[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
A próxima geração em
preparação e análise de
amostras de N glicano
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
União de técnicas complementares
para otimizar a análise de glicanos
A Waters oferece abordagens completas, baseadas em fluxo de trabalho, para analisar glicoproteínas em
todos os níveis estruturais.
¡ Definição de perfis das glicoproteínas
¡ C aracterização e monitoramento de glicanos livres
¡ Análise da subunidade
¡ Composição dos monossacarídeos
Complexidade do método
¡ Mapeamento de glicopeptídeos
ANÁLISE DE
GLICANOS
LIVRES
COMPOSIÇÃO DOS
MONOSSACARÍDEOS
MAPEAMENTO DE
GLICOPEPTÍDEOS
ANÁLISE
DA SUBUNIDADE
ANÁLISE DE PROTEÍNA
INTACTA
Aumento das informações
2
3
E se...
a análise de N glicanos livres pudesse
ser otimizada e altamente sensível?
Finalmente, um fluxo de trabalho inteligente sem
limitações.
5
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLICANOS]
Fluxo de trabalho da análise de proteína intacta
GLICOPROTEÍNA
Padrão de
verificação de massa
de mAb intacto
INJEÇÃO NA COLUNA
PARA ANÁLISE LC
ANÁLISE EM LC
COM DETECTOR TUV
CONFIRMAÇÃO DE
MASSA COM QTof MS
Cartucho de dessalinização MassPREP™ ou
Coluna ACQUITY UPLC® BEH C 4 de 300 Å,
Mistura de padrões de proteína MassPREP
e Kit de análise de massa intacta
Sistemas ACQUITY UPLC
Xevo ® G2-XS QTof MS
SYNAPT® G2-Si HDMS
Fluxo de trabalho da análise da subunidade
GLICOPROTEÍNA
DIGESTÃO ENZIMÁTICA IdeS
COM REDUÇÃO OPCIONAL
Padrão de
verificação de massa
de mAb intacto
INJEÇÃO NA COLUNA
PARA ANÁLISE LC
ANÁLISE EM LC
COM DETECTOR UV
Coluna ACQUITY UPLC
Protein BEH C 4 de 300 Å
Sistemas Alliance ® HPLC ou
ACQUITY UPLC
Fluxo de trabalho do mapeamento de glicopeptídeos
GLICOPROTEÍNA
Padrão de
verificação de massa
de mAb intacto
REDUÇÃO, ALQUILAÇÃO
E DIGESTÃO DE ENZIMAS
INJEÇÃO NA COLUNA
PARA ANÁLISE LC
ANÁLISE EM LC
COM DETECTOR TUV
Fragmentos de peptídeos
glicosilados e não glicosilados
Coluna de amida de fase
reversa ou BEH Waters
ACQUITY UPLC
Fluxo de trabalho da composição dos monossacarídeos
GLICOPROTEÍNA
LIBERAÇÃO DE
MONOSSACARÍDEOS
Hidrólise com ácido
3
RÓTULO COM UM
FLUORÓFORO
Injeção na coluna
para análise LC
Coluna ACQUITY UPLC BEH
C18, de 130 Å, 1,7 μm,
2,1 x 100 mm
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
Software UNIFI ® e
MassLynx ®
G1F/G2F
PROCESSAMENTO
DE DADOS
2000
2500
3000
m/z
3500
147700
148000
Espectro MS ESI-TOF de um mAb
148300
148600
G2F/G2F
G0F/G1F
G0F/G0F
+48
+54
G1F/G1F, G0F/G2F
Resultados
+51
148900
massa
149200
Espectro MS ESI-TOF deconvolutado
Resultados
Fc/2 + glicanos
0,24
CONFIRMAÇÃO DE MASSA
UTILIZANDO QTof MS
PROCESSAMENTO
DE DADOS
Xevo G2-XS QTof MS
SYNAPT G2-Si HDMS
Software MassLynx
A 214
0,18
Fd’
LC
0,12
0,06
0,00
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 min
Resultados
A
Aumentado em 6x
BPI de MS
B
Glicopeptídeos
ANÁLISE DE MAPEAMENTO
DE PEPTÍDEOS UTILIZANDO
QTof MS
Xevo G2-XS QTof
SYNAPT G2-Si HDMS
PROCESSAMENTO
DE DADOS
Aumentado em 4x
Software MassLynx e
UNIFI
UV em 280 nm
0
5
50
45
40
35
10
15
20
25
30
35
1. N-acetilglucosamina (GlcNAc)
2. N-acetilgalactosamina (GalNAc)
3. Galactose (Gal)
4. Manose (Man)
5. Glucose (Glc)
6. Fucose (Fuc)
40
45 min
Resultados
3
4 5
30
6
EU
25
Análise em LC
com detector FLR
PROCESSAMENTO
DE DADOS
Sistemas Alliance HPLC ou
ACQUITY UPLC
Software Empower ® 3
2
20
15
10
1
5
0
-5
10
15
20
25
30 min
5
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
MONITORAMENTO DE ROTINA
Explore as possibilidades
Em função do aumento da eficiência de ionização e maior afinidade de prótons do RapiFluor-MS, a detecção
de massas dos glicanos com o Detector ACQUITY QDa finalmente se tornou possível.
