UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA – UNIR
NÚCLEO DE SAÚDE - NUSAU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL – PGBIOEXP
CENTRO DE ESTUDOS DE BIOMOLÉCULAS APLICADAS À MEDICINA –
FIOCRUZ RONDÔNIA
JOÃO GABRIEL RIBEIRO
ANÁLISE PROTEÔMICA DE ANTÍGENOS DE MEMBRANA DE Leishmania
amazonensis
PORTO VELHO-RO
2012
JOÃO GABRIEL RIBEIRO
ANÁLISE PROTEÔMICA DE ANTÍGENOS DE MEMBRANA DE Leishmania
amazonensis
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Experimental da
Universidade Federal de Rondônia, como
requisito para obtenção do título de mestre
em Biologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stabeli
Porto Velho - RO
2012
FICHA CATALOGRÁFICA
BIBLIOTECA CENTRAL PROF. ROBERTO DUARTE PIRES
Ribeiro, João Gabriel.
R484a
Análise proteômica de antígenos de membrana de Leishmania
Amazonensis. / João Gabriel Ribeiro. Porto Velho, Rondônia, 2012.
70f.
Dissertação (Mestrado em Biologia Experimental) – Núcleo de
Saúde (NUSAU), Programa de Pós-Graduação em Biologia
Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto
Velho, 2012.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stabeli.
1. Leishmania Amazonensis. 2. Análise Proteômica. 3.
Proteolipossomos. 4. Imunorreatividade. 5. Imunoproteômica. I.
Título.
CDU: 573
Bibliotecária Responsável: Eliane Gemaque / CRB 11-549
RIBEIRO, J. G. Análise proteômica de antígenos de membrana de Leishmania
amazonensis. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia, como requisito para
obtenção do título de mestre em Biologia Experimental.
Aprovado em:_____/ _____/_____
BANCA EXAMINADORA:
_______________________________________
Nome
Titulação
Instituição
_______________________________________
Nome
Titulação
Instituição
_______________________________________
Nome
Titulação
Instituição
"As we conquer peak after peak we see in front
of us regions full of interest and beauty, but we
do not see our goal, we do not see the horizon;
in the distance tower still higher peaks, which
will yield to those who ascend them still wider
prospects, and deepen the feeling, the truth of
which is emphasized by every advance in
science, that 'Great are the Works of the Lord'."
(J.J. Thomson, Nature, v. 81, p. 257, 1909).
Às pessoas que dedicaram suas vidas a
fazer a minha vida melhor, minha mãe
Sandra, minhas irmãs Débora e Nídia. A
Tia Cida que sempre se fez presente em
todas as etapas da minha vida e ao meu
padrasto Francisco. Aos meus sobrinhos
que são fontes inesgotáveis de alegria
Mateus, Júlia e a Isabela Estelita,
dedico.
Dedico à minha noiva, Ivie Ribeiro
Barcelos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli por me receber como
seu aluno de pós-graduação, por sua grande paciência e dedicação. Por investir em
minha capacitação e por sua postura humana frente às adversidades. Agradeço por
providenciar e oportunizar o CEBio, onde pude encontrar o meu caminho: a análise
proteômica.
Agradeço a Dra. Marcelle Colhone e ao Dr. Pietro Ciancaglini, por compartilhar
conosco este trabalho tão rico, pela colaboração e pelo envio das amostras.
Agradeço ao amigo Msc. Anderson Makoto Kayano, por compartilhar o entusiasmo
pela ciência, pelas incontáveis ajudas em experimentos tão diversos, bem como na
execução de vários deles quando não foi possível para mim. E por me ensinar os
fundamentos daquelas que se tornaram minhas principais ferramentas de trabalho, a
eletroforese em gel de poliacrilamida e immuno-blotting. As informações adicionais
que foram surgindo sobre as peculiaridades das amostras, sem dúvida foram
consolidadas durante nossas conversas no laboratório. Por ser parceiro no
aprendizado da Química de Edman. Agradeço por suas dedicadas visitas enquanto
estive fora do laboratório.
Agradeço aos colegas de laboratório do CEBio, Kayano, Leandro e Rodrigo que
participaram na obtenção dos resultados que estão presentes nesta dissertação.
Agradeço ao Prof. Dr. Leonardo Calderon por seus esforços a frente do Laboratório,
e mais recentemente, ao Prof. Dr. Andreimar Soares por ingressar ao laboratório e
propulsionar o CEBio, com toda a sua paciência, atenção, disponibilidade e por
suas contribuições, respectivamente, a este trabalho.
Agradeço ao Dr. Roberto Nicolette, por sua atenção, pelas sugestões e
contribuições ao presente trabalho.
Agradeço a Dra. Carla Celedonio por sua suas sugestões, contribuições e conversas
sobre proteínas de membrana.
Agradeço ao Dr. Carlos Roberto Alves e a Dra. Patrícia Watanabe por suas
contribuições e atenção.
Agradeço aos companheiros de laboratório pela convivência ao longo destes anos,
Prof. Msc. Antônio Coutinho Neto, Angela, Ângelo, Cleópatra, Kaynara, Kayena,
José, Tiago, Rafaela, Roniele, George, Débora, Marjorie, Gizele, Denis e à galera
que está chegando ao CEBio.
Agradeço ao pessoal do Laboratório de Bioinformática e Bioestatística, pela sempre
boa disposição em me ajudar com computadores, programas e discussões
científicas. O meu muito obrigado, Andrei, Beto, Dr. Fernando Zanchi, PH e Dr.
Ricardo.
Agradeço ao pessoal do Laboratório de Bioquímica do IPEPATRO, na pessoa da
Profa. Dra. Juliane Zuliane, pelos materiais compartilhados e pela força.
Agradeço à todos os Professores, alunos e funcionários das unidades IPEPATRO e
CEPEM pelas contribuições e vivência, especialmente aos meus colegas de
turma/disciplinas Msc. Sulamita Setubal, MSc. Cezarino, MSc, Fernanda Bay, MSc.
Elis e também à MSc. Joana, a todos o meu mais sincero obrigado e um grande
abraço!
Agradeço à minha amiga por ter me acompanhado durante estes anos, sendo
família para mim na maior parte deste período, por sua grande generosidade, sem a
qual este trabalho não teria sido realizado. Muito Obrigado Sandra Barcelos.
Agradeço a Dra. Lucilene Delazari dos Santos, antes de tudo por sua presteza, por
ajudar sem esperar em troca. Sou grato por sua grande contribuição para minha
formação em análise proteômica
Agradeço ao Prof. Dr. Mário S. Palma pelas oportunidades de ser aluno em
disciplina e curso, por me receber no Laboratório de Biologia Estrutural e
Zooquímica LBEZ para realização de trabalhos que constam nesta dissertação.
Agradeço a Dra. Bibiane Monson de Souza pela realização das análises no LCMSIT-TOF.
Agradeço aos colegas da UNESP que me receberam tão bem e logo se tornaram
bons amigos: Alessandra, Analy, Beto, Daniel, Dom e Nicoli.
Agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelas
bolsas concedidas.
RESUMO
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença negligenciada,
com alta incidência no Brasil, para a qual ainda não se dispõe de vacina ou
diagnóstico eficiente. Proteolipossomos construídos a partir de frações enriquecidas
em proteínas de membrana de Leishmania amazonensis apresentaram efeito
imunoprotetor quando inoculados em camundongos BALB/c. Os mesmos
proteolipossomos foram utilizados na confecção de um nanobiosensor de
diagnóstico diferencial que é capaz de reconhecer e diferenciar soro de
camundongos infectados por L. amazonensis ou Trypanosoma cruzi, resolvendo o
problema atual de imunorreatividade cruzada entre LTA e Doença de chagas no
diagnóstico sorológico convencional. Porém, as proteínas imunogênicas
empregadas ainda não haviam sido identificadas. Neste trabalho, estas proteínas
foram parcialmente identificadas através de técnicas proteômicas. As proteínas de
membrana extraídas de promastigotas de L. amazonensis e aquelas inseridas nos
proteolipossomos foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE e a imunnoblotting revelado com o soro de camundongos BALB/c reativos, respectivamente. Os
spots revelados correspondentes foram submetidos à digestão tríptica em gel e
análise por espectrometria de massas em LCMS-IT-TOF. Os resultados obtidos
foram analisados por meio de bancos de dados de espectros de massa de peptídeos
e proteínas utilizando o programa MASCOT®. Desta forma, doze proteínas foram
identificadas com score significativo, sendo que sete proteínas apresentaram
correlação com bandas imunogênicas em immuno-blotting. As bandas de gel e as
proteínas identificadas foram: Banda PMLA2 de 82,3 kDa, proteína zinco carboxipeptidase hipotética (GI 68128818); banda PMLA4, de 51,1 kDa, proteína hipotética
de função desconhecida (GI 68129375), possivelmente integral à membrana;
PMLA5 de 46,4 kDa, cuja identificação resultou em duas proteínas, a proteína de
membrana similar à tuzina de L. major, (GI 68129360) e a proteína hipotética (GI
68129375); PMLA20 de 56,4 kDa, proteína de membrana GILP galf transferase (GI
68128797) e a cisteíno peptidase com função de ubiquina hidrolase C-terminal (GI
68129587); PMLA8 de massa molecular próxima 10 kDa resultou na identificação da
proteína ATPase aminofosfolipídeo translocadora tipo-P (GI 68127901). Outras cinco
proteínas presentes nas amostras foram identificadas, sendo três proteínas
hipotéticas de L. major (GI 68129000, GI 68129370, GI 68129049873) e duas
proteínas solúveis de L. amazonensis (tubulina-β, GI 68128896 e manose fosfato
isomerase, GI 155675728). Novos estudos imuno-bioquímicos deverão ser
realizados para expandir e validar a identificação de antígenos.
Palavras-chaves: Leishmania amazonensis, análise roteômica, proteolipossomos,
imunorreatividade, imunoproteômica.
