencial dos reprodutores, provavelmente porque eles não levam em
consideração
importantes
capacitação
espermática
etapas
e
HAMMERSTEDT,
1993).
inseminação,
apresentam
que
a
no
processo
reação
Reprodutores
parâmetros
de
fertilização,
acrossômica
pertencentes
seminais
a
como
a
(AMMAN
&
centrais
de
equivalentes,
ainda
apresentam diferenças de 20 a 25% nas taxas de não retorno ao estro, os quais
não podem ser explicados pelas análises seminais de rotina (LARSSON &
MILLER, 2000). Portanto, a existência de reprodutores sub-férteis que
apresentam quadro seminal normal é uma observação importante e tem
estimulado a busca por outros marcadores para a fertilidade.
16
O plasma seminal é fluido composto por secreções oriundas dos
testículos, epidídimos e glândulas sexuais acessórias (ampolas, glândulas
vesiculares e bulbo-uretrais), que influenciam a capacidade de fertilização
dos espermatozóides. Suas funções incluem o transporte dos espermatozóides
durante a ejaculação, ativação de espermatozóides imóveis, manutenção de
sua viabilidade no sistema reprodutivo feminino (EVANS & MAXWELL,
1987), prevenção de capacitação prematura (YANAGIMACHI, 1994) e
proteção das células espermáticas contra a peroxidação lipídica (SCHÖNECH
et al., 1996). Além disso, o fluido seminal é o fluido natural para a maturação
espermática,
mecanismos
que
ocorre
enzimáticos
ao
longo
e
do
trânsito
hormonais
epididimal,
(MILLER
et
através
al.,
de
1990;
YANAGIMACHI, 1994; LASSERRE et al., 2001).
A potencial influência das proteínas seminais sobre a fertilidade veio
à tona devido a estudos mostrando que sua expressão está relacionada,
significativamente, às taxas de não retorno ao estro (KILLIAN et al., 1993;
BRANDON et al., 1999; PARENT et al., 1999; BRAUNDMEIER & MILLER,
2001), taxas de penetração in vitro de oócitos (HENAULT et al., 1995;
HENAULT & KILLIAN, 1996) e mesmo à motilidade espermática (AMMAN
et al., 1987; DIAMANDIS et al., 1999).
Contudo, as proteínas seminais também podem apresentar efeitos
adversos sobre a qualidade seminal. A presença de proteínas de baixa massa
molecular no sêmen tem sido apontada como a causa para a baixa fertilidade,
em bovinos da raça Nelore (UNANIAN et al., 2001). Do mesmo modo, altas
concentrações de plasma seminal em diluidores têm se mostrado deletérias
para os espermatozóides sujeitos ao resfriamento e congelamento (PICKETT
et al., 1975; MARTINUS et al., 1991). Além disso, alguns componentes do
17
plasma seminal podem interferir com a capacitação espermática, reação
acrossômica ou enzimas acrossômicas antes da fertilização (BRANDON et al.,
1999).
Estas
proteínas
deletérias
podem
incluir,
entre
outras,
fatores
decapacitantes (ENG & OLIPHANT, 1978), fator anti-fertilidade humano
(AUDHYA et al., 1987) e seminalplasmina bovina (BHARGAVA, 1986). O
estudo dessas proteínas pode contribuir para uma melhor compreensão dos
processos fisiológicos
ligados
à
fertilidade
e
permitir
seu
uso como
marcadores moleculares, bem como para auxiliar a elaboração de diluidores
seminais mais eficientes.
2.2.1. Proteínas Ligadoras de Fosfolipídeos
A capacitação é um processo complexo que ocorre in vivo, após o
espermatozóide estar presente no trato genital feminino (MARTINEZ &
MORROS, 1996) e que envolve alterações bioquímicas e estruturais em sua
membrana, que incluem a perda de componentes adsorvidos, alterações em
sua composição lipídica e maior permeabilidade a íons (DE LAMIRANDE et
al., 1997; CROSS, 1998; VISCONTI & KOPF, 1998). Estas alterações
permitem a interação espermática com o oócito e a reação acrossômica
(THÉRIEN et al., 2001).
A perda de colesterol pela membrana espermática e uma redução na
proporção
colesterol:fosfolipídeos
estão
entre
as
principais
etapas
da
capacitação (EHRENWALD et al., 1988; THÉRIEN et al., 1998). O plasma
seminal contém proteínas ligadoras de fosfolipídeos, denominadas BSPs, que
são secretadas pelas vesículas seminais e são importantes para a capacitação
espermática (DESNOYERS et al., 1994). Elas são denominadas BSP A1/A2,
18
BSP A3 e BSP 30-kDa, com massas moleculares de 15, 16,5 e 28-30 kDa,
respectivamente.
Estas proteínas ligam-se a fosfolipídeos contendo colina presentes na
membrana espermática, especialmente a fosfatidilcolina, e estimulam a
liberação de colesterol e fosfolipídeos por um curto período após a
ejaculação, induzindo reorganização da membrana e aparecimento de novos
receptores para glicosaminoglicanos semelhantes à heparina (GAGs) ou HDL
na membrana espermática (THÉRIEN et al., 1998; 1999; MOREAU &
MANJUNATH, 1999; MANJUNATH & THÉRIEN, 2002).
No trato genital feminino, os espermatozóides são capacitados por
duas vias. Inicialmente, a ligação das BSPs à membrana espermática aumenta
o número de sítios de ligação para heparina, e os espermatozóides passam a
reagir com os GAGs (MILLER et al., 1990). Em seguida, os espermatozóides
interagem com a HDL, estimulando uma segunda liberação de colesterol,
alterando
a
proporção
entre
este
e
os
fosfolipídeos.
Esta
liberação
desestabiliza a membrana espermática e inicia vias de transdução que regulam
a expressão de receptores para proteínas da zona pelúcida na superfície
espermática, habilitando a reação acrossômica (BENOFF et al., 1993;
THÉRIEN et al., 1998). Os processos mediados pelas BSPs que levam à
capacitação
espermática
sugerem
que
diferenças
detectadas
em
suas
concentrações no plasma seminal podem influenciar a fertilidade. Entretanto,
correlações entre índices de fertilidade e concentração de BSPs ainda não
foram estabelecidas (NAUC & MANJUNATH, 2000).
19
2.2.2. Proteínas Ligadoras de Heparina
A heparina é um açúcar pertencente ao grupo dos GAGs, secretado no
trato genital feminino (LEE et al., 1985), sendo um dos mais potentes
indutores da capacitação espermática em bovinos (HANDROW et al., 1982;
MILLER & HUNTER, 1986), ligando-se aos espermatozóides por meio de
proteínas (NASS et al., 1990).
Proteínas ligadoras de heparina (HBPs) são secretadas pela próstata,
glândulas bulbo-uretrais e vesiculares no plasma seminal, sendo estas últimas
a principal fonte (MILLER et al., 1990). Estas proteínas não estão presentes
em espermatozóides epididimais (McCAULEY et al., 1996) e sua expressão é
dependente
de
andrógenos,
uma
vez
que
animais
castrados
reduzem
significativamente a secreção de HBPs, a qual é restaurada aos níveis iniciais
após reposição de testosterona (NASS et al., 1990).
Utilizando ensaios de ligação a heparina radioativa, MARKS & AX
(1985) observaram que espermatozóides oriundos de touros de alta fertilidade
possuem maior afinidade pela heparina que aqueles originados de touros de
baixa fertilidade, apesar dos dois grupos apresentarem o mesmo número de
sítios de ligação para heparina. Portanto, a afinidade, e não a presença da
HBP na membrana espermática, está relacionada ao potencial de capacitação
de reação acrossômica dos espermatozóides. Nesse contexto, cinco famílias de
HBPs com diferentes afinidades pela heparina foram identificadas (MILLER
et al., 1990). Entre elas, o complexo HBP-B5 é o que apresenta a maior
afinidade (BELLIN et al., 1994), sendo formado por múltiplas proteínas, com
massas moleculares de 31, 24 e 14 – 18 kDa (MILLER et al., 1990).
Em outro estudo, touros com circunferência escrotal e características
seminais equivalentes foram agrupados de acordo com a presença ou ausência
20
da HBP-B5 na membrana espermática ou no plasma seminal. Os animais
foram mantidos com as fêmeas por dois meses, e a taxa de prenhez foi
determinada 60 dias após o fim da estação de cobertura. Touros que
apresentavam o complexo HBP-B5 ligado à membrana espermática, contudo
não detectável no plasma seminal, apresentaram uma fertilidade 17% maior
que
aqueles
com
outros
perfis
de
HBP-B5
(BELLIN
et
al.,
1994).
Possivelmente, toda HBP-B5 anteriormente presente no plasma seminal ligouse com maior afinidade aos espermatozóides induzindo capacitação mais
eficiente. De fato, quando machos de parâmetros andrológicos e seminais
semelhantes são agrupados com base no conteúdo de HBP na membrana
espermática, pode-se detectar diferenças de até 40% nas taxas de prenhez
(BELLIN et al., 1996).
O antígeno associado à fertilidade (FAA) é um dos componentes do
complexo HBP-B5, com massa molecular de 31 kDa, é secretado pelas
glândulas vesiculares e próstata (BELLIN et al., 1998; McCAULEY et al.,
1999). Pesquisas mostraram que o FAA associado à membrana espermática
pode funcionar como marcador para fertilidade masculina, mesmo em machos
com idêntica capacidade de serviço, medida pelo número de ejaculações
aparentes, em touros expostos a novilhas em estro (BELLIN et al., 1998). Em
um estudo comparando taxas de prenhez ao primeiro serviço, fêmeas
inseminadas
com
sêmen
contendo
FAA
ligada
aos
espermatozóides
apresentaram taxa de prenhez 15,9% maior que aquelas inseminadas com
espermatozóides sem FAA (SPROTT et al., 2000). Independentemente da
idade ou raça, touros FAA positivos foram 9% mais férteis que touros FAA
negativos (BELLIN et al., 1998). Portanto, a determinação dos perfis de FAA
21
pode ser utilizada para identificar animais sub-férteis, não detectados durante
o exame andrológico ou testes de capacidade de serviço.
A concentração de outro componente do complexo HBP-B5, com
massa molecular de 24 kDa (HBP-24), também está relacionado à fertilidade.
Dados obtidos da mobilidade protéica em SDS-PAGE e homologia da
seqüência de aminoácidos permitiu a identificação desta proteína como o
inibidor tecidual de metaloproteinases 2 (TIMP-2) (CALVETE et al., 1996;
McCAULEY et al., 2001). Touros de maior fertilidade, definida como sendo o
número de vacas prenhes 60 dias após o início da estação de cobertura,
puderam ser discriminados daqueles de baixa fertilidade baseando-se na
presença de HBP-24 ligada aos espermatozóides (BELLIN et al., 1996; 1998),
mas as vias envolvidas na regulação da reprodução por essa via ainda não
estão esclarecidas (McCAULEY et al., 2001). Contudo, MÉTAYER et al.
(2002) relataram, recentemente, que o TIMP-2 é sintetizado pelo testículo e
está presente no fluido da cabeça do epidídimo do carneiro. Além do mais,
TIMP-2 parece ativar o precursor da “matrix metaloproteinase” 2 (MMP2),
que é uma das mais abundantes metalogelatinases presentes no epidídimo do
carneiro. A MMP2 é sintetizada no testículo, principalmente pelas células de
Sertoli, e é provável que atue no remodelamento da matriz extracelular
durante o desenvolvimento gonadal (ROBINSON et al., 2001). O TIMP-2
inibe a atividade da MMP2 (NAGASE & WOESSNER, 1999), mas o
significado deste fato em relação ao desenvolvimento testicular permanece
indeterminado.
Em bodes, proteínas com afinidade pela heparina (HAP) compõem 18 a
19% da quantidade total de proteína presente no plasma seminal e sua
expressão está relacionada à atividade sexual. Estudos associando SDS-PAGE
22
e cromatografia de afinidade mostraram que entre as HAP, uma banda de 178
kDa está presente apenas na estação sexual, enquanto uma de 119 kDa é a
mais abundante na estação não reprodutiva (LA FALCI et al., 2002). A HAP
de 178 kDa causou leve redução tempo e dose dependente na motilidade
espermática após 60 minutos de incubação, sem danos acrossômicos. Por
outro lado, a incubação de espermatozóides com a HAP da estação não sexual
causou perda total da motilidade após 5 minutos, com importante perda
acrossômica.
2.2.3. Prostaglandina D Sintetase
Duas proteínas
do plasma
seminal
foram detectadas
em maior
quantidade no sêmen de touros de alta fertilidade comparados com aqueles de
média e baixa fertilidade, utilizados em centrais de inseminação artificial
(IA) (KILLIAN et al., 1993). Neste estudo, os autores encontraram correlação
significativa (r = 0,89) entre a concentração dessas proteínas no plasma
seminal
e
a
fertilidade
de
machos
utilizados
em
pelo
menos
1.000
inseminações com sêmen congelado. Estas proteínas foram identificadas
através de eletroforese bidimensional, Western Blotting e sequenciamento
como sendo prostaglandina D sintetase GSH-independente (PGDS) (GERENA
et al., 1998) e osteopontina (OPN) (CANCEL et al., 1997). Em um estudo
conduzido em cavalos, BRANDON et al. (1999) também encontraram
correlações entre a densidade protéica do plasma seminal e índices de
fertilidade em quatro estações de cobertura sucessivas. Uma dessas proteínas
demonstrou homologia antigênica com a OPN.
A prostaglandina D sintetase (26 kDa) catalisa a isomerização da
prostaglandina H 2 a prostaglandina D 2 (URADE et al., 1985) e existe em duas
23
formas distintas (URADE & HAYAISHI, 2000a), uma necessitando de
glutationa, e a outra independente desta (URADE et al., 1987). Esta última é
membro da superfamília das lipocalinas, um grupo de proteínas que se liga e
transporta pequenas moléculas lipofílicas, como o retinol, progesterona e
feromônios do plasma ao trato reprodutivo, e através da barreira hematotesticular (PERVAIZ & BREW, 1987). Recentemente, FOUCHÉCOURT et al.
(2002) identificaram esta proteína no fluido epididimal do carneiro, com
cerca de 191 aminoácidos, com massa molecular de 21,1 kDa.
Estudos têm sugerido que a PGDS teria dupla função, funcionando
como enzima produtora de prostaglandina D 2 intracelular, e como lipocalina
após sua secreção no espaço extracelular e diversos fluidos corporais
(TANAKA et al., 1997; URADE & HAYAISHI, 2000b). No trato reprodutivo
masculino, a PGDS está presente nas células de Sertoli e Leydig, células
epiteliais do epidídimo e ampola de vários mamíferos, incluindo carneiro,
touro e cavalo (FOUCHÉCOURT et al., 1999; RODRIGUEZ et al., 2000a;
URADE & HAYAISHI, 2000b). Em touros, a expressão da PGDS foi
detectada apenas em túbulos contendo espermátides alongadas durante os
últimos estágios da espermatogênese, sugerindo que sua expressão varia
conforme o estágio do ciclo espermatogênico (GERENA et al., 2000;
RODRÍGUEZ et al., 2000a).
Em vista de sua localização no testículo e sua afinidade por
metabólitos da vitamina A (VAN PELT & DE ROOIJ, 1990; TANAKA et al.,
1997), a PGDS deve ter um papel crucial na espermatogênese. Em ratos, sua
expressão no testículo mostra um aumento dependente da idade, independente
do peso testicular. Utilizando técnicas de RT-PCR, SAMY et al. (2000)
observaram que, no testículo adulto, há um aumento de cerca de 40 vezes na
24
concentração de mRNA para PGDS comparado com testículos imaturos.
Observaram ainda que seu surgimento estava relacionado à produção dos
primeiros espermatozóides maduros.
As células de Sertoli expressaram cerca de três vezes mais PGDS que
as
células
germinativas,
relacionando-se
com
a
formação
de
junções
especializadas entre estas células e o estabelecimento da barreira hematotesticular, no início da puberdade. Apesar das células de Sertoli serem alvos
de
hormônios
hipofisários
e
esteróides,
FSH,
dihidrotestosterona
e
testosterona não mostraram efeito aparente na expressão de PGDS por essas
células. Os retinóides, contudo, induziram um aumento significativo em sua
expressão (SAMY et al., 2000).
Utilizando Northern Blotting e hibridização in situ, a expressão da
PGDS foi observada em células epiteliais da cabeça, corpo e cauda do
epidídimo em touros (RODRÍGUEZ et al., 2000a), mas ele mostrou-se mais
abundante nas células principais da cabeça (GERENA et al., 2000). Em
carneiros, PGDS mRNA foi detectado apenas na cabeça do epidídimo, e sua
secreção representou cerca de 25% da quantidade total de proteínas secretadas
no tecido. Semelhante ao encontrado em bovinos, sua quantidade é reduzida
progressivamente durante o trânsito epididimal, atingindo um valor 5 vezes
menor no fluido da cauda comparado àquele da cabeça, com alterações em
suas propriedades bioquímicas (FOUCHÉCOURT et al., 1999). Esta proteína
também é encontrada nos fluidos testicular e epididimal, e no plasma seminal
(GERENA et al., 1998). Nos espermatozóides, a PGDS se concentra no
segmento apical do acrossoma, e parece associar-se com a membrana
plasmática da cabeça do espermatozóide, uma vez que não é mais detectável
em espermatozóides bovinos após reação acrossômica (GERENA et al., 2000).
25
A castração induz redução na expressão da PGDS (FOUCHÉCOURT et al.,
1999), sugerindo que andrógenos influenciam esta proteína ao nível de
expressão gênica ou estabilidade do mRNA.
A relação da PGDS com a fertilidade masculina pode resultar de sua
habilidade
atravessando
em
as
funcionar
barreiras
como
transportador
hemato-testicular
e
lipofílico
intercelular,
hemato-epididimal.
A
localização específica da PGDS nas espermátides e células de Sertoli no
testículo, e nas células principais do epidídimo, especialmente no segmento
proximal da cabeça, sugere que ele pode ser importante no desenvolvimento e
maturação espermática (GERENA et al., 1998; 2000). Apesar da PGD 2
representar de 7 a 10% das prostaglandinas detectadas no epidídimo de
carneiros, sua produção se dá independentemente da presença de PGDS no
lúmen. Estes achados, juntamente com aqueles de que esta proteína é capaz de
se ligar ao ácido retinóico e à testosterona no fluido epididimal, sugerem,
conforme observado em touros, que a PGDS age no trato reprodutivo do
carneiro como uma lipocalina, envolvida na regulação do epitélio epididimal.
Contudo, como baixas concentrações de PGDS foram encontradas no sêmen
de carneiros com alta fertilidade, é possível que altas concentrações de PGDS
no trato genital masculino não sejam essenciais para sua função reprodutiva
(FOUCHÉCOURT et al., 2002).
2.2.4. Osteopontina
A osteopontina (OPN) é uma proteína altamente acídica (55 kDa), rica
em ácido aspártico, ácido glutâmico e serina (SORENSON & PETERSEN,
1994) e foi isolada inicialmente da matriz mineralizada de ossos bovinos
(FRANZEN & HEINEGARD, 1985). Estudos imunohistoquímicos localizaram
26
a OPN na superfície luminal das células epiteliais do trato reprodutivo
(BROWN et al., 1992), mas ela também está presente em fluidos biológicos,
como urina, leite e plasma seminal (SENGER et al., 1989; CANCEL et al.,
1997). Em média, a OPN é 2,6 vezes mais concentrada em animais de alta
fertilidade que naqueles de menos férteis (CANCEL et al., 1997). Este estudo
encontrou ainda uma associação (R²=0,48) entre a densidade desta proteína no
plasma seminal e a fertilidade de touros (taxa de não retorno ao estro em pelo
menos 1.000 IAs), um resultado semelhante ao encontrado por KILLIAN et al.
(1993).
Várias formas de osteopontina tem sido descritas, incluindo as formas
fosforilada e não fosforilada. A primeira está associada com a superfície
celular, enquanto a última está presente na forma solubilizada, sugerindo
diferentes funções para esta proteína (PATARCA et al., 1993). Em touros, a
OPN foi encontrada no plasma seminal, fluido das glândulas acessórias,
fluido da glândula vesicular e urina (CANCEL et al., 1999). Contudo, a OPN
é secretada apenas pelas ampolas e glândulas vesiculares, indicando que a
proteína encontrada no plasma seminal origina-se dessas glândulas. A
expressão da osteopontina foi encontrada primariamente nos túbulos contendo
espermátides
alongadas,
envolvendo
o
lúmen
do
epitélio
seminífero,
sugerindo que a expressão gênica da OPN, como o gene da PGDS, é regulada
pelo ciclo das células germinativas. No epidídimo, a osteopontina não foi
detectada nas células epiteliais de nenhum segmento, apesar de estar presente
nos espermatozóides em seu lúmen. Nas glândulas sexuais acessórias, sua
expressão
foi
observada
apenas
nas
células
epiteliais
da
ampola
(RODRÍGUEZ et al., 2000b).
27
Diferentemente dos achados de RODRÍGUEZ et al. (2000b), CANCEL
et al. (1999) não puderam demonstrar que a OPN liga-se aos espermatozóides
bovinos. Essas diferenças possivelmente devem-se a variações na detecção da
OPN e no estado funcional dos espermatozóides durante a maturação. É ainda
possível que a OPN se ligue fracamente aos espermatozóides, e seja retirada
durante o procedimento de lavagem. De fato, a relação entre a OPN no plasma
seminal e a fertilidade masculina pode ser indireta. Ela pode evitar a ligação
de bactérias ao epitélio reprodutivo, competindo pelos sítios de ligação das
integrinas que estão presentes nas células epiteliais, protegendo as glândulas
acessórias contra inflamações (BROWN et al., 1992; RODRÍGUEZ et al.,
2000b).
Considerando a função da OPN como molécula de adesão celular, é
possível que ela possa auxiliar na adesão das células germinativas em
desenvolvimento às células de Sertoli ou a outras células germinativas. A
osteopontina também pode estar envolvida na transferência de informação
entre células nos túbulos seminíferos. Uma vez que a OPN foi expressa
apenas
no
compartimento
adluminal
dos
túbulos
seminíferos
e
nos
espermatozóides localizados no epidídimo, esta proteína pode ainda estar
associada
com
o
desenvolvimento
das
espermátides
alongadas
e
dos
espermatozóides, influenciando a agregação de vesículas durante a formação
do acrossoma. Finalmente, é possível que mRNAs para osteopontina sejam
armazenados durante a espermatogênese para estar disponíveis para tradução
durante o desenvolvimento embrionário inicial (RODRÍGUEZ et al., 2000b).
28
2.2.5. Fosfolipase A2
Fosfolipases A2 (PLA2), de baixa massa molecular, são enzimas que
variam de 14 a 20 kDa, encontradas em fluidos corporais (DENNIS, 1994).
