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ANÁLISE PROTEÔMICA DA FRAÇÃO FLAGELAR DE Leishmania spp. PARA
INDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RADIAL SPOKE.
Ana Carla Rodrigues (bolsista ICV/UFPI), Ana Carolina Landim Pacheco (Orientador, Depto
de Biologia – UFPI/CSHNB)
INTRODUÇÃO: Leishmania spp. são responsáveis por um complexo grupo de
diversas formas clínicas das clássicas doenças negligenciadas amplamente
conhecidas como Leishmanioses. Os parasitas do gênero Leishmania são
heteroxênicos, com ciclo de vida digenético, tendo flebotomíneos como insetos
vetores e muitas ordens de mamíferos como seus hospedeiros: roedores, canídeos,
edentados, marsupiais, ungulados primitivos e primatas. Todos esses mamíferos
são considerados reservatórios potenciais da doença. Humanos são considerados
hospedeiros acidentais (BANULS et al., 2007). O estágio no inseto, chamado de
promastigota, caracteriza-se por uma célula fusiforme com aproximadamente 11- 20
µm de tamanho e 2 µm de diâmetro, com um longo flagelo que emana do bolso
flagelar, este uma evaginação da membrana citoplasmática na extremidade anterior
da célula. As promastigotas são transmitidas para o hospedeiro mamífero durante o
repasto sanguíneo do mosquito. Essas formas são absorvidas pelos macrófagos e
vão se alojar nos lisossomos destas células de defesa do hospedeiro, formando os
chamados vacúolos parasitóforos. Ao invés de serem degradados neste ambiente
[que deveria ser adverso, pelas altas temperaturas e baixo pH, os parasitos sofrem
diferenciação para a forma amastigota, esférica, com volume celular reduzido,
refletido em um comprimento e largura de 5-6 µm, além de um flagelo rudimentar ou
críptico (TULL et al., 2004). A importância de se estudar os mecanismos intrínsecos
pelos quais estes patógenos exercem seus efeitos devastadores nos hospedeiros
mamíferos (no homem, em particular) continua cada vez mais oportuna à luz das
recentes descobertas propiciadas pelos resultados dos projetos genoma e por toda a
gama de derivações pós genômicas decorrentes. Por isso mesmo, lançar mão das
ferramentas biotecnológicas atualmente disponíveis, em prol de se avançar no
conhecimento sobre os processos que configuram tamanha pujança a esses
parasitos em suas virulências e resistências, deve ser imperativo. O flagelo é uma
organela-chave na motilidade, aderência, penetração e diferenciação dos
protozoários a serem estudados nesse trabalho (Leishmania chagasi, L.
amazonensis e L. major), sendo essa a importância de se conhecer bem o flagelo e
suas interações com o ambiente a fim de melhor entender as doenças caudadas por
esses patógenos. Estudos de proteômica e genômica realizados em
Chlamydomonas reinhardtii (BROADHEAD et al., 2006) and Trypanosoma brucei
revelaram mais de 500 polipeptídeos distintos que, presumivelmente, são
construídos em subcomplexos axonemal, como as proteínas Radial Spoke (RSP),
utilizados neste estudo como mapa de referência para o conjunto de proteínas
flagelares eucarióticas. Como os genes e proteínas de RSPs de Leishmania estão
longe de serem adequadamente (genoma) anotado ou reconhecido, essa foi a
motivação para investigar as proteínas Radial Spoke, que é um complexo
macromolecular ubíquo, conservado e necessária para a regulação a movimentação
dos flagelos e cílios no axonema 9+2. Proteínas radial spoke são regularmente
distribuídas ao longo dos axonemas dos cílios e flagelos e tem uma subunidade
multipla ‘stalk’ e ‘head’ que formam uma transdução do sinal entre o par central (CP)
e os braços de dineína. Apesar da importância das RSPs como um complexo crucial
de proteínas ‘multi-unit’ encontrado dentro de todos os axonemas flagelares, as
estrutura e modo de ação das RSP ainda são pouco compreendidas (YANG et al.,
2006), enquanto ainda não há nem estruturas no PDB para as RSPs, nem razoável
modelos estruturais para a modelagem de homologia 3D dos RSPs.
OBJETIVO: Realizar análise proteômica para indentificação de proteínas RSP em
Leishmania spp.