¡ Fornece sensibilidade inigualável para detecção de FLR e MS.
¡ Oferece maior confiança com a confirmação de massa dos picos de FLR.
¡ Tempos de análise de cromatografia mais curtos com a definição de perfis de glicanos MS para o
desenvolvimento rápido do processamento.
¡ Pode ser facilmente integrado com os fluxos de trabalho UPLC existentes que atendem aos padrões GMP com
o software Empower 3.
Monitoramento de glicanos com o Sistema ACQUITY UPLC H Class Bio com detecção FLR e ACQUITY QDa
FLR
EU
480
240
0
10
15
20
25
MS
3,2x10 6
Intensidade
30 min
1,6x106
0
10
15
20
25
30 min
Glicanos N rotulados como RapiFluor-MS
monitorados utilizando um Sistema
ACQUITY UPLC H Class Bio configurado
com detecção de massa FLR e ACQUITY
QDa para confirmação de estruturas
conhecidas e dados de massa para picos
removidos.
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[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
Apresentamos o Kit N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS
A Waters, líder em inovações para análise bioterapêutica, reinventou o fluxo de trabalho para análise de N glicanos
livres. O novo reagente, RapiFluor-MS™, inclui a capacidade de ionização necessária para maximizar as informações
geradas pela detecção MS. O novo fluxo de trabalho agiliza a deglicolisação e otimiza a rotulagem.
É o fluxo de trabalho inteligente que os laboratórios biofarmacêuticos estavam esperando: não é mais necessário
escolher entre uma ferramenta de rotulagem “rápida” e sensibilidade para a espectrometria de massas; não há mais
processos complicados e trabalhosos propensos a erros.
Com a Waters, não é necessário comprometer a velocidade e a sensibilidade na preparação de amostras, há somente
ganhos na confiança de seus resultados analíticos.
Junte-se à Waters e pense em alternativas
para a análise de glicanos livres.
DESEMPENHO DE MS
VELOCIDADE/RENDIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DE FLR
6
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
Como funciona?
A análise de N glicanos livres é uma técnica com muitas informações,
mas que envolve procedimentos complicados e preparação de amostras.
Quando os glicanos são liberados por PNGase F, é necessária a
rotulagem para promover a separação e a detecção eficazes. O novo
protocolo da Waters agora oferece um fluxo de trabalho versátil para:
¡ Identificação de glicanos
GLICOPROTEÍNA
N GLICANOS
LIVRES
¡ Estrutura de glicanos
¡ Monitoramento de glicanos
GLICOPROTEÍNA
N GLICANOS
LIVRES POR
DEGLICOLISAÇÃO
Padrão de
verificação de
massa de mAb
intacto
1,2E+6
0,0E+0
1,2E+6
0,0E+0
GlycoWorks™ Rapid PNGase
F e tampão e tensoativo
RapiGest™ SF
FLR
10
12
14
16
18
Rotulagem como
GlycoWorks
RapiFluor-MS
INJEÇÃO NA COLUNA
PARA ANÁLISE LC
GLICANOS
PURIFICADOS
Coluna Amida BEH de glicanos,
Padrão de teste de desempenho de
glicanos e Gráfico de calibração de
dextrana
Plate ou cartuchos
GlycoWorks HILIC µElution
ANÁLISE EM LC
COM DETECTOR FLR
CARACTERIZAÇÃO OU
CONFIRMAÇÃO DE MASSA
Sistemas Alliance HPLC
ou ACQUITY UPLC
Detector ACQUITY® QDa ®
Xevo G2-XS QTof MS
SYNAPT G2-Si HDMS
20
22
24
26
28
30 min
MS
10
GLICANOS
ROTULADOS
Resultados
PROCESSAMENTO
DE DADOS
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30 min
Software UNIFI,
MassLynx e Empower
Veja a ciência por trás dos NOVOS Reagentes GlycoWorks RapiFluor-MS, que proporcionam
novos recursos para análise, monitoramento e caracterização de glicanos. Assista ao vídeo em
waters.com/SeeT heScience
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[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
E se a preparação de amostras de N glicanos livres fosse rápida e
simplificada?
¡ Prepare amostras rotuladas de N glicanos livres com facilidade e rapidez.