ABSTRACT
American cutaneous leishmaniasis (ACL) is a neglected disease with high incidence
in Brazil, for wich one do not have an effective vaccine or an efficient diagnostic has
been still studied. Proteoliposomes constructed with Leishmania amazonensis
membrane proteins were able to produce immunoprotective effect when inoculated
into BALB/c mice. The same proteoliposomes were used to make a differential
diagnosis nanobiosensor which was effective in recognizing serum of Balb/c mice
infected. This nanobiosensor showed selective immunoreactivity with Trypanosoma
cruzi resolving the current cross-immunoreactivity between ACL and Chagas disease
in conventional serological diagnosis. However, the immunogenic proteins used for
proteoliposomes constructs were not been identified. In this work, these proteins
were identified throught proteomic techniques. Membrane proteins extracted from L.
amazonensis promastigotes and those inserted in proteoliposomos were submited to
electrophoresis on SDS-PAGE and immuno-blotting revealed with the serum from
reactive BALB/c mice, respectively. The corresponding spots revealed were
submitted to in gel tryptic digestion and mass spectrometry analysis using a LCMSIT-TOF. The results obtained were analyzed through databases of mass spectra of
peptides and proteins using the software MASCOT®. Thus, twelve proteins were
identified with significant score, and seven proteins correlated with immunogenic
bands in immuno-blotting. The bands of gel and the proteins identified were: A 82,3
kDa gel band PMLA2, putative zinc carboxypeptidase putative (GI 68128818); 51,1
kDa gel band PMLA4 hypothetical protein with unknown function (GI 68129375),
probabily an integral membrane protein; From the 46,4 kDa gel band PMLA5 two
proteins were identified, the L. major tuzin-like protein (GI 68129360) and a
hypothetical protein with unknown function (GI 68129375); From the 56,4 kDa gel
band PMLA4 two proteins were identified, membrane protein GILP GALF transferase
(GI 68128797) and cysteine peptidase with C-terminal ubiquitine hydrolase putative
function (GI 68129587); From the 10 kDa gel band PMLA8, P-type
aminophospholipid translocase (GI 68127901). Five other proteins present in the
samples were identified, three L. major like hypothetical proteins major (GI
68129000, GI 68129370, GI 68129049873) and two soluble proteins from L.
amazonensis (tubulin-β, GI 68128896 and manose fosfato isomerase, GI
155675728). New immune-biochemical studies will be performed to expand and
validate the identification of antigens.
Keywords: Leishmania amazonensis,
immunoreactivity, immunoproteomics.
proteomic
analysis,
proteoliposomes,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo biológico de Leishmania sps. . .......................................................... 21
Figura 2: Âncora de Glicosilfosfatidil-inositol.. ........................................................... 40
Figura 3: Perfil eletroforético em SDS-PAGE a 12,5%T comparativo por coloração
em azul de coomassie e nitrato de prata de EBS e Proteolipossomos. .................... 41
Figura 4: Perfil eletroforético em SDS-PAGE de EBS e Proteolipossomos .............. 42
Figura 5: Perfil eletroforético em SDS-PAGE e Immuno-blotting. ............................. 44
Figura 6: Immuno-blotting de EBS e GPI. ................................................................. 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Identificação proteômica de proteínas de Extrato Bruto Solubilizado de
membrana de L. amazonensis.............................................................................................48
Tabela 2: Identificação proteômica nos géis de EBS de proteínas de membrana de L.
amazonensis. ......................................................................................................................... 49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%T: Porcentual de poliacrilamida total
APC: Células apresentadoras de antígenos
CBB: Coomassie Brilliant Blue R-250
DTN: Doenças Tropicais Negligenciadas
DTT: Ditiotreitol
EBS: Extrato bruto solubilizado
ESI: Ionização por eletronebulização
ESI-IT-TOF-MS: Espectrômetro de massas de ionização por eletronebulização,
armadilha de íons e analisador tempo de vôo
GI: Identificação de gene
GPI: âncora de glicosil-fosfatidilinosiltol
GRAVY: índice de hidrofobicidade médio
GM-CSF: fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos
iNOS: enzima óxido nítrico sintase induzível
LdMT: Transportador de milfetosina de L. (L.) donovani
LPG: Lipofosfoglicano
LPS: Lipopolissacarídeo
LTA: Leishmaniose tegumentar americana
LCMS-IT-TOF: Cromatógrafo líquido em escala semi-micro acoplado a um
espectrômetro de ionização de eletronebulização, armadilha de íons e analisador de
tempo de vôo
MS/MS: Espectro de massas seqüencial (in tamdem)
m/z: relação entre massas e cargas
NO: óxido nítrico
PACAP: Polipeptídeo ativador da adenilato-ciclase pituitária
pI: Ponto isoelétrico
13
PMF: impressão digital de massas de peptídeos
PPG: proteofosfoglicano
PVDF: Fluoreto de polivinilideno
14
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................... 8
ABSTRACT ................................................................................................................................ 9
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ 10
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................. 12
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15
1.1. DOENÇAS TROPICAIS NEGLIGENCIADAS............................................................................... 15
1.2. LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICA - LTA ..................................................................... 16
1.3. A RESPOSTA IMUNOLÓGICA CONTRA LEISHMANIA SPS. ....................................................... 22
2. OBJETIVO ......................................................................................................................... 31
3. MÉTODOS............................................................................................................................ 32
3.1. ELETROFORESE EM CONDIÇÃO DESNATURANTE (SDS-PAGE) ............................................ 32
3.2. IMMUNO-BLOTTING .............................................................................................................. 33
3.3. DIGESTÃO TRÍPTICA EM GEL DE POLIACRILAMIDA DAS BANDAS PROTÉICAS ......................... 34
3.4. ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL (MSMS) DOS FRAGMENTOS PEPTÍDICOS ...... 35
3.5. IDENTIFICAÇÃO AUTOMÁTICA DAS PROTEÍNAS ................................................................... 36
3.6. ANÁLISE IN SILICO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS IDENTIFICADAS ............................. 37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 39
4.1. ELETROFORESE EM CONDIÇÃO DESNATURANTE SDS-PAGE ............................................ 40
4.2. IMMUNO-BLOTTING............................................................................................................ 43
4.3. IDENTIFICAÇÃO PROTEÔMICA E CARACTERIZAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DESCONHECIDAS ..... 45
5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ................................................................................... 59
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 60
APÊNDICE A............................................................................................................................ 69
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doenças tropicais negligenciadas
As doenças infecciosas compõem umas das principais causas de morbimortalidade (WHO, 2010) e são responsáveis por aproximadamente 26% das
mortes entre a população mundial (MOLINARI, 2009). Dentre estas, as doenças
transmissíveis por vetores são muito mais prevalentes nas regiões tropicais e
subtropicais devido ao clima favorável a proliferação dos vetores como, por exemplo,
moscas e flebotomíneos (HOTEZ et al., 2007). Sob o termo coletivo de doenças
tropicais negligenciadas (DTN), aceitam-se as asserções de que são doenças que
afetam os mais pobres e não possuem tratamento e controle eficazes (IFPMA,
2003).
Nas regiões tropicais próximas ao Equador se concentram um sexto da
população mundial em comunidades rurais remotas, favelas urbanas e populações
desalojadas (FEASEY et al., 2010)
Estima-se que 2,7 bilhões de pessoas vivam em áreas de risco de DTN’s na
América latina, África subsaariana e Ásia, com renda de menos de U$ 2,00 (dois
dólares americanos) por dia, falta de acesso a saneamento básico e sistema de
atenção a saúde (HOTEZ et al., 2007; FEASEY et al., 2010). A organização mundial
de saúde (OMS) categoriza doenças relacionadas à pobreza, levando em
consideração os fatores sócio-econômicos das populações afetadas como
desnutrição, analfabetismo, discriminação de gênero, debilidade do sistema imune e
carência de recursos (WHO, 2010).
Os países pertencentes às áreas tropicais endêmicas possuem ocorrência de
ao menos cinco DTN’s e é comum a co-infecção por dois parasitas diferentes
(LINDOSO; LINDOSO, 2009).
Não existe uma definição amplamente aceita na qual são listadas as doenças
tropicais negligenciadas. Fato indiscutível, porém, é a necessidade de tratamentos
diagnósticos mais seguros e eficazes para leishmanioses, doença do sono africano
e doença de chagas (MITROPOULOS; KONIDAS; DURKIN-KONIDAS, 2010).
Aproximadamente 500 milhões de pessoas estão em áreas de risco, 20 milhões
estão infectadas com os patógenos causadores destas doenças, estimando-se
16
mortalidade de 100 mil pessoas por ano (TARLETON et al., 2007). Os únicos
recursos terapêuticos para estas três doenças são medicamentos de uso parenteral
que necessitam de múltiplas administrações, possuem graves efeitos colaterais e
têm diminuição da eficácia devido ao surgimento de resistência (IFPMA, 2003).
Em termos monetários, os investimentos em projetos de controle de doenças
tropicais negligenciadas não passam dos 0,6% do total dos recursos investidos em
saúde no mundo (MOLINARI, 2009). Em pesquisa e desenvolvimento farmacêutico
de doenças infecciosas, 80% do volume de recursos despendidos são direcionados
às chamadas "três grandes doenças" HIV/AIDS, malária e tuberculose (LIESE;
ROSENBERG; SCHRATZ, 2010). Doenças não infecciosas como doenças
cardiovasculares, neurodegenerativas e desordens autoimunes são um campo de
maior exploração econômica, pois na última década, deslocou o interesse da
indústria farmacêutica em relação às doenças infecciosas (MOLINARI, 2009).
Apesar das altas taxas de incidência, morbidade e mortalidade, para algumas
destas doenças tropicais como hanseníase, oncocercose e filariose linfática, existem
tratamentos eficazes (WHO, 2010). Paradoxalmente, não existem políticas públicas
eficientes de controle, prevenção e assistência a saúde que assegurem o acesso e
manutenção do tratamento pela maioria dos enfermos (IFPMA, 2003). O surgimento
de resistência aos medicamentos de primeira e segunda linha utilizados no combate
aos agentes infecciosos acentua a necessidade de maiores investimentos em
pesquisa de novos agentes terapêuticos (MOLINARI, 2009; WHO, 2010). A mesma
urgência de desenvolvimento tecnológico contempla diagnóstico confiável, rápido e
de baixo custo de patologias tropicais (PERINOTO et al., 2010).
1.2. Leishmaniose tegumentar america - LTA
A leishmaniose é uma doença de caráter zoonótico que acomete o homem e
diversas espécies de animais silvestres e domésticos (BRASIL, 2006). Manifesta-se
de diferentes formas clínicas, entre cutânea, muco-cutânea e visceral. Afeta cerca
de 12 milhões de pessoas em 88 países, sendo que 350 milhões de pessoas vivem
em áreas de risco. Possui incidência anual de aproximadamente 2 milhões de novos
casos, destes 1,5 milhões de casos de leishmaniose cutânea e 500 mil casos de
leishmaniose visceral (MITROPOULOS; KONIDAS; DURKIN-KONIDAS, 2010).
17
Dentre os 88 países, todos fazem parte da área de abrangência da doença
nas regiões geográficas como o noroeste da Índia e Paquistão, o Oriente Médio, o
sul da Rússia, regiões litorâneas dos países do Mediterrâneo, além das regiões
norte, oeste e centro-oeste do continente africano. Ocorre também no México, na
América Central e na América do Sul, excetuando-se o Chile. No Brasil a maior
incidência ocorre na região amazônica (BRASIL, 2010).
A Leishmaniose tegumentar americana (LTA) pode ser considerada como
exemplo de doença relacionada à pobreza (WHO, 2010). É uma doença que afeta a
pele e mucosas e causa desfiguração no homem. As feridas ulcerosas na pele,
cicatrizes e deformações implicam em questões psicossociais nos doentes
(GONTIJO; CARVALHO, 2003; WHO, 2010). As condições de pobreza agravam o
risco para os indivíduos não infectados e também a progressão da enfermidade dos
indivíduos infectados. A própria doença leva ao empobrecimento da família devido à
ocorrência
de
debilidade
funcional
e
morte
dos
componentes
familiares
economicamente ativos (WHO, 2010).
