UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
RAFAELA ALBUQUERQUE MELO
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA IL-17 E DO ROR-γT NO LÍQUEN PLANO
ORAL
NATAL/RN
2015
RAFAELA ALBUQUERQUE MELO
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA IL-17 E DO ROR-γT NO LÍQUEN PLANO
ORAL
Artigo científico apresentado ao Departamento de
Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte na disciplina de TCC II como parte dos
requisitos para conclusão da graduação em
Odontologia.
Orientadora: Prof. Dra. Márcia Cristina da Costa
Miguel
NATAL/RN
2015
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Melo, Rafaela Albuquerque.
Análise da imunoexpressão da il-17 e do ror-γt no líquen plano oral / Rafaela
Albuquerque Melo. – Natal, RN, 2015.
31 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) – Universidade
Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de
Odontologia.
1. Líquen plano bucal - Monografia. 2. Patogênese - Monografia. 3. Células th17 Monografia. I. Miguel, Márcia Cristina da Costa. II. Título.
RN/UF/BSO
Black D61
RAFAELA ALBUQUERQUE MELO
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA IL-17 E DO ROR-γT NO LÍQUEN PLANO
ORAL
Artigo científico apresentado ao Departamento de
Odontologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito para aprovação
na disciplina de TCC II.
Aprovado em
____/____/____
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel
Orientadora
UFRN
Prof. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira
Membro
UFRN
Prof. Dr. Lélia Maria Guedes Queiroz
Membro
UFRN
DEDICATÓRIA
A Deus, para quem eu devo tudo o que sou e o que tenho.
“Confia teus negócios ao senhor e teus planos terão bom êxito.” (Provérbios 16, 3);
À minha mãe, Irianne de Albuquerque Marques, pelo seu amor e carinho incondicionais,
por sempre acreditar no meu potencial e por me mostrar a importância dos estudos. Sem você
eu não teria ultrapassado os obstáculos do caminho;
AO meu pai, Rafael Pontes Melo, por ter me ensinado o valor dos estudos, pelo seu amor
que ultrapassa barreiras e que apesar de estar distante fisicamente, encontra-se presente
espiritualmente. Sei que estaria muito feliz por me ver chegar até aqui;
À minha irmã, Mariana Albuquerque Melo, por ser a minha fiel companheira de estudos,
pelo seu amor sem limites, por não me deixar desistir dos meus sonhos e me estimular a
seguir adiante quando eu precisei,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À professora Doutora Márcia Cristina da Costa Miguel, minha orientadora do Trabalho de
Conclusão de Curso, por sua paciência e sabedoria na condução deste trabalho de
fundamental importância para mim. Obrigada por ter me dado a oportunidade de fazer parte
da base de pesquisa em Patologia Oral da UFRN, sendo a grande responsável por meu
crescente interesse pela imunologia e patologia Oral. A sua responsabilidade e competência
com o que faz, bem como o seu amor ao trabalho motivam qualquer aluno a querer sempre
aprender. Muito obrigada por me inspirar a sempre dar o melhor de mim.
À professora Doutora Éricka Janine Dantas da Silveira, por quem tenho enorme admiração.
A sua dedicação ao trabalho e o carinho com que trata os alunos a engrandece enormemente.
Sua sabedoria e amor com o que faz só refletem ainda mais a excelente profissional que é.
À minha mãe Irianne de Albuquerque Marques e à minha irmã Mariana Albuquerque
Melo por toda a compreensão nos momentos de realização deste trabalho e por sempre
torcerem por mim.
À Bárbara Vanessa de Brito Monteiro por nunca ter medido esforços para me ajudar, por
todas as dúvidas esclarecidas e por todo o material disponibilizado para o andamento deste
estudo.
À Anderson Fernandes pela sua grandiosa ajuda na análise estatística deste trabalho e por
quem admiro bastante e À Cecília e A todos da biblioteca por toda a ajuda na construção
desse projeto.
À Maria Alice Ramalho de Sá Leite pela convivência na patologia e por ter me auxiliado
nos momentos de dúvida.
À Thâmara Manoela Marinho que sempre se prontificou a me ajudar quando eu precisei.
À Luiz Arthur Barbosa da Silva pelas dúvidas esclarecidas.
À Sandrinha, Ricardo e Hévio por sempre se disponibilizarem em me ajudar.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de IL-17 no infiltrado inflamatório de
LPO (400x)...............................................................................................................................27
Figura 2- Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de IL-17 no infiltrado inflamatório de
HFI (400x).................................................................................................................................27
Figura 3- Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de ROR-γt no infiltrado inflamatório
de LPO (400x)...........................................................................................................................28
Figura 4- Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de ROR-γt no infiltrado inflamatório
de HFI (400x)............................................................................................................................28
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO...............................................................................10
2
MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................11
2.1
Análise imuno-histoquímica............................................................11
2.2
Análise estatística.............................................................................12
3
RESULTADOS...............................................................................13
3.1
Características clínicas....................................................................13
3.2
Análise de imunoexpressão de IL-17..............................................14
3.3
Análise de imunoexpressão de ROR-γT........................................14
4
DISCUSSÃO....................................................................................15
5
AGRADECIMENTOS....................................................................21
REFERÊNCIAS..............................................................................21
ANEXO.............................................................................................29
Análise da imunoexpressão da IL-17 e do ROR-γT no Líquen Plano Oral
R.A. Melo 1, M.A. Ramalho de Sá1, B.V.B. Monteiro2, E.J.D. Silveira 2, M.C.C. Miguel2
1
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN, Brasil
2
Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, RN, Brasil
Correspondência: Márcia Cristina da Costa Miguel, Programa de Pós-Graduação em
Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova, Natal, RN, Brasil, CEP 59056-000. Tel.: +55
84 3215 4138; fax: +55 84 3215 4138. E-mail: [email protected].