No trato reprodutivo, a PLA2 regula a maturação espermática e a reação
acrossômica (UPRETI et al., 1994), convertendo fosfolipídios em lisolipídios,
como a lisolecitina. Espermatozóides tratados com lisolecitina apresentam
fusão das membranas plasmática e acrossômica durante a reação acrossômica
(ROLDAN & FRAGGIO, 1993), um evento essencial para a fertilização. Estas
enzimas foram detectadas no sêmen de carneiros (ROLDAN & FRAGGIO,
1993), bodes (ATREJA & GANDHI, 1992) e touros (SOUBEYRAND et al.,
1997), próxima ao acrossoma (RIFFO & PARRAGA, 1996). No carneiro, há
baixos níveis desta proteína no plasma seminal, sugerindo que a PLA2
origina-se no epidídimo ou é liberada do espermatozóide (UPRETI et al.,
1999).
Em bodes, altas concentrações de PLA2 estão presentes no plasma
seminal durante a estação não reprodutiva, com forte afinidade por heparina.
Esta proteína pode estar relacionada à deterioração da qualidade seminal
quando se utiliza diluidores baseados em leite. Provavelmente, estes efeitos
deletérios estão relacionados com a hidrólise de fosfolipídeos da membrana
espermática pela PLA2 presente na fração protéica com afinidade pela
heparina (HAP). Este efeito é mais intenso na HAP da estação não
reprodutiva, em meio rico em fosfolipídeos, sugerindo que um modulador da
PLA2 pode estar presente no sêmen em diferentes concentrações conforme a
estação. Uma função para a PLA2 no plasma seminal na estação reprodutiva
poderia estar relacionada à capacitação espermática, uma vez que sua
29
modulação altera a fluidez da membrana espermática, o que constitui uma das
etapas da capacitação (LA FALCI et al., 2002).
2.2.6. Sistema Kalikreína-Cininas
Os componentes do sistema kalikreína-cininas melhoram a motilidade
de
espermatozóides
ovinos
e
bovinos,
a
fresco
ou
criopreservados
(BRATANOV et al., 1978ab). As cininas são os principais produtos deste
sistema e ativam a motilidade espermática após a ejaculação (SCHILL et al.,
1989). O plasma seminal contém cininogênio (FINK et al., 1990), o substrato
específico da kalikreína, cininas, o produto desta reação, e cininase, a enzima
inativadora das cininas (SCHILL et al., 1989). No trato reprodutivo
masculino, a principal fonte de kalikreína é a próstata (FINK et al., 1985),
mas seu exato significado fisiológico em mamíferos ainda não foi elucidado
(SOMLEV & SUBEV, 1997).
O plasma seminal bovino apresenta importante atividade de kalikreína,
que está significativamente associada a motilidade, mas não à concentração
espermática (SOMLEV et al., 1996), sendo a bradicinina que apresenta efeito
estimulatório sobre esta motilidade. Este efeito é mais pronunciado em
ejaculados
com
baixos
níveis
de
atividade
da
kalikreína,
devido
à
compensação no déficit de cininas. Nesse caso, a baixa atividade enzimática
leva
a considerável ativação dos
mecanismos reguladores da cinética
espermática causada pela proteína exógena (SOMLEV & HELILI, 1996;
SOMLEV & SUBEV, 1997). Contudo, a adição de maiores concentrações de
cininas aos espermatozóides acima da concentração ótima não leva a
posteriores aumentos na motilidade, indicando um efeito saturável (MISKA &
SCHILL, 1990).
30
A enzima cininase II é outro componente do sistema kalikreína-cininas
encontrado
identificada
no
plasma
como
seminal
enzima
(MISKA
conversora
et
da
al.,
1988).
Esta
angiotensina
1
enzima,
(ACE)
(HOHLBRUGGER et al., 1984) é secretada pelos testículos, epidídimos e
próstata (KRASSNIG et al., 1989) e é inespecífica com relação a seus
substratos. Além da angiotensina, ela hidrolisa outros peptídeos como a
bradicinina (BERNSTEIN et al., 1992), inativando seus efeitos biológicos.
Inibidores da ACE seminal aumentaram o poder estimulante da bradicinina
sobre a motilidade espermática, bloqueando a influência negativa da ACE.
Este efeito abre a possibilidade do uso prático dos inibidores da ACE em
centrais de IA (SOMLEV & SUBEV, 1998).
Atividade significativa da ACE tem sido relatada no trato genital de
mamíferos, especialmente no epidídimo (VINSON et al., 1997). A ACE
presente no plasma seminal do carneiro é secretada pelas células germinativas
e é liberada da membrana espermática ao longo do trânsito epididimal. Uma
vez no fluido, há uma redução em seu massa molecular de, aproximadamente,
105 kDa para 94 kDa, no fluido da junção entre cabeça e corpo epididimal,
sugerindo a perda de sua âncora na membrana (GATTI et al., 1999). De
acordo com esses estudos, utilizando 2D-PAGE, a ACE estava totalmente
ausente do fluido epididimal de carneiros azoospérmicos. É possível que esta
enzima atue na maturação espermática (KÖHN et al., 1998), evitando ativação
prematura da motilidade, mas isto ainda não foi confirmado.
A ACE existe em duas formas, uma somática (S) e outra testicular (T).
Camundongos knock-out para ambas enzimas (stst) apresentam prolificidade
muito baixa (KREGE et al., 1995). Menos de 5% dos ovos fertilizados pelos
espermatozóides destes animais desenvolveram-se até o estágio de 8 células,
31
comparado com mais de 65% em camundongos normais (STST), embora os
machos
knock-out
apresentassem
histologia
testicular,
concentração,
morfologia, viabilidade e motilidade espermática, reatividade acrossômica,
bem como critérios avaliados por análise computadorizada do sêmen como
velocidade linear, deslocamento lateral de cabeça e movimento espermático
comparáveis aos de machos normais. Contudo, os animais STST obtinham
concentração espermática no oviduto 1 hora após a cobertura muito maior que
os
animais
nas mesmas
knock-out
condições. In
vitro,
estes
animais
apresentaram número significativamente menor de espermatozóides ligados
por zona pelúcida que os animais STST.
Em outro estudo, com o objetivo de determinar as isoenzimas
importantes para a fertilidade, machos knock-out apenas para a isoenzima
somática (sTsT) foram produzidos, deixando a ACE testicular inalterada.
Nesse caso, a prolificidade foi equivalente àquela de animais normais, mas
significativamente maior que aquela de animais stst, mostrando que a
ausência da ACE somática não influencia a fertilidade. Já em animais knockout para uma alelo de cada isoenzima (stST), os espermatozóides st e ST são
funcionalmente idênticos. Apesar da ausência do gene para ACE testicular nas
células st, todas as espermátides maduras nesses machos contêm mRNA para
ACE testicular e a própria proteína, provavelmente devido às pontes
intercitoplasmáticas
entre
as
células
germinativas
em
desenvolvimento
(HAGAMAN et al., 1998).
DEMOTT et al. (1995) demonstraram que as alterações na membrana
espermática
durante
espermática
do
a
epitélio
capacitação
do
são
oviduto.
importantes
Desse
modo,
para
é
a
mediação
possível
que
32
espermatozóides de machos stst liguem-se ao epitélio do oviduto mas não
consigam desligar-se adequadamente devido à ausência da ACE testicular.
Em carneiros, a ACE seminal pertence a isoforma testicular liberada
no fluido epididimal (GATTI et al., 1999). A atividade seminal da ACE ovina
está relacionada significativamente com a concentração espermática do
ejaculado. Em um estudo a campo, carneiros de baixa fertilidade tenderam a
apresentar menor atividade da ACE que aqueles de alta fertilidade. Nesse
caso, as ovelhas foram inseminadas cervicalmente e o índice de fertilidade foi
determinado como a proporção de ovelhas que pariram em relação ao número
total de fêmeas inseminadas. Os machos com maior atividade de ACE seminal
emprenharam significativamente mais fêmeas que aqueles com mais baixa
atividade, confirmando os estudos in vitro, sendo a atividade epididimal da
ACE zinco, cloreto e pH dependente (MÉTAYER et al., 2001). Baseando-se
nesses achados, pode-se inferir que a atividade da ACE testicular está
relacionada a alguns parâmetros de qualidade seminal importantes para a
fertilidade.
2.2.7. Clusterina
A clusterina é uma glicoproteína presente em inúmeros tecidos e
fluidos fisiológicos, como o leite e o sêmen (WATTS et al., 1990; KOUNNAS
et al., 1995), tendo sido isolada, pela primeira vez, do fluido da rete testis de
carneiros. Esta proteína tem seu nome devido à sua habilidade de causar
agregação
celular
distribuição,
a
(BLASCHUK
clusterina
tem
et
sido
al.,
1983).
implicada
Devido
em
à
vários
sua
ampla
fenômenos
fisiológicos. Algumas de suas funções incluem interações intercelulares,
maturação espermática, regulação da ativação do sistema complemento,
33
metabolismo de lipídeos, secreção endócrina e remodelamento da membrana
celular (FRITZ et al., 1983; JENNE & TSCHOPP, 1989; DE SILVA et al.,
1990; SYLVESTER et al., 1991; TENNISWOOD et al., 1992; BAILEY &
GRISWOLD, 1999; HUMPHREYS et al., 1999).
No trato reprodutivo, a clusterina foi encontrada na próstata, glândulas
vesiculares, testículo, espermatozóides luminais e epidídimo (SENSIBAR et
al., 1993; BAILEY & GRISWOLD, 1999; BRAUNDMEIER & MILLER,
2001). No epidídimo há um aumento em sua concentração na cabeça,
decrescendo progressivamente até a cauda. Esta proteína representa 1,5% do
total de proteínas no fluido luminal do segmento proximal da cabeça, 6% no
segmento médio e 7% no segmento distal. No fluido do corpo, constitui
13,5%, e 9,2% no fluido da cauda, com sua concentração variando de 3,9 a
4,8 mg/mL. A clusterina é uma das proteínas mais abundantes no epidídimo,
podendo compor até 24,8% da secreção epididimal total (FOUCHÉCOURT et
al., 2000). Esta proteína associa-se tão fortemente à membrana espermática,
que é necessário o uso de detergentes para removê-la (LAW & GRISWOLD,
1994; BAILEY et al., 2001). Devido à essa associação, sugere-se que sua
concentração está relacionada à qualidade seminal, mas os resultados de
estudos são
contraditórios. Pacientes
humanos
com oligozoospermia
e
azoospermia apresentam menores concentrações seminais de clusterina,
explicando, talvez, porque maiores concentrações seminais desta proteína
estejam associadas com maior taxa de sucesso na fertilização in vitro (CHOI
et al., 1990; O’BRYAN et al., 1990). Contudo, sêmen de touros que possuem
muitos espermatozóides ligados a clusterina atingem menor fertilidade,
determinada pela taxa de não retorno ao estro, bem como apresentaram maior
percentual de anormalidades morfológicas, um indicador de problemas na
34
espermatogênese ou maturação epididimal (IBRAHIM et al., 2000). De fato,
apesar de promissora, o uso da clusterina seminal como marcador molecular
para fertilidade ainda depende de
maiores estudos para elucidar
seu
mecanismo de ação.
A clusterina é induzida em resposta ao dano celular e é sintetizada,
principalmente, pelas células que sobrevivem a apoptose ou por aquelas
próximas daquelas que iniciam o processo. Esta proteína parece ligar-se a
moléculas hidrofóbicas
celulares
potencialmente
como um mecanismo de eliminar componentes
danosos
durante
a
degeneração
das
células
germinativas (CLARK et al., 1997; BAILEY & GRISWOLD, 1999). A
clusterina pode inibir também a precipitação protéica induzida pelo estresse.
Este achado apóia a hipótese de que a clusterina expressa durante o estresse
celular age como chaperone, ou seja, liga-se a proteínas parcialmente
desestruturadas,
solubilizando-as
e
protegendo
as
células
dos
efeitos
citotóxicos da precipitação protéica. A clusterina pode ser a primeira
chaperone identificada em mamíferos (MICHEL et al., 1997; HUMPHREYS
et al., 1999; WILSON & EASTERBROOK-SMITH, 2000). Estes achados,
junto com as observações de que a expressão da clusterina está limitada às
células de Sertoli e, no epidídimo, ela está uniformemente presente nas
células epiteliais levou ARONOW et al. (1993) a apontar que essa proteína
participaria na proteção das membranas celulares expostas a moléculas
hidrofóbicas potencialmente tóxicas nas barreiras fluido-teciduais.
A associação da clusterina com o complexo de ataque a membranas
sugere que ela modula danos mediados pelo complemento, uma vez que ela
liga-se a complexos terminais do complemento, prevenindo sua inserção nas
membranas celulares. Os complexos resultantes são solúveis e incapazes de
35
induzir
lise
celular.
espermatozóides
no
Isto
trato
pode
ser
importante
reprodutivo
para
feminino
a
proteção
(ROSENBORG
dos
&
SILKENSEN, 1995; MERI & JARVA, 2001). Apesar da clusterina apresentar
várias funções, em vários tecidos e fluidos biológicos, ainda não foi
determinado se esta proteína apresenta um mecanismo de ação comum. Desse
modo, a compreensão desse mecanismo é importante para o desenvolvimento
de ensaios para a clusterina e seu uso como marcador para fertilidade.
2.2.8. Lactoferrina
Uma das proteínas do plasma seminal envolvidas na manutenção da
motilidade espermática é a lactoferrina (Lf). Ela está presente também em
outros fluidos corporais, como leite (MASSON & HEREMANS, 1971),
lágrima (GACHON et al., 1982) e fluido amniótico (NIEMELA et al., 1989).
A Lf liga-se ao ferro iônico e pode participar de atividades anti-microbianas,
diferenciação celular e regulação gênica (FURMANSKI, 1995; NOZAKI et
al., 2002), muito embora sua principal função esteja relacionada com o
transporte e armazenagem de ferro durante a lactação (SORRENTINO et al.,
1999).
No trato genital masculino, a lactoferrina é um dos principais
componentes
do
fluido
epididimal,
estando
em
contato
com
os
espermatozóides durante o armazenamento na cauda do epidídimo (ARAÚJO,
2000). No fluido epididimal do garanhão, ele constitui cerca de 60% das
proteínas no corpo (15 mg/mL) (DRUART, 1998; FOUCHÉCOURT, 1999;
FOUCHÉCOURT et al., 2000). Esta proteína liga-se aos espermatozóides
durante o trânsito epididimal (JIN et al., 1997) ou após a ejaculação. No
plasma seminal, esta ligação ocorre na presença de fatores de ligação
36
(THALER et al., 1990). No trato genital feminino, a Lf é progressivamente
liberada da superfície espermática após a penetração no muco cervical (JIN et
al., 1997), mas sua exata função nesse contexto ainda é desconhecida.
Recentemente, ARAÚJO (2000) mostrou o efeito benéfico da Lf sobre
a motilidade espermática, percentual de espermatozóides móveis e freqüência
de batimento flagelar in vitro em carneiros. Este efeito é dose dependente e
menos pronunciado na percentagem de espermatozóides móveis. A presença
desta proteína no diluidor seminal permite uma melhor manutenção dos
parâmetros citados acima. Possivelmente, este efeito esteja relacionado à
habilidade da lactoferrina em se ligar ao ferro, evitando a produção de
radicais livres, levando a peroxidação e danos à membrana espermática,
funcionando, desta forma, como um antioxidante, do mesmo modo que outras
proteínas epididimais (WAKABAYASHI et al., 1999).
2.2.9. Proteínas Não Identificadas
O plasma seminal contém muitos compostos bioquímicos importantes
para a motilidade e viabilidade espermática no carneiro (ASHWORTH et al.,
1994; GRAHAM, 1994; MAXWELL et al., 1997) que melhoram a resistência
de espermatozóides suínos ao choque térmico (BERGER & CLEGG, 1985).
Além do mais, as membranas dos espermatozóides ovinos são menos
resistentes ao choque térmico comparado a outras espécies (FISER &
FAIRFULL, 1989). Estudos demonstraram que grande quantidade de proteínas
do
plasma
seminal
são
adsorvidas
pelo
espermatozóide,
promovendo
alterações em sua superfície e, especialmente no carneiro, elas são capazes de
reverter danos à membranas causados pelo choque térmico (GARCIA-LÓPEZ
et al., 1996; OLLERO et al., 1997). De fato, as proteínas do plasma seminal
37
ovino podem melhorar significativamente a sobrevivência e o percentual de
espermatozóides com membrana intacta sujeitos ao choque térmico. Este
efeito benéfico foi aumentado pela adição de ácido oléico/linoléico ou
vitamina E (PÉREZ-PÉ et al., 2001). Concordando com esses achados,
aproximadamente 65% dos espermatozóides ovinos danificados pelo choque
térmico tiveram sua membrana restaurada após incubação com 1,4 mg de
proteínas do plasma seminal. A proporção de células restauradas foi
dependente da concentração de proteínas no meio, sugerindo que o plasma
seminal é muito importante na determinação da qualidade do ejaculado
(BARRIOS et al., 2000).
No touro, RONCOLETTA et al. (1999), através de SDS-PAGE,
encontraram uma banda com 61,8 kDa e mobilidade relativa de 20,3 que
estava presente no sêmen de reprodutores de alta congelabilidade e sempre
ausente naqueles de baixa fertilidade, mostrando que alguns componentes
protéicos do plasma seminal podem melhorar a crioresistência espermática.
Em caprinos, estudo recente demonstrou que a motilidade espermática
foi significativamente melhorada quando o plasma seminal estava presente no
meio, tanto em sêmen a fresco ou descongelado. Além disso, a remoção do
plasma seminal aumentou o percentual de espermatozóides com a membrana
danificada (AZEREDO et al., 2001). Outro estudo, realizado por MAXWELL
et al. (1999) mostrou que a suplementação de espermatozóides ovinos
descongelados com plasma seminal aumentou significativamente as taxas de
prenhez e prolificidade de ovelhas inseminadas cervicalmente a um nível
semelhante àquelas inseminadas intra-uterinamente. A cérvix da ovelha age
como uma barreira aos espermatozóides, especialmente aos danificados.
Considerando
que
o
processo
de
congelamento
danifica
a
membrana
38
espermática, e reduz sua habilidade de ultrapassar a cérvix, a IA cervical co m
sêmen descongelado em ovelhas resulta em taxas de concepção muito baixas
(MAXWELL et al., 1999), impondo dificuldades à expansão da IA em ovinos.
Estes resultados mostram-se muito importantes para a indústria da IA, porque
indicam, pela primeira vez, que índices de fertilidade semelhantes aos obtidos
com inseminação intra-uterina podem ser obtidos pela via cervical com sêmen
descongelado.
39
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Localização do experimento e Manejo dos Animais
O experimento foi conduzido no Núcleo de Estudos em Forragicultura,
pertencente ao Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará
(UFC), situado a 3°45’ de latitude Sul e 38°32’ de longitude Oeste, co m
altitude média de 15,5m acima do nível do mar.
Foram utilizados dezesseis cordeiros machos da raça Santa Inês, com
8,00 ± 0,13 semanas de idade. Os animais foram mantidos em confinamento
até os 12 meses de idade, alimentados com feno de tifton (11% PB) e capimelefante (4% PB), fornecidos para uma sobra de 10 a 15% do total ofertado, e
suplementação concentrada (18% PB – Ovinotech, Purina ® ) segundo os
requerimentos do NRC (1985), tendo acesso livre à água e mistura mineral
(Purinafós 65 Ovinos Plus, Purina ® ).
3.2. Desenvolvimento Corporal e Testicular
Semanalmente, a partir de oito semanas de vida, avaliou-se o peso vivo
(PV), perímetro torácico (PT), circunferência escrotal (CE), comprimento
(CT) e diâmetro testiculares (DT). O PT foi medido com auxílio de fita
métrica e tomado na região imediatamente caudal às espáduas.
A medida da CE foi tomada também com fita métrica, na parte inferior
da bolsa escrotal, em sua região mais larga (MARTINS FILHO, 1991), com os
testículos tracionados para baixo, a fim de evitar uma medida superestimada.
40
Utilizando-se um paquímetro, determinou-se a medida dos dois testículos
na posição dorso-ventral (CT), desprezando-se a cauda do epidídimo e médiolateral (DT), obtendo-se a média dos dois testículos em cada período. Estas
medidas serviram para o cálculo da relação comprimento-diâmetro (RCD) nas
várias idades estudadas.
Às 50 semanas de idade, os cordeiros foram abatidos segundo métodos
recomendados pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento (BRASIL,
1980). Os animais foram insensibilizados por concussão cerebral, sangrados,
esfolados e eviscerados, pesando-se a carcaça para estudo de rendimento.
Foram determinados o peso ao abate (PA), o peso de carcaça quente (PCQ) e
o
rendimento
de
carcaça
( RC =
PCQ
x100 ),
PA
logo
após
a
evisceração
(OLIVEIRA et al., 2002).
3.3. Estudo da Puberdade
Nos mesmos períodos de mensuração da circunferência escrotal, avaliouse o grau de desprendimento entre a parte livre do pênis e a mucosa do
prepúcio, baseando-se em uma escala de 0 (completamente ligado) a 5
(totalmente livre), conforme WIGGINS & TERRIL (1953). O animal foi
considerado púbere quando apresentava o pênis totalmente desprendido.
3.4. Avaliação do Sêmen
Logo que iniciado o desprendimento peniano, amostras de sêmen foram
colhidas semanalmente por eletroejaculação, objetivando determinar a idade
em que aparecem os primeiros espermatozóides e o início da motilidade no
ejaculado, bem como as associações entre os parâmetros seminais e as demais
41
características estudadas. O procedimento de eletroejaculação consistiu na
inserção de um eletrodo bipolar, lubrificado com vaselina, no reto do animal,
a uma profundidade de 15 a 20 cm, tomando-se a precaução de evitar danos à
mucosa retal. O eletrodo foi direcionado para o assoalho pélvico e foram
aplicados curtos estímulos (3 a 7 segundos) a intervalos de 15 a 20 segundos,
com intensidade média de 15V até a ejaculação, evitando-se desconforto
desnecessário ao animal (CAMERON, 1977).
Após limpeza do prepúcio, o sêmen foi colhido em um copo coletor
graduado acoplado à abertura prepucial para avaliação do volume ejaculado e
motilidade massal (MM), motilidade (MOT), motilidade progressiva (MOP), e
vigor dos espermatozóides. Nesta fase, o pH do ejaculado também foi
determinado utilizando tiras reagentes (MERCK ® ).
A motilidade massal é o movimento em massa dos espermatozóides no
plasma seminal, assemelhando-se a ondas do mar (NUNES et al., 1997) e é
resultante da interação entre a motilidade e a concentração espermática
(WENKOFF, 1988). Imediatamente após a colheita do sêmen, ela foi avaliada
em uma gota de 50 µL de sêmen puro, sem lamínula, onde se arbitrou uma
nota subjetiva numa escala de 0 a 5, de acordo com a intensidade do
movimento dos espermatozóides, em microscopia óptica com aumento de
100X (SALAMON, 1976).