METODOLOGIA: O fluxo de trabalho está sendo baseado na extração das proteínas
de culturas gentimente cedidas pelo departamento de parasitologia da Universidade
Federal do Ceará. Para a análise proteômica, as proteínas correspondentes aos
genes selecionados nas predições bioinformáticas serão investigadas a partir da
obtenção de proteínas totais através de um tratamento com tampão de lise contendo
uréia 7 M, tiouréia 2 M, NP-40 2 %, DTT 2% e anfólitos 2 % (pH 3 a 10). Incubação
por 1h à temperatura ambiente e posteriormente centrifugação por 15 minutos a
13.000 rpm (Drummelsmith et al., 2003). As proteínas contidas no sobrenadante
serão quantificadas pelo método de ‘Comassie blue’ (Bradford, 1976).
Para a realização do 2D-PAGE, ainda não realizada, amostras contendo 2 mg de
proteínas serão precipitadas por um período mínimo de 18h e máximo de 36h em
20% de ácido tricloroacético (TCA) em acetona a -20ºC. As amostras serão então
lavadas com acetona em 5 passos sucessivos de centrifugação por 10min a
13.000rpm a 20ºC. Após, o sedimento formado será secado a temperatura ambiente
e incubado por 40mim com tampão de solubilizaçao (7M uréia, 2M tiuréia, CHAPS
4%(p/v), ditioeitol (DTT) 1% (p/v) e 0,2% (v/v) de anfólitos. Após mais uma
centrifugacão de 40min nas mesmas condições anteriores, o sobrenadante será
utilizado para hidratação das tiras de isoeletrofocalização (IPG). Serão utilizados
tiras de pH imobilizados para IPG de 17cm nas faixas de pH de 3-10 e 4-7
(Immobiline IPG Strips - GE Healthcare). As tiras serão hidratadas por 18h à
temperatura ambiente com um volume de 300µL do sobrenadante do passo anterior.
As Focalizações Isoeletricas - IEFs serão realizadas em equipamento do tipo
Multiphor II (GE Healthcare) acoplado a um circulador termostático até 55.000VH,
com uma voltagem máxima de 10.000V. As tiras serão equilibradas no tampão de
equilíbrio I (glicerol 30% (v/v), uréia 6M, DTT 1%(p/v) e um traço de azul de
bromofenol), por 15 min, e no tampão de equlibrio II(tampão de equlíbrio I com
4%(p/v) iodocetamida em lugar de DTT) por mais 15min. Na segunda dimensão, as
tiras IPG foram resolvidas verticalmente por SDS-PAGE 12% em sistema vertical
DaltSix (GE Healthcare) a uma amperagem média de 80mA por gel. A detecção das
proteínas resolvidas em 2-DE/SDS-PAGE será feita através de coloração com prata
(Blum et al. 1987). A análise dos géis bidimensionais será feita, inicialmente através
da digitalização das imagens capturadas pelo ImageScanner II (GE Healthcare). Os
géis serão comparados e os ‘spots’ de proteína terão massa molecular e PI
determinados com o emprego do Software Imagemaster 2D Platinum (GE
Healthcare). Os dados dos spots, resultantes das análises por 2D-PAGE serão
utilizados para identificação das proteínas correspondentes utilizando a ferramenta
de busca TagIdent (web.expasy.org/tagident/), a partir de investigação in silico de
sequencias depositadas em banco de dados públicos (Uniprot, por exemplo).
RESULTADOS: Foi realizada a extração da fração flagelar de Leishmania
amazonensis de cultura gentilmente cedida pela Universidade Estadual do Ceará e
estão armazenadas em freezer -20C para posterior realização de análises 2D-PAGE
e espectrometria de masas. Cultivos de cepas de Leishmania major foi bem
sucedido e foi obtido a fração protéica flagelar. O cultivo de Leishmania chagasi não
foi bem sucedido, não sendo possível a análise do proteoma de L. chagasi. A
análise de gel 2D-PAGE foram identificadas 26 spots de proteínas RSP, não
necessariamente diferentes e singulares RSP.
CONCLUSÃO: Frente aos resultados observados, conseguimos obter apesar das
dificuldades de cultivo a fração flagelar de L. amazonensis e estabelecer o cultivo de
L. major. realizando as análises 2D e identificação 25 prováveis spots de RPSs nos
géis das frações flagelares. Sugere-se ainda uma melhoria na refinação do dados e
intensificação na busca por proteínas RSP descritas na literatura corrente.
Destacando a importância destas proteínas para a motilidade do flagelo que permite
a movimentação desses microorganismos em especial a Chlamydomonas reinhardtii
aqui utilizada como modelo e a Leishmania spp. causadora de uma importante
doença neglienciada prevalente no estado do Piauí que é o Calazar.
Palavras chaves: Bioinformática; Proteínas Radial Spoke; Leishmania spp.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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3. Tull, D.; Vince, J.E.; Callaghan, J.M.; Naderer, T.; Spurck, T.; McFaden, G.I.;
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