RESUMO
O Líquen Plano Oral (LPO) é considerado uma doença imunologicamente mediada que
possui dois subtipos principais: reticular e erosivo. A linhagem TH17 é um subtipo de células
T CD4+ que pode estar associada à patogênese do LPO. O objetivo deste trabalho foi
pesquisar a imunoexpressão de IL-17 e de RORγt no LPO dos tipos reticular e erosivo.
Selecionou-se 38 casos de LPO, sendo 26 do tipo reticular e 12 de erosivo. Em um aumento
de 100x, foi selecionada a área com maior imonumarcação na região subepitelial e,
posteriormente, em um aumento de 400x, foram contados os linfócitos imunomarcados em 5
campos, para cada anticorpo avaliado. Foram utilizados casos de Hiperplasia Fibrosa
Inflamatória (HFI) para comparação. Testes estatísticos foram usados para avaliar a diferença
entre o número de linfócitos marcados para IL-17 e ROR-γT de acordo com o tipo de lesão.
Os resultados mostraram que não houve diferença estatisticamente significativa entre o LPO
reticular, LPO erosivo e HFI com relação à imunoexpressão de IL-17 (p = 0,122). Porém,
observou-se diferença estatisticamente significativa entre o LPO e HFI na análise do ROR-γT
(p < 0,001). Não houve diferença entre a imunoexpressão do IL-17 e o RORγT com relação
aos tipos reticular e erosivo do LPO. A alta quantidade de IL-17 e principalmente do ROR-γT
no LPO indica que a resposta Th17 participa ativamente da patogenia desta doença.
Palavras-chave: Líquen plano bucal, Patogênese, TH17.
ABSTRACT
Oral lichen planus (OLP) is considered an immunologically mediated disease that has two
major subtypes: erosive and reticular. The strain TH17 is a CD4 + T cell subtype that may be
associated with the pathogenesis of OLP. The aim of this study was to investigate the
immunoreactivity of IL-17 and RORγt in the OLP types reticular and erosive. It selected 38
cases of OLP, 26 of the reticular type and 12 erosive. In one 100x magnification, the area was
selected with higher immunostaining subepithelial region and thereafter an increase of 400
times, the lymphocytes were counted in 5 fields immunostained for each antibody assessed.
Case of Iinflammatory Fibrous Hyperplasia were used for comparison. Statistical tests were
used to evaluate the difference between the number of lymphocytes stained for IL-17 and
ROR-γT according to the type of lesion. The results showed no statistically significant
difference between the reticular OLP, erosive OLP and HFI regarding IL-17
immunoreactivity (p = 0.122). However, there was a statistically significant difference
between OLP and HFI in the analysis of ROR-γT (p <0.001). There was no relationship
between the immunoreactivity of IL-17 and the RORγT in relation to reticular and erosive
type of OLP. The high IL-17 expression and especially ROR-γT in OLP indicates that Th17
response participates actively in pathogenesis of this disease.
Keywords: Oral lichen planus, Pathogenesis, TH17
10
INTRODUÇÃO
O líquen plano oral (LPO) é uma doença imunologicamente mediada de caráter
inflamatório crônico e que tem maior prevalência em indivíduos de meia idade e sexo
feminino (Carrozzo & Thorp 2009; Boorghani et al. 2010; Fraga et al. 2011; Dudhia et al.
2011; Colonia & Vélez 2011). Essa desordem acomete aproximadamente 2% da população
(Carrozzo & Thorp 2009; Boorghani et al. 2010) e não aparenta exibir predileção racial
(Carrozzo & Thorp 2009).
Clinicamente o LPO pode se caracterizar de várias maneiras (Colonia & Vélez 2011),
dentre as quais os tipos reticular e erosivo apresentam-se com maior frequência. A forma
reticular é a mais encontrada, apresentando-se de modo assintomático na grande maioria das
vezes (Boorghani et al. 2010). Diferentemente, a forma erosiva do líquen plano normalmente
é sintomática (Nico et al. 2011) e os pacientes relatam sensação de dor e queimação (Dudhia
et al. 2011).
O diagnóstico do LPO é dado pela análise conjunta das características clínicas e
histopatológicas (Nico et al. 2011). Não há tratamentos direcionados e específicos, sendo o
uso de corticoides tópicos os mais utilizados (Carrozzo & Thorp 2009; Boorghani et al. 2010;
Colonia & Vélez 2011).
Apesar de não ter uma etiologia totalmente elucidada (Boorghani et al. 2010), é
reconhecido que a patogênese do LPO decorre de uma resposta imunologicamente mediada e
muitos autores têm acreditado tratar-se de um processo de natureza auto-imune (Lukac et al.,
2006; Charazinska-carewick et al., 2008; Fahri & Dupin, 2010; Mattila et al., 2011 ) e esta
doença tem sido associada a mecanismos específicos e não-específicos. Os mecanismos
específicos incluem a apresentação de antígenos pelos ceratinócitos da camada basal e
posterior morte desses ceratinócitos pelos linfócitos T citotóxicos. Enquanto os mecanismos
não-específicos englobam a degranulação de mastócitos e a ativação de metaloproteinases da
matriz (Fraga et al. 2011).