A motilidade foi avaliada no sêmen diluído 1:10 em solução salina
(0,9%), sob lamínula, em diversos campos, e representa a percentagem de
espermatozóides móveis, enquanto a MOP refere-se àqueles com motilidade
progressiva retilínea. Estes parâmetros foram avaliados em microscopia
óptica, sob aumento de 400X. O vigor, por sua vez, representa a intensidade
42
da movimentação dos espermatozóides, sendo avaliado numa escala subjetiva
de 0 a 5 (NUNES, 1982; FONSECA et al., 1992).
A concentração espermática foi determinada através da contagem dos
espermatozóides em uma câmara de Neubauer (CHEMINEAU et al., 1991),
utilizando-se uma diluição seminal de 1:400 em solução formol-salinatamponada (EVANS & MAXWELL, 1987).
Após a colheita, foram confeccionados esfregaços seminais corados com
eosina-nigrosina (COLAS, 1980), onde se determinou a percentagem de
espermatozóides com defeitos totais e de cabeça, peça intermediária, cauda e
gotas proximais e distais. Foram contadas 200 células por esfregaço/coleta em
aumento de 1000X.
3.5. Determinação da Concentração de Testosterona no Plasma Sanguíneo
Amostras de sangue foram colhidas em tubos a vácuo (5 mL) contendo
EDTA nas fases de pré-puberdade (3 meses de idade), puberdade (5 e 6
meses) e pós-puberdade (8, 10 e 12 meses) através de punção da veia jugular.
Foram obtidas três amostras por animal, a intervalos de 30 minutos,
iniciando-se a coleta sempre entre 8:00 e 9:00 horas da manhã. O sangue foi
transportado ao laboratório em gelo para centrifugação (5000 rpm, 10
minutos, 4°C) e o plasma, armazenado a -20°C.
As concentrações plasmáticas de testosterona nas diferentes idades foram
quantificadas através de radioimunoensaio (Coat-a-Count Total Testosterone,
Diagnostic Products Corp., Los Angeles, California, USA), previamente
validado para o plasma ovino (CASTRILLEJO et al., 1995). Todas as
amostras foram processadas em duplicatas. As amostras foram descongeladas
à temperatura ambiente e homogeneizadas em agitador Vortex (Scientific
43
Industries Inc., USA) e 50µL de plasma foram pipetados em tubos de
polipropileno contendo anticorpos específicos para testosterona imobilizados
em sua parede. Em seguida, adicionou-se 1 mL de testosterona radioativa
(marcada com I 1 2 5 ) por tubo, homogeneizou-se o conteúdo no Vortex e
incubaram-se os tubos em banho-maria a 37°C por 3 horas. Após a incubação
os tubos foram vertidos, decantados por 15 minutos e lidos em um Contador
Gamma (Nuclear Enterprises NE – USA). A sensibilidade do ensaio é de 0,04
ng/mL.
3.6. Avaliação das Proteínas do Plasma Seminal
Amostras de plasma seminal das idades entre 15 e 48 semanas foram
obtidas por centrifugação do sêmen logo após a colheita (3000 rpm, 5
minutos, 4°C) e mantidas congeladas (-20°C) para posterior análise do perfil
protéico.
3.6.1. Quantificação da Concentração de Proteína Total
Inicialmente, obteve-se uma curva analítica de calibração a partir de
soluções padrão, com concentrações de proteína conhecidas, encerrando 0, 5,
10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 mg de albumina sérica bovina (BSA) mL - 1 .
Adicionou-se a cada 100 µL padrão, 2,5 mL do reagente de Bradford
(BRADFORD, 1976) e as leituras de absorbância feitas a 595 nm, após 10
minutos de incubação.
A curva de calibração foi, então, estabelecida por espectrofotometria em
triplicata, gerando uma equação linear de absorbância x concentração (R² =
0,9761) através da qual foi possível a determinação do teor de proteínas totais
em cada uma das amostras experimentais.
44
Para quantificação dos teores de proteína nas amostras, também em
triplicata, estas foram previamente diluídas na proporção de 1:80, em água
milli-Q, adicionando-se a 100 µL da amostra diluída 2,5 mL do reagente de
Bradford. Após 10 minutos, procedeu-se à leitura em 595 nm, obtendo-se o
valor de cada amostra como a média das triplicatas.
3.6.2. Caracterização das Proteínas por Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
O perfil protéico do plasma seminal foi avaliado por eletroforese
desnaturante em gel de poliacrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio
(SDS-PAGE), segundo o método descrito por SCHÄGGER & VON JAGOW
(1987). Inicialmente, as amostras foram diluídas em tampão contendo SDS
para uma concentração de 2 mg mL - ¹. O detergente aniônico SDS solubiliza as
proteínas, ligando-se a elas em uma proporção de 1,4:1 (REYNOLDS &
TANFORD, 1970), escondendo as cargas intrínsecas do polipeptídeo, de modo
que a carga líquida por unidade de massa torna-se, aproximadamente,
constante e a separação eletroforética se dá com base na massa molecular das
proteínas.
Foram utilizados géis de poliacrilamida a 12,5% com dimensões de 10 x
10,5 cm. Adicionou-se 20 µg de proteína nos poços formados no gel de
empilhamento (3,5%) e utilizou-se marcadores moleculares na faixa de 10 a
250 kDa (RPN 800, Amersham Biosciences, USA). A corrida foi realizada em
geladeira, utilizando fonte para eletroforese com corrente elétrica de 20 mA
por gel, por um período de, aproximadamente, 2 horas. Ao final da corrida, os
géis foram retirados das cubas e corados com Coomassie Brilliant Blue R-350
(Amersham
Biosciences,
USA)
por,
aproximadamente,
15
horas
e,
45
posteriormente, lavados com solução descorante contendo 4:1:3,5 (v:v) de
água milli-Q, ácido acético e metanol, respectivamente, e fotografados.
3.7. Avaliação Testicular
3.7.1. Avaliação Morfológica
Após
separados
o abate, os testículos foram recolhidos, desencapsulados e
dos
epidídimos,
foram
pesados
e
tomou-se
as
medidas
de
comprimento (CT50) e diâmetro (DT50) de ambos os testículos. O volume
testicular foi calculado segundo a fórmula (SETCHELL & WAITES, 1964;
WROBEL et al., 1995): VT =
1
. A este resultado, aplicou-se o
6π × CT 50 × DT 50 2
fator de correção (x 0,945), uma vez que os testículos não são totalmente
elipsóides
(WROBEL,
calculado
subtraindo-se
1990).
O
volume
do
parênquima
11%
do
volume
testicular,
testicular
foi
correspondente
ao
mediastino e à túnica albugínea (WROBEL et al., 1995). A densidade
testicular foi calculada através da razão entre peso e volume testicular
(BIELLI et al., 2000).
3.7.2. Avaliação Histológica
Um fragmento da região central do testículo esquerdo, de aproximadamente 4
mm de espessura, foi retirado e imerso em fluido de Bouin por 24 horas para fixação
e transferido para uma solução de etanol a 70%. Em seguida, os fragmentos foram
desidratados em concentrações crescentes de etanol (70% a 100%), diafanizados em
xilol e incluídos em blocos de parafina. Os blocos foram cortados em seções de 5 µm
de espessura, as quais foram montadas em lâminas, desparafinizadas em incubações
46
com xilol e concentrações decrescentes de etanol (100% a 70%) e coradas com
hematoxilina-eosina (HE).
O diâmetro dos túbulos seminíferos (DTM) foi obtido em 10 seções transversais
para cada testículo, com uma ocular micrométrica em aumento de 400X. O mesmo
procedimento foi utilizado para a medição da altura do epitélio germinativo. Para
cada seção, o DTM foi obtido como a média de dois valores, e a espessura epitelial
como a média de quatro medições.
As proporções volumétricas de túbulos seminíferos (VTS) e espaço
intersticial (VI) foram estimadas segundo BIELLI et al. (2001), em aumento
de 400X. Foram contados 600 pontos por animal, totalizando 9.600 pontos
para a determinação do percentual volumétrico ocupado pelos componentes
estudados (CHALKLEY, 1943). Para tanto, utilizou-se a fórmula Vt =
Pi
,
Pt
onde Vt representa o volume ocupado pelo componente de interesse (túbulo
ou interstício), Pi, o número de pontos sobre o componente de interesse e Pt,
o total de pontos contados.
A população celular dos túbulos seminíferos foi estimada pela contagem
dos núcleos das células germinativas e de Sertoli em 10 seções transversais
em aumento de 1000X, no estágio 2 para leptótenos e 1 e 8 do ciclo do
epitélio seminífero (CES) para as demais células, segundo HOCHEREAU-DEREVIERS et al. (1990). As contagens celulares foram corrigidas para
diâmetro
nuclear
(ABERCROMBIE,
e espessura
1946):
do
corte
N = NC × (
pela
fórmula
de
5μm
),
5μm + diâm.nucleolar ( μm)
Abercrombie
onde
N
representa a real contagem celular e NC representa o número de células
contadas por seção. Tomaram-se ainda os diâmetros nucleares das referidas
47
células, contando-se 10 unidades por tipo celular em aumento de 1000X com
ocular micrométrica.
A população de células de Sertoli por testículo foi estimada através da
seguinte fórmula (BIELLI et al., 2001): NTS = Ns ×
L
, onde Ns
Espessura.do.corte
corresponde ao número médio de células de Sertoli por seção transversal de
túbulo seminífero, e L ao comprimento total dos túbulos seminíferos. O
mesmo procedimento foi aplicado às demais células germinativas.
Admitindo-se que os túbulos seminíferos são cilíndricos, o comprimento
tubular
L=
foi
calculado
VTS
⎛ DTM ⎞
π ×⎜
⎟
⎝ 2 ⎠
2
conforme
MARSHALL
&
PLANT
(1996):
.
As populações de células de Sertoli e germinativas foram calculadas com
base
em
10
seções
transversais
de
túbulos
seminíferos
por
animal
(BERNDTSON et al., 1987). Baseados nos valores de N para cada tipo
celular, foram estimadas as proporções do número de espermatogônias A /
célula de Sertoli, número de espermátides / célula de Sertoli e espermatogônia
A.
A produção diária de células germinativas foi calculada a partir de seu
número total por testículo, dividido pela duração (10,4 dias) do CES em
carneiros (ORTAVANT, 1959; HOCHEREAU-DE-REVIERS, 1990).
3.8. Análise Estatística
Utilizou-se o delineamento experimental em blocos ao acaso (16
animais = 16 blocos). A análise de variância e os testes de Duncan e t de
48
Student foram utilizados para determinar as diferenças dos parâmetros de
desenvolvimento corporal e testicular entre as idades. Utilizou-se ainda a
análise de variância e o teste de Student para determinação das diferenças na
secreção de testosterona ao longo das idades (SAMPAIO, 1998). Os valores
referentes
às
concentrações
de
testosterona
sofreram
transformação
logarítmica antes da análise (BIELLI, 1999).
As características de desbridamento peniano, motilidade massal e
vigor espermático foram analisadas pelo teste não paramétrico de KruskalWallis. As correlações entre os parâmetros foram calculadas pelo método de
Pearson (SAS, 2000).
49
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Desenvolvimento Ponderal
4.1.1. Peso corporal
O peso vivo dos animais apresentou uma evolução contínua de
12,31±0,65 kg às 8 semanas para 54,25±1,62 kg às 48 semanas (Figura 1),
com um ganho médio diário de 196,2 g. Estudos semelhantes mostraram
ganhos de peso de 157,6 a 191,6 g/d em cordeiros Santa Inês confinados na
mesma faixa etária (KAWAS et al., 1986; MOURA et al., 1999; SOUZA et
al., 2000), o que mostra desempenhos equivalentes ou superiores aos obtidos
para os referidos animais.
60
h
Peso Corporal (kg)
50
h, i
k
i, j j
g
40
f
d
30
b
20
e
c
a
10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 1 – Variação do peso vivo em função da idade, em carneiros da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
O peso corporal médio dos animais ao abate foi 55,25 ± 3,50 kg e o
peso de carcaça quente, 24,49 ± 3,83 kg, correspondendo a um rendimento de
carcaça de 48,60 ± 2,24%. SOUZA et al. (1998), trabalhando com cordeiros
da
raça
Santa
Inês
confinados
e
abatidos
às
24
semanas
de
idade,
apresentaram médias de peso ao abate de 29,50 a 34,75 kg, e pesos de carcaça
quente de 13,30 a 15,30 kg, com rendimentos de 44,03 a 45,08%. A diferença
50
entre estes resultados sugere que o rendimento de carcaça dos carneiros é
influenciado pela idade, embora sejam necessários estudos mais específicos
para comprovação desta hipótese.
4.1.2. Perímetro Torácico
O perímetro torácico dos animais variou de 55,41 ± 1,10 cm às 8 sem.
para 87,84 ± 0,78 cm às 48 sem., aumentando mais rapidamente até 36 sem.,
mas com aumentos menores após 38 sem. (Figura 2). LÔBO et al. (1997)
mostraram que o crescimento do PT de carneiros Morada Nova foi de apenas
10% entre as idades de 30 e 52 sem. SOUZA et al. (2000), trabalhando com
cordeiros Santa Inês na mesma faixa etária, encontraram também maiores
variações no perímetro torácico até 32 sem. de vida. Possivelmente, o
crescimento dos animais após 36 sem. tem pouca relação com o crescimento
da estrutura óssea do tórax dos animais. Resultado semelhante foi encontrado
por LEDIC & DERAGON (1997) em touros Nelore.
95
Perímetro Torácico (cm)
90
g
85
h
i i
h,i
i
f
80
e
75
d
70
c
65
b
60
a
55
50
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 2 – Variação do perímetro torácico em função da idade, em carneiros da raça Santa
Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
51
4.2. Biometria Testicular
4.2.1. Circunferência Escrotal
O potencial das medições testiculares, em particular da circunferência
escrotal, como critério de seleção para a fertilidade masculina em carneiros,
já foi demonstrado (LAND, 1973; MATOS et al., 1992). A circunferência
escrotal variou de 9,78 ± 0,46 cm às 8 sem. para 32,09 ± 0,37 cm às 48 sem.
(Figura 3). Estas variações foram significativas até 36 sem., quando alcançou
30,66 ± 0,49 cm. SOUZA et al. (2000) encontraram crescimento significativo
na circunferência escrotal em cordeiros Santa Inês até 28 sem. de idade (28,8
cm), e SOUZA et al. (2001) observaram aumentos da mesma magnitude em
cordeiros dessa raça até a idade de 32 sem. Em animais adultos (81 sem.),
durante a XVI Exposição Agropecuária de Recife, SALGUEIRO & NUNES
(1999) encontraram valor médio de 33,3 cm, o qual é próximo do valor
encontrado às 48 sem. em nossos animais, confirmando a tendência à
estabilização da CE a partir desta idade.
Circunferência Escrotal (cm)
35
g
30
h h
h
h
h
f
25
d
20
e
c
b
15
a
10
5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 3 – Variação da circunferência escrotal em função da idade, em ovinos da raça
Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
52
Em um estudo comparando a circunferência escrotal em ovinos das
raças Santa Inês e Morada Nova, em diversas faixas etárias, FREITAS et al.
(1991) observaram valores de 29,0 e 26,2 cm entre 24 e 48 sem. de idade;
30,2 e 28,8 cm entre 48 e 96 sem.; 30,2 e 31,2 cm entre 96 e 144 sem.; e
finalmente
31,8
e
33,0
cm
em
animais
com
mais
de
144
sem.,
respectivamente, para as duas raças. Estes resultados apóiam os nossos
achados de que a CE, nesta espécie, não aumenta significativamente após as
48 sem. de vida.
Parâmetros
semelhantes
foram
achados
por
LÔBO
(1996)
que,
trabalhando com ovinos da raça Morada Nova, também de pequeno porte,
observou circunferência escrotal de 10,34 ± 0,74 cm às 16 sem. de idade,
comparado ao valor de 17,01 ± 0,77 nos cordeiros Santa Inês de mesma idade.
Ele encontrou, ainda, valores de 18,54 cm às 30 sem. e 23,82 cm às 48 sem.
de idade e relatou que o período de crescimento mais rápido se deu entre 16 e
30 sem. de idade, possivelmente devido aos efeitos das concentrações
crescentes de testosterona, características dessa fase, e seus efeitos sobre o
desenvolvimento do epitélio germinativo.
BELIBASAKI & KOUIMTZIS (2000), estudando o desenvolvimento
sexual de cordeiros de diferentes raças nativas da Grécia, encontraram valores
para a circunferência escrotal de 28,9; 27,5 e 27 cm, respectivamente, para as
raças Chios, Karagouniki e Serres às idades de 25, 27 e 30 sem. Nas raças
Horros e Menz (nativas da Etiópia), a circunferência escrotal cresceu de 14,5
e 14,1 cm para 19,9 e 20,2 cm, atingindo ainda 23,2 e 23,5 cm às 24, 32 e 48
sem., respectivamente. Embora estes animais apresentem menores valores de
CE em relação à raça Santa Inês, isto possivelmente se deve ao fato de eles
53
também apresentarem pequeno porte (variação de 11 a 20 kg de peso vivo
entre essas idades) (TOE et al., 2000).
Em animais lanados da raça Corriedale, MORAES et al. (1981) não
encontraram diferenças para circunferência escrotal entre animais com 48 e 96
sem. de idade (30,6 e 31,6 cm, respectivamente). Por outro lado, VIVANCO et
al. (1986), estudando o desenvolvimento da circunferência escrotal em animais
desta raça, observaram diferenças significativas nos valores de CE entre as
idades de 72 e 168 sem. Nesse caso, as medições foram feitas nos mesmos
animais, e estas variações podem ter refletido efeitos do fotoperíodo, uma vez
que às 72 sem. os animais estavam em estação não reprodutiva, o que não
ocorreu na segunda avaliação. Em animais mestiços Finnsheep X Rambouillet,
NOTTER et al. (1981) obtiveram valores de 10,8 a 25,6 cm entre as idades de
03 e 22 sem. de idade.
YARNEY et al. (1993), estudando o desenvolvimento sexual em
cordeiros Suffolk, observaram crescimento linear da circunferência escrotal
entre 4 e 27 sem., conforme nossos achados. No entanto, estes animais
estabilizaram o crescimento da CE em idade mais jovem, comparado aos
animais Santa Inês, refletindo possíveis diferenças entre genótipos, conforme
constataram CARR & LAND (1975).
O peso corporal e a idade são as duas maiores fontes de efeitos sobre a
CE, devendo ser levados em consideração no momento da seleção dos
reprodutores (LÔBO, 1996). A CE está correlacionada positivamente com o
peso corporal e a idade (JOBIM et al., 1989; FREITAS et al., 1991;
OSINOWO et al., 1992), sendo as correlações entre CE e PV sempre maiores
que aquelas entre CE e idade (LÔBO, 1996). Entretanto, esses efeitos são
54
particularmente pronunciados em animais jovens (ODABASIOGLU et al.,
1992).
Inúmeros fatores ambientais podem influenciar o desenvolvimento
testicular.
Em
regiões
temperadas,
a
estação
do
ano
apresenta
efeito
significativo sobre os valores da CE (LAND & SALES, 1977; PÉREZCLARIGET
et
al.,
1998).
BIELLI
et
al.
(1997)
observaram
que
a
circunferência escrotal de carneiros Corriedale apresentou regressão (-17%) no
inverno, voltando aos valores normais no outono. Esta regressão foi atribuída a
uma redução no diâmetro dos túbulos seminíferos (-23%) no mesmo período.
Isto se justifica, uma vez que estes ocupam aproximadamente 85% do volume
testicular em ovinos (WROBEL et al., 1995). Estas variações são governadas
por alterações no fotoperíodo, mecanismo pelo qual os animais registram a
duração da luminosidade diária (MALPAUX et al., 1996).
Embora
o
fotoperíodo
exerça
uma
forte
influência
sobre
o
desenvolvimento testicular, quanto mais próximo do equador, menores os
efeitos fotoperiódicos, tornando-se mais relevante a influência nutricional, de
tal modo que em regiões tropicais os efeitos da nutrição são mais pronunciados
(LINCOLN & SHORT, 1980). Ainda durante a gestação, BIELLI et al. (2002)
mostraram que a subnutrição da fêmea pode limitar o desenvolvimento
testicular do cordeiro, por reduzir a população das células de Sertoli.
MURRAY et al. (1990) encontraram correlações (r = 0,85) entre a
ingestão de energia e o crescimento testicular em cordeiros Merino. Em
animais deslanados, FREITAS & NUNES (1992) observaram diferenças
significativas para o valor da CE em animais sem raça definida, criados em
sistema semi-intensivo, entre as estações seca e chuvosa, com valores maiores
nesta última, refletindo maior abundância de alimentos. Os efeitos da nutrição
55
sobre o desenvolvimento testicular envolvem respostas a curto ou longo prazo
(BLACHE et al., 2000). Os efeitos em curto prazo agem principalmente no
sistema neuroendócrino que controla a atividade testicular (MARTIN et al.,
1994), enquanto aqueles em longo prazo agem sobre o desenvolvimento
testicular propriamente dito e produção espermática (OLDHAM et al., 1978).
MATOS et al. (1992) estudaram os efeitos de fatores ambientais sobre a
circunferência escrotal de cordeiros Rambouillet, não encontrando efeitos da
idade da mãe sobre a CE, mas observaram influência significativa do tipo e ano
de parto, apenas nas idades mais jovens. Outro efeito importante é o manejo
dos animais. Estes efeitos são eliminados quando se trabalha com grupos
contemporâneos. MORAES (1997), estudando a avaliação reprodutiva do
carneiro, observou que a CE só é válida como critério de seleção de
reprodutores dentro de grupos contemporâneos, visando minimizar variações
nas condições ambientais relativas às práticas de manejo. MORAES &
OLIVEIRA (1998), estudando os componentes da variância sobre a CE,
observaram que, aproximadamente, 50% da variância observada foram devidos
às diferentes condições de criação dos animais.
4.2.2. Comprimento e Diâmetro Testiculares
O CT e o DT apresentaram a mesma tendência que a CE, com variações
de 2,64 ± 0,11 cm a 10,01 ± 0,16 cm e 1,82 ± 0,09 cm a 6,01 ± 0,11 cm entre 8
e 48 sem., respectivamente (Figuras 4 e 5). Entretanto, estas variações só
foram significativas entre 12 e 36 sem. de idade. O fato do diâmetro testicular
não ter crescido significativamente entre 8 e 12 sem. pode estar relacionado ao
fato de que, em animais muito jovens, no início da espermatogênese, a taxa de
crescimento
testicular
apresentam-se
muito
reduzidas
(AMMAN
&
SCHANBACHER, 1983). YARNEY et al. (1990) mostraram que o diâmetro
56
testicular de carneiros Suffolk aos 6 – 7 meses não foi maior que aos 13 – 14
meses de idade, apesar de um aumento de 60% no PV entre essas idades.