A manifestação clínica mais comum é a leishmaniose cutânea localizada,
caracterizada pela presença de úlceras em áreas expostas da pele, passíveis de coinfecções, com tendência à cura espontânea em um período variável entre alguns
meses e poucos anos, no fim do qual ocorrem cicatrizes. As manifestações cutâneas
disseminadas e difusas são menos frequentes, porém mais graves do que a forma
localizada. A manifestação cutânea disseminada é caracterizada por centenas de
nódulos não-ulcerosos, que acometem frequentemente a face e o tronco, não tende
a cura espontânea, porém apresenta resposta considerável à terapêutica
empregada. Em 30% dos casos ocorre acometimento mucoso concomitante e coinfecção com HIV (BRASIL, 2010). A manifestação cutânea difusa ocasiona grave
desfiguração da aparência, devido à formação de placas e múltiplas nodulações não
ulcerosas sobre grandes extensões cutâneas, além de não haver resposta
terapêutica considerável, ocorrendo em pacientes com anergia a antígenos de
Leishmania (BRASIL, 2010).
O diagnostico clínico de leishmanioses, particularmente leishmaniose cutânea
é difícil devido à ocorrência de doenças de espectros clínicos semelhantes, mas de
causas diferentes, como hanseníase, câncer de pele, tuberculose e micoses
cutâneas, por exemplo, em áreas endêmicas de leishmanioses (REITHINGER et al.,
2007).
18
Os métodos diagnósticos parasitológicos padrões são exame microscópico de
aspirados de biopsias corados em Giemsa, exame histopatológico de biopsias
fixadas de lesões ou ainda culturas obtidas de aspirados ou triturados de biopsias.
Os métodos microscópicos são mais comuns porque possuem custo relativamente
baixo, e métodos mais sofisticados são raramente encontrados nos sistemas de
atenção à saúde dos países nas áreas endêmicas. Os métodos de cultura são mais
informativos quanto à espécie do agente etiológico, mas requerem maior
capacitação técnica e maior tempo para produção dos resultados, além de serem
mais caros (REITHINGER et al., 2007).
Estes métodos possuem sensibilidade variável e apresentam limitações
quanto à carga parasitária no material biológico analisado. Embora existam métodos
moleculares altamente sensíveis, mesmo frente a amostras de baixa carga
parasitária, baseados em PCR, este tipo de procedimento requer substancial infraestrutura laboratorial, alto nível de capacitação técnica e são de alto custo, o que os
tornam inviáveis na maioria dos países em áreas endêmicas de leishmaniose. O
diagnóstico sorológico apresenta problemas de sensibilidade, especificidade e não
permite distinção entre infecções atuais ou anteriores (REITHINGER et al., 2007).
Particularmente, há um problema de imunorreatividade cruzada entre
antígenos de L. amazonensis e T. cruzi que ocasionam identificações falso-positivas
dificultando o resultado conclusivo do diagnóstico (PERINOTO et al., 2010).
Embora existam quimioterápicos para leishmanioses, os medicamentos
usados são caros, limitados e tóxicos. Além do mais, os tratamentos quimioterápicos
disponíveis são ameaçados por resistência às drogas pelos parasitas. A prevenção
das leishmanioses, assim como todas as doenças infecciosas, é superior ao
tratamento devido ao acometimento da saúde do paciente, bem como a
desfiguração causada no decorrer de algumas manifestações clínicas da
leishmaniose. Uma vacinação profilática pode provar ser a estratégia mais efetiva ao
controle da infecção e dispersão deste grupo de doenças (DUNNING, 2009).
No entanto, até o momento não existe relatos sobre uma vacina efetiva para
qualquer forma de leishmaniose humana.
Os patógenos causadores da LTA são parasitas protozoários digenéticos do
gênero
Leishmania
sp.,
pertencentes
à
ordem
kinetoplastida
e
família
Trypanosomatidae (CUNNINGHAM, 2002). Existem sob duas formas morfológicas
principais, de acordo com seu estágio de desenvolvimento no vetor como
19
promastigotas flageladas e como amastigotas não flageladas em relação parasitária
com células do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados
(CUNNINGHAM, 2002).
A transmissão ao homem e animais silvestres ocorre pela picada das fêmeas
de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae), de aproximadamente 30
espécies pertencentes aos gêneros Lutzomya e Psychodopygus. A exceção é a
espécie Leishmania major que pode também ser transmitida por pequenos roedores
(CUNNINGHAM, 2002).
O parasita L. (L.) amazonensis é endêmico em locais onde existem florestas
primárias e secundárias nas cinco regiões do Brasil, como nos estados de Rondônia,
Amazonas, Tocantins, Pará e Maranhão na Amazônia Legal; na Bahia na região
nordeste; em Goiás no Centro-Oeste; São Paulo e Minas Gerais no Sudeste e no
Estado do Paraná na região Sul. Além do hospedeiro humano, evidências
experimentais sugerem que os roedores Proechymis e o Oryzomys são
reservatórios de transmissão do parasito L. (L.) amazonensis. Em Rondônia e no
Amazonas seus vetores são os flebotomíneos L. reducta, L. olmeca nociva e,
principalmente L. flaviscutellata. Este flebotomíneo tem ampla distribuição
geográfica, além dos estados onde há distribuição de L. (L.) amazonensis,
abrangem os demais estados da região norte, Ceará, Espírito Santo, Mato Grosso,
Mato Grosso do Sul e Distrito Federal (BRASIL, 2007).
Aproximadamente vinte e uma espécies podem infectar mamíferos (BRASIL,
2010). Nas Américas são reconhecidas onze espécies dermotrópicas causadoras da
doença humana e oito espécies que podem infectar somente animais. Destas sete
espécies foram identificadas no Brasil, seis do subgênero Viannia e uma do
subgênero Leishmania. As mais importantes causadoras de doenças são
Leishmania (Viannia) braziliensis, L. (L.) amazonensis e L. (V.) guyanensis.
(BRASIL, 2007).
Dentre os agentes etiológicos de leishmaniose, Leishmania (L.) amazonensis
merece atenção devido à amplitude e gravidade das manifestações clínicas que
apresenta (BARRAL- NETTO; BARRAL, 1987; PEREIRA; ALVES, 2008), dentre elas
leishmaniose cutânea localizada, disseminada e a forma cutânea difusa (BRASIL,
2010).
Em relação à morfologia dos parasitos do gênero Leishmania ao longo de seu
ciclo biológico, as principais diferenças são as dimensões das células e a estrutura
20
do flagelo que nas promastigotas se estendem para além da superfície celular,
enquanto que nas amastigotas fica confinado na bolsa flagelar (BRASIL, 2006). As
promastigotas são fusiformes e detentoras de flagelo na parte anterior do corpo
celular. Possuem medidas variáveis em torno de 10 a 15 pm de comprimento e 1,53,5 µm em sua parte mais larga. A amastigota não flagelada pode ter formato
esférico, oval ou fusiforme de diâmetros de 1,5 a 3,0 x 3,0 x 6,5 µm (GLEW et al.
1988; BRASIL, 2006). Ambas as formas possuem um núcleo grande que ocupa a
maior parte do volume intracelular e um plastídeo associado à estrutura mitocondrial,
chamado de cinetoplasto (BRASIL, 2006). Em seu interior há uma rede compactada
de DNA circular que compõe cerca de 30% do DNA do parasita (SIMPSON, 1968;
DE SOUZA; ATTIAS; RODRIGUES, 2009; FLEGONTOV et al., 2009; HORIKAWA,
2010). Na matriz citoplasmática estão contidos o Golgi, o retículo endoplasmático,
ribossomos, vacúolos e inclusões. A membrana plasmática é associada à
microtúbulos no lado citoplasmático (BRASIL, 2006).
O início do ciclo de vida pode ser considerado a partir do repasto sanguíneo
das fêmeas dos flebotomíneos (Figura 1). Após a picada no hospedeiro vertebrado
infectado, o mosquito é contaminado pela ingestão de sangue contendo monócitos e
macrófagos infectados. No intestino do mosquito os parasitas diferenciam em
promastigotas e iniciam intensa reprodução assexuada por fissão binária (DE
ARAÚJO SOARES et al., 2003). As formas promastigotas se subdividem em formas
promastigota procíclica proliferativa extracelular alongada que se fixa a parede do
intestino ou forma estacionária infectante promastigota metacíclica encontrada na
foz e na parte anterior do intestino, que não possui capacidade de se fixar na parede
do intestino e migra para partes do aparelho bucal e então ao local da inoculação no
hospedeiro vertebrado (CUNNINGHAM, 2002; ALMEIDA et al., 2003; REAL,
MORTARA; RABINOVITCH, 2010).
21
Estágio no inseto vetor
Divisão no intestino e
migração ao
proboscídeo
Repasto
sanguíneo
As amastigotas se transformam em
promastigotas dentro do intestino
Ingestão de
célula
parasitada
Estágios no hospedeiro
vertebrado
As promastigotas são
fagocitadas por
macrófagos
As promastigotas se
transformam em
amastigotas dentro dos
macrófagos
As amastigotas se multiplicam nas
células de vários tecidos, incluindo
macrófagos
Repasto
sanguíneo
Figura 1: Ciclo biológico de Leishmania sps. no hospedeiro vertebrado e no inseto vetor
(modificado de http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html).
No próximo repasto sanguíneo, após a picada do mosquito na pele do
vertebrado, uma pequena poça de sangue é formada quando a fêmea ingere
sangue. As promastigotas infectantes são expelidas nesta poça de sangue,
adentrando o corpo do hospedeiro vertebrado (KANE; MOSSER, 2000). Este
período de multiplicação e diferenciação ocorre entre quatro a sete dias, e coincide
com o período de maior infectividade em relação a picadas dos mosquitos, após o
qual as formas infectantes em alta densidade migram à válvula cardíaca.
Aproximadamente, entre uma e mil promastigotas metacíclicas são regurgitadas
neste evento (ALMEIDA et al., 2003). As formas promastigotas metacíclicas, por
intermédio de uma diversidade de proteínas de superfície se ligam a receptores dos
macrófagos. O processo de entrada no macrófago pode ser auxiliado por proteínas
do complemento e anticorpos presentes no soro do hospedeiro. Subsequentemente
22
ocorre a formação do vacúolo parasitóforo (VP) encerrando o parasito. O VP então
se funde com os lisossomos formando o fagolisossoma (BRODSKYN et al., 2003).
Após a incorporação aos fagolisossomos, as promastigotas diferenciam-se em
formas amastigotas. As amastigotas se proliferam e após a lise do macrófago
infectam as células vizinhas (CUNNINGHAM, 2002).