A linhagem Th17, que foi recentemente descoberta, produz citocinas, como a IL-17 e
tem sido considerada como uma importante linhagem presente na inflamação tecidual e
autoimunidade (Oukka, 2008; Fujisawa et al. 2011). Esta linhagem diferencia-se a partir da
interação das citocinas inflamatórias, tais como a IL-1, IL-6 e IL-23, que juntamente com o
11
TGF-β estimulam a produção do RORγt que é o fator de transcrição responsável pela
diferenciação dessas células (Yasuhiro, 2011; Abbas et al. 2012).
Poucos estudos têm pesquisado a associação da linhagem TH17 com a patogênese do
LPO (Xie et al, 2014; Wang et al, 2013; Piccinni et al, 2014; Wang et al, 2015). Sendo assim,
o presente estudo foi realizado com o objetivo de pesquisar a imunoexpressão de IL-17 e do
RORγt no LPO, dos tipos reticular e erosivo, com o intuito de contribuir com maiores
esclarecimentos sobre a possível participação da linhagem TH17 na patogenia do LPO.
MATERIAIS E MÉTODOS
Dentre os casos arquivados no laboratório de Anatomia Patológica da Disciplina de
Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN) foram selecionados 38 casos com diagnóstico histopatológico para LPO e 9
para HFI. A HFI foi selecionada como lesão comparativa pelo fato de algumas vezes exibir
infiltrado inflamatório intenso na região subepitelial, mas possuir patogenia distinta, sendo
associada ao trauma mecânico. Foram escolhidos casos com qualidade e quantidade suficiente
de material nos blocos de parafina considerados adequados para o estudo imuno-histoquímico
e dados suficientes no prontuário para caracterizar o LPO quanto à sua forma clínica. Dos
casos de LPO selecionados, 26 foram do tipo reticular e 12 do tipo erosivo. A classificação
quanto aos tipos de LPO foi feita de acordo com as informações da ficha clínica. Quando
havia presença de lesões assintomáticas e linhas brancas entrelaçadas o caso foi classificado
como reticular. Por outro lado, quando caracterizados como lesões sintomáticas, ulceradas e
eritematosas o caso foi classificado como erosivo. O projeto de pesquisa foi submetido à
apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, tendo parecer aprovado com o número
362/2011.
Análise imuno-histoquímica
A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina foi submetida
a cortes de 3 micra de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro devidamente
preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao método da
imunoperoxidase pela técnica da estreptoavidina-biotina (LSAB + System HRP, Dako North
America Inc., Carpinteria, CA, USA) utilizando os anticorpos primários anti-IL-17 e anti-
12
ROR-γt (QUADRO 1). Como controle positivo para os anticorpos anti IL-17 e e anti-ROR-γt
foram utilizados cortes de tecido tonsilar. Enquanto o controle negativo consistiu na
substituição do anticorpo primário por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução
tampão.
A expressão imuno-histoquímica do IL-17 e ROR-γt foi analisada sob microscopia de
luz (Olympus CX41, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN) considerando-se a quantidade de
células marcadas para os anticorpos utilizados. A quantidade de células imunomarcadas foi
avaliada escolhendo-se em um aumento de 100x a região subepitelial com maior marcação.
Dentro desta área, sob aumento de 400x, os 5 campos selecionados aleatoriamente foram
fotomicrografados por meio de uma câmera acoplada ao microscópio (Olympus EVOLT E330, Olympus Japan CO., Tokyo, JPN) para serem contados os linfócitos imunomarcados.
Em seguida, as imagens foram enviadas ao computador por meio do sistema Olympus
MasterTM2. Foram considerados imunomarcados os linfócitos que exibiam coloração marrom
de qualquer intensidade no seu citoplasma, sendo registradas as contagens. Em seguida foi
calculada a média e mediana das imunomarcações positivas entre os campos de cada lâmina
estudada. A avaliação foi realizada por uma observadora, previamente treinada, que não teve
acesso a qual tipo de lesão estava sendo analisada.
Análise estatística
Os dados foram analisados através do Statistical Program Software - SPSS® 17.0
(SPSS Inc., Chicago, USA) mediante os testes estatísticos de Mann Whitney para analisar até
duas variáveis e de Kruskal-Wallis para análise de mais de duas variáveis. Foi estabelecido o
nível de significância em 5% (p < 0,05) para os testes estatísticos utlizados neste estudo.
Quadro 1. Especificidade e clone, número do catálogo, fabricante, diluição, recuperação
antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo.
Especificidade e
Nodo
clone
Catálago
Fabricante
Diluição
sc-7927
Incubação
antigênica
Santa Cruz -
IL-17 (H-132)
Recuperação
Biotechnology
Citrato pH
1:500
6,0, Pascal
121oC, 3
minutos
Citrato pH
Overnight
13
ROR-γT (6F3-1)
6F3-1
Millipore
1:300
6,0, Pascal
120 minutos
o
121 C, 3
minutos
RESULTADOS
Características clínicas
Neste estudo, observou-se que 55,3% (n = 26) da amostra estudada corresponderam ao
LPO reticular, 25,5% (n = 12) ao LPO erosivo e 19,2% (n = 9) à HFI (TABELA 1).