Maiores CE e CT entre 8 e 36 sem. são provavelmente conseqüência de uma
intensa proliferação das células germinativas e aumento de volume das células
de Sertoli, nos túbulos seminíferos (CURTIS & AMMAN, 1981).
Achados semelhantes para o comprimento testicular em cordeiros Santa
Inês foram relatados (MOURA et al., 1999; SOUZA et al., 2001). FREITAS et
al. (1991), estudando a biometria testicular de três raças de ovinos deslanados,
conforme a faixa etária, observaram evolução entre as idades de 24 e 144 sem.
No entanto, os autores não relataram se estas diferenças foram significativas.
Para a raça Santa Inês, os valores variaram de 7,8 a 9,5 cm para o comprimento
testicular e de 4,9 a 5,5 cm para o diâmetro. O comprimento aumentou ainda de
7,3 e 6,8 cm para 8,7 e 8,7 cm, enquanto o diâmetro foi de 4,8 e 4,5 cm para
5,1 e 5,2 cm, respectivamente, para as raças Morada Nova e Somalis, nas
mesmas idades. Vale ressaltar que os menores valores encontrados para estas
raças podem estar relacionados a seu menor porte. No entanto, os autores não
relataram se havia diferenças significativas entre raças. Estas medições são
importantes, uma vez que o diâmetro testicular tomado em animais jovens
fornece indicação confiável do desempenho reprodutivo do animal adulto
(YARNEY & SANFORD, 1993).
57
Comprimento Testicular (cm)
11
10
g
9
8
h
h
h h
h
f
e
7
d
6
5
c
4
b
a
3
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 4 – Variação do comprimento testicular em função da idade, em ovinos da raça
Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
6,5
Diâmetro Testicular (cm)
6
e
5,5
e,f
f,g f,g
f,g
g
d
5
c
4,5
4
b
3,5
a
3
a
2,5
2
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 5 – Variação do diâmetro testicular em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
A relação comprimento/diâmetro testicular (Figura 6) elevou-se entre
12 e 16 sem., mantendo-se constante entre 16 e 32 sem., e elevando-se
novamente das 32 sem. em diante, mas sem variações significativas após esta
idade. Estes dados mostram que o comprimento cresce mais rapidamente em
58
comparação ao diâmetro testicular na fase pré-púbere e em algumas semanas
após a idade à puberdade até o início da maturidade sexual, quando este valor
estabiliza-se, revelando que o crescimento do CT e do DT não ocorre de
maneira uniforme, mas que esses valores se equilibram na pós-puberdade.
Resultados para esta relação foram confirmados em touros Nelore por
MOURA et al. (1999). CURTIS & AMMAN (1981) mostraram que, em touros
Holandeses,
o
comprimento
significativamente
concentrações
na
de
fase
dos
de
testosterona.
túbulos
seminíferos
pré-puberdade,
Entretanto,
estes
aumenta
juntamente
com
autores
puderam
não
as
relacionar de que modo estes fenômenos definem o formato testicular.
Circunferência Escrotal (cm)
1,8
c
c
1,7
b,c
1,6
a
b
a
c
c
b
1,5
c
c
b
1,4
1,3
1,2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 6 – Variação da relação comprimento/diâmetro testicular em função da idade, em
ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
4.2.3. Peso Testicular
O peso testicular apresenta uma curva de crescimento parecida com a da
circunferência escrotal. Os aumentos são pequenos entre 4 e 12 sem. de idade,
sendo aparentes e significativos entre 12 e 30 sem. de idade, paralelamente aos
níveis de testosterona (YARNEY & SANFORD, 1989). Os valores médios de
59
peso testicular e epididimal às 50 sem. foram 191,25 ± 7,40 g e 29,93 ± 1,20 g
respectivamente, sendo que a primeira variável correspondeu a 0,38 ± 0,1% do
peso corporal. Os valores referentes a diâmetro e comprimento testicular foram
9,23 ± 0,18 e 6,35 ± 0,91 cm, respectivamente, e 184,59 ± 8,22 mL para volume
testicular. Valores detalhados para as duas gônadas são apresentados na Tabela
1.
Não existem estudos dessa natureza em carneiros da raça Santa Inês.
Contudo, QUEIROZ & CARDOSO (1989), trabalhando com ovinos deslanados
adultos, sem raça definida, encontraram valores médios de 90,3 g e 127,1 g para
o peso testicular de animais abatidos nos meses de junho e novembro, o que
corresponde a 47,2 e 66,4% do valor descrito no presente estudo. Possivelmente,
esta superioridade pode refletir efeitos de diferenças nutricionais, uma vez que
os animais, no referido estudo, foram criados a pasto. Os animais abatidos em
junho sofreram efeito da estiagem que, na referida região, vai de abril a
setembro, enquanto os últimos aproveitaram a estação chuvosa. BIELLI et al.
(2000), comparando os efeitos da nutrição sobre o desenvolvimento testicular de
carneiros Corriedale, observaram que animais suplementados a pasto durante a
prenhez e os primeiros 100 dias de vida apresentaram melhor desenvolvimento
testicular
biométrica
e
histologicamente,
comparados
aos
criados
sem
suplementação.
Já em animais lanados, os valores para peso testicular variaram de 10 a 41
g, em ovinos Corriedale às 25 sem. de idade criados a pasto (BIELLI et al.,
2001) e de 130 a 275 g para animais com pelo menos 144 sem. de idade, da
mesma raça, respectivamente, para animais criados em pastagem nativa ou em
pastagem melhorada com suplementação (BIELLI et al., 1999). HOCHEREAUDE-REVIERS et al. (1990) obtiveram valores médios para peso testicular de 173
60
e 255 g, respectivamente, para animais das raças Romanov e Ile-de-France, às 72
sem. de vida. Já em cordeiros Suffolk às 24 sem. de vida, WROBEL et al. (1995)
encontraram peso testicular de 113 g. Estes achados ilustram que o peso
testicular apresenta grandes variações em diferentes raças. Isto sugere que
componentes genéticos sejam importantes na determinação desta variável.
Nesse sentido, CHUBB (1992) estudou a ação de determinados genes
sobre o desenvolvimento testicular em camundongos. Ele encontrou dois genes
autossômicos cuja expressão estava relacionada com as diferenças no peso
testicular entre linhagens, devido a uma diferença na população das células de
Sertoli. Esta regulação se dava sobre a atividade mitótica dos precursores destas
células na pré-puberdade. A população de células de Sertoli está correlacionada
com o tamanho testicular adulto (SHARPE, 1994) em diversas espécies,
incluindo os ovinos (BIELLI et al., 2000). A multiplicação dessas células cessa
por ocasião da puberdade, e seu número define o número máximo de células
germinativas que um animal pode produzir. Um mecanismo genético semelhante
ao que existe em camundongos deve existir em ovinos, explicando as diferenças
observadas em relação ao peso testicular nas diferentes raças. Foi demonstrado
que o aumento do peso testicular é dependente do FSH, uma vez que cordeiros
Ile-de-France imunizados contra o FSH, entre o nascimento e 24 sem. de idade,
apresentaram pesos testiculares significativamente menores ao longo de todo o
período em relação àqueles não imunizados (KILGOUR et al., 1998).
4.2.4. Volume Testicular
Com relação ao volume testicular, cordeiros Corriedale às 25 sem. de vida
apresentaram valores de 9,5 mL a 41 mL (BIELLI et al., 2001), enquanto os
animais adultos apresentaram volumes de 147 a 272 mL (BIELLI et al., 1999).
Já em animais Suffolk, esse valor correspondeu, em média, a 101 mL para
61
animais de 6 a 7 meses de idade (WROBEL et al., 1995), mostrando variações
semelhantes àquelas observadas para o peso testicular.
O volume ocupado pelo parênquima testicular foi de 164,3 mL (TABELA
2). Este valor foi maior que o encontrado em cordeiros recém-púberes
(WROBEL et al., 1995). O volume ocupado pelos túbulos seminíferos é
praticamente constante no feto, apresentando relação linear com o peso
testicular (COUROT, 1971), quando constituem de 40 a 50% do volume
testicular. Entre o feto e o nascimento, ele aumenta lentamente (cerca de 90X).
Entre o nascimento e 11 sem. de vida, seu volume continua aumentando
(1000X). Contudo, sua taxa máxima de crescimento ocorre por volta da
puberdade, às 22 sem. de vida (40.000 X) (COUROT, 1971).
4.2.5. Densidade Testicular
Já a densidade testicular, em ovinos Santa Inês, foi estimada em 1,04
g/mL. Em ovinos Corriedale, foram encontrados valores de 1,01 a 1,02 g/mL
para animais de 25 sem. (BIELLI et al., 2001) e 0,93 a 1,01 g/mL para animais
adultos (BIELLI et al., 1999), sugerindo que os testículos de carneiros Santa
Inês são mais densamente ocupados que aqueles de animais Corriedale. Estas
diferenças podem estar relacionadas ao regime alimentar dos animais (GASTEL
et al., 1995), contudo, estudos específicos precisam ser realizados para explicar
esta diferença.
62
TABELA 1: Biometria testicular de carneiros da raça Santa Inês abatidos às 50
semanas de idade (X ± EPM)
Parâmetro
Testículo
Direito
Esquerdo
Médio
192,40 ± 7,65
190,11 ± 7,38
191,25 ± 7,40
Comprimento (cm)
9,29 ± 0,18
9,17 ± 0,20
9,23 ± 0,18
Diâmetro (cm)
6,31 ± 0,10
6,39 ± 0,10
6,35 ± 0,09
Volume (mL)
183,78 ± 8,51
185,39 ± 8,54
184,59 ± 8,22
Volume Parênquima (mL)
163,57 ± 7,58
165,02 ± 7,59
164,28 ± 7,32
1,03 ± 0,02
1,06 ± 0,03
1,04 ± 0,02
Peso (g)
Densidade (g/mL)
4.3. Concentrações Periféricas de Testosterona
As concentrações basais de testosterona elevaram-se progressivamente
entre 9 e 32 sem., de 0,37 ± 0,07 para 1,35 ± 0,23 ng/mL (FIGURA 7) e, a
partir dessa idade, houve aumentos maiores até 42 sem., quando ocorreu o
pico (2,99 ± 0,34 ng/mL). Daí em diante, sua concentração reduziu-se a um
valor equivalente àquele detectado às 32 sem. A redução na secreção de
testosterona após às 42 sem. pode ser conseqüência dos próprios níveis
elevados na corrente sanguínea antes dessa idade, os quais são aromatizados a
estradiol no sistema nervoso central, exercendo efeito negativo sobre o
hipotálamo (AUCLAIR et al., 1995; SCOTT et al., 1997) e hipófise (OLSTER
& FOSTER, 1986). Este é o primeiro relato sobre concentrações de
testosterona na raça Santa Inês, contudo, os achados deste estudo são
equivalentes àqueles relatados por LEE et al. (1976) para ovinos em
desenvolvimento (0,24 a 3,02 ng/mL).
63
4
Testosterona (ng/mL)
3,5
c
3
2,5
d
2
1,5
d
b,d
b
1
a
0,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Idade (sem anas)
FIGURA 7 – Concentrações plasmáticas basais de testosterona em função da idade, em
ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
Estes resultados confirmam os achados em cordeiros Merino entre 14 e
30 sem. de idade (AUCLAIR et al., 1995) e em cordeiros Ile-de-France
(CARREAU et al., 1984) entre 7 e 34 sem. de idade que apresentaram
concentrações crescentes de testosterona plasmática. YARNEY & SANFORD
(1989) observaram que, em cordeiros entre 8 e 29 sem. de idade, as
concentrações plasmáticas de testosterona elevaram-se paralelamente ao peso
testicular dos animais. Foi constatado que o aumento na testosteronemia foi
devido a um aumento paralelo do número de sítios de ligação para FSH e LH
no testículo e nas concentrações basais de LH. As concentrações crescentes de
LH estimulam as células de Leydig a secretar testosterona (BEARDEN &
FUQUAY, 1992). LANGFORD et al. (1998), trabalhando com as raças
Canadian, Outaouais, Rideau e Finnish Landrace, observaram aumentos
significativos nas concentrações de testosterona entre 24 e 32 sem. de vida.
Eles
observaram
ainda
que
em
todas
as
raças,
as
concentrações
de
64
testosterona às 48 sem. não foram significativamente diferentes daquelas às
32 sem., apesar de serem numericamente menores.
De uma forma geral, diversos estudos referentes à secreção de testosterona
em carneiros mostraram que existe uma aumento em suas concentrações
plasmáticas com a idade, até os 12 meses de idade. BIELLI et al. (2001),
trabalhando com cordeiros Corriedale entre 6 e 14 sem. de idade, encontraram
valores de 0,001 a 0,2 ng/mL, enquanto em animais com pelo menos 144 sem.,
desta raça, a testosteronemia varia de 0,05 a 1,19 ng/mL (BIELLI et al., 1999).
Do mesmo modo, VALENTIM et al. (1995) encontraram valores de 0,2 a 1,3
ng/mL em borregos da raça Churra antes de 26 sem. de idade, e valores de 0,2 a
2,8 ng/mL após as 26 sem. Entretanto, LAFORTUNE et al. (1984) obtiveram
valores de 2,0 a 4,51 e 0,4 a 1,19 ng/mL, respectivamente, para as raças
Romanov e Ile-de-France, à 1 e às 12 sem. de vida. Estes trabalhos mostram que,
de uma maneira geral, as concentrações de testosterona elevam-se entre o
nascimento e a pós-puberdade. Entretanto,
alguns
desses
trabalhos não
permitiram determinar um pico para a secreção desse hormônio. Isso pode estar
relacionado ao número de coletas e ao intervalo entre as coletas.
4.4. Parâmetros Seminais
4.4.1. Volume Ejaculado
No presente estudo, a proporção de carneiros cujo sêmen pôde ser colhido
aumentou com a idade. Às 16 sem., apenas cerca de 20% dos animais chegavam
a ejacular, enquanto que às 42 sem., todos os animais ejaculavam normalmente.
O volume ejaculado aumentou significativamente entre as 15 sem. e as 24
sem. de idade, por ocasião da puberdade. A partir daí, apresentou aumento
contínuo até 48 sem. de vida (FIGURA 8).
65
Volume Ejaculado (mL)
2,5
2
g
f
1,5
f
f
e, f
1
a, b,
c, d
0,5
d, e
d
b, c, d
c
c
a, c
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 8 – Volume ejaculado de sêmen colhido por eletroejaculação em função da idade,
em ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
A coleta de sêmen por eletroejaculação em carneiros foi descrita
inicialmente por GUNN (1936) e pode ser utilizada rotineiramente (até mais de
uma vez ao dia) sem danos à saúde dos animais (WHITE, 1977; EVANS &
MAXWELL, 1987). RODRIGUES et al. (1997) mostraram não haver diferenças
na qualidade do sêmen de caprinos, para os parâmetros de volume ejaculado,
motilidade, concentração espermática e pH, comparando os métodos de vagina
artificial e eletroejaculação para colheita de sêmen de caprinos. Além disso, em
um estudo sobre as características seminais de cabritos da raça Saanen entre o
nascimento e 44 sem. de idade, utilizavam a eletroejaculação ou vagina artificial
para colheita do sêmen dos animais sem discriminar o método de colheita
quando da avaliação dos dados (BECKER-SILVA et al., 1999).
Vários trabalhos têm demonstrado que os efeitos da idade sobre o
volume ejaculado são mais pronunciados em animais jovens. No entanto, em
animais acima de 48 sem. de idade esse efeito não foi demonstrado (MORAES
et al., 1981; VIVANCO et al., 1986; FREITAS & NUNES, 1992). O fato de
66
SALGUEIRO & NUNES (1999) não terem encontrado resultado superior aos
nossos em carneiros Santa Inês com 81 sem. de idade, confirma a ausência de
efeitos da idade sobre este parâmetro em animais com mais de 48 sem. de
idade.
Os nossos achados validam os resultados obtidos anteriormente em
cordeiros jovens da raça Santa Inês (SOUZA et al., 2000) mostrando uma
tendência de crescimento acentuado desse parâmetro entre a puberdade e as
48 sem. de idade. Esta técnica, embora cause algum desconforto momentâneo
aos animais (CAMERON, 1977), é a mais indicada para o estudo de animais prépúberes, pois permite que se evidencie os primeiros ejaculados, mesmo antes do
desprendimento total entre o pênis e o prepúcio dos animais, sem quaisquer
danos à sua saúde.
4.4.2. Motilidade Massal
Embora os animais começassem a ejacular às 15 sem., ejaculados com
motilidade massal só foram detectados às 21 sem. (FIGURA 9) e, a partir
desta idade, os aumentos foram significativos entre 21 e 24 sem., com uma
fase de crescimento rápido, e entre 27 e 48 sem., com crescimento mais lento,
tendendo à estabilização.
Do mesmo modo que o volume ejaculado, estudos mostram que os
efeitos da idade são mais pronunciados até umas poucas semanas após a
puberdade. De fato, em carneiros Santa Inês com 81 sem. de idade,
SALGUEIRO & NUNES (1999) encontraram valor médio de 3,72 para
motilidade massal. Este valor não foi maior que o encontrado às 48 sem. em
nosso estudo.
67
Motilidade Massal (0 - 5)
5
4,5
4
3,5
d
c
3
c c
c
2,5
2
c
c
b
b
1,5
1
0,5
a
a
a
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 9 – Variações na motilidade massal do sêmen em função da idade, em ovinos da
raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
Dentre os vários parâmetros utilizados para a avaliação da qualidade
seminal em ovinos, a motilidade massal define o movimento em massa dos
espermatozóides,
resultando
de
uma
interação
entre
a
motilidade
e
concentração espermática. Este parâmetro é bastante útil por ocasião de uma
avaliação inicial de grandes grupos de animais ainda não selecionados para
reprodução, para escolha daqueles que serão submetidos a exames mais
detalhados. No entanto, a motilidade massal pode não ser precisa o suficiente
para
distinguir
pequenas
diferenças
de
qualidade
espermática
entre
reprodutores (CHEMINEAU et al., 1991).
4.4.3. Motilidade
Os primeiros espermatozóides no ejaculado ocorreram em média às
23,05 ± 0,94 sem. de idade, quando os animais apresentavam 28,08 ± 0,99 kg
e CE de 22,44 ± 0,42 cm. Contudo, os primeiros espermatozóides móveis só
apareceram às 23,94 ± 0,98 sem., com os parâmetros de 28,63 ± 1,05 kg e
22,72 ± 0,44 cm, respectivamente para peso corporal e circunferência
68
escrotal. Houve animais que apresentaram espermatozóides no ejaculado já às
18 sem. de idade, e um outro animal só veio a ejacular espermatozóides às 28
sem. A motilidade elevou-se significativamente de 0 para 12,5 ± 7,5% entre
15 e 18 sem. e de 42,7 ± 7,6 para 65,6 ± 4,4% entre 27 e 30 sem., atingindo
76,25 ± 2,4% às 48 sem. (FIGURA 10). Em resumo, os aumentos na
motilidade espermática foram mais pronunciados nas fases pré-púbere e
púbere, sendo mais discretos após esta fase.
90
80
Motilidade (%)
d
d
70
d
60
d
d
e
d
50
c
40
c
30
b
20
10
b
a
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 10 – Variações na motilidade do sêmen em função da idade, em ovinos da raça
Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
A motilidade espermática é essencial para que o espermatozóide atravesse
o trato genital feminino e se desloque até o oviduto, para fertilizar o ovócito
(CAMERON, 1977). Este parâmetro é especialmente importante em ovinos,
devido a particularidades anatômicas da cérvix (EVANS & MAXWELL, 1987), e
deve ser avaliado regularmente devido aos seus efeitos sobre a fertilidade do
rebanho (VIVANCO et al., 1986).
Essa tendência de menores aumentos na motilidade após a puberdade é
confirmada pelos resultados de SALGUEIRO & NUNES (1999), com valor
69
médio de 85% para este parâmetro em ovinos Santa Inês com 81 sem. de idade.
De fato, as características seminais de animais jovens tendem a melhorar com a
idade (WIEMER & RUTTLE, 1987). Esta melhora se dá, em parte, devido ao
crescimento e amadurecimento testicular (COUROT, 1979), caracterizado por
maior secreção de testosterona.
De
maneira
semelhante,
o
percentual
de
espermatozóides
progressivamente móveis (MOP) e o vigor espermático (FIGURAS 11 e 12)
aumentaram gradativamente até 27 sem., mas somente entre 27 e 30 sem. houve
aumento significativo. A partir de 30 sem., esse valor tendeu a aumentar com a
idade, mas as diferenças não foram significativas.
100
Motilidade Progressiva (%)
90
80
70
b
b
b
60
b
b
50
40
b
b
a
30
20
10
a
a
a
a
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 11 – Variações na motilidade progressiva do sêmen em função da idade, em ovinos
da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
70
Vigor Espermático (0 - 5)
5
4,5
4
b
3,5
b
b
b
b
b
3
b
a
2,5
2
a
1,5
1
a
a
0,5
a
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 12 – Variações no vigor espermático em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
Enquanto a MOP caracteriza o percentual de espermatozóides com
motilidade progressiva, o vigor qualifica esse movimento, conferindo notas
subjetivas para sua intensidade. Os valores obtidos nesse trabalho a partir de 30
sem. de idade estão de acordo com os observados nesta raça (SOUZA et al.,
2000).
4.4.4. Concentração Espermática
A concentração espermática dos animais na fase recém-púbere foi muito
baixa, elevando-se significativamente após as 30 sem. de idade. Entre 30 e 42
sem. este valor permaneceu estável, aumentando novamente após as 44 sem.
(FIGURA 13), quando ultrapassou 1,0 x 10 9 de espermatozóides por mililitro de
sêmen ejaculado.
A concentração espermática é uma característica de grande importância,
especialmente quando do uso da IA, uma vez que a taxa de diluição e o número
de palhetas de sêmen produzidas dependem dela (EVANS & MAXWELL, 1987).
Em ovinos, devido a particularidades anatômicas da cérvix, o uso de sêmen
congelado por via cervical não é indicado. No entanto, uma estratégia comum
71
tem sido aumentar a concentração espermática nas palhetas (SALAMON &
MAXWELL, 2000), uma vez que resulta em maior número de espermatozóides
viáveis,
compensando
os
danos
sofridos
durante
o
Concentração Espermática (x10 9/mL)
congelamento/descongelamento (GIL et al., 2002).