Fatores quimiotáticos presentes na saliva do mosquito atraem maior
quantidade de células fagocíticas ao local da mordida, aumentando o número de
células infectadas. No mecanismo das espécies dermotrópicas de Leishmania, as
lesões permanecem na pele, mas nos mecanismos das espécies viscerotrópicas, os
parasitos se dispersam da lesão de pele inicial ao fígado, baço e medula óssea. Os
parasitos replicam intensamente dentro das células retículo – endoteliais, rompem e
dispersam-se através da infecção das células fagocíticas adjacentes, dentro do
mamífero hospedeiro. O mecanismo pelo qual o rompimento dos macrófagos
infectados ocorre, ainda não está elucidado. Não há evidências conclusivas sobre
um possível papel efetor das células do hospedeiro, se são fisicamente rompidas
pela infecção ou se sofrem apoptose (PONTE-SUCRE, 2003). Os sintomas
humanos de leishmaniose são os efeitos do rompimento destas células. Na
ocorrência de uma nova picada de fêmea de flebotomíneo para alimentação de
sangue, os macrófagos infectados são reinoculados, dando prosseguimento ao ciclo
de biológico do parasita (KANE; MOSSER, 2000).
1.3. A resposta imunológica contra Leishmania spp.
O início da relação parasita-hospedeiro pode ser considerado como o
momento da picada do flebotomíneo na pele do hospedeiro vertebrado. A pequena
poça de sangue é formada por efeito mecânico do probóscide além de componentes
da saliva, como a enzima hialuronidase (ALMEIDA et al., 2003).
A indução de resposta imune de hipersensibilidade do tipo tardia pela saliva
do flebotomíneo é descrita, levando em consideração a existência de correlação
entre níveis de IgG1 e IgE antiglândula salivar e resposta hipersensitiva do tipo
tardia a antígenos de Leishmania em crianças de áreas endêmicas de leishmaniose
visceral (GOMES et al., 2002).
A resposta imune inata em leishmaniose é primeiramente mediada por
neutrófilos, monócitos/macrófagos e células dendríticas (OKWOR; UZONNA, 2009),
23
sendo que o macrófago ativado é a principal célula efetora da morte do parasita na
forma
amastigota
e
promastigotas
opsonizadas
pelo
complemento
ou
imunoglobulinas. A ativação dos macrófagos é feita principalmente por linfócitos T
auxiliares, que após a apresentação de antígenos podem se diferenciar em duas
subpopulações de linfócitos TH1 e TH2, ambas com atuação na modulação da
resposta imune, além das demais células apresentadoras de antígenos (APC)
(BRASIL, 2006).
As formas promastigotas procíclicas no ambiente extracelular ficam sujeitas a
ação de componentes da imunidade inata do hospedeiro como fatores do sistema
complemento, podendo ocorrer à liberação de antígenos imunorreguladores. As
formas amastigotas são liberadas após a fissão da célula hospedeira e interagem
com células do sistema imune, podendo ser fagocitadas e apresentar peptídeos
antigênicos via receptores de superfície MHC (PEREIRA; ALVES, 2008).
Estudos em modelos experimentais murinos de infecção por L.(L.) major
evidenciaram que existe uma relação de desequilíbrio entre resposta mediada por
linfócitos TH1 e TH2, que resultaria na resistência ou suscetibilidade do hospedeiro à
infecção. Este modelo serve como base para a compreensão da relação parasitahospedeiro de diversas doenças infecciosas (BRASIL, 2006).
Entre os parasitas do gênero Leishmania, a resposta imune do hospedeiro
mediada por linfócitos TH1 mediante a apresentação de antígenos por uma célula
fagocítica infectada, através da secreção de citocinas características como IL-2, IFNγ, IL-12 e TNF-α pode conferir resistência ao hospedeiro vertebrado devido ao
direcionamento de mecanismos celulares de morte dos parasitos efetivos como
fagocitose. Por outro lado, o estabelecimento de resposta por células TH2, que
secretam citocinas como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TGF-β, pode direcionar a
mecanismos humorais relacionados à eosinófilos, IgE e IgG1, que acarreta o
desenvolvimento da infecção (CUNNINGHAM, 2002; ALMEIDA et al., 2003;
PEREIRA; ALVES, 2008; SAKTHIANANDESWAREN; FOOTE; HANDMAN, 2009;
COELHO et al., 2010).
A relação TH1/TH2 em L.(L.) amazonensis é controversa nos modelos murinos
de infecção, sendo fortemente associada ao perfil genético das linhagens de
camundongos utilizadas, bem como as características fenotípicas intrínsecas destes
em relação à resposta TH1 de camundongos resistentes. Mas as hipóteses para o
fenótipo suscetível variam entre reposta TH2 intrinsecamente predominante, tanto
24
como ausência de resposta TH1 ou ainda por uma resposta misturada entre TH1 e
TH2 (PEREIRA; ALVES, 2008).
Em relação ao modelo de infecção, os camundongos C57BL/6 infectados por
L.(L.) major desenvolvem uma resposta TH1 e fenótipo de resistência. Os
camundongos BALB/c desenvolvem uma resposta TH2 e infecção crônica
progressiva. E, os camundongos deficientes em proteínas especificas, por
eliminação genética ou mediada por anticorpos, apresentam o papel central de
citocinas especificas incluindo INF-γ, IL-4, IL-10 e IL-12 na proteção. Desta forma, os
camundongos BALB/c são importantes modelos de suscetibilidade a infecção, e os
camundongos C57BL/6 são modelos de resistência a doença e seus determinantes.
O hamster sírio é considerado como um modelo mais representativo para o estudo
do lado progressivo da doença humana, porque, apesar da resposta imune TH1 do
hamster, ele desenvolve doença progressiva por causa da atividade de iNOS
reduzida (BIRNBAUM; CRAFT, 2011).
Além disso, alguns estudos colocam em questão se o fenótipo TH1
predominante de células T CD4 + é indicativo absoluto de proteção contra infecções
de L.(L.) amazonensis, demonstrando que o paradigma TH1/TH2 permanece
inexplicado para L.(L.) amazonensis (PEREIRA; ALVES, 2008).
A hipótese de que os parasitos do gênero Leishmania são capazes de
modular a resposta imune do hospedeiro a fim de promover o desenvolvimento e
estabelecimento da infecção é amplamente aceita e descrita, sendo geralmente
associada ao favorecimento de resposta mediada por linfócitos TH2 (ALMEIDA et al.,
2003; PEREIRA; ALVES, 2008; SILVEIRA et al., 2009; COELHO et al., 2010).
Os neutrófilos secretam citocinas como IL-12 e TGF-β e podem apresentar
antígenos via MHC de classe II na presença do fator de estimulação de colônias de
granulócitos e macrófagos - GM-CSF. É possível que neutrófilos infectados
apoptóticos constituam uma fonte inicial de antígenos para células dendríticas. As
células dendríticas maduras não são capazes de ingerir promastigotas, entretanto,
estas células fagocitam e armazenam amastigotas. Peptídeos antigênicos liberados
neste processo podem ser usados por APC no processo de reconhecimento
antigênico (ALMEIDA et al., 2003).
Há evidências de que cisteíno-proteases em L.(L.) amazonensis inibem a
apresentação de antígenos pela clivagem de moléculas de MHC de classe II no
vacúolo parasitóforo, sugerindo um mecanismo imunorregulatório potencial do
25
parasita e que a resposta imune adaptativa pode ser conduzida por moléculas do
MHC de classe I durante a infecção murina, levando a ativação de células T CD8+
durante infecções (PEREIRA; ALVES, 2008).
De modo geral, a ativação dos macrófagos infectados é relacionada à citocina
IFN-γ, autócrina ou produzida por linfócitos T auxiliares, também, como mencionado
anteriormente por linfócitos T CD4+ e CD8+; citocinas como IL-12, IFN-γ, TNF-α,
linfotoxinas e algumas quimiocinas produzidas por macrófagos são envolvidos na
ativação de macrófagos (BRASIL, 2006).
A produção de IL-12 por células dendríticas e macrófagos levam linfócitos T
naive a se diferenciar em células TH1 e induz a produção de IFN-γ por células T e
células NK. A ação conjunta de INF-γ e TNF-α, ativa o gene iNOS, resultando na
produção de NO (CUNNINGHAM, 2002).
O fato de que pessoas infectadas adquirem imunidade contra reinfecções
indica a viabilidade do desenvolvimento de uma vacina (NAGIL; KAUR, 2011).
A primeira geração de vacinas para leishmaniose compreende o uso de
parasitas mortos ou atenuados, de espécies unitárias ou misturas com ou sem
adjuvantes. Outra abordagem neste sentido é o uso de parasitas modificados
geneticamente para conter genes sensíveis a drogas ou depleção de genes
essenciais à sobrevivência posterior do parasita, conhecida como cassetes suicidas
(NAGIL; KAUR, 2011). Questões de segurança e produção em larga escala limitam
o uso de vacinas de parasitas atenuados. Embora existam preparações seguras de
vacinas com parasitas mortos, que possuem razoável imunogenicidade e algumas
evidências de proteção, ainda não existe uma vacina profilática eficaz (NAGIL;
KAUR, 2011).
As vacinas de segunda geração são baseadas na aplicação de subunidades
definidas de antígenos. Diversas tecnologias são empregadas na produção e
direcionamento destas subunidades definidas tais como síntese química, expressão
recombinante, parasitas Leishmania sps. geneticamente modificados, bactérias ou
vírus carreando genes de antígenos de Leishmania, e frações nativas purificadas de
parasitas (NAGIL; KAUR, 2011).
O desenvolvimento de vacinas de segunda geração para Leishmania tem
incluído proteínas recombinantes, poliproteínas, vacinas de DNA, formulações
26
lipossomais e sistema de entrega de vacinas baseados em células dendríticas
(EVANS; KEDZIERSKI, 2011).
Desta forma o desenvolvimento de vacinas de segunda geração é baseado
na identificação de proteínas através de purificação de classes particulares, como
proteínas envolvidas na infecção ou que interferem em funções do sistema imune,
tais como produção de citocinas, apresentação de antígenos ou ativação celular. Por
exemplo, proteínas envolvidas na invasão do parasita à célula hospedeira como
protéinas de superfície ancoradas por glicosilfosfatidilinositol. Outra categoria de
proteínas utilizadas são aquelas presentes em ambos os estágios celulares
promastigota e amastigota ou proteínas presentes em apenas um destes estágios
(SOTO et al., 2009).
Existem trabalhos envolvendo proteínas selecionadas por “screening
genômico”, isto é, sequências de genes em fase aberta de leitura cujas sequências
deduzidas de aminoácidos contêm epítopos antigênicos conhecidos, assim como o
desenho de proteínas recombinantes contendo epítopos antigênicos de várias
proteínas diferentes (SOTO et al., 2009).
A primeira vacina aprovada para leishmaniose visceral canina, leishmune® é
uma fração purificada chamada ligante fucose-manose (FML) e saponina como
adjuvante, e foi caracterizada como um complexo antigênico de L. donovani e o
principal antígeno é NH36, uma enzima envolvida na construção do DNA do parasita
(DUNNING, 2009).