Comparando-se as duas formas clínicas do LPO observou-se que o tipo reticular representou
68,4% (n=26) da amostra encontrada, enquanto que o tipo erosivo 31,6% (n=12).
Dos 38 pacientes com LPO analisados, 78,9% (n=30) correspondiam ao sexo
feminino, enquanto 21,1% (n=8) ao sexo masculino. Nas lesões de LPO reticular, 69,2%
(n=18) dos casos foram encontrados no sexo feminino, enquanto 30,8% (n=8) no sexo
masculino. Todos os casos de LPO do tipo erosivo neste estudo acometeram o sexo feminino.
A análise da amostra dos indivíduos diagnosticados com LPO com relação à faixa
etária revelou uma predominância de indivíduos entre 30 e 70 anos de idade, o que
correspondeu a 84,3% (n=32) casos do total observado. Foram observados apenas 10,5%
(n=4) de indivíduos com menos de 30 anos de idade com diagnóstico para essa lesão. Além
disso, não foram encontrados idosos com mais de 70 anos de idade diagnosticados com LPO
no presente estudo. Houve subnotificação no prontuário clínico de alguns pacientes com
relação à faixa etária, o que representou 5,2% (n=2) dos casos.
O presente estudo também demonstrou uma predominância de LPO na mucosa jugal
com relação às demais localizações, correspondendo a 52,6% (n=20) dos casos. A gengiva foi
a segunda região mais acometida pelo LPO, englobando 10,5% (n=4) dos indivíduos
estudados. Também foram encontradas lesões em outras regiões orais como lábio inferior e o
dorso da língua, porém com menor frequência.
O sexo feminino foi diagnosticado em 60% (n=18) dos casos com LPO reticular e em
40% (n=12) com o tipo erosivo. Todos os homens do estudo apresentaram a forma clínica
reticular. Com relação à faixa etária, 62,5% (n=20) dos pacientes entre 30 e 70 anos possuíam
14
o LPO reticular, enquanto que 37,5% (n=12) o tipo erosivo. Todos os pacientes com menos de
30 anos nessa amostra foram diagnosticados com a forma clínica reticular (TABELA 2).
Análise da imunoexpressão de IL-17
O estudo imuno-histoquímico para a expressão de IL-17 mostrou que, na maioria dos
campos, observou-se nas lesões de LPO marcação de linfócitos de forma difusa na região
subepitelial (FIGURA 1). Além disso, houve imunomarcação positiva para outras células,
como os macrófagos. Com relação à HFI foi observada imunomarcação para a IL-17 de
maneira predominantemente difusa e com menor quantidade do que o observado para o LPO
(FIGURA 2).
A análise quantitativa da imunoexpressão de IL-17 no LPO demonstrou uma
contagem de linfócitos imunomarcados com valores médios de 14,2 a 219,6, com uma média
de 67,8 (±41,51) e mediana de 56,7. A análise das HFIs revelou uma contagem de linfócitos
com valores médios entre 5,2 e 74, com uma média de 41 (±26,65) e mediana de 42,2
(TABELA 3).
Quando se comparou os tipos reticular e erosivo, verificou-se para o LPO reticular
uma contagem de linfócitos imunomarcados com valores médios entre 14,2 e 219,6 com uma
média de 70,8 (±43,0) e uma mediana de 59,7. Com relação ao LPO erosivo a contagem
mostrou valores médios que variaram entre 27,4 e 147,2 com uma média de 61,5 (±39,1) e
uma mediana de 42,4 (TABELA 4).
De acordo com os testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, observou-se
que não houve diferença estatisticamente significativa entre as lesões de LPO reticular, LPO
erosivo e hiperplasia com relação à imunoexpressão de IL-17 (p = 0,122) (TABELA 5).
Análise da imunoexpressão de ROR-γT
A análise da expressão imuno-histoquímica de ROR-γT no LPO revelou a presença de
uma intensa marcação nos linfócitos na região subepitelial que se apresentou de maneira
difusa (FIGURA 3). Também foi observada marcação positiva para ROR-γT nos macrófagos.
A imuno-marcação nas HFIs se mostrou de maneira difusa e com uma menor quantidade do
que o observado para o LPO (FIGURA 4).
A análise quantitativa da imunoexpressão de ROR-γT no LPO demonstrou uma
contagem de linfócitos imunomarcados com valores médios de 2,4 a 251,23 com uma média
15
de 50,0 (±53,02) e mediana de 34,3. A análise das HFIs revelou uma contagem de linfócitos
com valores médios entre 0,4 e 1,2 com uma média de 0,9 (±0,29) e mediana de 1,0
(TABELA 6).
A análise quantitativa da imunoexpressão de ROR-γT quando comparando-se os tipos
reticular e erosivo revelou para o LPO reticular valores médios que variaram entre 2,4 e 251,2
com uma média de 56,6 (±60,5) e mediana de 34,3. Com relação ao LPO erosivo a contagem
de linfócitos imunomarcados mostrou valores médios entre 3 e 93,2 com uma média de 35,9
(±28,5) e mediana de 33,3 (TABELA 7).
De acordo com os testes estatísticos de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney, observouse que não houve diferença estatisticamente significativa entre o LPO reticular e o LPO
erosivo com relação à imunomarcação de ROR-γT. Todavia, observou-se diferença
estatisticamente significativa entre o LPO das duas formas clínicas em relação à HFI (p <
0,001) (TABELA 5).