1,4
1,2
c
c
1
0,8
c
0,6
0,4
b
0,2
a
a
a
a
b
b
b
a
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 13 – Variações na concentração espermática em função da idade, em ovinos da raça
Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
Nossos resultados demonstraram valores muito baixos de concentração
espermática até as 27 sem. de idade, contra-indicando seu uso para reprodução.
Entretanto, a partir de 42 sem. de idade, este parâmetro atingiu valores que
permitem a utilização dos animais. A partir dessa idade, houve uma tendência a
aumentos (P = 0,07), mas sem resultados significativos. Do mesmo modo, REGE
et
al.
(2000)
demonstraram
que
a
concentração
espermática
aumenta
paralelamente à idade entre 36 e 48 sem. de vida em cordeiros. Estudos em
animais sem raça definida (FREITAS & NUNES, 1992) e Santa Inês
(SALGUEIRO & NUNES, 1999) acima de 48 sem. de idade mostraram valores
mais elevados de concentração espermática, mostrando que os valores poderiam
ainda aumentar até a maturidade sexual dos animais.
72
4.4.5. Patologias Espermáticas
O percentual de alterações morfológicas é um exame detalhado de
qualidade
seminal.
Todos
os
ejaculados
contêm
alguns
espermatozóides
anormais, mas amostras com alto percentual normalmente resultam em baixa
fertilidade (EVANS & MAXWELL, 1987). Às 15 sem. de idade, os animais
apresentavam cerca de 88% de espermatozóides defeituosos, este percentual
reduziu-se significativamente entre 24 sem. e 27 sem. e entre 33 e 36 sem.,
atingindo 15% e estabilizando-se daí em diante (FIGURA 14).
REGE et al. (2000) encontraram redução significativa neste percentual
entre 24 e 48 sem. de idade em ovinos nativos da Etiópia, evidenciando o
importante efeito da idade sobre este parâmetro em animais jovens. Apesar dos
resultados mostrarem valores compatíveis com aqueles de animais adultos, a
partir de 36 sem. de idade, diversos estudos mostraram que estes valores
poderiam ser ainda menores, uma vez atingida a maturidade sexual (FREITAS &
NUNES, 1992; MANDIKI et al., 1998).
Alterações Morfológicas (%)
100
a
90
80
a
a
70
60
b
a, b
50
b, c
40
c
30
d
20
d d
d
d
10
0
12
17
22
27
32
37
42
47
52
Idade (sem anas)
FIGURA 14 – Variações no percentual de alterações morfológicas no sêmen em função da
idade, em ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
73
4.5. Parâmetros Bioquímicos do Sêmen
4.5.1. pH Seminal
O equilíbrio bioquímico do sêmen é essencial para a manutenção de sua
qualidade (PINHEIRO et al., 1996). Segundo QUINN & WHITE (1968), o pH
seminal pode influenciar na susceptibilidade seminal ao choque térmico. Ele é
determinado, entre outros, pela presença de ácido cítrico e ácido láctico no
plasma seminal. O ácido cítrico é um componente normal do plasma seminal
de ruminantes, secretado pelas glândulas vesiculares sob estímulo da
testosterona (MACHADO et al., 1999), enquanto o ácido láctico é resultado
do metabolismo anaeróbico da frutose pelos espermatozóides (WHITE, 1977).
O sêmen dos animais jovens apresentou-se bastante alcalino às 15 sem.
9,00 ± 0,00, havendo redução significativa desse valor a partir de 30 sem de
idade (FIGURA 15), até atingir 8,00 ± 0,17 às 48 sem. De fato, o decréscimo
dos valores de pH coincide com aumentos na concentração espermática dos
animais, levando a uma maior produção de ácido láctico, e com maior
secreção de testosterona.
9,2
a
9
a
a
pH
8,8
a
a
8,6
8,4
b
b
b
8,2
b
b
b
8
c
7,8
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 15 – Variações no pH do sêmen em função da idade, em ovinos da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
74
EL-AZAB et al. (1998), trabalhando com cordeiros Rhamani entre 24 e
32 sem. de vida, encontraram valores de pH variando de 6,6 a 6,9. No entanto,
esses animais apresentavam maior concentração espermática (1,7 a 2,4 x
10 9 /mL).
Além
disso,
os
animais
foram
alimentados
com
volumoso
amonizado, que exerce um abaixamento significativo sobre o pH.
Estudos em diversas raças, com animais acima de 48 sem. de idade, têm
mostrado valores de pH na faixa de 6,5 a 7,0 (MORAES et al., 1981;
FREITAS & NUNES, 1992; IBRAHIM et al., 1997) Entretanto, em todos
esses estudos, a concentração espermática dos animais estava bem acima
daquela encontrada em nossos animais. Baseando-se nos resultados de
SALGUEIRO & NUNES (1999) para concentração espermática em carneiros
Santa Inês com 81 sem. de idade, seria de se esperar que a concentração
espermática dos animais aumentasse à medida que atingissem a maturidade
sexual, levando à conseqüente redução nos valores de pH seminal. Vale
ressaltar que mesmo esses valores mais elevados de pH não causaram danos
ao metabolismo espermático, uma vez que os demais parâmetros seminais
estavam dentro da faixa preconizada para animais desta raça. Esses resultados
validam achados anteriores para esta raça (SOUZA et al., 2000) para os diversos
parâmetros seminais, em animais manejados de forma semelhante, mostrando
que, após 30 sem. de idade, ocorre melhora consistente nas características
seminais dos animais, permitindo seu uso como reprodutores somente após esta
idade.
75
4.5.2. Proteínas Seminais Totais
A concentração protéica total do plasma seminal elevou-se gradualmente
até às 24 sem. de idade (FIGURA 16). Os aumentos foram mais pronunciados
entre 15 e 18 sem. (3,00 ± 0,00 para 14,16 ± 3,46 mg/mL) e entre 38 e 48 sem.
de vida (14,93 ± 1,16 para 19,95 ± 0,88 mg/mL).
Concentrações de proteínas no plasma seminal variando de 0,7 a 2,1
mg/mL são capazes de reduzir os danos causados a espermatozóides ovinos pelo
processo de congelamento dessas células (PÉREZ-PÉ et al., 2001). Estes
resultados foram confirmados por BARRIOS et al. (2000) e AZEREDO et al.
(2001), que observaram que algumas frações protéicas do plasma seminal são
capazes de recuperar a ultra-estrutura e permeabilidade da membrana de
espermatozóides já danificados pelo congelamento.
25
Proteína (mg/mL)
20
b, c
15
b
b, c
b, c
c
c
c
b
b
b
b
10
5
a
0
12
17
22
27
32
37
42
47
Idade (sem anas)
FIGURA 16 – Variações na concentração protéica do sêmen em função da idade, em ovinos
da raça Santa Inês.
Médias de 16 animais; as barras verticais representam os respectivos erros-padrão das médias.
Valores com as mesmas letras não diferem significativamente (α = 0,05).
Conforme observado, a concentração de proteínas seminais cresce em
paralelo com os níveis plasmáticos de testosterona, desenvolvimento sexual e
produção de espermatozóides. Inúmeras proteínas presentes no plasma
76
seminal foram associadas aos parâmetros de qualidade do sêmen (KILLIAN et
al., 1993; SPROTT et al., 2000; FOUCHÉCOURT et al., 1999; 2002; LA
FALCI et al., 2002). Dentre elas, a ABP (androgen-binding protein) (JÉGOU
et al., 1979) é secretada pelas células de Sertoli (HAGENAS et al., 1975;
COUROT,
1980)
e
é
responsável
pelo
transporte
e
concentração
de
andrógenos nos testículos e epidídimos (HANSSON et al., 1975; COUROT,
1980; CARREAU et al., 1984), onde estimulam a síntese de receptores de
andrógenos,
afetando
os
processos
de
espermatogênese
e
maturação
espermática epididimal (COUROT, 1980).
De fato, o epidídimo possui inúmeros receptores para hormônios
esteróides, especialmente receptores para andrógenos. A testosterona penetra
nas células e é convertida em 5α-dihidrotestosterona (DHT) pela 5α-redutase
(LINDZEY et al., 1993). A DHT modula a expressão de inúmeras proteínas
epididimais andrógeno dependentes (FOURNIER-DELPECH et al., 1981;
RODRÍGUEZ et al., 2001). CARREAU et al. (1984) demonstraram que em
animais
de
7
sem.
de
idade
as
regiões
do
epidídimo
apresentam-se
indiferenciadas, e a ABP não é detectável. Por ocasião da puberdade, quando
se inicia a diferenciação das células epididimais, observou-se concentrações
crescentes de testosterona plasmática e no conteúdo epididimal de ABP e
testosterona. Nessa ocasião, inicia-se a secreção de uma série de proteínas e
glicoproteínas
estimuladas
pela
testosterona
(FOURNIER-DELPECH
&
COUROT, 1980; FOUCHÉCOURT et al., 1999). Entre elas, a prealbumin
epididymal specific (PES – 64 kDa) liga-se à região periacrossômica de
espermatozóides imaturos e permanece ligada mesmo após a ejaculação,
podendo estar envolvida nos processos de reação acrossômica (FOURNIERDELPECH et al., 1988ab). A testosterona ativa também a função secretória
77
das glândulas sexuais acessórias (SALISBURY et al., 1978), as quais também
contribuem com a composição protéica do plasma seminal (HENAULT et al.,
1995).
Entre outros fatores, a secreção dessas proteínas é bastante influenciada
pelo plano nutricional dos animais. EL-AZAB et al. (1998) observaram que
sua concentração elevou-se de 16,1 mg/mL para 39 mg/mL devido a
amonização do volumoso, de maneira dose dependente. Possivelmente, o
aumento do total de proteína bruta das dietas foi responsável por esse
crescimento na secreção protéica. PINHEIRO et al. (1996) observaram
comportamento idêntico em caprinos, com diferença significativa na secreção
protéica do plasma seminal ao longo do ano, sendo maior na estação chuvosa
(42,7 mg/mL) que na seca (34,1 mg/mL).
Essas proteínas têm ação tamponante, auxiliando na regulação de
osmolaridade e pH seminal (EL-AZAB et al., 1998; MACHADO et al., 1999).
Entretanto, apesar do aumento na secreção protéica, o pH seminal reduziu-se
no mesmo período. Este achado, aparentemente contraditório, explica-se pelo
fato de que a concentração espermática cresceu em magnitude muito maior
que a protéica, sobrepujando sua capacidade tamponante. De fato, com o
aumento da idade e da concentração protéica, os valores de pH devem cair
para sua faixa normal, entre 6,4 e 7,2 (MORAES et al., 1981; PINHEIRO et
al., 1996). Esta queda é vantajosa para os espermatozóides, pois a frutólise
torna-se mais lenta, reduzindo o consumo de nutrientes (MANN, 1975).
Nossos achados são semelhantes àqueles descritos por EL-AZAB et al.
(1998), que observaram redução no pH de animais alimentados com volumoso
amonizado em comparação àqueles sem amonização, apesar de um aumento na
secreção protéica, devido a aumentos na concentração espermática, e àqueles
78
relatados por EL-CHAHIDA et al. (1977), que observaram correlação
negativa entre a concentração espermática e o pH seminal.
O presente trabalho é pioneiro na descrição detalhada de aspectos
ligados ao desenvolvimento sexual de cordeiros da raça Santa Inês durante o
primeiro ano de vida, incluindo aspectos de desenvolvimento ponderal,
testicular, secreção de testosterona, qualidade do sêmen e proteínas do plasma
seminal.
Os resultados mostram que à medida que aumentos do peso vivo dos
animais a partir de 8 semanas de idade são acompanhados por crescimento
testicular, avaliado pelo comprimento, diâmetro e circunferência escrotal até
cerca de 36 sem. de idade, quando estes valores se estabilizam, apesar do
aumento contínuo no peso vivo. O crescimento testicular é acompanhado por
aumento na secreção de testosterona, que atingiu um pico às 42 sem. de idade,
e pelo aparecimento de espermatozóides no ejaculado dos animais a partir de
23 sem. de idade. Daí em diante, os animais apresentaram uma fase onde a
qualidade seminal melhora rapidamente, entre 23 e 30 sem. de idade. A partir
de 36 sem. de idade, os animais já apresentavam qualidade seminal típica de
animais maduros, à exceção da concentração espermática, cujos maiores
aumentos se deram um pouco mais tarde.
Esta sincronia entre o crescimento testicular, secreção de testosterona e
produção espermática resultou ainda num aumento gradual na concentração
total de proteínas no plasma seminal. Esta elevação na concentração protéica
se deve, em parte, a uma ativação da diferenciação celular no epidídimo e
glândulas sexuais acessórias, mediadas pela testosterona, que ocorre por volta
da puberdade (CARREAU et al., 1984) e que resulta em um processo ativo de
secreção protéica.
79
4.5.3. Perfil Eletroforético do Plasma Seminal
Com relação à análise eletroforética, existe uma grande abundância de
proteínas no plasma seminal. Uma ampla gama de proteínas foi detectada,
variando de 5,9 a 170 kDa. Em todas as idades, as proteínas de massa
molecular abaixo de 10 kDa foram as mais abundantes. Entre elas, aquelas
com massa molecular de 8,7 a 9,5; 16-16,6 kDa e 21 kDa estavam sempre
presentes entre 15 e 33 sem. de idade (FIGURA 17).
A
B
C
D
E
F
G
H
250
160
105
75
50
35
30
25
21 kDa
16 a 16,6 kDa
8,7 a 9,5 kDa
15
10
FIGURA 17 – Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de ovinos da
raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A – G correspondem a
diferentes animais. H corresponde aos marcadores moleculares, variando de
10 a 250 kDa.
THÉRIEN et al., (1998; 1999) identificaram uma proteína de massa
molecular de 16-16,5 kDa presente no plasma seminal bovino, denominada
BSP A3. Esta proteína estava relacionada a alterações sofridas na membrana
espermática associadas ao processo de capacitação. Com relação à proteína de
21 kDa, FOUCHÉCOURT et al. (2002) identificaram no plasma seminal ovino
uma proteína de massa molecular 21,1 kDa, composta de 191 aminoácidos e
80
identificada como sendo a enzima prostaglandina-D-sintetase. Em touros,
KILLIAN et al. (1993) observaram que animais com maior abundância dessa
proteína no plasma seminal apresentaram maior taxa de fertilidade após IA
com sêmen congelado. Entretanto, em bovinos, ela apresenta massa de 26
kDa.
Aquelas com massa molecular acima de 70 kDa apresentaram grande
variação entre idades e entre animais. Possivelmente, elas constituíam
complexos protéicos maiores e, à medida que os animais se desenvolviam
foram hidrolisados ou glicosilados para sua ativação. No entanto, uma banda
com massa molecular de 86 kDa era característica de animais a partir de 30
sem. de idade, quando os parâmetros seminais, como um todo, começaram a
apresentar melhoras significativas.
Foi detectado que às 28 sem. de idade, animais que apresentavam maior
motilidade
massal
e
motilidade
progressiva
(acima
de
2,5
e
62%,
respectivamente) apresentavam uma banda de massa molecular de 64 kDa.
Essa banda estava presente apenas em um animal com parâmetros inferiores a
estes. FOURNIER-DELPECH et al. (1988ab) observaram que animais após 25
sem. de idade passavam a apresentar uma proteína epididimal de 64 kDa,
denominada PES, a qual se ligava aos espermatozóides, e permanecia ligada,
mesmo após a ejaculação. Levantou-se a hipótese de essa proteína estar
associada aos processos de reação acrossômica, uma vez que ela se ligava à
região periacrossômica, mas seu mecanismo de ação ou outras funções não
foram elucidadas. A partir de 30 sem. de idade, essa proteína passou a ser
expressa por maior número de animais, coincidindo com melhora nos
parâmetros seminais, e não era mais exclusiva dos animais com os maiores
valores de motilidade. Possivelmente, a partir de 30 sem. de idade, como essa
81
proteína passou a ser expressa por um maior número de animais, sua ligação
com a motilidade não foi mais evidente. De fato, a motilidade espermática é
dependente de vários outros fatores (MORAES et al., 1981).
Detectou-se, ainda, que uma proteína de 74,3 kDa era secretada no
plasma seminal às 33 sem. de idade somente naqueles animais com maior
número de células de Sertoli por testículo (FIGURA 18). IBRAHIM et al.
(1999) identificaram a clusterina no plasma seminal bovino com massa
molecular de 74 kDa, secretada pelas células de Sertoli e presente no fluido
da cauda do epidídimo. É possível que esta proteína de massa molecular 74,3
kDa seja a clusterina. Entretanto, análises mais detalhadas, incluindo
focalização isoelétrica e sequenciamento, precisam ser realizadas para
confirmar sua identidade.
A
B
C
D
E
F
G
H
250
160
105
75
50
35
30
25
15
10
FIGURA 18 – Perfil protéico do plasma seminal determinado em SDS-PAGE de ovinos da
raça Santa Inês às 33 sem. de idade. As amostras A e D correspondem a
animais com menor população de células de Sertoli. B, C, F e G são amostras
pertencentes àqueles animais com maior população destas células. H
corresponde aos marcadores moleculares, variando de 10 a 250 kDa. A seta
corresponde à banda do fragmento de 74,3 kDa.
82
Conforme foi demonstrado, o plasma seminal ovino apresenta uma
grande
quantidade
e
variedade
de
proteínas.
Essas
proteínas
variam
individualmente e conforme a idade. Contudo, algumas proteínas estão
presentes em todos os animais, e em todas as idades desde 15 até 33 sem. de
vida. Outras, no entanto, foram secretadas apenas em animais com melhores
parâmetros seminais, ou maior número de células de Sertoli por testículo, em
idades específicas.
Não foi possível identificar associações entre outras proteínas e os
parâmetros de qualidade do sêmen de maneira consistente em todas as idades.
Isto
se
deve,
em
parte,
ao
fato
de
que
animais
jovens
apresentam
características seminais instáveis, próprias da fase de puberdade e primeiras
semanas pós-puberdade, de modo que fica difícil associar um único fator
como indicador da qualidade seminal. Em parte, é necessário a realização de
análises mais detalhadas para melhor caracterização e identificação das
proteínas encontradas, uma vez que a eletroforese unidimensional é apenas o
primeiro passo nessa direção.
Vale ressaltar, também, que KILLIAN et al. (1993) encontraram
diferenças no perfil protéico do plasma seminal, mesmo em animais de
parâmetros seminais semelhantes. Esses animais só puderam ser distinguidos
em termos de fertilidade a campo. Isto demonstra que, muitas vezes, a
presença de determinadas proteínas no plasma seminal, mesmo não estando
associadas aos parâmetros de motilidade e concentração espermática, podem
levar a diferenças nos índices de fertilidade.
Um outro fator que dificulta a associação da massa molecular das
proteínas a parâmetros seminais em animais jovens, é o fato de a eletroforese
unidimensional não permitir a identificação de alterações sofridas pelas
83
proteínas após a tradução, como glicosilação ou hidrólise. GATTI et al.
(1999) observaram que a enzima conversora de angiotensina 1 (ACE) é
secretada pelos testículos com massa molecular de 105 kDa, mas, durante o
trânsito epididimal esta proteína sofre alterações e passa a apresentar uma
massa de 94 kDa. IBRAHIM et al. (1999) observaram que a clusterina, ao ser
secretada
no
fluido
da
rete
testis,
apresenta
massa
molecular
de,
aproximadamente, 94 kDa na forma dimérica ou 42 e 43 kDa nas formas
monoméricas. No fluido da cauda do epidídimo, a forma dimérica passa a
apresentar 74 kDa, enquanto as formas monoméricas, com 38, 39 e 40 kDa
passam a ligar-se à membrana espermática. Eles detectaram que essas
alterações de massa molecular se deram por deglicosilação ao longo do
epidídimo.
Portanto, estudos mais detalhados, incluindo focalização isoelétrica e
quantificação da atividade enzimática dessas proteínas nas fases específicas
de desenvolvimento devem ser realizados, para confirmar as associações das
diferentes proteínas com os parâmetros seminais.
4.6. Puberdade
A puberdade constitui uma série de transformações fisiológicas que
resultam na aquisição da capacidade reprodutiva (WOOD & FOSTER, 1998).
Nessa fase, ocorrem alterações no crescimento das gônadas, desenvolvimento de
características sexuais secundárias e, nos machos, produção de espermatozóides a
um ponto onde a reprodução é possível (GANONG, 1991). É o resultado de um
ajuste gradual entre a atividade gonadotrófica crescente e a habilidade das
gônadas de assumir simultaneamente a esteroidogênese e a gametogênese
(YARNEY et al., 1990).
84
Para o manejo reprodutivo adequado de um rebanho, faz-se necessário
conhecer a idade e o peso à puberdade das diferentes raças ovinas. O
conhecimento da idade à puberdade possibilita a introdução e adoção de práticas
simples de manejo, tais como a castração, desmame, separação por sexo e escolha
precoce de animais para a reprodução. Permite também, de forma mais correta, o
estabelecimento da idade para o uso dos animais jovens em reprodução (GIRÃO et
al., 1996) e em programas de seleção visando reduzir o intervalo de gerações
(MADANI & RAHAL, 1988; RENAVILLE et al., 2000).
Por ser um processo complexo, especialmente no macho, é difícil definir
um único evento como sendo seu marco inicial (FRENEAU et al., 2001). Em
pequenos ruminantes, não há consenso quanto ao seu início. A puberdade pode ser
descrita como sendo o início da fertilidade e o período de rápido desenvolvimento
que a precede (BRONSON & RISSMAN, 1986).
A idade à puberdade pode ser determinada através da demonstração da
primeira
ejaculação
CHAKRABORTY
et
com
al.,
espermatozóides
1989;
móveis
BELIBASAKI
&
(TRALDI,
KOUIMTZIS,
1983;
2000;
NISHIMURA et al., 2000), ou através do desbridamento peniano (WIGGINS &
TERRIL, 1953; MOURA et al., 1999; SOUZA et al., 2001). O desbridamento
peniano tem sido apontado como uma conseqüência da ação dos hormônios
testiculares (ELOY & ROSA, 1998). Entretanto, WILDEUS & GIPSON (1994)
consideraram púberes apenas os animais que produziam um ejaculado contendo
espermatozóides com uma motilidade superior a 10%.
De nosso conhecimento, o presente trabalho é inédito no que diz respeito a
proporcionar um quadro detalhado da puberdade em carneiros da raça Santa Inês.
O desprendimento entre a parte livre do pênis e a lâmina mucosa interna do
prepúcio iniciou-se às 9 sem. de idade, sendo concluído em média às 25,87 ± 0,72
85
sem., 2,3 sem. após o aparecimento dos primeiros espermatozóides no ejaculado e
1,9 sem. após o surgimento dos primeiros espermatozóides móveis. Os parâmetros
referentes ao desenvolvimento dos animais nesta fase encontram-se na Tabela 2.