Em seu artigo de revisão, Nagil e Kaur (2011) listaram 17 antígenos definidos
de Leishmania empregados em vacinas:
“Os antígenos definidos empregados nestas vacinas incluem: a
glicoproteína 63 (gp63), glicoproteínas de membrana 46 (gp46
ou M-2), ligante de fucose manose (FML), Homólogo de
Leishmania de receptores de cinase C ativada (p36 ou LACK),
NH36, quimera Proteína Q, Cisteíno protease (CP)B e CPA,
GRP78, antígenos LD1, proteína B1 hidrofílica e acilada de
superfície (HASPB1), LCR1, proteína salivar 15 (SP15),
antígeno de superfície de promastigota 2 (PSA-2), A-2, histona
H1, MML, Fator de crescimento e iniciação de Leishmania
(LeIF),Homólogo de L. major de proteína-1 eucariótica induzida
por estresse (LmSTI1), Homólogo de L. major de antioxidante
tiol-específico eucariótico (TSA) e Leish-111f.”
Apesar deste número de antígenos definidos conhecidos, apenas uma vacina
de segunda geração está em estágio avançado de desenvolvimento. Esta é a vacina
LEISH-F1 +MPL-SE, conhecida anteriormente como Leish-111f, é composta de três
27
poliproteínas recombinantes junto com os adjuvantes, lipídio monofosforil e
esqualeno em uma emulsão estável (MPL-SE) (MODABBER, 2010). Atualmente em
fase II de testes clínicos (SOTO et al.,2009). Além desta, existem outras três vacinas
em fase de testes pré-clínicos na Europa, uma delas é a vacina sintética RAPSODI e
as outras duas são vacinas de DNA como a LEISHDNAVAX (MODABBER, 2010).
Recentemente, estudos in vitro realizados por Colhone e colaboradores
(2009) demonstraram que o estímulo produzido por uma fração de proteínas
ancoradas por GPI de membrana de L. (L.) amazonensis e proteolipossomos
construídos a partir desta fração reduziram o percentual de infecção a macrófagos
peritoneais murinos e o percentual de células amastigotas intracelulares (COLHONE
et al., 2009).
Os resultados do experimento de viabilidade celular e a observação de maior
produção de NO nas culturas de macrófagos submetidas aos estímulos, evidenciam
que os macrófagos foram ativados para matar o parasita intracelular Leishmania (L.)
amazonensis. Associadamente, os proteolipossomos e a fração protéica utilizada
para sua confecção induziram imunidade protetora em camundongos BALB/c de
50% e 60% respectivamente, após desafio com 104 formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis após 14 semanas (SANTOS et al., 2009).
Os proteolipossomos foram imobilizados em eletrodos interdigitalizados, por
uma técnica que envolve várias camadas em um filme poroso que permite
confinamento de carga gerada nas reações biológicas e consequentemente,
detectar variações na resposta elétrica. Os eletrodos foram capazes de detectar
anticorpos específicos purificados, soro total de camundongos infectados com L.
amazonensis e soro de camundongos infectados com T. cruzi diluídos a
concentrações inferiores a 10-5 mg/mL com poder de distinção entre os dois soros
totais, sem apresentar reatividade cruzada (PERINOTO et al., 2010).
Estes resultados demonstram o potencial deste sistema mimético de
membrana carregado com antígenos para o desenvolvimento de produtos
biotecnológicos para o tratamento e diagnóstico de leishmanioses. Contudo, as
proteínas de membrana do extrato bruto e as proteínas de membrana solubilizadas
nos proteolipossomos mencionados ainda não foram identificadas.Embora exista
certo número de estudos sobre as propriedades imunogênicas de proteínas de
Leishmania sps. e sua viabilidade como candidatos para biomarcadores de
diagnóstico e propósitos vacinais contra leishmanioses, informações no papel
28
funcional de antígenos de imunodiagnóstico relevantes são menos abundantes
(KUMARI et al., 2008).
A proteômica pode ser vista como uma abordagem experimental para explicar
a informação contida nas sequências genômicas em termos de estrutura, função, e
controle de processos biológicos e vias (AEBERSOLD; GOODLETT, 2001),
seguindo o dogma central da biologia molecular: DNA → RNA → Proteínas
(WATSON; SPARKMAN, 2007).
Os principais mecanismos de regulação gênica em tripanosomatídeos são
pós-transcricionais, principalmente pós-traducionais. A modulação pós-transcricional
e pós-traducional de mRNA maduro e os níveis protéicos parecem ser realizadas por
regulação da estabilidade do DNA, a taxa de iniciação de tradução e o tunover
protéico. Em função de aumento da estabilidade das proteínas geradas, ocorrem
diversas modificações pós-traducionais em proteínas de Leishmania sps. tais como
acetilação, piroglutamilação N-terminal, deamidação, glicosilação, lipidação, como,
por exemplo, a produção de proteínas ancoradas a membrana plasmática por
domínios de glicosil-fosfatidilinositol. Tais modificações ocasionam efeitos de
regulação de função, localização celular, atividade e interações moleculares. Outro
aspecto relevante do ponto de vista da análise dos produtos gênicos é o fato de que
62%, 50%, e 50% dos genes sequenciados em Leishmania sp, T. cruzi e T. brucei
respectivamente, não possuem função anotada (CUERVO et al., 2010).
As tecnologias proteômicas viabilizam estudos funcionais de proteínas de
Leishmania sps. a nível de organela e célula total (KUMARI et al., 2008). A
proteômica é um campo de pesquisa emergente facilitado por numerosos avanços
nos últimos anos em separação de proteínas, espectrometria de massas,
sequenciamento
e
anotação
de
genomas
e
algorítimos
de
busca
de
proteínas.Atualmente a espectrometria de massas é a ferramenta mais importante
da proteômica (AEBERSOLD; GOODLETT, 2001).
Nos últimos anos, houve o surgimento de vários estudos utilizando
abordagens proteômicas com o objetivo de elucidar as bases moleculares de
processos fisiopatológicos da Leishmania. As técnicas de eletroforese bidimensional
e immuno-blotting dos géis bidimensionais de extratos totais de proteínas solúveis
de parasitas Leishmania donovani, associadas à espectrometria de massas, têm
sido empregadas para identificação de antígenos diferenciais de pacientes humanos
(FORGBER
et
al.,
2006),
ou
para
identificação
de
proteínas
reguladas
29
diferencialmente em amastigotas axênicos e promastigotas de L. panamensis na
faixa de pH de 5-7 (WALKER et al., 2006).
Costa e colaboradores (2011) avaliaram o perfil proteômico solúvel total
diferencial de Leishmania chagassi nas formas promastigota e amastigota, utilizando
a tecnologia de altíssima reprodutibilidade 2-D DIGE (do inglês 2-D Difference gel
electrophoresis) na qual marcações fluorescentes de comprimentos de ondas
diferentes são utilizadas para análise de duas amostras no mesmo gel. Assim como
a elucidação de mecanismos de secreção possivelmente envolvidos na virulência do
parasita, através da identificação de proteínas diferencialmente secretadas no
estágio promastigota (CUERVO et al., 2009), ou ainda a comparação de proteínas
solúveis totais dos parasitas L. major e L. amazonensis no estágio promastigota
(BROBEY et al., 2006).
As estratégias proteômicas podem utilizar da combinação de técnicas
clássicas de fracionamento de organelas e técnicas proteômicas para detecção de
proteínas pouco abundantes e sub-representadas em análises de proteínas totais,
tais como proteínas do peroxissomo ou proteínas de superfície (CUERVO et al.,
2010). A investigação de mecanismo de secreção envolvendo exossomas, por
exemplo, foi realizada utilizando fracionamento protéico, isolamento dos exossomos,
marcação peptídica para análise quantitativa em condições diferenciadas de
secreção, digestão com tripsina dos exossomos e subsequente análise por LCMS/MS com busca em bancos de dados dos espectros dos fragmentos para
comparação
entre
as
espécies
L.
donovani
(Sudan
S2),
L.
mexicana
(MNYC/BZ/62/M379) e L. major (MHOM/IL/80/Friedlin) (SILVERMAN et al., 2010).
A despeito do número de trabalhos envolvendo proteínas de Leishmania,
publicações sobre análise proteômica de proteínas de membrana plasmática e de
superfície de Leishmania são escassas.
Dois trabalhos apenas apresentam eletroforese bidimensional de proteínas
de membrana ou superfície celular de Leishmania. Contudo, não se trata da
obtenção do perfil de proteínas totais de membrana resolvidas por eletroforese
bidimensional e ensaiadas com soro por immuno-blotting dos géis bidimensionais.
Bhowmick e Ali (2009) descreveram a identificação de antígenos de membrana a
partir da separação de extrato total de proteínas de L. donovani utilizando SDSPAGE e immuno-blotting. As bandas protéicas reativas ao soro de pacientes
infectados foram eletroeluídas e as proteínas contidas nas bandas foram resolvidas
30
por eletroforese bidimensional. Os spots protéicos foram recortados, submetidos à
proteólise e analisados por espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF.
Kamoun-Essghaier e colaboradores (2005) descreveram a identificação de
proteínas imunorreativas de uma fração de proteínas de membrana de 30 a 36 kDa
de promastigotas de Leishmania infantum por duas abordagens. Pela primeira
abordagem, bandas protéicas coradas em azul de Coomassie que foram
especificamente reativas com soro de pacientes de leishmaniose visceral, foram
cortadas do gel e submetidas à digestão enzimática. Os peptídeos obtidos foram
sequenciados por Degradação de Edman em um sequenciador automatizado. As
sequências foram atribuídas às proteínas a proteína mitocondrial integral
transportadora de ADP-ATP de L. major, uma NADH citocromo redutase b5
hipotética e uma proteína mitocondrial transportadora hipotética. A segunda
abordagem consistiu na utilização de eletroforese bidimensional combinada a
espectrometria de massas acoplada a nanocromatografia – nanoLC-MS/MS. Para tal
foi utilizado um espectrômetro de massas de ionização electrospray e análise de
massas Quadrupole-Time Of Flight – QTOF. Seis spots compreendidos entre os
valores de pH de 6,7 a 7,4 e de massas de 30-36 kDa corresponderam as proteínas:
subunidade β da proteína de ligação de guanidina a nucleotídeos, antígeno
homólogo ao receptor da proteína kinase C – LACK e a um provável membro da
família de aldeído-redutase. Um spot foi identificado como uma provável ubiquinolcitocromo C redutase (EC 1.10.2.2). Outros spots foram identificados como formas
truncadas do fator de elongamento 1α. Os autores deste trabalho registraram
patentes dos antígenos viáveis para a produção de um kit diagnóstico pra
leishmaniose visceral, contendo as proteínas identificadas (United States Patent
Application 2006021105).
31
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi identificar proteínas antigênicas de membrana de
Leishmania amazonensis, com potencial uso para a construção de protótipos
vacinais e diagnósticos.