DISCUSSÃO
O Líquen plano é uma doença mucocutânea que possui caráter inflamatório crônico,
sendo frequentemente encontrado na mucosa oral. Apesar de não ter uma etiologia bem
definida, diversos autores têm afirmado que a sua patogênese baseia-se em uma resposta
imunologicamente mediada (Colonia et al. 2011; Dudhia et al. 2011; Fraga et al. 2011; Nico
et al. 2011).
O presente estudo mostrou uma predominância de LPO do tipo reticular (68,4%) em
comparação ao LPO erosivo (31,6%), corroborando os achados de Bagán et al (1994) que
analisaram 187 pacientes e encontraram uma prevalência da forma clínica reticular em 178
casos em detrimento da erosiva, presente em 80 pacientes. Resultado diferente foi encontrado
por Einsen (2002) que analisando as amostras de LPO encontrou em 40% dos pacientes a
presença predominantemente da forma erosiva e em 23% do tipo reticular.
De acordo com a literatura, na forma erosiva do LPO há a presença de lesões que na
maior parte das vezes são acompanhadas de alguma sintomatologia, sendo mais significativa
para o paciente. Apresenta-se geralmente por meio de sensação de dor e queimação que são
presentes também nas lesões atróficas e bolhosas (Boorghani et al. 2010; Dudhia et al. 2011;
Fraga et al. 2011). Os estudos mostram que a remissão espontânea raramente ocorre nas
lesões desse tipo (Carrozzo & Thorp 2009) e essa forma de LPO pode se exacerbar em
16
algumas situações, como em decorrência do estresse emocional, por exemplo (Colonia &
Vélez, 2011; Fraga et al. 2011).
O presente estudo mostrou que uma maior frequência das lesões foi encontrada no
sexo feminino (78,9%) com relação ao sexo masculino (21,1%). O trabalho de Einsen (1999)
também exibiu uma predominância de mulheres, correspondendo a 70% dos pacientes, em
detrimento dos homens que representaram apenas 30% dos indivíduos. Esses achados
concordam com a literatura, segundo a qual as mulheres são mais frequentemente acometidas
pelo Líquen Plano do que os homens (Carrozzo & Thorpe 2009; Boorghani et al. 2010;
Dudhia et al. 2011; Fraga et al. 2011; Nico et al. 2011).
Os estudos mostram que o LP atinge aproximadamente 0,5% a 2% da população,
acometendo mais frequentemente o sexo feminino e indivíduos entre 30 e 60 anos de idade
(Boorghani et al. 2010). De acordo com Nico et al. (2011) pode ainda ser prevalente em até
4% da população e, apesar de raro em crianças, sua ocorrência nesse grupo tem sido cada vez
mais presente.
Com relação à faixa etária presente neste trabalho, houve uma prevalência de LPO em
indivíduos de 30 a 70 anos de idade (84,3%), seguido daqueles com menos de 30 anos
(10,5%), porém nenhum paciente diagnosticado com LPO nesse estudo possuía idade superior
a 70 anos. Isso condiz com a literatura, já que o LPO acomete preferencialmente indivíduos
de meia idade (Carrozzo & Thorpe 2009; Boorghani et al. 2010; Colonia & Vélez 2011; Nico
et al. 2011). Fraga et al. (2011) relatam ainda que o LPO é mais frequente em indivíduos de
50 a 60 anos, enquanto que para Dudhia et al. (2011) é mais comum naqueles entre 40 e 50
anos.
A cavidade oral é geralmente acometida e pode ser o único local de envolvimento do
LP (Roopashree et al. 2010). Segundo Nico et al. (2011) cerca de 50% a 70% dos indivíduos
que apresentam LP são acometidos pelo LPO.
No presente estudo, o LPO acometeu os indivíduos predominantemente na mucosa
jugal (52,6%), em seguida na região gengival (10,5%), em menor frequência no lábio inferior
(5,2%) e menos comumente no dorso da língua (2,6%). Isso ratifica os achados da literatura
no que concerne à região de localização do LPO, frequentemente relatado com acometimento
na mucosa jugal, gengiva, dorso da língua e vermelhão do lábio (Nico et al. 2011). A
prevalência, no presente trabalho, de LPO na mucosa jugal é semelhante aos achados de Eisen
(2002) que observaram uma predominância de lesões na região de mucosa jugal. Xue et al.
17
(2005) ainda relatam que as alterações no palato, assoalho da boca e lábio superior foram
incomuns nos seus achados.
Em alguns casos, o diagnóstico diferencial do LPO reticular pode ser feito com a
leucoplasia (Fraga et al, 2011). De acordo com Colonia e Vélez (2011) o tipo erosivo da lesão
deve ser diferenciado de alterações como o Pênfigo Vulgar e Penfigoide das membranas
mucosas. Nico et al. (2011) ainda acrescentam que o diagnóstico diferencial do tipo erosivo
também deve ser feito com aftas, reações medicamentosas, eritema multiforme e lesões
agudas de lúpus eritematoso. E para Fraga et al (2011) também deve ser feito com candidíase
crônica, Morsicatio buccarum, reação liquenoide ao amálgama ou a drogas e doença do
enxerto versus hospedeiro.