¡ Reduza os erros e a perda de amostras.
¡ Treine facilmente os analistas e transfira métodos em seu laboratório.
TRÊS ETAPAS, 30 MINUTOS
GLICOPROTEÍNA
Padrão de verificação
de massa de mAb
intacto
N GLICANOS LIVRES
GLICANOS ROTULADOS
GLICANOS PURIFICADOS
GlycoWorks Rapid PNGase
F e tampão e tensoativo
RapiGest SF
Rotulagem como GlycoWorks
RapiFluor-MS
Plate ou cartuchos
GlycoWorks HILIC µElution
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
< 15
minutos
5
minutos
10
minutos
Assista a um breve vídeo de demonstração,
com 2 minutos, sobre o Kit N glicano
GlycoWorks RapiFluor-MS.
www.waters.com/RapiFluorMS
8
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
E se você pudesse obter sensibilidade incomparável de FLR e MS?
¡ Aumento da compreensão sobre a qualidade do produto com a caracterização aprofundada dos picos que não foram
identificados anteriormente utilizando a quantificação da fluorescência obtida com uma resposta MS equivalente.
¡ Agilização na tomada de decisões.
¡ Identificação facilitada de glicanos ligados a N pouco abundantes.
SENSIBILIDADE INCOMPARÁVEL
Fluorescência
Rotulado como RapiFluor-MS
O
N
O
NH
100
90
90
80
80
N
NH
40
30
a*
id
AB
m
na
tâ
an
st
ai
o
ne
S
M
r-
m
na
ai
0,6
2-
0,1
in
AB
2-
tâ
an
AB
in
st
Fl
Ra
pi
NH
ne
S
M
r-
N
uo
NH
Glycan
1000X 160X
10
0
0
O
o
Rotulado como procainamida
20
7,0*
7,0
10
oc
14X
20
Fluorescência de 14x e resposta
MS de 160x em comparação com
os rótulos tradicionais (2-AB e
procainamida). Fluorescência
de 2x e resposta MS de 1.000x
em comparação com os rótulos
instantâneos.
Pr
30
NH2
O
3X
30,0*
AB
NH
50
40
uo
Glycan
50
Fl
Rotulado como 2-AB
60
52,5
pi
NH
oc
NH
Ra
NH2
O
Glycan
70
2X
60
a*
O
id
Rotulado como AB instantâneo
70
Pr
NH
Desempenho relativo (%)
Glicano
MS (BPI)
100
*Com base em valores teóricos publicados.
Veja como é possível levar possibilidades
extraordinárias à sua análise de rotina.
www.waters.com/XevoG2XS
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[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
E se os dados de massa estivessem facilmente disponíveis a qualquer
momento para a análise de glicanos de rotina?
¡ Maior confiança no monitoramento de perfis de glicano com a detecção de massas de rotina.
¡ Obtenha informações sobre as alterações de fabricação com execução rápida das amostras.
¡ Resolução rápida do desenvolvimento de métodos e de problemas de transferência.
CONFIANÇA
Detalhamento do perfil N glicano de um mAb
1,2E+6
0,0E+0
1,2E+6
0,0E+0
FLR
10
12
14
16
18
20
22
24
28
30 min
MS
10
12
14
16
18
20
22
24
Assista a um breve vídeo de 1 minuto sobre
como levar o poder da detecção de massas
para seu laboratório.
www.waters.com/QDa
10
26
26
28
30 min
A maior eficiência em ionização do
RapiFluor-MS proporciona fluorescência
quantitativa e detecção de massas com o
Detector ACQUITY QDa.
[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLIC ANOS]
Informações sobre kits para análise de glicanos
Kits completos para preparação de amostras
Descrição
Nº de peça
Kit básico N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS
O kit contém: Módulo de deglicolisação GlycoWorks, Módulo de rotulagem GlycoWorks, Módulo
de limpeza GlycoWorks, Módulo de coleta de amostras GlycoWorks, Coluna ACQUITY UPLC
Glycan BEH Amide, 1,7 μm, 2,1 x 150, Concentrado de fase móvel: formato de amônio
176003635
Kit N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS
O kit contém: Módulo de deglicolisação GlycoWorks, Módulo de rotulagem GlycoWorks,
Módulo de limpeza GlycoWorks, Módulo de coleta de amostras GlycoWorks
176003635
176003606
176003606
Padrões e acessórios
Descrição
Qde.