32
3. MÉTODOS
As amostras utilizadas foram extratos de proteínas de membrana de L.(L.)
amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), quantificadas pelo método de Lowry possuindo
concentração protéica variável. O primeiro lote de amostras obtido possuía
concentração protéica de 0,5 mg/mL e o segundo lote 6 mg/mL. Além das amostras
supracitadas, o soro de camundongos BALB/c infectados pelo parasita L.(L.)
amazonensis foram cedidos pela Dra. Marcelle Colhone e Dr. Pietro Ciacanglini do
Laboratório de nanotecnologia e sistema miméticos de membrana do Depto de
Química da FFCLRP-USP. A digestão com tripsina das proteínas em gel e as
análises em espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF de amostras foram realizadas
pela Dra. Bibiane Monson de Souza, sob a coordenação do Prof. Dr. Mário Sérgio
Palma.
3.1. Eletroforese em condição desnaturante (SDS-PAGE)
A massa molecular aparente das proteínas foi determinada pelo método
descrito por Laemmli (1970), utilizando-se do sistema Hoefer Mini-VE (Amersham
Biosciences – GE), que produz géis de 8 x 9 cm. Inicialmente, foi utilizado 5%T de
poliacrilamida no gel de empilhamento e 12,5%T no gel de separação. As amostras
foram secas e adicionadas a 15 µL de tampão de amostra contendo 20% (m/v) de
dodecil sulfato de sódio – SDS, 87% (v/v) de glicerol, ditiotreitol a 5,26% (m/v), azul
de bromofenol, solução de Tris pH 6,8 a 6,23% (v/v) e então levadas ao banho-maria
a 100ºC por 5 minutos e aplicadas no gel. Padrões de peso molecular foram
utilizados nos géis para determinar a mobilidade relativa de cada proteína. Para a
visualização das proteínas fracionadas no SDS-PAGE, o gel foi corado pela prata
segundo o método descrito por Blum e colaboradores (1987), ou corados por
Coomassie Coloidal G-250 e Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) em aplicações
de amostra de 30 e 40 µg de proteínas. Após a corrida eletroforética, os géis foram
colocados em solução fixadora, constituída de ácido acético 10% (v/v), metanol 40%
(v/v) e água, por 30 minutos, e subsequentemente, em solução de corante por 12 h.
33
3.2. Immuno-blotting
A técnica de eletrotransferência do experimento de immuno-blotting foi
executada de acordo com o método de Towbin e Gordon (1979), com a substituição
da membrana de nitrocelulose por polivinilfluorideno (PVDF). As alíquotas de extrato
bruto solubilizado de membrana plasmática de L. (L.) amazonensis na forma
promastigota foram submetidas à eletrotransferência do gel de poliacrilamida para
membrana de PVDF em solução tampão de transferência composta por Tris 20 mM,
Gly 192 mM, SDS 0,1% (m/v), pH 8,3 em metanol a 10% (v/v), utilizando-se da cuba
de eletrotransferência Semi-Dry TE 70 (Amersham Biosciences – GE).
Após a medição do comprimento e altura verificou-se que os géis de
separação possuíam as dimensões de 8,6 x 8,4 cm e foram utilizadas estas medidas
para recorte das membranas de PVDF. As membranas recortadas foram imersas em
metanol para ativação por 1 minuto, depois em água por 5 minutos e em seguida, as
membranas foram imersas no tampão de eletrotransferência por 10 minutos
juntamente com 6 folhas de papel filtro recortadas em dimensões idênticas as das
membranas de PVDF. O gel de poliacrilamida foi imerso no tampão de
eletrotransferência por 30 minutos para equilíbrio neste tampão. As folhas de papel,
gel de poliacrilamida e membrana de PVDF foram levados para a cuba de
eletrotransferência e empilhados na superfície do cátodo da cuba, colocando-se
primeiro as 3 folhas de papel filtro, em seguida o gel, subsequentemente a
membrana e outras 3 folhas de papel filtro. Os parâmetros elétricos foram 50 V, 70
mA por 1 a 10 minutos para os géis com dimensões de 8,6 x 8,4 cm. Ao adicionar as
folhas utilizou-se de um tubo de plástico para retirada de bolhas de ar que
possivelmente diminuiria a eficiência da transferência das proteínas.
Após a eletrotransferência, a membrana de PVDF foi imersa em solução
tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) pH 7,4, 3 vezes de 5 minutos. Em seguida, a
membrana foi imersa em 100 mL de tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em
pó desnatado 5% (m/v) em temperatura ambiente por 30 minutos. Após este período
a membrana foi lavada com tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) 3 vezes de 5
minutos para retirada do excesso de leite. A solução de anticorpos primários foi feita
pela solubilização de soro total de camundongos infectados por L. amazonensis em
TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) a concentração de 1:75 (v/v) ou
34
1:50 (v/v). À membrana (8,6 x 8,4 cm) foi adicionada 25 mL da solução descrita
acima e submetida à agitação por 18 horas a 4°C.
Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20 mL de TBS-Tween 20 a
0,1% (v/v) pH 7,4, por três vezes durante 10 minutos para remoção de anticorpos
em excesso. A seguir, a membrana foi incubada com
a solução de anticorpo
secundário na diluição de 1:1000 em TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) por 1 hora, em
temperatura ambiente. Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20 mL de TBSTween 20 0,1% (v/v) pH 7,4 por três vezes durante 10 minutos cada lavagem a
temperatura ambiente. Em sequência, a membrana foi submetida à revelação por
substrato cromogênico 4-Cloro-1-Naftol na seguinte solução: 6mg de 4-cloro-1naftol, 1 mL de metanol, 10 mL de solução TBS pH 7,4 e 50 µL de peróxido de
hidrogênio a 30 volumes.
3.3. Digestão tríptica em gel de poliacrilamida das bandas protéicas
Com base nos resultados do immuno-blotting foi feito um gel SDS PAGE
corado em Solução de Coomassie Coloidal G-250 com 150 µg de conteúdo protéico
em cada poço, dos quais foram recortados seis pedaços, descorados e submetidos
à digestão tríptica em gel, de acordo com o método de Shevchenko (1996).
Os extratos correspondentes a 18 bandas recortadas foram armazenados a 80ºC e subsequentemente submetidas à análise em um sistema de cromatografia
líquida em fase reversa acoplada a um espectrômetro de massas híbrido com
ionização por eletronebulização (Electrospray-ESI), armadilha de íons (Ion Trap-IT) e
analisador do tipo tempo de vôo (Time off flight – TOF), LCMS-IT-TOF (SHIMADZU,
Kyoto, Japão), conforme descrito a seguir.
As bandas foram recortadas sobre uma superfície de vidro limpa, utilizandose um bisturi com troca de lâmina a cada banda, luvas sem talco, touca e máscara a
fim de evitar contaminação. O primeiro experimento foi realizado em sala fechada e
o segundo em uma capela de fluxo laminar. Os recortes foram transferidos para
micro tubos de propileno com capacidade de 1,5 mL (eppendorf®) e imersos em
água deionizada ultra-pura sob agitação constante, por 5 minutos. Em seguida foi
executada a seguinte sequência de trocas de soluções:
100 µL de água durante 5 minutos;
35
100 µL de solução descolorante constituída de dihidrogeno carbonato de
amônio 100 mM 50% (v/v) e acetonitrila 50% (v/v);
50 µL de água por 5 minutos;
50 µL de acetonitrila até o momento em que os pedaços de gel ficaram
brancos e opacos.
Os tubos foram submetidos à centrifugação a vácuo por 10 minutos. A
solução meio reacional de digestão foi preparada a partir de 52 µL uma solução
estoque de tripsina a concentração de 200 ng/µL adicionada a 988 µL de solução de
dihidrogeno carbonato de amônio 50 mM/acetonitrila 10% (v/v). Para cada pedaço
de gel de 1 mm3 foi adicionado 1 µL de solução de digestão, depois foi adicionada
solução de dihidrogeno carbonato de amônio 50 mM até cobrir os pedaços de gel
nos tubos, em banho de gelo e então acondicionados em banho de água com
controle termostático de temperatura a 37ºC por 18 horas. A reação de digestão
tríptica foi terminada pela adição de 0,6 µL de uma solução ácido fórmico/ água 1/3
(v/v) a cada tubo, pela inativação da tripsina devido à acidificação do meio reacional.
O sobrenadante foi removido, adicionado a outro tubo com marcação
correspondente e aos tubos contendo os recortes foram adicionados em cada 30 µL
de solução de extração constituída de acetonitrila 50% (v/v), ácido fórmico 5% (v/v),
água e após 45 minutos em banho de gelo foram submetidos a banho de ultra-som
por 5 minutos e o sobrenadante foi recolhido para os tubos correspondentes. A
extração foi repetida a fim de alcançar bom rendimento, em seguida adicionou-se 30
µL de solução contendo acetonitrila a 90% (v/v) e Ácido fórmico a 5% (v/v). Após 5
minutos o sobrenadante foi recolhido aos tubos e foram concentrados em centrífuga
speedvac®.
3.4. Espectrometria de massas sequencial (MSMS) dos fragmentos peptídicos
As amostras, obtidas a partir da digestão em gel com tripsina, foram analisadas
através de análises de massas com a utilização do sistema LCMS-IT-TOF. Foi utilizado
o sistema UFLC (SHIMADZU) acoplado diretamente (on line) ao espectrômetro de
massas, contendo duas bombas LC-20AD, detector de arranjo de diodos SPD-M20A,
amostrador automático SIL-20AHT e forno para coluna CTO-20A. A análise da amostra
foi realizada sob gradiente de acetonitrila de 5 a 90% (v/v), contendo 0,1% de TFA (v/v),
36
por 90 minutos, utilizando-se uma coluna C-18 Shim-pack XR-ODS (3 x 100 mm), com
poros de 120 Å, com partículas de 2,2 µm (SHIMADZU). A eluição dos componentes foi
monitorada por absorbância ultravioleta a 214 nm através do sistema UFLC
(SHIMADZU), com fluxo de 0,2 mL/min, durante 90 minutos. Os eluentes foram
analisados no modo positivo (ESI+) contínuo, durante todo o experimento.
A obtenção dos espectros de massas foi realizada em um Espectrômetro de
Massas com fonte ESI, do tipo “Ion Trap-Time of Flyght” (IT-TOF SHIMADZU). O
software LCMS solution (SHIMADZU) foi utilizado para controle de aquisição e análise
de dados. Durante todos os experimentos a voltagem na agulha foi 4,5 kV e a voltagem
no cone a 3,5 V. O fluxo de gás secante (Nitrogênio) foi de 100 L/h e o fluxo de gás
nebulizador (Nitrogênio) de 1.5 L/hora. A detecção no espectrômetro de massas foi
realizada com varreduras feitas no intervalo de m/z 200 a 4000 Da, com uma resolução
de aproximadamente 15.000; o sistema de aquisição de dados foi operado em modo
positivo contínuo.