TABELA 2: Parâmetros produtivos e reprodutivos de carneiros da raça Santa
Inês à puberdade (X ± EPM)
Parâmetro
1º SPZ*
1º SPZM*
Idade (semanas)
23,05 ± 0,94a
23,94 ± 0,98a
Desbridamento
Peniano
25,87 ± 0,72b
Peso corporal (kg)
28,09 ± 0,99a
28,63 ± 1,05a
30,69 ± 1,02a
Perímetro torácico (cm)
69,09 ± 0,75a
69,84 ± 0,79ab
71,66 ± 0,67b
Circunferência escrotal (cm)
22,44 ± 0,42a
22,72 ± 0,44a
24,03 ± 0,38b
Comprimento testicular (cm)
6,33 ± 0,17a
6,51 ± 0,20ab
6,87 ± 0,18b
Diâmetro testicular (cm)
4,25 ± 0,09a
4,35 ± 0,09ab
4,53 ± 0,10b
Volume ejaculado (mL)
0,38 ± 0,11a
0,33 ± 0,06b
0,60 ± 0,08a
Motilidade massal (0 – 5)
-
0,06 ± 0,06a
1,04 ± 0,34b
Motilidade (%)
-
18,44 ± 9,14a
43,57 ± 6,49b
Vigor (0 – 5)
-
1,00 ± 0,22a
2,14 ± 0,26b
Alterações morfológicas (%)
75,25 ± 7,26a
60,21 ± 9,65a
54,79 ± 4,34a
Concentração espermática (x 106/mL)
40,00 ± 10,00a
60,00 ± 20,00a
70,00 ± 20,00a
pH
8,89 ± 0,05a
8,90 ± 0,05a
8,66 ± 0,09b
Concentração protéica (mg/mL)
20,39 ± 2,36a
17,77 ± 1,27a
16,14 ± 2,03a
* 1 º SP Z: pr imei ros e s per ma to zói de s; 1ºSPZM : e s pe r ma toz ói des móve is.
L et ra s di f ere nte s na me s ma li nha di fe rem signi fi ca tiva ment e ( P < 0 ,05 ) .
Estes valores estão de acordo com aqueles observados na raça Santa
Inês, que desbridaram o pênis com idades de 24 sem. (SOUZA et al., 2000) e
26,7 sem. (SOUZA et al., 2001), e em animais lanados com 20 sem.
(HOCHEREAU-DE-REVIERS
et
al.,
1987)
e
27,8
sem.
(YARNEY
&
SANFORD, 1993). Em caprinos, o desbridamento peniano ocorreu em idades
de 19 e 20 sem. para animais da raça Marota e mestiços com Anglo-Nubiano
(GIRÃO et al., 1996), 20 sem. em animais de raças leiteiras (SMITH, 1986),
22 sem. na raça Baladi (ABI-SAAB et al., 1997) e 16 sem. para cabritos
86
Saanen
(BECKER-SILVA
et
al.,
1999).
Estes
últimos
apresentaram
espermatozóides no ejaculado às 20 sem., e espermatozóides móveis às 24
sem. de vida. O fato destes animais apresentarem idades médias de 20 e 24
sem. para apresentar espermatozóides imóveis e móveis, respectivamente,
após o desbridamento peniano é explicado pelo fato de que as coletas de
sêmen nesse estudo só tiveram início após o descolamento completo entre o
pênis e o prepúcio. Mesmo na primeira coleta de sêmen, vários animais
(23,08%) já apresentavam espermatozóides móveis no ejaculado, embora as
idades médias tenham sido mais elevadas.
Em cordeiros Suffolk, a idade à puberdade se deu entre 16 e 18 sem. de
idade, com os animais pesando cerca de 40 kg, baseando-se no percentual de
espermatozóides vivos no ejaculado (OLSTER & FOSTER, 1986). Entretanto,
os autores não descreveram que percentual de células vivas foi utilizado para
se considerar o animal púbere. O fato de estes animais serem mais precoces,
provavelmente está relacionado com o desenvolvimento corporal mais rápido
dessa raça, uma vez que os animais entraram em puberdade cerca de 5
semanas mais cedo, pesando 10 kg a mais, em média, enquanto HASSAN et
al. (2003), trabalhando com raças de menor porte, encontraram animais mais
tardios. Nesse sentido, FOSTER (1994) afirmou que o custo energético da
reprodução pode ser alto, especialmente em animais de reprodução estacional,
como os carneiros, onde a competição pela cobrição das fêmeas é grande, no
curto período em que elas são receptivas. Além disso, como a reprodução é
uma função não essencial à sobrevivência do indivíduo, ela apresenta baixa
prioridade energética em animais em crescimento. À medida que o animal
cresce a massa corporal aumenta, reduzindo a relação massa/superfície, e em
conseqüência, a taxa metabólica. Esta redução disponibiliza mais energia para
87
os
processos
reprodutivos
e
permite
o
armazenamento
de
gordura,
acompanhado por aumento nas secreções de gonadotrofinas e esteróides
sexuais (LAFORTUNE et al., 1984).
O
mecanismo
pelo
qual
o
cérebro
reconhece
esses
sinais
está
relacionado à secreção de leptinas (FOSTER & NAGATANI, 1999). A leptina
é uma proteína produzida pelos adipócitos (ZHANG et al., 1994), cujas
concentrações na circulação regulam o apetite (MORRISON et al., 1998), e
sua síntese está correlacionada com a percentagem de gordura corporal
(DELAVAUD et al., 2000). As ações da leptina sobre a secreção de GnRH, o
qual estimula o aumento na secreção de gonadotrofinas característico da
puberdade (OLSTER & FOSTER, 1986), se dão através da disponibilidade de
glicose. FOSTER & NAGATANI (1999) sugeriram que a leptina e a glicose
atuem
conjuntamente
sobre
a
secreção
de
IGF-I.
Uma
vez
que
as
concentrações plasmáticas de IGF-I aumentam significativamente por ocasião
da puberdade em ovinos (ROBERTS et al., 1990), eles sugeriram que este seja
um dos sinais que iniciam o processo de puberdade. Confirmando essa
hipótese, RENAVILLE et al. (2000) observaram que em touros jovens existe
uma elevação nos níveis plasmáticos de IGF-I por ocasião da puberdade,
sendo que esta fase só é atingida com níveis mínimos de 150 ng/mL. Eles
observaram, ainda, que a restrição alimentar leve ou severa reduz os níveis
plasmáticos de IGF-I, retardando o início da puberdade em até 107 dias
(normal: 71 dias).
FOOTE & SIMPLÍCIO (1988) encontraram espermatozóides móveis em
cabritos Moxotó às 18,4 sem. de idade, mas o pênis tornou-se livre do
prepúcio às 17,8 sem. A liberação do pênis é visível e facilmente medida, e já
88
que ocorre imediatamente antes ou logo após a primeira ejaculação de
espermatozóides móveis, representa um método útil para estimar a puberdade.
Ao avaliar a puberdade como o momento da primeira ejaculação em
vagina artificial, HASSAN et al. (2003) detectaram diferenças entre raças
quanto à idade (41; 42 e 48 sem.) e peso (38,7; 41,1 e 35,4 kg),
respectivamente, para as raças Ossimi, Awassi e Chios. Essas diferenças
sugerem que diferentes taxas de crescimento influenciam a idade à puberdade,
e que existe um componente genético, uma vez que todos os animais foram
criados nas mesmas condições, mas a raça Chios atingiu a puberdade mais
tardiamente e com um menor peso. O ejaculado característico da puberdade
apresentou um volume de 0,73 mL, motilidade de 48,3%, com 11,4% de
alterações morfológicas, concentração espermática de 16 x 10 6 /mL e pH de
7,4.
Embora os animais atingissem esse estágio com diferentes pesos e
idades, não houve diferença significativa quanto à qualidade dos ejaculados
em nenhum dos parâmetros. Esses valores mostram-se próximos daqueles
encontrados por nós, e pequenas diferenças, especialmente quanto ao pH,
podem estar relacionadas a diferenças no manejo e alimentação, uma vez que
EL-AZAB et al. (1998) demonstraram que o tipo de volumoso pode exercer
efeito
significativo
sobre
o
pH
seminal,
devido
a
diferenças
na
disponibilidade de nutrientes digestíveis e proteína total. A concentração
desta última no sêmen dos animais seria responsável pelo tamponamento.
Infelizmente,
HASSAN
et
al.
(2003)
não
avaliaram
nesse
estudo
a
concentração protéica do sêmen dos animais.
AUCLAIR et al. (1995) citaram que em cordeiros, o desenvolvimento
puberal é caracterizado por aumentos na freqüência dos pulsos de LH,
89
concentração de testosterona, volume testicular e queda na amplitude dos
pulsos de LH. MANN & LUTWAK-MANN (1981) observaram que, na maioria
dos mamíferos, o modelo de crescimento e desenvolvimento das células de
Leydig exibem duas ondas distintas, uma das quais ocorre por ocasião da
puberdade,
elevando
a
concentração
de
testosterona
e
atividade
espermatogênica intratesticular, sendo que a separação entre o pênis e o
prepúcio é conseqüência da ação dos hormônios testiculares (JOHNSTONE,
1948). Desse modo, tanto o surgimento de espermatozóides no ejaculado
quanto
o
desbridamento
peniano,
característicos
da
puberdade,
são
conseqüência dos mesmos processos fisiológicos, daí ocorrerem de maneira
gradativa e seqüencial.
Baseado
seminal,
nos
animais
achados
de
púberes,
desenvolvimento
caracterizados
testicular
pelo
e
qualidade
aparecimento
de
espermatozóides no ejaculado e pelo desbridamento peniano ainda não
apresentam qualidade seminal compatível com seu uso para reprodução,
devido aos deficientes parâmetros de motilidade e concentração espermática,
associados
ao
elevado
número
de
alterações
morfológicas
totais
nos
ejaculados. A partir de 30 sem. ocorre uma melhora significativa nos
parâmetros de motilidade e às 36 sem., uma redução significativa no
percentual de alterações morfológicas totais. No entanto, somente às 42 sem.
ocorre uma elevação na concentração espermática considerável, tornando os
animais aptos à atividade reprodutiva. Portanto, somente a partir desta idade
os animais apresentam condições de ser utilizados como reprodutores, ou de
permitirem colheita de sêmen para utilização a fresco ou resfriado.
90
4.7. Histologia Testicular
A espermatogênese está dividida em três fases, a espermatocitogênese,
a meiose e a espermiogênese (WROBEL et al., 1994), que são caracterizadas
pela
divisão
e/ou
diferenciação
de
espermatogônias,
espermatócitos
e
espermátides, respectivamente. A transferência dos espermatozóides, imóveis,
para e através do epidídimo está na dependência de contrações peristálticas
dos túbulos seminíferos e da parede do ducto epididimal (BEDFORD, 1975).
Estas são mediadas por camadas celulares de musculatura lisa (células
mióides) dos túbulos seminíferos, estimuladas pela produção parácrina de
ocitocina
(ASSINDER
et
al.,
2000).
A
importância
do
estudo
da
espermatogênese é fundamental para o conhecimento da fisiologia testicular e
para auxiliar a compreensão dos demais parâmetros da avaliação seminal
(WROBEL et al., 1995; CASTRO et al., 1997).
4.7.1. Biometria dos Túbulos Seminíferos
O diâmetro dos túbulos seminíferos é um dos indicadores do estado
funcional dos testículos. Estudos têm mostrado que esta variável está
significativamente correlacionada com a circunferência escrotal e com os
níveis
de
testosterona
em
ovinos
jovens
(GASTEL
et
al.,
1995)
e,
principalmente, adultos (BIELLI et al., 1999). BIELLI et al. (1997) relataram
que alterações estacionais no diâmetro tubular (-23%) são responsáveis pela
regressão
na
circunferência
escrotal
(-17%).
Estas
alterações
foram
desencadeadas por mudanças proporcionais no fotoperíodo, uma vez que o
peso vivo dos animais não se alterou, revelando ausência de efeitos
nutricionais sobrepostos.
91
Em nosso trabalho, os túbulos seminíferos apresentaram diâmetro médio
de 207,12 ± 2,95 µm, com comprimento total de 3.920,29 ± 206,19 m às 50
sem. de idade. De nosso conhecimento, não existem estudos descrevendo estes
parâmetros em ovinos da raça Santa Inês. Em ovinos deslanados adultos, sem
raça definida, o diâmetro médio dos túbulos seminíferos foi de 152,7 µm para
animais abatidos durante a estação seca, e de 171,0 µm naqueles abatidos na
estação chuvosa. Esta diferença foi significativa, demonstrando o efeito da
escassez de alimento sobre o diâmetro tubular (QUEIROZ & CARDOSO,
1989). Confirmando esses achados, BIELLI et al. (1999) observaram que
cordeiros Corriedale de 50 sem. de idade, criados em pastagem melhorada
apresentaram melhor recuperação no diâmetro dos túbulos seminíferos após a
regressão estacional dos testículos que aqueles alimentados em pastagem
nativa (231,1 X 202,6 µm). BIELLI et al. (2001) também mostraram que os
efeitos da nutrição se iniciam desde a gestação. Cordeiros filhos de ovelhas
criadas em pastagem melhorada apresentaram maior diâmetro tubular às 14
sem. de idade (113,92 µm) comparados àqueles filhos de ovelhas criadas em
pasto nativo (72,61 µm).
WROBEL et al. (1995) demonstraram que o diâmetro tubular não varia
em função do estágio do ciclo do epitélio germinativo, tendo encontrado
valores de 228,52 a 233,90 µm em cordeiros Suffolk às 28 sem. de idade.
Com relação à idade, os cordeiros nascem com um diâmetro tubular
médio de 40 µm, o qual cresce rapidamente até atingir cerca de 110 µm às 11
sem. de idade. A partir daí, o crescimento é mais lento, tendendo a se
estabilizar após 22 sem. de idade (200 µm) (COUROT, 1971). Estes achados
foram confirmados por BIELLI et al. (1999; 2001), os quais demonstraram
92
que a idade exerce efeito significativo sobre o diâmetro tubular comparando
animais com 14 e 72 sem. de idade, não havendo diferenças nesse parâmetro
entre animais de 72 e 120 sem. Do mesmo modo, KILGOUR et al. (1998)
encontraram valores de 37,4 µm e 138 m, respectivamente para diâmetro e
comprimento tubular de cordeiros Ile-de-France ao nascimento, evoluindo
para 92,2 µm e 1.043 m às 14 sem. Eles constataram que esse crescimento é
mediado principalmente pelo FSH, uma vez que animais imunizados contra
esse hormônio apresentaram medidas significativamente inferiores. Eles
constataram, ainda, aumento posterior nesses parâmetros, que atingiram 116,1
µm e 1.210 m às 23 sem., com efeito idêntico do FSH.
Já o comprimento tubular parece evoluir de maneira bifásica, em
relação ao peso testicular. Ao longo da vida fetal, seu crescimento é muito
rápido, aumentando suas circunvoluções no parênquima testicular. Elevandose de cerca de 1m em embriões de 40 dias até 200m ao nascimento (X 200).
Entre o nascimento e 11 sem. de vida sua velocidade de crescimento cai para
5X, atingindo cerca de 1000m. Por volta da puberdade, os túbulos atingem
cerca de 3000m, correspondendo a um crescimento de apenas 3X em
comparação com 11 sem. Em animais adultos são citados valores de 2900m
para a raça Ile-de-France e 1608m para a raça Romanov (HOCHEREAU-DEREVIERS, 1990).
4.7.2. Tipos Celulares
Após a diferenciação fetal das gônadas, não se observa atividade
espermatogênica de diferenciação nos testículos ovinos antes da puberdade.
As únicas células observadas são as células germinativas primordiais e as
células de suporte (COUROT, 1971). Estas se multiplicam durante a vida
93
fetal, constituindo cerca de 1 milhão e, após o nascimento, até a puberdade (7
a 8 bilhões), dando origem às células de Sertoli (COUROT et al., 1971;
HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1987). As células de Sertoli estendem-se
da base ao lúmen dos túbulos seminíferos, com prolongações laterais e
luminais em forma de ramos de árvores (RUSSELL, 1993). Estas células
determinam a estrutura geral do epitélio seminífero por meio de junções
intercelulares
envolvendo
as
células
germinativas
e
controlando
seu
posicionamento e metabolismo (BIELLI, 1999). O número de células de
Sertoli está altamente correlacionado com o tamanho testicular adulto, e
define a capacidade de produção de células germinativas (SHARPE, 1994;
BIELLI, 1999). Isto se deve à enorme gama de proteínas secretadas pelas
células de Sertoli (GRISWOLD, 1995), sob estímulo do FSH e testosterona
(COUROT, 1988; KILGOUR et al., 1993; GRISWOLD, 1998), as quais
regulam o metabolismo das células germinativa.
Como a duração que a do ciclo espermatogênico em carneiros dura 50
dias (ORTAVANT, 1958) e o trânsito epididimário dura 16 dias (AMMAN,
1981), a espermatogênese deve ter começado por volta da 13 sem. de vida,
uma vez que os primeiros espermatozóides no ejaculado de nossos ovinos
apareceram com cerca de 23 sem. de idade.
A altura do epitélio germinativo revela o grau de funcionalidade tubular
(COUROT, 1971). Há um aumento progressivo da altura entre o nascimento e
a puberdade, quando ele atinge sua espessura máxima e estabiliza-se
(STEGER & WROBEL, 1996). No entanto, este parâmetro independe da fase
do ciclo do epitélio seminífero (WROBEL et al., 1995). No presente trabalho
foi observada uma altura epitelial de 70,88 ± 1,49 µm em cordeiros Santa Inês
94
às 50 sem. de idade. Estes achados estão de acordo com os achados de
cordeiros Merino com 24 a 28 sem. de idade, que apresentaram altura epitelial
de 76,11 a 85,03 µm (WROBEL et al., 1995).
Os valores médios de células germinativas encontradas por seção
transversal estão de acordo com os observados em outras raças ovinas
(TABELA 3).
TABELA 3: Número por seção transversal e por testículo e produção diária de
células germinativas de carneiros da raça Santa Inês abatidos às 50
semanas de idade (X ± EPM)
Por Seção
Transversal
Tipo Celular
Por Testículo
População
População
(x10 9 )
Produção
Diária (x10 7 )
Espermatogônias A
1,18 ± 0,11
0,56 ± 0,05
5,35 ± 0,47
Espermatogônias Intermediárias
1,23 ± 0,15
0,65 ± 0,09
6,22 ± 0,88
Espermatogônias B
5,20 ± 0,55
1,96 ± 0,25
18,85 ± 2,40
Espermatócitos em Leptóteno
21,71 ± 1,78
7,71 ± 0,61
74,20 ± 5,80
Espermatócitos em Paquíteno
44,96 ± 1,93
13,31 ± 0,87
128,00 ± 8,30
Espermátides Arredondadas
145,73 ± 7,11
53,84 ± 4,38
517,70 ± 42,10
Não existem na literatura, dados referentes aos parâmetros histológicos
em carneiros da raça Santa Inês. Em ovinos deslanados sem raça definida, foi
detectado um total de 1,4 espermatogônias A, 7,6 espermatogônias B e 16,9
espermatócitos I em leptóteno por seção transversal de túbulo seminífero,
durante a estação seca. Estes valores aumentaram para 1,5; 11,0 e 23,7,
respectivamente,
sendo
significativos
para
espermatogônias
B
e
espermatócitos (QUEIROZ & CARDOSO, 1989). Estes resultados estão
próximos
aos
demonstrados
nesse
trabalho,
e
mostram
o
efeito
da
95
disponibilidade de alimentos sobre a população de células germinativas, à
exceção
das
espermatogônias
A,
mediada
por
menor
secreção
de
gonadotrofinas, especialmente o FSH, uma vez que este hormônio não
influencia a população de espermatogônias A, mas é essencial para produção
de espermatogônias intermediárias e B (KILGOUR et al., 1993; 1994).
KILGOUR et al. (1993) encontraram, em animais Corriedale com 120
sem. de idade, uma população de 0,35 x 10 9 espermatogônias A por testículo,
muito próximo do nosso, que foi de 0,56 x 10 9 . Eles mostraram que esse valor
não foi afetado pela imunização contra o FSH. Com relação à produção diária
de células germinativas (x 10 7 /testículo) foram observados os seguintes
valores:
3,8
espermatogônias
A,
61,8
espermatogônias
B,
129,8
espermatócitos em leptóteno, 126,6 espermatócitos em paquíteno e 455,5
espermátides arredondadas. Esses números são significativamente afetados
pela imunização contra o FSH, mas não contra o LH (KILGOUR et al., 1994).
Estes valores também estão de acordo com os nossos achados. No entanto,
apesar dos cordeiros Santa Inês apresentarem menor produção diária de
espermatogônias
B
e
espermatócitos
em
leptóteno,
a
produção
de
espermátides arredondadas foi maior. É possível que uma maior taxa de
apoptose tenha ocorrido nos estágios intermediários da espermatogênese,
especialmente na meiose (WROBEL et al., 1994; SANTOS, 1999), resultando
em menor produção de espermátides.
BIELLI et al. (2000) trabalhando com cordeiros Corriedale encontraram
uma população de 6,91 x 10 9 espermátides alongadas por testículo. Esse valor
está muito aquém daquele relatado para espermátides arredondadas nos
cordeiros Santa Inês e em outras raças (COUROT, 1971; HOCHEREAU-DE-
96
REVIERS et al., 1987; KILGOUR et al., 1993; 1994; 1998). A explicação
para essa diferença pode estar relacionada ao manejo nutricional dos animais,
uma vez que eles foram criados em pastagem nativa melhorada. BIELLI et al.
(1999) demonstraram que uma baixa disponibilidade alimentar pode reduzir
significativamente o número de espermátides alongadas por testículo. Em
nosso caso, os animais foram criados em confinamento, presumivelmente
recebendo maior quantidade de proteína e nutrientes digestíveis.
Com
relação
à
produção
diária
de
células
germinativas,
foram
encontrados os seguintes resultados (x10 9 ) para animais das raças Ile-deFrance e Romanov, respectivamente: 3,8 e 2,2 espermatogônias A1, 110,0 e
70,0 espermatócitos I em leptóteno e 330,0 e 190,0 espermátides arredondadas
(HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1990).
As células de Sertoli multiplicam-se principalmente durante a vida
fetal, aumentando seu número em 500X (COUROT, 1971), mas também após o
nascimento, até a puberdade (COUROT, 1971; HOCHEREAU-DE-REVIERS,
1987). Após essa fase, a população se estabiliza, não sofrendo efeitos
significativos
da
estação
do
ano
(HOCHEREAU-DE-REVIERS,
1987;
QUEIROZ & CARDOSO, 1989) nem de restrição alimentar (BIELLI et al.,
2000), mas seu número é significativamente reduzido por imunização contra o
FSH na fase pré-púbere (nascimento às 23 sem. de idade).