No presente estudo, toda a amostra de LPO exibiu microscopicamente intenso
infiltrado inflamatório que se encontrava disposto em faixa na região justaepitelial,
corroborando os critérios para diagnóstico histopatológico preconizado pela OMS em 1978 e
modificados por van der Meij e van der Waal (2003) de que o LPO deve exibir um infiltrado
inflamatório bem definido, confinado à parte superficial do tecido conjuntivo, disposto em
faixa e constituído na maioria das vezes por linfócitos. Esses achados foram semelhantes aos
resultados encontrados por Brant et al. (2008), Sousa et al. (2009), Anuradha et al. (2011);
Fernández-González et al. (2011).
Apesar da etiologia do LPO não ter sido completamente elucidada, segundo Lodi et al.
(2005), existem muitas evidências que sugerem existir uma desregulação imunológica na
patogenia dessa desordem que envolvem, mais precisamente, a resposta imune celular.
Estudos têm mostrado que o desencadeamento da resposta imune inflamatória no LPO
provavelmente está relacionado com um antígeno, ainda desconhecido, que pode ser um autoantígeno ou antígeno exógeno (Lodi et al., 2005; Fahri & Dupin, 2010). Para Roopashree et
al. (2010) o antígeno envolvido na patogenia dessa desordem pode ser um auto-antígeno.
Estudos têm mostrado que a patogênese do LPO decorre de uma resposta
imunologicamente mediada, a qual tem-se acreditado ser desencadeada por um processo
autoimune (Lukac et al., 2006; Charazinska-carewick et al., 2008; Fahri & Dupin, 2010;
Mattila et al., 2011 ). Sendo assim, Charazinska-carewick et al. (2008), analisando o sangue
periférico de indivíduos com LPO, observaram diferença na quantidade de células do sistema
imunológico com relação aos níveis normais, condizendo com a possibilidade de haver
autoimunidade no LPO. Mattila et al. (2011) observaram a presença de linfócitos CD27+ no
18
LPO erosivo e perceberam que a forma como essas células se organizavam na lâmina própria
era semelhante ao observado em doenças autoimunes, como a síndrome de Sjögren.
De acordo com Fahri & Dupin (2010) e Roopashree et al. (2010) a maior prevalência
do LPO nas mulheres, o seu início na idade adulta, a sua cronicidade e a associação com
outras doenças autoimunes também favorecem a possibilidade de haver uma resposta
autoimune nessa desordem.
A literatura mostra que os linfócitos T CD4+ podem ser subdivididos em células T
CD4+ regulatórias (Treg) e em células T CD4+ efetoras (Kurts, 2008). As células T CD4+
helper efetoras são diferenciadas a partir das células T CD4+ naives (Korn et al, 2009). Essas
células T CD4+ efetoras são compostas por três subtipos celulares importantes na defesa do
hospedeiro contra agentes infecciosos: as linhagens TH1, TH2 e TH17. De acordo com Oukka
(2008) e Korn et al. (2009) as células Th17 possuem funções efetoras diferentes dos outros
dois subtipos como a eliminação dos patógenos que não foram combatidos pelas células Th1
ou Th2.
Estudos têm mostrado que as células TH1 e TH17 têm sido consideradas efetoras em
várias doenças auto-imunes (Ivanov et al, 2006; Oukka, 2008; Kurts, 2008; Fujisawa et al.,
2011). Fujisawa et al. (2011) concordam que as células Th17 têm um papel importante na
inflamação tecidual e autoimunidade. Nograles et al. (2008) dizem ainda que o papel dessa
nova linhagem celular tem sido investigado também na infecção. Segundo Oukka (2008) as
células Th17 têm sido implicadas na patogênese de muitas doenças experimentais
autoimunes. Pacientes com doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico, esclerose
múltipla, colite inflamatória e artrite reumatoide têm apresentado aumento nos níveis de IL-17
(Kurts, 2008). São envolvidas também na patogenia de algumas doenças como psoríase e
doença inflamatória intestinal (Abbas et al., 2012).
A literatura tem mostrado que o desenvolvimento das células TH17 a partir células T
CD4+ naive decorre da interação das citocinas inflamatórias, tais como a IL-1, IL-6 e IL23,
que juntamente com o fator de crescimento transformador (TGF-β) estimulam a produção do
RORγt que é o fator de transcrição responsável pela diferenciação das células TH17 (Oukka
2008; Fujisawa et al. 2011; Abbas et al. 2012). De acordo com Oukka (2008) o acréscimo de
IL-6 ao TGF-β não apenas induz a diferenciação das células Th17, mas também inibe a
geração de células Treg, possuindo um importante balanço entre a geração desses dois tipos
celulares. Segundo Korn et al. (2009) as células Th17 secretam IL-17, IL-21 e IL-22 que
auxiliam na indução da inflamação tecidual.
19
O presente estudo demonstrou uma alta contagem de linfócitos imunomarcados com
IL-17 (média = 67,8; ±41,51; Md= 56,7) nas lesões de LPO e de HFI (média = 41; ±26,65;
Md =42,2) sem diferença estatisticamente significativa entre elas (p= 0,122). A forte presença
de IL-17 no LPO encontrada neste estudo sugere uma possível participação do IL-17 na
patogênese dessa desordem. Esses achados se assemelham ao estudo de Sharker & Hassan
(2011) que analisaram o sangue periférico de pacientes com LP cutâneo e encontraram uma
maior quantidade de IL-17 em comparação a um grupo saudável o que sugeriu uma possível
participação da IL-17 na patogênese do LP cutâneo.