Os experimentos de espectrometria de massas sequenciais, ou seja, de
fragmentação peptídica (MS2 ou MS/MS) foram realizados utilizando os mesmos
parâmetros dos experimentos de MS. Foi utilizado Argônio como gás de colisão a uma
pressão de 100 kPa. Os íons produzidos através dos experimentos MS/MS foram
aprisionados e acumulados durante 50 msegs no íon trap, utilizando-se uma energia de
colisão de 50% e frequência de 30 kHz.
Os espectros de massas obtidos foram analisados primeiramente com as
ferramentas do programa LCMS solution (SHIMADZU), utilizado para controle de
aquisição, análise de dados e intermediação da identificação automática de proteínas
em bancos de dados.
3.5. Identificação automática das proteínas
A identificação proteômica por impressão digital de mapa de peptídeos foi
realizada de acordo com o método de Pappin e colaboradores (1996), e a
identificação probabilística baseada em comparação de espectros MS/MS não
interpretados foi realizada de acordo com o método algorítmico de Perkins e
colaboradores (1999) implementado no pacote de programas MASCOT®.
Em ambos os modos de identificação mencionados, a informação do
sequenciamento genômico dos organismos é utilizada pelo programa para simular
37
os resultado dos experimentos proteômicos e possibilitar comparação com os
resultados experimentais reais, cujo resultado indica probabilidade alta de
identificação da proteína. O programa pode utilizar as sequências gênicas através
de servidores remotos em bancos de dados biológicos na rede mundial de
computadores como o SWISSPROT e o NCBI, ou hospedar as informações em
servidores locais que propiciam maior controle sobre o modo e o conteúdo do banco
consultado em cada análise.
As amostras consistiram de misturas de polipeptídeos parcialmente
separadas em eletroforese e gel de poliacrilamida unidimensional e submetidas à
digestão com tripsina, compondo possivelmente uma mistura de peptídeos de
proteínas diferentes, submetidas à cromatografia em fase reversa acoplada a
espectrometria de massas. A modalidade de busca utilizada no programas
MASCOT® foi MS/MS ion search, levando em conta a análise de mistura de
peptídeos na pontuação probabilística da identificação - MudPit score. Os
parâmetros utilizados foram 2 clivagens de tripsina perdida, oxidação de metionina
como modificação variável uma vez que a interação com os fatores de catálise e
iniciação de polimerização de poliacrilamida, APS e TEMED tornam o suporte de
poliacrilamida um ambiente oxidante aos polipeptídeos; carbamidometilação como
modificação fixa, dado que uma vez que as proteínas são submetidas a esta reação,
pelo uso do reagente Ácido Iodoacético como etapa prévia a digestão com tripsina,
tolerância de massas do peptídeo de 0,6 Da e tolerância de massas do fragmento
do MS/MS 1,2 Da.
3.6. Análise in silico das sequências de aminoácidos identificadas
Após a identificação das proteínas, com seus códigos de acessos foram
realizadas buscas nos bancos NCBI (PRUITT et al., 2009) e UniprotKB (JAIN et al.,
2009), a fim de verificar anotações de informações experimentais
ou inferência
eletrônica de funções através das sequencias, sobre as estruturas proteínas
envolvidas. Os bancos Gene Ontology (ASHBURNER et al., 2000), TriTrypDB
(AURRECOECHEA et al., 2009) e ORTHOMCL (LI; STOECKERT; ROOS, 2003)
foram consultados em relação a anotações de possíveis processos biológicos das
proteínas identificadas. Após a identificação das proteínas, as sequências das
38
proteínas desconhecidas foram utilizadas para predição teórica das propriedades
físico-químicas como massa molecular, pI, e índice de hidrofobicidade pelo
programa ProtParamTools (http://ca.expazy.org/tools/protparam.html) (WILKINS et
al., 1999).
A identificação de possíveis domínios estruturais foi obtida pelo programa
SMART
(Simple
Modular
ArchitectureResearch
Tool)
(http://smart.embl-
heidelberg.de/) (SCHULTZ et al., 1998) e Interpro (http://www.ebi.ac.uk/Tools/
InterProScan/) (APWEILER et al., 2001).
A predição de segmentos transmembrânicos foi realizada pelos programas
THMM 2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (EMANUELSSON et al., 2007),
PSORT II (http://psort.hgc.jp/form2.html) (NAKAI; HORTON, 1999) e SOSUI
(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)
(HIROKAWA;
BOON-CHIENG;
MITAKU,
1998).
A identificação de possível peptídeo-sinal foi feita através do programa
SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (BENDTSEN et al., 2004). O
alinhamento
de
sequências
foi
feito
através
do
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (ALTSCHUL et al., 1990).
programa
BLAST
39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A solubilização das proteínas de membrana do parasita e a confecção dos
proteolipossomos foram realizadas previamente conforme descrito por Colhone e
colaboradores (2008).
Brevemente, o tratamento da fração de membrana plasmática, obtida após
ultracentrifugação, com o detergente Triton X-114, foi utilizado para extração de
proteínas de membrana com âncoras de glicosil-fosfatidilinosiltol (GPI) com
presença confirmada através de ensaio enzimático conforme descreve Colhone e
colaboradores (2008), que foram relatadas como mediadoras em interação celular
parasita-hospedeiro. Estas macromoléculas apresentam componentes não protéicos
constituídos geralmente de carboidratos, lipídios e glicolipídios com longas cadeias
carbônicas que podem aumentar o seu caráter hidrofóbico. A figura 2 representa
uma proteína enfatizando a estrutura de sua âncora de GPI (PAULICK; BERTOZZI,
2008).
40
Figura 2: Âncora de Glicosilfosfatidil-inositol. (Adaptado de PAULICK; BERTOZZI, 2008).
A abordagem adotada priorizou identificar as proteínas de membrana com
atividade imunogênica dentre os componentes do EBS de proteínas de membrana
do parasita L. (L.) amazonensis na fase promastigota.
4.1. Eletroforese em condição desnaturante SDS-PAGE
Foram realizados géis de poliacrilamida SDS-PAGE com as amostras de EBS
de células no estágio de promastigotas. Os géis com 40 µg de proteínas foram
corados com solução de prata de acordo com o método de Blum e colaboradores
(1987), os géis com aplicação de amostra de 80 µg, 140 µg e 150 µg foram
revelados em CBB.
Como observado na figura 3, não houve perfil inicial de separação de
proteínas. Desta forma foi obtido melhor separação de bandas do que nos géis
41
anteriores, submetendo a amostra à desnaturação em tampão contendo SDS e DTT
a temperatura de 37ºC por 30 minutos. Melhor perfil de separação foi obtido
aplicando quantidades menores de amostra por poço, como 85 µg conforme pode
ser visto na figura 4. De acordo com Lee e colaboradores (2005), proteínas de
membrana podem formar agregados com o detergente dodecil sulfato de sódio SDS quando submetidos a banho de água fervente, o que justificaria em parte a
ineficiência de separação observada nos experimentos com desnaturação à
temperatura de ebulição.
Figura 3: Figura 3: Perfil eletroforético em SDS-PAGE a 12,5%T comparativo por coloração
em azul de coomassie e nitrato de prata de EBS e Proteolipossomos. Raias: 1 - Padrões de
peso molecular de 14 – 97 kDa; 2 – Extrato bruto solubilizado (EBS), 40 µg; 3 –
Proteolipossomos, 40 µg; 4 – EBS, 150 µg; 5 – Proteolipossomos, 150 µg. A: corados em
prata; B: corados em CBB.
42
kDa
1
2
3
116
97,2
66,4
42,7
34,6
27
14.3
Figura 4: Perfil eletroforético em SDS-PAGE 12,5%T. Raias: 1- Padrões de peso molecular
de 14 – 97 kDa; 2 e 3- EBS, 85 µg. Ambas amostras desnaturadas por SDS e DTT a 37ºC
por 30 minutos.
Nos géis com concentração de poliacrilamida total de 12,5%T foram
observados sinais no início dos poços de aplicação, evidenciando a presença de
proteínas que não migraram na corrida eletroforética, diferindo do perfil de um gel
com 10%T no qual foi observada a presença de novas bandas no nível superior do
gel e ausência de sinal no início do gel de separação conforme evidenciado pela
comparação das imagens dos géis acima mencionados, assim como a menor
resolução das bandas mais baixas no gel de 10%T do que no gel de 12,5%T.
Schagger e von Jagow (1987) descreveram a separação de proteínas em gel de
poliacrilamida com sistema tampão baseado em tricina, cuja resolução é melhorada
e uniforme para proteínas em amplitude de massas de 1 a 100 kDa, o qual se
apresenta como uma alternativa ao problema de resolução em diferentes
concentrações de poliacrilamida. Baldwin e colaboradores (1993) e Fivaz e
colaboradores (2000) relataram melhor eficiência de separação clivando as âncoras
de glicosil fosfatidil inositol antes da separação eletroforotética em sistemas 1D e
43
2D, respectivamente, através do uso da enzima PI-PLC II e uso de PGNase F para
remoção de ligações N-açúcar, com a obtenção de géis com boa separação
eletroforética de proteínas. Os autores destes trabalhos atribuíram a eficiência de
separação das proteínas de membrana após a clivagem das caudas lipídicas e
glicolipídeos as propriedades conferidas como hidrofobicidade total diminuída, que
resultaram em maior interação do detergente SDS com a molécula com
consequente melhora da eficiência de migração diferencial no campo elétrico,
melhor desenovelamento e desnaturação, menor interação com a matriz de
poliacrilamida do gel e minimização de interação por hidrofobicidade intermolecular e
agregação.
A estratégia preferencial de análise em larga escala de proteínas de
membrana, em linhas gerais consiste de separação por SDS-PAGE seguida de
digestão em gel das proteínas dos spots, purificação dos peptídeos digeridos
através de 2D-UPLC ou RP-UPLC, aplicação dos fragmentos purificados em placa
de MALDI-TOF/MS para análise por PMF e sequenciamento de novo através de
MS/MS (BODNAR, et al., 2003; WU et al., 2003; WU; YATES, 2003; YATES et al.,
2005). As limitações dessa abordagem residem no número de proteínas presentes
em uma mesma banda devido à complexidade da mistura de proteínas de
membrana, que geram escores baixos na identificação em bancos de dados. A
diminuição do número de proteínas presentes em uma banda/spot poderia ser obtida
com a otimização da separação eletroforética que pode ser realizada através de
variações nas técnicas utilizadas uni e bidimensional SDS-PAGE e IEF/SDS-PAGE,
respectivamente. Alguns exemplos são, o sistema descontínuo de Laemmli (1970)
em condição desnaturante glicina-SDS-PAGE e/ou a substituição da focalização
isoelétrica em gradientes imobilizados de pH na eletroforese bidimensional por um
método alternativo como 16-BAC/SDS-PAGE e CTAB/SDS-PAG (RABILLOUD et al.,
1999; MOLLOY, 2000; SANTONI; MOLLOY; RABILLOUD, 2000; SCHAGGER,
2003).