Após a puberdade, as células de Sertoli diferenciam-se gradualmente,
aumentando o tamanho de seu núcleo e citoplasma (MONET-KUNTZ et al.,
1984) e na quantidade de receptores para FSH (YARNEY & SANFORD, 1985;
1989) e testosterona (CARREAU et al., 1979). Esses eventos fazem com que
aumente sua capacidade de secreção de proteínas e estradiol (GRISWOLD,
97
1998), importantes na regulação do metabolismo das células germinativas.
Seu volume altera-se ao longo do ciclo do epitélio seminífero, sendo maior
durante a meiose (WROBEL et al., 1995), mostrando a flexibilidade desta
célula.
Na presente pesquisa foram observadas 14,94 ± 0,38 células de Sertoli
por seção transversal de túbulo seminífero. Em ovinos deslanados sem raça
definida, foram encontrados valores de 16,2 durante a época seca e 17,0
durante a chuvosa, sem diferença significativa (QUEIROZ & CARDOSO,
1989). COUROT et al. (1971) observaram que o número de células de Sertoli
por seção de túbulo seminífero aumenta exponencialmente com o peso
testicular entre o nascimento e 11 sem. de idade, quando tende a estabilizarse, com pequenos aumentos até a puberdade.
Em cordeiros Merino hipofisectomizados às 7 sem. de vida, o número
de células de Sertoli por seção de túbulo seminífero reduz-se rapidamente, até
se
estabilizar
16
dias
depois
(COUROT,
1971).
Dentre
as
células
sobreviventes, um grupo apresenta redução nuclear e citoplasmática, com
estruturas enegrecidas. Outro grupo apresenta citoplasma mais claro, contudo,
com retículo endoplasmático regredido e com menos ribossomos. Além disso,
essas
células
nunca
se
desenvolvem
em
células
de
Sertoli
maduras,
características de animais não submetidos ao processo. Esses efeitos estão
associados, em especial, ao FSH (KILGOUR et al., 1993), uma vez que a
imunização contra o LH não surtiu efeitos adversos à população de células de
Sertoli (KILGOUR et al., 1994).
Em nosso trabalho, o número total de células de Sertoli por testículo foi
de 7,72 ± 0,45 x 10 9 , com 41,05 x 10 6 células por grama de parênquima
98
testicular e 42,31 x 10 6 células por mililitro de parênquima. Esse população
foi superior à encontrada em ovinos Corriedale às 72 sem. (4,13 a 5,19 x 10 9 )
ou 120 sem. (4,51 a 5,57 x 10 9 ) de vida (BIELLI et al. 2000). Já em ovinos
Ile-de-France
(COUROT,
1971)
observou-se
um
crescimento
em
sua
população de 1,5 x 10 6 no embrião de 40 dias, tendo os animais nascido com
0,5 x 10 9 e atingido 4,5 e 8 x 10 9 as 11 e 23 sem. de idade, respectivamente.
Em animais Ile-de-France, foram observados valores de 2,8 x 10 9 e 1,36 x 10 9
para animais da raça Romanov, ambos às 72 sem. de vida (HOCHEREAU-DEREVIERS, 1990).
BIELLI et al. (2001) mostraram que ovelhas suplementadas durante a
gestação produzem cordeiros que tendem a ter maior número de células de
Sertoli às 25 sem. de idade. No entanto, após o nascimento, BIELLI et al.
(2000) não encontraram diferenças na população testicular de células de
Sertoli em animais criados em pastagem nativa ou melhorada às 72 sem. de
idade,
confirmando
os
achados
em
ovinos
deslanados
(QUEIROZ
&
CARDOSO, 1989). Estes efeitos também foram observados em carneiros
Merino às 144 sem. (HÖTZEL et al., 1998). Animais alimentados com dietas
que
permitiam
o
ganho
de
142
g/dia
apresentaram
um
número
significativamente maior de células de Sertoli/testículo (12 x 10 9 ) que aqueles
recebendo dietas que levaram a uma perda diária de peso da mesma magnitude
(7,7 x 10 9 ). Embora as células de Sertoli não mais se dividam após a
puberdade, é possível que nos animais alimentados com a dieta que levou a
perda de peso, tenha havido morte de parte da população de células de Sertoli,
levando a essas diferenças. Além do menor aporte de nutrientes (os animais
diferiram no peso vivo em 30 kg), os animais mais mal alimentados
99
apresentaram concentrações de FSH significativamente menores, e o FSH
controla as divisões das células de Sertoli (COUROT et al., 1971).
De fato, o FSH se mostra também fundamental para o metabolismo das
células de Sertoli (GRISWOLD et al., 1995). Carneiros Ile-de-France
imunizados ao nascimento o FSH apresentaram número significativamente
menor de células de Sertoli por testículo às 23 sem. (1,73 x 10 9 ) comparados
com aqueles não imunizados (3,04 x 10 9 ) (KILGOUR et al., 1998). Em
animais adultos da mesma raça, imunizados às 120 sem. de idade, durante 20
dias, as células de Sertoli apresentaram menor área superficial comparado
àqueles não imunizados (KILGOUR et al., 1993). Esses efeitos foram devidos
particularmente ao FSH, uma vez que animais imunizados contra o LH não
mostraram alterações (KILGOUR et al., 1994). Embora o total de células de
Sertoli de carneiros Santa Inês tenha sido maior que a população citada em
alguns
trabalhos
com
outras
raça,
tais
diferenças
já
foram
relatadas
(HOCHEREAU-DE-REVIERS, et al. 1984; 1990).
4.7.3. Relações entre os Tipos Celulares
A
contagem
das
células
germinativas
e
de
Sertoli
em
seções
transversais de túbulos seminíferos e suas proporções refletem o rendimento e
a eficiência do processo espermatogênico (QUEIROZ & CARDOSO, 1989),
permitindo a estimação das perdas ocorridas no processo.
O carneiro apresenta seis divisões espermatogoniais, sendo três do tipo
A, uma intermediária e duas do tipo B (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al.,
1987),
sendo
que
essas
divisões
são
altamente
dependentes
do
FSH
(KILGOUR et al., 1993). A eficiência das mitoses espermatogoniais é
100
avaliada pela razão entre o número de espermatócitos em leptóteno e o
número de espermatogônias A. Em nosso trabalho, foi obtido o valor de 14,80
± 1,29. Trabalhos com animais lanados mostram um valor da ordem de 16 em
animais adultos (ORTAVANT et al., 1977) e 12,07 a 15,80 para animais
deslanados abatidos na época seca e chuvosa, respectivamente.
A
razão
entre
os
demais
tipos
de
células
germinativas
por
espermatogônia A foi: 1,28 ± 0,21 espermatogônia intermediária, 3,81 ± 0,56
espermatogônias B, 25,29 ± 1,77 espermatócitos em paquíteno e 103 ± 9,03
espermátides arredondadas. Encontramos ainda uma proporção de 4,02 ± 0,12
espermátides arredondadas por espermatócito em paquíteno.
A proporção entre as células germinativas e de Sertoli fornece uma
estimativa da capacidade de suporte destas últimas. Nós encontramos os
seguintes resultados para essa proporção: 0,08 ± 0,01 espermatogônias A,
0,09 ± 0,01 espermatogônias intermediárias, 0,35 ± 0,04 espermatogônias B,
1,44 ± 0,10 espermatócitos I em leptóteno, 3,01 ± 0,12 espermatócitos I em
paquíteno e 9,79 ± 0,46 espermátides arredondadas. KILGOUR et al. (1998),
encontrou proporção semelhante à nossa, de 0,06 espermatogônias A por
célula de Sertoli, em cordeiros Ile-de-France abatidos com 23 sem. de idade.
No entanto, HOCHEREAU-DE-REVIERS et al. (1990) encontraram
valores de 1,19 e 1,41 espermátides arredondadas por célula de Sertoli,
respectivamente para as raças Ile-de-France e Romanov. Estes autores
observaram diferenças significativas entre as duas raças para este parâmetro,
indicando que as células de Sertoli das diversas raças apresentam diferentes
capacidade de suporte. Ainda assim, a grande diferença observada entre esses
resultados e os nossos pode refletir diferenças no método utilizado para sua
101
determinação, no número de seções contadas e na seleção subjetiva do tipo
celular.
4.7.4. Diâmetro dos Tipos Celulares
Os valores encontrados para o diâmetro do núcleo e nucléolo das
células
de
Sertoli
foram
de
9,57
±
0,15
µm
e
2,58
±
0,04
µm,
respectivamente. Até onde nós sabemos, não existem estudos relatando esses
valores para ovinos da raça Santa Inês, ou qualquer outra raça de ovinos
deslanados. Em carneiros Ile-de-France, KILGOUR et al. (1998) observaram a
seguinte evolução para o diâmetro nuclear das células de Sertoli: 5,44 µm ao
nascimento, 6,8 µm às 14 sem. e 8,4 µm às 23 sem. de idade. Detectaram
ainda que os dois últimos valores são reduzidos significativamente em
animais imunizados contra o FSH, revelando a importância desse hormônio na
regulação de seu metabolismo. Já em animais Merino, STEGER & WROBEL
(1996) observaram células de Sertoli cujo núcleo apresentava diâmetro de 9
µm em animais com 12 a 18 sem. de idade. Em cordeiros Suffolk, foram
relatados valores de 481,35 a 549,75 µm³ para o volume das células de
Sertoli, variando conforme o estágio do ciclo do epitélio seminífero
(WROBEL et al., 1995).
Com
relação
às
células
germinativas,
as
espermatogônias
A
apresentaram diâmetro nuclear e nucleolar de 9,18 ± 0,13 µm e 3,18 ± 0,08
µm, respectivamente. Em carneiros Merino, com idades de 2 a 20 sem., o
diâmetro médio das espermatogônias A foi de 8,65 µm (STEGER &
WROBEL, 1996), mostrando que o volume nuclear dessas células não varia
significativamente
entre
essas
idades.
Em
relação
as
espermatogônias
102
intermediária e B, os diâmetros nucleares foram respectivamente de 6,86 ±
0,12 µm e 5,60 ± 0,13 µm. Esses valores assemelham-se aos encontrados em
cordeiros Suffolk, que variaram de 7,52 a 8,41 µm, conforme o estágio do
CES (WROBEL et al., 1995). Em relação aos espermatócitos, os valores para
o diâmetro nuclear das células em leptóteno e paquíteno foram de 5,83 ± 0,10
µm e 8,24 ± 0,14 µm, respectivamente. WROBEL et al. (1995) encontraram
valores de 7,68 µm para os leptótenos e 10,03 a 10,85 µm para os paquítenos,
conforme o estágio do ciclo do epitélio seminífero. Finalmente, com relação
as espermátides arredondadas, os cordeiros Santa Inês apresentaram diâmetro
nuclear de 5,69 ± 0,05 µm. Valores pouco maiores foram observados em
cordeiros Suffolk, sendo de 7,13 µm no estágio 8 e 6,87 µm no estágio 1 do
CES (WROBEL et al., 1995).
Coletivamente, esses achados mostram que o núcleo das células
germinativas e de Sertoli não apresentam grandes variações em animais de
diferentes raças e idades. Por outro lado, o estágio do ciclo do epitélio
seminífero afeta significativamente estas variáveis, considerando que as
células germinativas estão em processos de mitose e meiose, e as células de
Sertoli possuem diferentes demandas metabólicas conforme o tipo de célula
germinativa que está sendo suportada, uma vez que se alteram também seu
volume citoplasmático, e tipo e distribuição das organelas (WROBEL et al.,
1995).
103
4.8. Correlações
4.8.1. Desenvolvimento Ponderal
O perímetro torácico (PT) às 48 sem. apresentou correlação com o PT
medido a partir das 8 sem. de idade (r = 0,55; P = 0,02), incluindo às 18 sem.
(r = 0,51; P = 0,04), às 28 sem. (r = 0,76; P<0,01) e às 38 sem. de idade (r =
0,82; P<0,01). O PT apresentou correlação significativa com o peso vivo
entre 8 e 48 sem. de idade (r = 0,70 a 0,95; P<0,01), mas estas correlações
apresentaram maior magnitude até 30 sem. de idade (r = 0,76 a 0,95; P<0,01)
do que após esse período (0,70 a 0,89). O PT entre 8 e 48 sem. esteve ainda
correlacionado com o peso ao abate (r = 0,66 a 0,83; P<0,01) e peso de
carcaça (r = 0,68 a 0,79; P<0,01).Estes resultados mostram que o perímetro
torácico medido na pré-puberdade e puberdade é um bom indicador do
desempenho produtivo dos animais pós-púberes. Após 30 sem. de idade, o
crescimento do tórax tende a estar menos associado ao peso corporal.
O perímetro torácico também esteve relacionado com as medidas de
biometria testicular, incluindo a circunferência escrotal (r = 0,55 a 0,86;
P<0,01), comprimento (r = 0,56 a 0,92; P<0,01) e diâmetro testicular (r =
0,49 a 0,83; P<0,05) entre 8 e 36 sem. de idade. Porém, após 36 sem. estas
correlações não foram significativas (P>0,05). O PT apresentou ainda
correlação com o grau de evolução do desbridamento peniano nas fases prépúbere e púbere (r = 0,54 a 0,84; P<0,05), e entre 8 e 14 sem. de idade,
também esteve correlacionado com as concentrações basais de testosterona às
23 sem. de idade (r = 0,49 a 0,62; P<0,04). O fato do perímetro torácico estar
correlacionado com o desbridamento peniano e com as concentrações de
testosterona por volta da puberdade indica que este hormônio constitui um
104
fator comum no desenvolvimento de ambas as características. Estes resultados
confirmam achados anteriores para a raça Santa Inês (SOUZA et al., 2000;
SOUZA et al., 2001), mas este é o primeiro estudo a mostrar correlações entre
o perímetro torácico e as concentrações basais de testosterona. De fato, a
testosterona exerce um efeito anabólico sobre o crescimento esquelético em
cordeiros e, de maneira particular, sobre a taxa de mitoses dos condrócitos
(PERALTA et al., 1994).
O peso vivo (P) medido às 48 sem. de idade esteve correlacionado com
o peso vivo a partir de 8 sem. de idade (0,54 a 0,99; P<0,01), resultados
semelhantes aos observados em cordeiros mestiços (½ e ¾ Santa Inês X SRD)
entre 8 e 16 sem. de idade (r = 0,81 a 0,95; SILVA & ARAÚJO, 2000) e em
animais Santa Inês entre as 4 e 30 sem. de idade (r > 0,65; QUESADA et al.,
2002). O peso vivo avaliado entre 8 e 48 sem. de idade esteve ainda
correlacionado com o peso ao abate (r = 0,71 a 0,91; P<0,01) e com o peso de
carcaça (r = 0,77 a 0,94; P<0,01). Contudo, apenas o peso entre 8 e 12 sem.
esteve correlacionado com o rendimento de carcaça (r = 0,53 a 0,62; P<0,05),
embora correlações de menor magnitude tenham sido observadas quando os
animais foram pesados em outras idades (r = 0,12 a 0,34; P<0,10).
Provavelmente, estes resultados podem indicar alguma associação entre peso
vivo e peso de carcaça, mas os valores são pouco expressivos e de reduzida
significância estatística com relação ao rendimento de carcaça, sugerindo que
esta variável é influenciada por vários fatores, os quais não foram avaliados
em detalhes no presente trabalho. Um desses fatores seria a idade ao abate,
mas não do peso, uma vez que cordeiros Santa Inês abatidos em diferentes
faixas de peso às 24 sem. de idade apresentaram rendimentos de carcaça
105
idênticos, apesar de diferenças significativas no peso vivo, com correlações
de baixa magnitude entre estas variáveis (SOUZA et al., 1998). Contudo,
foram observadas correlações semelhantes às desse trabalho entre peso vivo e
de carcaça. Estes achados mostram que o peso vivo avaliado em cordeiros
jovens pode ser utilizado para estimar o peso dos animais às 50 sem. de idade,
bem como o peso de carcaça. O peso vivo entre 8 e 18 sem. de idade
correlacionou-se com as concentrações basais de testosterona às 23 sem. de
idade (r = 0,49 a 0,60; P<0,05) e os animais mais pesados entre 8 e 32 sem.
de idade foram os mais precoces com relação ao desbridamento peniano (r = 0,57
a
-0,88;
P<0,01),
e
à
idade
do
aparecimento
dos
primeiros
espermatozóides (r = -0,54 a -0,85; P<0,01) e espermatozóides móveis no
ejaculado (r = -0,50 a -0,83; P<0,01).
O peso vivo correlacionou-se com as medidas de circunferência escrotal
(r = 0,58 a 0,86; P<0,01), comprimento (r = 0,58 a 0,91; P<0,01) e diâmetro
testicular (r = 0,52 a 0,86; P<0,01) entre 8 e 42 sem. de vida, mostrando que
já às 8 sem. há uma intrínseca interação entre os eventos que coordenam o
desenvolvimento ponderal e sexual. Estas correlações tenderam a diminuir
com a idade, não sendo mais significativas a partir de 44 sem. de idade.
Relações semelhantes entre o peso corporal e biometria testicular foram
relatadas para a raça Santa Inês (SOUZA et al., 2000; 2001) confirmando
esses achados. Correlações semelhantes, porém de menor magnitude (r = 0,65
a 0,74) foram relatadas entre peso vivo e biometria testicular em cordeiros
Horros e Menz às 24 e 36 sem. de idade para CE e entre 24 e 48 sem. (r =
0,60 a 0,68) para o diâmetro testicular (TOE et al., 2000). Na presente
pesquisa, correlações semelhantes àquelas observadas por YARNEY et al.
106
(1990) foram obtidas entre P e CE (r = 0,56 a 0,96) e diâmetro testicular (r =
0,86) de cordeiros Suffolk entre 4 e 27 sem. de idade. De fato, o peso
corporal, embora bom indicador do diâmetro testicular antes da puberdade,
apresenta pouca relação com o diâmetro após esta fase (YARNEY &
SANFORD, 1993).
O peso vivo entre 33 e 48 sem. está correlacionado com o peso
testicular (r = 0,49 a 0,63; P<0,05) e entre 38 e 48 sem. com o peso do
epidídimo (r = 0,50 a 0,55; P<0,05) às 50 sem. de idade. Foram detectadas
correlações significativas entre P partir de 27 sem. de vida e diâmetro
testicular (DT) às 50 sem. de idade (r = 0,54 a 0,70; P<0,05). Correlações
entre P e o comprimento testicular (CT) obtido às 50 sem. só foram
significativas a partir de 34 sem. de idade (r = 0,44 a 0,50; P<0,05), sendo de
menor magnitude, comparadas àquelas com o DT. O peso vivo a partir de 30
sem. de idade correlacionou-se com os seguintes parâmetros testiculares às 50
sem. de idade: volume testicular (r = 0,48 a 0,65; P<0,05), volume ocupado
pelo parênquima testicular (r = 0,48 a 0,64; P<0,05) e volume ocupado pelos
túbulos seminíferos (r = 0,48 a 0,68; P<0,01). Animais mais pesados a partir
de 30 sem. de idade apresentaram maior número de espermátides arredondadas
por testículo (r = 0,52 a 0,55; P<0,05). Estes animais também tenderam a
apresentar maior número de células de Sertoli por testículo, mas as
correlações
não
foram
significativas
(P
=
0,06
a
0,09).
Correlações
semelhantes e significativas entre o peso vivo e a circunferência escrotal e o
número de espermátides alongadas por testículo foram encontradas em
carneiros Corriedale às 72 e 120 sem. de idade (BIELLI et al., 2000). No
entanto, estes autores não conseguiram detectar correlações entre o peso vivo
107
e o volume ocupado pelos túbulos seminíferos ou número de células de Sertoli
por testículo. Estes achados sugerem que o peso vivo só está relacionado ao
volume testicular em idades jovens (até 50 sem. de idade).
Com
relação
aos
parâmetros
seminais,
o
peso
vivo
esteve
correlacionado com algumas características somente após a puberdade, mas
estas correlações se deram em idades específicas. O peso corporal entre 24 e
26 sem. correlacionou-se com o percentual de defeitos espermáticos totais (r
= -0,61 a -0,68; P<0,05), às 31 sem. correlacionou-se com o volume ejaculado
e motilidade massal (r = 0,55 e 0,70, respectivamente; P<0,05) e às 34 sem.
com o volume ejaculado (r = 0,58; P<0,05). Estas correlações foram
inconsistentes nas demais idades. Possivelmente, a dificuldade em se
encontrar correlações entre P e parâmetros seminais se deve ao fato de que
apesar de haver mecanismos comuns controlando seu desenvolvimento, como
foi
mostrado
concentrações
pelas
basais
correlações
de
com
testosterona,
as
características
existem
fatores
testiculares
que
e
causam
instabilidade nesses valores, próprios dessas fases. Com base na literatura
examinada, este é o primeiro trabalho a mostrar esta sincronia entre os
parâmetros de desenvolvimento corporal e testicular, secreção de testosterona
e precocidade sexual em cordeiros Santa Inês.
O peso da carcaça dos animais apresentou correlações (P<0,05) com os
seguintes parâmetros às 50 sem. de idade: peso testicular (r = 0,58), peso do
epidídimo (r = 0,63), diâmetro (r = 0,58) e volume testicular (r = 0,51),
volume do parênquima testicular (r = 0,52) e ocupado pelos túbulos
seminíferos (r = 0,55) e com o diâmetro dos túbulos seminíferos (r = 0,48).
Estas correlações sugerem que animais com maior desenvolvimento corporal
108
às 50 sem. também apresentaram maior desenvolvimento da estrutura
testicular. Estes resultados são apoiados pelos achados de BIELLI et al.
(2000), que observaram que os animais mais bem nutridos durante as
primeiras
72
sem.
de
vida
apresentaram maior
diâmetro
dos
túbulos
seminíferos e maior volume ocupado pelos TS.
As correlações entre a circunferência escrotal (CE) às 48 sem. e a CE
tomada entre 8 e 13 sem. de idade foram baixas (r < 0,42; P>0,05),
aumentando a partir de 14 sem. de idade, com maiores valores a partir das 24
sem. (r = 0,50 a 0,98; P<0,01). A CE apresentou correlações altas com o
comprimento (CT) (r = 0,67 a 0,96; P<0,01) e diâmetro testicular (DT) (r =
0,59 a 0,97; P<0,01) em todas as idades avaliadas entre 8 e 48 sem. de idade.
Comprimento e diâmetro testiculares também estiveram significativamente
correlacionados em todas as idades (r = 0,65 a 0,96; P<0,001), embora a
magnitude dessas correlações tendeu a reduzir-se após 36 sem. de idade (r =
0,65 a 0,78; P<0,01), uma vez que o crescimento do comprimento testicular
tende a se estabilizar mais cedo, enquanto o diâmetro continua apresentando
pequenos aumentos. Isto é demonstrado pela tendência de redução na relação
comprimento/diâmetro a partir das 36 sem. de idade.
