XII Salão de
Iniciação Científica
PUCRS
Validação de Método para Determinação de Cotinina em
Líquido Amniótico
Karine Rodrigues1, José Miguel Chatkin2, 3, Julia de Barros Machado2, 3, Carolina Mohr2, 3, Ana Paula
Goulart Szezepaniak2, 3, Flavia Valladão Thiesen1 (Orientadora)
1
Faculdade de Farmácia, PUCRS, 2 Faculdade de Medicina, PUCRS, 3 Hospital São Lucas da PUCRS
Resumo
Introdução
O tabagismo é atualmente um dos principais problemas de saúde pública. É
considerado fator de risco para diversas doenças como cânceres, doenças cardiovasculares e
respiratórias (Nakajima et al., 2000). A nicotina é o maior constituinte do tabaco, sendo que
um cigarro contém, em média 8,4 mg desse composto, que é o responsável por causar
dependência. Quimicamente, é uma amina terciária composta de anéis piridina e pirrolidina.
Apenas de 10 a 20% de toda nicotina inalada é excretada sob a forma inalterada e o principal
metabólito de biotransformação da nicotina é a cotinina, um marcador biológico útil para essa
exposição e é usado em larga escala para validar a auto-relatados de tabagismo. A cotinina
tem uma meia vida de 15-40 horas em adultos e 37-160 horas em crianças. A partir disso a
determinação de cotinina em líquido amniótico é relevante para medir a exposição do feto ao
tabaco durante a gravidez (Sant’Anna, 2010). Até a vigésima semana de gestação, as
secreções maternas são as principais contribuintes para a formação de líquido amniótico, com
alguns componentes provenientes das secreções do feto. Após este período, a urina, as
secreções de fluidos fetais e do pulmão tornam-se as principais fontes de líquido amniótico,
como um meio de proteção do feto. Mais do que qualquer outro compartimento, o líquido
amniótico acumula substâncias solúveis em água, mas também pode conter compostos
parentais e seus metabólitos, o que expõe o feto durante toda gravidez a diversas substâncias
tóxicas (Malafatti e Martins, 2009).
A presença de cotinina no líquido amniótico indica que o feto tem exposição ao
tabaco. Outras amostras, como sangue e urina, são invasivas ou de difícil coleta em recémnascidos.
XII Salão de Iniciação Científica – PUCRS, 03 a 07 de outubro de 2011
Esse trabalho tem como objetivo validar um método para detecção de cotinina em
líquido amniótico, a fim de verificar a exposição de recém-nascidos ao tabaco durante o
período fetal.
Metodologia
A partir de um método para determinação de cotinina já validado para amostras de
soro, adaptamos o mesmo para a quantificação em líquido amniótico. O procedimento
analítico envolve extração líquido-líquido com 1,0 mL de líquido amniótico, utilizando como
padrão interno 2-fenilimidazol 0,25 ug/mL. A extração foi feita com diclorometano, onde se
retira a fase aquosa depois de homogeneização e centrifugação. A fase aquosa foi extraída
novamente para maior reprodutibilidade, e logo após a fase orgânica foi evaporada sob ar
comprimido a 37°C e o extrato foi reconstituído com 200 uL da fase móvel (Água MilliQ,
Metanol, Acetato de sódio 0,1M e Acetonitrila - 50:15:25:10 v/v em pH 4,4) para injeção em
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Agilent 1100® series, com separação em coluna de
fase reversa (Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6x150mm e 5u), sob fluxo isocrático de 0,5 mL/min
e detecção ultravioleta em 261 nm. O tempo total da corrida foi de 10 minutos, sendo que o
tempo de retenção para cotinina foi aproximadamente de 6,8 minutos e para o padrão interno
foi de 5,6 minutos.
Considerando que o método foi previamente validado para amostras de soro (Petersen
et al., 2010), foi realizada validação parcial. Validação parcial é empregada sempre que
ocorrem modificações no método bioanalítico já validado, como mudança de matriz, no
procedimento de preparação da amostra, na metodologia ou na substituição do sistema de
detecção. Foram determinados os parâmetros limite inferior de quantificação (LIQ),
linearidade, exatidão, precisão interdia e intradia, segundo as exigências da ANVISA (2003).
Resultados
O coeficiente de correlação foi superior a 0,998 no intervalo de 2,0 a 200,0 ng/mL,
sendo o limite inferior de quantificação de 2,0 ng/mL. Os valores de precisão intra e interensaio (Tabela 1) apresentaram coeficiente de variabilidade (CV) de 3,89 a 13,99% e exatidão de
82,23 a 91,47%.
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Tabela 1. Precisão e exatidão intra e interdia de cotinina em líquido amniótico por HPLC
Adicionado
(ng/mL)
Cotinina
Intradia
(n=6)
Interdia
Detectado
(média±DP)
(ng/mL)
Precisão
CV (%)
Exatidão
(%)
5.0
4.56 ± 0.61
13.46
50.0
200.0
41.12 ± 1.81
182.94 ± 9.65
4.41
5.28
(n=6)
Detectado
(média±DP)
(ng/mL)
Precisão
CV (%)
Exatidão
(%)
91.12
4.40 ± 0.62
13.99
87.92
82.23
91.47
41.89 ± 3.57
177.40 ± 6.91
8.52
3.89
83.77
88.70
CV: Coeficiente de variação; DP: Desvio Padrão
Conclusão
O método apresentou linearidade, LIQ, precisão e exatidão dentro dos limites
aceitáveis pela ANVISA. No entanto, empregá-lo para avaliar exposição intra-uterina ao
tabaco, testes para determinação de estabilidade, especificidade, recuperação e limite de
detecção devem ser concluídos.
Referências
BENTLEY, M.C.; ABRAR, M.; KELK, M.; COOK, J.; PHILLIPS, J.K. Validation of assay for the
determination of cotinine and 3-hydroxycotinine in human saliva using automated solid-phase extraction and
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MALAFATTI, L.; MARTINS, I. Aspectos analíticos da determinação de cotinina em matrizes biológicas.
Revista Brasileira de Toxicologia Vol. 22, n. 1-2 (2009), pp. 9-20.
NAKAJIMA M.; YAMAMOTO T.; KUROIWA Y.; YOKOI T. Improved highly sensitive method for
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Chromatogr B. Vol. 742, (2000), pp. 211-215.
PETERSEN, G.O.; LEITE, C.E.; CHATKIN, J.M.; THIESEN, F.V. Cotinine as a biomarker of tobacco
exposure: Development of a HPLC method and comparison of matrices. Journal of Separation Science Vol.
33, (2010), pp. 516-521.
PICHINI S.; ALTIERI I.; PACIFICI R.; ROSA M. Simultaneous determination of cotinine and trans-3’hydroxycotinine in human serum by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr B. (1992), pp.
358-361.
RE nº 899, de 29 de maio de 2003 – Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. D.O.U.
02/06/2003.
SANT’ANNA, G.S. Avaliação da exposição fetal à nicotina através da análise toxicológica em mecônio. São
Paulo: USP, 2010. Tese Mestrado em Toxicologia e Análises Toxicológicas, Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2010.
WATTS, R.R.; LANGONE, J.J.; KNIGHT, G.J.; LEWTAS, J. Cotinine analytical workshop report:
consideration of analytical methods for determining cotinine in human body fluids as a measure of passive
exposure to tobacco smoke. Environ Health Perspect. Vol. 84, (1990), pp. 173-182.
Apoio: FAPERGS
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