Nº de peça
50 μg/vial
186007982
Total de 400 pmol/vial
186007983
Análise de glicanos em solução de formato de amônio
—
186007081
Calços do coletor a vácuo
—
186007986
Espaçador do coletor de pressão positiva do Kit N
glicano GlycoWorks RapiFluor-MS
—
186007987
Gráfico de calibração de dextrana RapiFluor-MS
Padrão de teste de desempenho de glicanos
RapiFluor-MS
Seminário Almoço e rotulagem
Saiba como rotular glicanos em seu intervalo de almoço
Quer ver como o Kit N glicano RapiFluor-MS e o detector de massas ACQUITY QDa
podem ajudá-lo a melhorar a análise de glicanos? Mostraremos como em um seminário
no local durante o intervalo de almoço. Para obter mais informações ou agendar um
seminário “Almoço e rotulagem”, acesse waters.com/GlycansForLunch
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[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLICANOS]
A próxima geração em rotulagem de glicanos
Reagente RapiFluor-MS
Com base na expertise da Waters em rotulagem rápida por
fluorescência dos aminoácidos, o RapiFluor-MS foi projetado com
propriedades químicas aprimoradas para proporcionar uma análise
de glicanos superior. Em uma reação de 5 minutos,
O
O
o RapiFluor-MS modifica as glicosilaminas geradas pela
N
liberação enzimática de uma glicoproteína.
O
NH
O
N
NH
MS
Tag de carga de
amina terciária
O
¡ Identificação rápida
Rápido
¡ Fluorescência eficiente
Grupo de identificação
rápida de carbamato NHS
¡ Resposta MS incomparável
N
Fluorescência
Fluoróforo de quinolinil
GlycoWorks RapiFluor-MS
CARACTERIZAÇÃO
Atribua componentes de glicanos de baixo nível com mais
facilidade e confiança
Obtenha níveis incomparáveis de atribuições estruturais de sensibilidade MS e MS/MS
combinando o RapiFluor-MS com os mais avançados espectrômetros de massa Xevo
G2-XS QTof ou SYNAPT G2-Si HDMS.
Caracterização de glicanos por UPLC® FLR com o Espectrômetro de massa Xevo G2-XS QTof
1130,9423, 2+
1: TOF MS ES+
FA2G2Ga1BPI
6.93e6
2-AB convencional
Glicano de 10 µg de proteína
Preparação de amostras em 1,5 dia
Fucose
GlcNAc
Manose
Galactose
1: TOF MS ES+
BPI
6.93e6
800
RapiFluor-MS
1600 m/z
Glicano de 0,1 μg de proteína
Preparação de amostras em <1 hora
5,5
12
10,0
15,0
20,0
25,0 min
Comparação do cromatograma
LC-MS de glicanos N rotulados
como 2AB e glicanos N rotulados
como RapiFluor-MS do mesmo mAb.
Resposta de ESI+ MS 100 vezes
maior observada para a amostra
rotulada como RapiFluor-MS. Um
espectro MS (inserção) mostra o
espectro somado de um glicano
pouco abundante dentro da amostra.
Filiais:
Alemanha 49 6196 400 600
Austrália 61 2 9933 1777
Áustria 43 1 877 18 07
Bélgica e Luxemburgo 32 2 726 1000
Brasil 55 11 4134-3788
Canadá 1 800 252 4752
China 86 21 6156 2666
Cingapura 65 6593 7100
Coreia 82 2 6300 9200
Dinamarca 45 46 59 8080
Espanha 34 93 600 9300
EUA 1 800 252 4752
Finlândia 358 9 5659 6288
França 33 1 30 48 72 00
Hong Kong 852 2964 1800
Hungria 36 1 350 5086
Índia 91 080 49292200 03
Irlanda 353 1 448 1500
Israel 9723 3731391
Itália 39 02 265 0983
Japão 81 3 3471 7191
México 52 55 52 00 1860
Noruega 47 6 384 6050
Países Baixos 31 76 508 7200
Polônia 48 22 101 5900
Porto Rico 1 787 747 8445
Portugal 351 21 893 61 77
Reino Unido 44 208 238 6100
República Tcheca 420 2 617 11384
Rússia/CEI 7 495 727 4490/336 7000
www.waters.com/glicanos
Suécia 46 8 555 115 00
Suíça 41 56 676 7000
Taiwan 886 2 2508 5500
UAE 971 4 214 62 38
Waters Corporation
34 Maple Street
Milford, MA 01757 U.S.A.
T: 508 478 2000
F: 508 872 1990
www.waters.com
Waters, T he Science of W hat’s Possible, ACQUITY UPLC, UPLC, Alliance, ACQUITY, QDa, UNIFI, SYNAPT,
Empower, Xevo, MassPREP e MassLynx são marcas registradas das Waters Corporation. RapiFluor-MS,
GlycoWorks e RapiGest são marcas comerciais da Waters Corporation.
© 2015 Waters Corporation. Impresso nos EUA.
Fevereiro 2015 720005271PB K P-SIG