A forte presença de IL-17 na HFI observada neste trabalho pode ser justificada pelo
fato dessa desordem representar uma inflamação crônica e apresentar uma grande quantidade
de células inflamatórias, além dos linfócitos. A IL-17 não é uma citocina presente apenas na
resposta Th17, além disto, não está associada apenas aos linfócitos, mas pode ser secretada
também por outras células inflamatórias em inflamações crônicas de diferentes origens. Nos
casos de LPO deste estudo, a maioria das células observadas com imunoexpressão de IL-17
foram os linfócitos, sugerindo que a marcação nessa desordem está relacionada
provavelmente à linhagem TH17. Corroborando este fato, Wang et al. (2013) observaram que
a IL-17 pode estar associada à patogênese do LPO em pacientes com periodontite crônica e de
acordo com Cătană et al. (2015) a IL-17 é relacionada à patogênese da doença inflamatória
intestinal.
A análise quantitativa da imunoexpressão de IL-17 no presente trabalho, quando
comparando-se os tipos reticular (média=70,8 ±43,0; Md=59,7) ao erosivo (média=61,5
±39,1; Md=42,4) não mostrou diferença significativa entre eles, o que sugere não haver uma
predileção da expressão de IL-17 com relação aos tipos reticular e erosivo. Diferentemente, o
estudo de Wang et al. (2015) encontrou no grupo com LPO erosivo uma concentração salivar
de IL-17 significativamente maior do que no grupo reticular e no grupo controle. Os autores
observaram que a diversidade microbiana salivar foi correlacionada negativamente com as
concentrações salivares de IL-17, demonstrando que a composição da comunidade microbiana
está intimamente relacionada com a IL-17. Os autores concluem que isso pode justificar a alta
quantidade de IL-17 encontrada no tipo erosivo, já que esta forma clínica possui maior
severidade clínica e a sua possível associação à baixa diversidade microbiana pode ser em
decorrência de uma maior atividade imunológica que leve a uma maior destruição microbiana.
Alguns estudos têm mostrado que a IL-17 pode estar associada a fases iniciais de
determinadas doenças. Seguindo-se esse raciocínio, a liberação de IL-17 pode levar a uma
20
maior expressão de moléculas de adesão vascular, o que levaria a uma maior quantidade de
linfócitos para os sítios de inflamação. Dessa forma, a linhagem Th17 conseguiria ter acesso
aos tecidos danificados e secretaria citocinas que exacerbariam a doença. Nguyen et al. (2008)
encontraram nos camundongos estudados altas quantidades de IL-17 precocemente à
manifestação clínica da síndrome de Sjögren, evidenciando a participação da IL-17 no
estágios iniciais da doença. De acordo com Steinman (2007) em um estágio inicial das
doenças pode haver uma resposta Th17, havendo a posterior liberação de IL-17.
Já o ROR-γT é um fator de transcrição específico para Th17, sendo considerado um
marcador fidedigno da linhagem Th17. De acordo com Fujisawa et al. (2011) o RORγt é um
membro do receptor hormonal órfão relacionado com retinóide. Considera-se que ele seja um
importante fator de transcrição para a linhagem Th17. Isso justifica a escolha do ROR-γT
neste estudo para avaliar a presença da resposta Th17 na patogênese do LPO.
O presente estudo observou uma maior imunoexpressão de ROR-γT no LPO (média=
50,0 ±53,02 Md= 34,3) do que na HFI (média = 0,9 ±0,29; Md= 1,0) com diferença
estatisticamente significativa entre eles (p< 0,001). Pelo fato do ROR-γT ser um fator de
transcrição mais confiável da resposta Th17 a sua forte imunoexpressão nessa lesão sugere a
presença da linhagem Th17 na patogênese do LPO. Os resultados deste trabalho corroboram
com os achados de Xie et al. (2014) que encontraram uma expressão de RORγT nas lesões de
LPO significativamente mais elevada quando comparada com a mucosa oral normal o que
demonstrou que as células Th17 participam da resposta imunológica em lesões de LPO.
O presente trabalho também comparou a imunoexpressão de RORγT nas formas
clínicas reticular (média = 56,6 ±60,5; Md = 34,3) e erosiva (média = 35,9 ±28,5; Md = 33,3)
e apesar de haver uma maior expressão de RORγT na forma reticular, não foi observada
diferença significativa entre elas. Diferentemente, Xie et al. (2014), ao analisar 24 pacientes
com LPO reticular e 19 com LPO atrófico-erosivo, observaram uma expressão
significativamente maior de RORγT no grupo acometido pelo LPO atrófico-erosivo do que no
grupo diagnosticado com a forma clínica reticular e uma maior expressão de RORγT nos
indivíduos com LPO reticular quando comparado ao grupo controle. De acordo com eles, a
linhagem Th17 participa da resposta imune nas lesões de LPO e a predominância de TH17 no
desequilíbrio TH17/Treg pode ser responsável pela resposta imune no LPO atrófico-erosivo.
O fator de transcrição ROR-γT tem sido relacionado com a patogênese de algumas
doenças inflamatórias, como demonstrado por Leppkes et al. (2009) que identificaram um
papel crucial da expressão de RORγT na inflamação intestinal crônica, de forma que
21
reagentes que atinjam RORγT possam atuar como uma forma terapêutica da Colite crônica.