4.8.2. Desenvolvimento Reprodutivo
A CE apresentou correlações significativas com as concentrações basais
de testosterona às 23 e 42 sem. de idade (r = 0,62 e 0,58; P<0,01) e com o
grau de desprendimento peniano entre 8 e 27 sem. de idade, quando esse
processo se completou (r = 0,51 a 0,93; P<0,01). A CE tomada entre 8 e 48
sem. esteve correlacionada com a idade em que se completou o desbridamento
109
peniano (r = -0,43 a -0,93; P<0,01). Essas correlações foram maiores durante
a puberdade (12 a 28 sem.; r = -0,81 a -0,93; P<0,05) do que antes (r = -0,46
a -0,75; P<0,05) ou depois (r = -0,43 a -0,54; P<0,05). Animais com maiores
valores de CE entre 8 e 28 sem. de idade também apresentaram, mais cedo, os
primeiros espermatozóides (r = -0,51 a -0,94; P<0,05) e espermatozóides
móveis (r = -0,48 a -0,93; P<0,01) no ejaculado. Estas correlações mostram
que a CE tomada em cordeiros a partir de 8 sem. de vida pode ser utilizada
como indicadora da precocidade sexual, uma vez que animais com maiores
valores de CE apresentam maiores concentrações de testosterona e produzem
espermatozóides mais cedo. No caso do comprimento e o diâmetro testicular,
as correlações seguiram a mesma tendência da CE. Estes resultados mostram,
pela primeira vez para a raça Santa Inês, que existe uma sincronia entre o
crescimento testicular, secreção de testosterona, amadurecimento do trato
reprodutivo e início da produção de espermatozóides, de modo que aqueles
animais com maiores valores de biometria testicular na fase de pré-puberdade
são mais precoces, apresentam maior concentração periférica de testosterona
durante a puberdade, e maior biometria testicular às 48 sem. de idade. Os
resultados deste estudo confirmam as relações encontradas por SOUZA et al.
(2000) em cordeiros Santa Inês, e YARNEY & SANFORD (1993) em animais
Suffolk, entre medidas testiculares tomadas na pré-puberdade e precocidade
sexual. YARNEY & SANFORD (1990) também encontraram correlações
significativas entre as concentrações de testosterona e a biometria testicular
em cordeiros com 24 a 28 sem. de idade.
O peso testicular às 50 sem. de idade esteve correlacionado com a CE
avaliada entre 8 e 11 sem. de idade (r = 0,51 a 0,58; P<0,05) e após 33 sem.
110
de idade (r = 0,55 a 0,80; P<0,01) e o peso do epidídimo, com a CE às 10 e 11
sem. (r = 0,50 a 0,51; P<0,05) e às 38 sem. de idade (r = 0,50; P<0,05),
mostrando que embora a CE esteja bastante relacionada ao peso dos testículos
às 50 sem. de idade, especialmente após a puberdade, ela não é um indicador
preciso do peso epididimal. Da mesma forma, o comprimento e o diâmetro
testiculares tomados entre 32 e 48 sem. apresentaram correlações (P<0,05)
com o peso testicular (r = 0,62 a 0,80; CT e r = 0,53 a 0,69; DT) e epididimal
(r = 0,47 a 0,62; DT). Comprimento e diâmetro testicular medidos entre 31 e
48 sem. de vida também apresentaram correlação (P<0,01) com as respectivas
medidas às 50 sem. de idade (r = 0,42 a 0,66; CT e r = 0,55 a 0,85; DT). De
fato, YARNEY & SANFORD (1993) mostraram que o diâmetro testicular em
idades jovens é um forte indicador de si mesmo em idades mais velhas (R² =
0,51 a 0,84).
A CE tomada entre 8 e 11 sem. de idade apresentou correlações com os
seguintes parâmetros testiculares às 50 sem. de idade: volume testicular (r =
0,53 a 0,72; P<0,05), volume ocupado pelo parênquima testicular (r = 0,53 a
0,65; P<0,05) e túbulos seminíferos (r = 0,54 a 0,64; P<0,05). Animais com
maiores valores de CT e DT entre 38 e 44 sem. de idade apresentaram maior
comprimento total dos túbulos seminíferos (r = 0,46 a 0,59; P<0,05). BIELLI
et al. (2000) também observaram correlações entre a circunferência escrotal e
o volume testicular e ocupado pelos túbulos seminíferos em carneiros
Corriedale às 72 e 120 sem. de vida. No entanto, não existem estudos dessa
natureza em carneiros da raça Santa Inês.
Com relação às características seminais, a CE apresentou correlações
significativas (P<0,05) com a motilidade massal (r = 0,49 a 0,59), motilidade
111
(r = 0,59 a 0,72), motilidade progressiva (r = 0,52 a 0,68), vigor (r = 0,62 a
0,74), percentual de defeitos espermáticos totais (r = -0,77 a -0,80) e pH
seminal (r = -0,60 a -0,68), apenas entre 26 e 30 sem. e às 34 sem. de idade,
mostrando que em animais púberes, aqueles com maior CE apresentam
também sêmen de melhor qualidade. Estas fases coincidem com concentrações
crescentes de testosterona e transformações características da puberdade. No
entanto, não foram detectadas correlações significativas após essas idades,
embora os animais ainda tendessem a apresentar melhor qualidade seminal
(P>0,05). De fato, REGE et al. (2000) também não conseguiram encontrar
correlações de Pearson significativas entre o tamanho testicular e as
características seminais em animais com 36 a 48 sem. de idade, mas as
correlações genéticas foram significativas, especialmente com aquelas às 48
sem. FERREIRA et al. (1988) mostraram que a motilidade espermática
correlaciona-se positivamente e o percentual de defeitos totais, negativamente
com a circunferência escrotal tomada em idades jovens em carneiros. No
entanto, devido às correlações médias e inconsistentes entre a CE e os
parâmetros seminais em cordeiros com mais de 34 sem. de idade, a CE não
deve ser utilizada como único parâmetro de seleção de reprodutores nesta
fase. MORAES et al. (1997) observaram que após as 34 sem. de idade, mesmo
carneiros com testículos menores também podem apresentar sêmen de boa
qualidade, apoiando esta afirmação.
O peso testicular às 50 sem. de idade apresentou correlação (P<0,05)
positiva com o volume ejaculado (r = 0,53) e negativa percentual de defeitos
totais (r = -0,47) às 28 sem. Já às 31 sem., correlacionou-se positivamente
com a concentração espermática (r = 0,42) e com a motilidade massal às 33
112
sem. (r = 0,47). O peso do epidídimo, por sua vez, correlacionou-se
positivamente com a concentração espermática às 31 sem. de idade (r = 0,53),
e negativamente com o percentual de defeitos totais às 36 sem. (r = -0,55).
A motilidade massal esteve significativamente (P<0,01) correlacionada
negativamente com o percentual de defeitos totais (r = -0,52 a -0,77) e pH (r
= -0,61 a -0,90), e positivamente com a concentração espermática (r = 0,51 a
0,77) entre 26 e 48 sem. de idade. A motilidade progressiva também
apresentou correlações significativas com o percentual de defeitos totais (r =
-0,57 a -0,96) e pH (r = -0,59 a -0,93) nessas mesmas idades. Estes resultados
mostram que a motilidade massal é um bom indicador da qualidade seminal,
para se selecionar quais animais serão submetidos a uma avaliação mais
detalhada.
Mostram
também
que
ejaculados
com
melhor
motilidade
apresentam menor percentual de células defeituosas.
As
concentrações
de
proteína
total
(PROT)
no
plasma
seminal
apresentaram correlações com os parâmetros seminais apenas 36 e 44 sem. de
idade. Às 36 sem., foram detectadas correlações (P<0,05) entre PROT e
motilidade massal (r = 0,62), PROT e motilidade progressiva (r = 0,49),
PROT e vigor (r = 0,50) e PROT e concentração espermática (r = 0,51). Às 44
sem. essas correlações foram de PROT e MM (r = 0,60), PROT e MOT (r =
0,61), PROT e MOP (r = 0,49), PROT e vigor (r = 0,45) e PROT e C (r =
0,61). Estas correlações mostram que em determinadas idades pós-púberes, o
plasma seminal contém proteínas que estão significativamente associadas a
melhores parâmetros de motilidade e concentração espermática. O fato de
estas correlações não terem sido detectadas em outras idades pode estar
relacionado às instabilidades no quadro espermático próprias da puberdade e
113
pós-puberdade. Estudos dessa natureza são necessários com animais adultos,
para se confirmar a natureza dessas correlações, e identificar quais proteínas
estariam relacionadas a esses parâmetros.
Os parâmetros de motilidade massal (r = 0,94), motilidade (r = 0,91), e
concentração espermática (r = 0,94) apresentaram correlação positiva e o
percentual de defeitos (r = -0,80) e pH (r = -0,85) correlacionaram-se
negativamente de maneira significativa com as concentrações de testosterona
às 23 sem. de idade, por ocasião da puberdade. Estes achados sugerem que as
maiores concentrações de testosterona nessa fase contribuíram para um
desenvolvimento testicular mais rápido, com conseqüente melhora no quadro
espermático. De fato, cordeiros adultos da raça Manchega mostraram
correlações significativas entre as concentrações de testosterona e as
concentrações espermática, de frutose e ácido cítrico, mostrando que maiores
concentrações desses parâmetros estão associadas à ação da testosterona
(BORQUE & VÁZQUEZ, 1999).
A CE tomada entre 42 e 48 sem. de idade correlacionou-se com a
produção diária de espermátides arredondadas (r = 0,46 a 0,52; P<0,05),
produção diária de espermatócitos em paquíteno (r = 0,56 a 0,61; P<0,02),
número de espermátides arredondadas (r = 0,46 a 0,51; P<0,05) e de
espermatócitos em paquíteno por testículo (r = 0,55 a 0,62; P<0,02) e número
de células de Sertoli por testículo (r = 0,37 a 0,45; P<0,05), mostrando que a
CE, após 42 sem. de idade, pode ser um bom indicador da capacidade
testicular de produção de células germinativas. Animais com maior CE às 48
sem. de idade apresentaram maior diâmetro dos túbulos seminíferos (r = 0,50;
P<0,05), mas não em idades mais jovens. BIELLI et al. (2000) encontraram
114
correlações entre a CE e o número de células de Sertoli por testículos às 120
sem. de idade, mas não às 72 sem., mostrando que a população de células de
Sertoli só apresentam correlação com o tamanho testicular, quando este para
de crescer. É possível que mesmo às 48 sem. de idade, os testículos dos
animais ainda estivessem crescendo, apesar da tendência à estabilização.
Com relação às correlações entre a concentração espermática (C) e os
parâmetros histológicos dos testículos às 50 sem. de vida, às 27 e 28 sem. de
vida, respectivamente, foram detectadas correlações (P<0,05) a concentração
espermática e o número de espermátides arredondadas por seção transversal
de túbulo seminífero (r = 0,65 e 0,71), por célula de Sertoli (r = 0,71 e 0,53)
e por testículo (r = 0,67 e 0,62) e produção diária de espermátides
arredondadas (r = 0,68 e 0,63). A concentração espermática às 36 sem. de
idade esteve correlacionada com o número de espermatogônias A por seção de
túbulo seminífero (TS; r = 0,50; P<0,05) e C às 44 sem. de vida
correlacionou-se (P<0,05) com o número de espermatogônias A por célula de
Sertoli (r = 0,54), por testículo (r = 0,55), por seção transversal de TS (r =
0,65), produção diária de espermatogônias A (r = 0,56) e número de células
de Sertoli por seção de TS (0,57) e por testículo (r = 0,65).
Uma vez que a população de células de Sertoli é estabelecida até a
puberdade (SHARPE, 1994), essas correlações mostram a importância dessas
células no crescimento e produção de células germinativas, mostrando que
animais que possuem maior número de células de Sertoli, apresentam maior
produção
diária
de
espermátides
arredondadas
e
maior
concentração
espermática.
115
Com relação às
correlações entre a
secreção
de testosterona e
parâmetros histológicos, foram detectadas correlações entre as concentrações
basais de testosterona (T) às 23 sem. de idade e o número de espermatogônias
B por célula de Sertoli (r = 0,53; P<0,05) e diâmetro nuclear das células de
Sertoli (r = 0,46; P<0,05). Às 32 sem., T correlacionou-se com o número de
células de Sertoli por grama de parênquima testicular (r = 0,51) e às 42 sem.,
T correlacionou-se novamente com o número de espermatogônias B por célula
de Sertoli (r = 0,53). Estas correlações entre T e parâmetros relacionados às
células de Sertoli são importantes, devido à importância das células de Sertoli
na
regulação
da
espermatogênese.
Sabe-se
que
as
células
de
Sertoli
apresentam receptores para testosterona, e que estas células secretam
inúmeras proteínas sob estimulação deste hormônio (COUROT et al., 1980;
NASS et al., 1990; FOUCHÉCOURT et al., 1999) as quais podem influenciar
a qualidade seminal. Nesse sentido, a maioria das características indicadoras
da qualidade seminal também esteve correlacionada com T às 23 sem. de
idade, sugerindo que maiores concentrações de T nesta idade estimulariam a
síntese de proteínas, por parte das células de Sertoli, importantes para o
metabolismo espermático.
O
fato
da
grande maioria
das
características
histológicas,
mais
notadamente aquelas ligadas às células germinativas, não se correlacionar
com as concentrações de testosterona, deve-se ao fato de as concentrações
basais de testosterona não refletirem a capacidade máxima de secreção das
células de Leydig. Esta só se dá quando elas são estimuladas pela injeção de
GnRH (RODRIGUES, 2000). De fato, estudos com touros mostraram que
correlações entre os níveis estimulados de testosterona e características
116
testiculares observadas após injeção de GnRH, não foram detectadas com os
níveis basais de testosterona (PALAZ et al., 1994; GÁBOR et al., 1995).
O peso testicular às 50 sem. de idade estava correlacionado com o
peso do epidídimo (r = 0,75; P<0,01), comprimento (r = 0,91; P<0,01),
diâmetro (r = 0,77; P<0,01) e volume testicular (r = 0,88; P<0,01), volume
ocupado pelo parênquima testicular (r = 0,89; P<0,01) e túbulos seminíferos (r
= 0,88; P<0,01). Correlacionou-se, ainda, com o número de espermatócitos em
leptóteno (r = 0,50; P = 0,04), e em paquíteno por célula de Sertoli (r = 0,59; P
= 0,017) e por seção de TS (r = 0,52; P = 0,047) e número de espermátides
arredondadas por célula de Sertoli (r = 0,66; P = 0,006) e por seção de túbulo
seminífero (r = 0,52; P = 0,007).
O peso do epidídimo esteve correlacionado com o comprimento (r =
0,59; P<0,01) e volume testicular (r = 0,53; P<0,01), com o volume ocupado
pelo parênquima (r = 0,52; P<0,01) e pelos túbulos seminíferos (r = 0,54;
P<0,01) e pelo diâmetro dos túbulos seminíferos (r = 0,54; P<0,05). Foram
detectadas correlações, também, com o número de espermatócitos em paquíteno
(r = 0,55; P<0,05) e espermátides arredondadas (r = 0,61; P<0,01) por célula de
Sertoli.
O volume testicular (VT) apresentou correlações de alta magnitude com
o volume do parênquima testicular (r = 0,99; P<0,001), volume ocupado pelos
túbulos seminíferos (r = 0,97; P<0,001), comprimento (r = 0,89; P<0,01) e
diâmetro testicular (r = 0,95; P<0,01) às 50 sem., e de média magnitude co m
o número de espermátides arredondadas por célula de Sertoli (r = 0,58;
P<0,05) e por testículo (r = 0,50; P<0,05) e número de espermatócitos em
paquíteno por testículo (r = 0,50; P<0,05).
117
O comprimento tubular total correlacionou-se com os seguintes tipos
celulares por testículo (P<0,05): número de células de Sertoli (r = 0,87),
espermatogônias B (r = 0,52), espermatócitos em paquíteno (r = 0,78) e
espermátides arredondadas (r = 0,77). Detectaram-se, ainda, correlações ainda
com a produção diária de espermatogônias B (r = 0,52), de espermatócitos em
paquíteno (r = 0,79) e de espermátides arredondadas (r = 0,78). Já o diâmetro
tubular correlacionou-se com o número de espermátides arredondadas por
seção de túbulo seminífero (r = 0,50; P<0,05) e por testículo (r = 0,54;
P<0,05).
Todos os tipos celulares por seção de TS correlacionaram-se (r > 0,80;
P<0,001) entre si por célula de Sertoli e por testículo, e com sua produção
diária. O número de espermatócitos em leptóteno correlacionou-se (P<0,05)
com as seguintes células por seção de TS: espermatócitos em paquíteno (r =
0,70), espermátides arredondadas (r = 0,53) e células de Sertoli (r = 0,55). Do
mesmo modo, o número de espermatócitos em paquíteno por seção de TS
esteve correlacionado (P<0,05) com o número de espermátides arredondadas
(r = 0,82) e células de Sertoli (r = 0,52) por seção de TS, número de
espermátides arredondadas (r = 0,61) e espermatócitos em leptóteno (r = 0,61)
por célula de Sertoli e leptótenos por testículo (r = 0,69).
O número de espermátides arredondadas por seção de TS esteve
correlacionado (P<0,05) com o número de espermatócitos em paquíteno e
leptóteno por testículo (0,67 e 0,62) e sua produção diária (r = 0,67 e 0,61),
respectivamente.
118
Por sua vez, o número de células de Sertoli por testículo correlacionouse com todos os demais tipos celulares por testículo (r = 0,53 a 0,83; P<0,05)
e suas produções diárias (r = 0,52 a 0,82; P<0,05).
Os achados para esses tipos celulares estão de acordo com os resultados
obtidos em ovinos sem raça definida (QUEIROZ & CARDOSO, 1989), e
ressaltam
a
importância
das
células
de
Sertoli
na
regulação
da
espermatogênese e suporte às células germinativas, demonstrado pelas
correlações entre população de células de Sertoli e números de células
germinativas, bem como sua produção diária por testículo.
119
5 CONCLUSÕES
Os resultados desse estudo mostram, pela primeira vez, as interações
entre os eventos relacionados ao desenvolvimento testicular, secreção de
testosterona e aspectos quanti-qualitativos do sêmen durante o primeiro ano de
vida em carneiros Santa Inês. Desse modo, avaliação da biometria testicular em
cordeiros
poderia
permitir
a
pré-seleção
de
animais
para
reprodução.
Confirmou-se também que, à idade de 50 semanas, as células de Sertoli estão
associadas aos diversos tipos de células germinativas nos túbulos seminíferos,
enfatizando sua importância para a produção espermática.
Animais com maior desenvolvimento testicular foram também mais
precoces, atingindo a puberdade mais cedo. Entretanto, os parâmetros seminais
nessa fase sugerem que só algumas semanas mais tarde (cerca de 42 semanas de
idade)
esses
animais
devem
ser
utilizados
de
forma
moderada
como
reprodutores, em sistema de monta controlada ou em colheita de sêmen para
uso a fresco. Com base nesses achados, a separação entre sexos deve ser feita
até 22 sem. de vida para se evitar prenhezes indesejadas, uma vez que a partir
dessa idade os animais já são capazes de produzir espermatozóides.
O aumento da concentração protéica no plasma seminal pode estar
relacionado às diversas funções exercidas por essas proteínas na maturação
epididimal e metabolismo espermático. As associações encontradas entre a
presença de determinadas bandas protéicas e alguns parâmetros reprodutivos
em idades específicas sugere a possibilidade de seu uso como marcadores
moleculares para a fertilidade. Entretanto, estudos mais detalhados são
120
necessários para identificação e caracterização dessas proteínas, de modo a
confirmar essas associações.
121
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7 - ANEXOS
Anexo 1: Composição das soluções de estoque utilizadas para a determinação do perfil
eletroforético das proteínas do plasma seminal.
Soluções
Reagentes
A
B
C
D**
E
F
Acrilamida*
30 g
-
-
-
-
-
Bisacrilamida*
0,8 g
-
-
-
-
-
-
18,17 g
12,0 g
-
-
Tris* (1,5M)
Tris* (0,5M)
6,06 g
Ácido clorídrico (6N) (q.s.p.)
-
pH 8,8
pH 6,8
-
-
-
Glicina*
-
-
-
57,6 g
-
-
SDS (10%)*
-
-
-
40 mL
2,6 mL
-
2-mercaptoetanol*
-
-
-
-
200 µL
-
Persulfato de amônio*
-
-
-
-
-
0,5 g
Solução C
-
-
-
-
1,25 mL
-
Glicerol*
30 g
-
-
-
1,26 g
-
EDTA (Na4) 0,5M*
-
-
-
-
10 µL
-
EGTA 0,2M*
-
-
-
-
25 µL
-
Azul de bromofenol 0,1%*
-
-
-
-
1,5 mL
-
Água milli-Q (q.s.p.)
100 mL 100 mL 100 mL 500 mL 10 mL
* Electrophoresis grade (99+%) – Acros Organics
* N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide, electrophoresis grade – Acros Organics
* Tris(hydroxymethyl)aminomethane (99+%) – Acros Organics
* Glycine, electrophoresis grade – Acros Organics
* Dodecyl sulfate, sodium salt, electrophoresis grade – Acros Organics
* 2-mercaptoethanol (electrophoresis) – Acros Organics
* Ammonium persulfate (98+%) – Acros Organics
* Glycerol (99+%) – Acros Organics
* Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt – Sigma Aldrich
* Ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid – Sigma Aldrich
* Bromophenol blue – Sigma Aldrich
** Solução concentrada (8 X)
5 mL
159
Anexo 2: Soluções para o preparo dos géis utilizados para a determinação do perfil
eletroforético das proteínas do plasma seminal.
Soluções de estoque
A
Gel de empilhamento (3,5%)
(µL)
500
Gel de separação (12,5%)
(µL)
6.024
B
-
4.680
C
1.250
-
SDS (10%)
49,3
150
F
50
100
TEMED*
15
15
Água milli-Q
3.100
4.027
*N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (for electrophoresis) – Sigma Aldrich
Anexo 3: Solução de coloração* dos géis utilizados para a determinação do perfil
eletroforético das proteínas do plasma seminal.
Solução Estoque
Coomassie Brilliant Blue R-350**
Quantidade
1 tablete
Metanol (mL)
60
Água milli-Q (mL)
40
* Solução de estoque (0,4%), estável por uma semana (4°C). No momento da coloração,
misturar 1 parte da solução de estoque a 1 parte de solução a 20% de ácido acético.
** PhastGel Blue R – Amersham Biosciences
Anexo 4: Solução de descoloração dos géis utilizados para a determinação do perfil
eletroforético das proteínas do plasma seminal.
Solução Estoque
Quantidade
Ácido acético (mL)
100
Metanol (mL)
350
Água milli-Q (mL)
400
160