Estudos têm mostrado a participação da linhagem Th17 na patogênese de doenças
inflamatórias como psoríase, doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla e artrite
reumatoide (Abbas et al, 2012).
A possível participação do ROR-γT por meio da indução da resposta Th17 nas lesões
de LPO sugere a possibilidade do LPO ser categorizado como uma doença autoimune. Cada
vez mais estudos têm tentado mostrar que sua patogênese decorre de fenômenos associadaos à
auto-imunidade (Lukac et al., 2006; Charazinska-carewick et al., 2008; Fahri & Dupin, 2010;
Mattila et al., 2011).
Como conclusão, a partir dos resultados deste estudo, no qual observou-se no LPO
uma forte expressão de IL-17 e principalmente do ROR-γT, fator de transcrição considerado
um marcador confiável do fenótipo Th17, sugere-se que a resposta Th17 está associada à
patogênese do LPO dos tipos reticular e erosivo.
AGRADECIMENTOS
Este estudo foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) através de bolsa do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação
Científica (PIBIC).
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25
TABELAS
Tabela 1 – Distribuição quantitativa dos casos de LPO erosivo e reticular e de hiperplasia.
Natal/RN, 2015.
Lesão
Amostra
LPO reticular
LPO erosivo
Hiperplasia
n (%)
n (%)
n (%)
26 (55,3%)
12 (25,5%)
9 (19,2%)
Fonte: Autora, 2015.
Legenda: LPO - Líquen Plano Oral
Tabela 2 – Distribuição da amostra de acordo com os tipos de LPO. Natal/RN. 2015.
LPO erosivo
LPO reticular
n (%)
n (%)
Masculino
-
8 (100%)
Feminino
12 (40%)
18 (60%)
0(0%)
4 (100%)
12(37,5%)
20(62,5%)
0(0%)
0 (0%)
Gengiva
2 (50%)
2 (50%)
Mucosa jugal
5 (25%)
15 (75%)
Lábio inferior
1 (50%)
1 (50%)
-
1 (100%)
4 (57,1%)
3(42,9%)
Sexo
Faixa etária
<30 anos
30-70 anos
>70 anos
Localização
Dorso de língua
Outras
Fonte: Autora, 2015.
Tabela 3 – Descrição para IL-17 comparando-se o LPO com a HFI. Natal/RN. 2015.
Média
DP
Md
Mín-Máx
Q25-Q75
LPO
67,8
±41,51
56,7
14,2-219,6
38,2-88,5
HFI
41,0
±26,65
42,2
5,2-74,0
13,8-67,8
Fonte: Autora, 2015.
Legenda: LPO - Líquen Plano Oral; HFI – Hiperplasia fibrosa inflamatória
26
Tabela 4 – Descrição para IL-17 comparando-se o LPO erosivo com o reticular. Natal/RN.
2015.
Média
DP
Md
Mín-Máx
Q25-Q75
LPO erosivo
61,5
±39,1
42,4
27,4-147,2
35,6-91,1
LPO reticular
70,8
±43,0
59,7
14,2-219,6
38,8-88,5
Fonte: Autora, 2015.
Legenda: LPO - Líquen Plano Oral
Tabela 5 - Comparação da imunomarcação de IL-17 e ROR-γT entre LPO erosivo, LPO
reticular e HFI. Natal/RN. 2015.
Lesão
p
LPO erosivo
LPO reticular
HFI
Md
Md
Md
IL-17
42,4
59,7
42,2
0,122
ROR-γT
33,3a
34,3a
1,0b
<0,001
Imunomarcador
Fonte: Autora, 2015.
Legenda: LPO - Líquen Plano Oral; HFI – Hiperplasia fibrosa inflamatória; a- as lesões não
apresentam diferença estatisticamente significativa entre si; b- a lesão apresenta diferença
estatisticamente significativa com relação à “a”.
Tabela 6 – Descrição para ROR-γt comparando-se o LPO com a HFI. Natal/RN. 2015.
Média
DP
Md
Mín-Máx
Q25-Q75
LPO
50,0
±53,02
34,3
2,4-251,2
9,5-80,5
HFI
0,9
±0,29
1,0
0,4-1,2
0,7-1,2
Fonte: Autora, 2015.
Legenda: LPO - Líquen Plano Oral; HFI – Hiperplasia Fibrosa Inflamatória
Tabela 7 – Descrição para ROR-γt comparando-se o LPO erosivo com o reticular. Natal/RN.
2015.
Média
DP
Md
Mín-Máx
Q25-Q75
LPO erosivo
35,9
±28,5
33,3
3,0-93,2
7,5-59,2
LPO reticular
56,6
±60,5
34,3
2,4-251,2
9,5-93,9
Fonte: Autora, 2015.
Legenda: LPO - Líquen Plano Oral
27
FIGURAS
Figura 1. Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de IL-17 no infiltrado inflamatório de
LPO (400x).
Figura 2. Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de IL-17 no infiltrado inflamatório de
HFI (400x).
28
Figura 3. Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de ROR-γt no infiltrado inflamatório
de LPO (400x).
Figura 4. Fotomicrografia exibindo a imunomarcação de ROR-γt no infiltrado inflamatório
de HFI (400x).
29
ANEXO
Anexo A. Parecer emitido pelo Comitê de Ética em Pesquisa.
30