4.2. Immuno-blotting
Foram produzidos géis com 80 µg de cada amostra que foram submetidos à
eletrotransferência para membrana de PVDF. Previamente ao immuno-blotting,
44
foram feitos dois géis carregados com 40 µg de proteínas totais e 40 µg de
proteolipossomos, após coloração em prata apresentaram distribuição espacial
idêntica das proteínas, como é observado na figura 5.
1
2
3
A
4
5
,
6
B
Figura 5: Perfil eletroforético em SDS-PAGE e Immuno-blotting a 12,5%T. Raias: 1 e 3Padrões de peso molecular de 14 a 97 kDa; 2 e 5 – Proteolipossomos, 40 µg; 4 e 6 - EBS,
40 µg. A: Géis corados em prata; B: Immuno-blotting revelado em 4-Cloro-naftol.
.
A amostra empregada no immuno-blotting foi o EBS apenas. Devido a baixa
concentração protéica da fração rica em GPI não foi realizado repetição do immunoblotting com esta amostra.
A eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS com tampão
baseado em tricina possui menor conteúdo de cross-linker e seus criadores relatam
melhor eficiência de eletrotransferência de proteínas do que em um gel com sistema
tampão baseado em glicina (SCHAGGER; VON JAGOW, 1987). Os anticorpos
produzidos através da inoculação dos proteolipossomos em camundongos são
específicos para as proteínas que foram incorporadas aos lipossomos, no entanto, a
separação parcial em gel unidimensional obtida não é suficiente para avaliação do
perfil imunogênico, conforme pode ser observado na figura 6. Será necessário
realizar novos ensaios de immuno-blotting revelando géis com perfil de separação
adequado para diferenciação de quais proteínas apresentam imunorreatividade.
45
1
2
3
4
5
Figura 6: Immuno-blotting de EBS e GPI. Raias: 1 e 3 - Padrões de pesos moleculares de 7
a 175 kDa.; 2- EBS, 80 µg; 4 – EBS, 40 µg; 5 – Fração GPI, 80 µg. Separado em gel de
12,5%T, immuno-blotting revelado em substrato cromogênico 4-cloro-naftol.
4.3. Identificação proteômica e caracterização das sequências desconhecidas
Através da técnica de a cromatografia em fase reversa em escala semi-micro
acoplada a um espectrômetro de ionização por eletronebulização (electronspray)
LCMS-IT-TOF, proteínas de 18 bandas de géis foram processadas e submetidas à
análise em, possibilitando a identificação de 12 proteínas por de comparação de
espectros MS/MS não interpretados através do pacote MASCOT®.
46
As amostras de extrato de proteínas de membrana usadas na confecção dos
proteolipossomos foram precipitadas e ressuspensas em solução tampão Tris-HCl
62,5 mM, pH 6,8 contendo 0,2% SDS (m/v) e submetidas à eletroforese 1D SDSPAGE. Em cada lote, um dos géis foi corado em 0,025% (m/v) azul de Coomassie
R-250 e o outro submetido à immuno-blotting. A imunodetecção foi realizada com o
uso do soro dos camundongos desafiados contra infecção por L.(L.) amazonensis,
anti-IgG de camundongo produzido em coelho conjugado com peroxidase como
anticorpo secundário e revelação em substrato cromogênico 4-Cloro-naftol.
O perfil de proteínas apresentou 18 bandas de massas entre 17 e 106 kDa
bem distinguíveis, dentre as quais 6 apresentaram sinal indicando imunogenicidade
em immuno-blotting, cujas bandas de géis corados em azul de coomassie
correlacionadas através dos fatores de retenção (RF) foram cortadas do gel,
digeridas com enzima tripsina e submetidas à cromatografia líquida de alta eficiência
em fase reversa acoplada a um espectrômetro de massas do tipo ESI-IT-TOF.
Através da identificação em bancos de dados utilizando o software MASCOT®
(PERKINS et al., 1999) na modalidade “MudPIT”, 12 proteínas foram identificadas
com pontuação estatística significativa.
Dentre as proteínas identificadas, as proteínas obtidas a partir de recortes de
bandas de géis, relacionadas a bandas imunogênicas em immuno-blotting obteve-se
proteínas de superfície, proteínas integrais de membrana conhecidas, novas
proteínas e até mesmo proteínas solúveis. Tais como uma zinco metalo-protease,
cisteíno-protease do tipo ubiquitinase, uma ATPase de superfície translocase do tipo
P , proteína similar a GIPL galf transferase, além de uma proteína pouco conhecida
potencialmente de superfície identificada também em Leishmania (L.) major e T.
cruzi denominada Tuzin-like protein.
Duas proteínas solúveis foram identificadas na amostras, a manose fosfato
isomerase de L. (L.) amazonensis, uma proteína utilizada na discriminação de cepas
e espécies de parasitas Leishmania spp. e uma tubulina-β geralmente associada a
um complexo no microtúbulo, muito abundante no citoplasma e presente em todas
as frações subcelulares de extratos protéicos.
Além destas, outras cinco proteínas de função desconhecida foram
identificadas por similaridade a sequências de L. (L.) major e suas estruturas
primárias foram parcialmente caracterizadas por ferramentas de alinhamento
múltiplo e predição de propriedades físico-químicas de proteínas.
47
Na Tabela 1 foram apresentadas as proteínas identificadas relacionando à
banda do gel, o código de acesso, a pontuação probabilística da identificação em
banco de dados e a sequência do peptídeo cujo espectro de MS/MS confere com o
espectro MS/MS deduzido de um peptídeo tríptico teórico das sequencias protéicas
dos organismos presentes no banco de dados consultado. Na Tabela 2 foram
relacionadas às bandas dos géis e das membranas de immuno-blotting e a
identificação das proteínas.
48
Tabela 1: Identificação proteômica de proteínas de Extrato Bruto Solubilizado de membrana de L. amazonensis.
Banda
Proteína
Código de acesso
Mascot Score*
Score threshould**
Sequências peptídicas
PMLA2
metallo-peptidase, Clan MC, Family M14; zinc
carboxypeptidase, putative
68128818
29
25
R.DAAGAQLHHTR.S
PMLA4
hypothetical protein, unknown function
[Leishmania major strain
68129375
24
21
R.LSSVPGMCDGCGAIK.N +
Oxidation (M)
PMLA5
tuzin-like protein [Leishmania major strain
Friedlin]
68129360
26
20
R.GATVK.A
68129099
21
20
R.TGVAGLYLQVDR.Q
68128797
22
20
R.GRPLK.V
68129587
22
20
K.ESQEK.W
68127901
22
21
K.QDTATLATVR.R
68129000
21
20
K.LCATFEK.F
68129370
21
20
R.GKAYK.I
68129049
23
20
R.GTPQPATRR.A
hypothetical protein, conserved [Leishmania major
strain Friedlin
GIPL galf transferase, putative [Leishmania major
PMLA20
strain Friedlin]
cysteine peptidase, Clan CA, family C19, putative;
PMLA20
ubiquitin hydrolase, putative [Leishm
phospholipid-translocating P-type ATPase
PMLA8
(flippase), putative
PMLA5
hypothetical protein, conserved [Leishmania major
strain Friedlin]
hypothetical protein, conserved [Leishmania major
PMLA22A
strain Friedlin]
hypothetical protein, conserved [Leishmania major
PMLA1
strain Friedlin]
PMLA21A
PMLA6
beta-tubulin [Leishmania major strain Friedlin]
68128896
27
25
K.LAVNLVPFPR.L
PMLA1A
mannose phosphate isomerase [Leishmania
amazonensis]
155675728
15
12
K.GLTNDK.S
*Mascot score: pontuação probabilística de identificação. **Score limiar: Probabilidade de a identificação ocorrer ao acaso (p> 0,005).
49
Tabela 2: Identificação proteômica nos géis de EBS de proteínas de membrana de L. amazonensis.
BANDA
RF GEL*
MM GEL
(kDa)**
RF BLOT*
MM BLOT
(kDa)**
NOME
Código de
acesso***
PMLA2
0,336170213
82,33
0,332869081
10,64
metallo-peptidase, Clan MC, Family M14;
zinc carboxypeptidase, putative
68128818
PMLA4
0,53106383
51,13
0.495821727
65,99
hypothetical protein, unknown function
[Leishmania major strain
68129375
PMLA5
0,570212766
46,47
0,622562674
45,47
tuzin-like protein [Leishmania major strain
Friedlin]
68129360
hypothetical protein, conserved [Leishmania
major strain Friedlin
68129099
PMLA5
PMLA20
0,541385435
56,42
0,495821727
65,99
PMLA20
PMLA8
0,837446809
PMLA21A 0,552753108
0,85097493
54,82
PMLA22A
PMLA1
0,225531915
PMLA6
0,774468085
PMLA1A
28,2
23,25
GIPL galf transferase, putative [Leishmania
major strain Friedlin]
cysteine peptidase, Clan CA, family C19,
putative; ubiquitin hydrolase, putative
[Leishm
phospholipid-translocating P-type ATPase
(flippase), putative
68128797
68129587
68127901
hypothetical protein, conserved [Leishmania
major strain Friedlin]
68129000
hypothetical protein, conserved [Leishmania
major strain Friedlin]
68129370
hypothetical protein, conserved [Leishmania
major strain Friedlin]
68129049
beta-tubulin [Leishmania major strain
Friedlin]
68128896
mannose phosphate isomerase [Leishmania
amazonensis]
155675728
*RF: Fator de retenção das bandas dos géis ou do immuno-bloting. **MM: Massa molecular calculada das bandas dos géis ou do immuno-blotting; ***Código
de acesso ao NCBI.
50
Os valores dos fatores de retenção das bandas da membrana de immunoblotting e do gel de eletroforese submetido à análise, respectivamente, RFs de
0,332869081 e 0,336170213, evidenciam a imunogenicidade da proteína identificada
da banda PMLA2, sendo uma proteína similar ao produto gênico predito de uma
zinco-carboxi peptidase de L (L.). major correlacionada a um sinal antigênico do
immuno-bloting revelado com soro de camundongos infectados por L. (L.)
amazonensis. Até o presente momento, esta proteína não foi depositada em bancos
de dados de L.(L.) amazonensis.
A sequência do gene identificado indica uma metalopeptidase da família M14
e um domínio Nna1-símile que é relacionado à ligação de ATP/GTP. No genoma de
L.(L.) major, 16 famílias de metalopeptidases são representadas. Metalopeptidases
incluem aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Muito pouco destas
proteínas tem sido estudadas, exceto por gp63, uma zinco-metaloprotease ancorada
à membrana plasmática por glicosilfosfatidil inositol, que tem efetividade bem
descrita em infecção e virulência de muitos tripanossomídeos. A maioria dos estudos
que descrevem atividade de metaloprotease de Leishmania sps. está relacionada à
atividade de gp63 (BESTEIRO et al., 2007).
O alinhamento da sequência, através do programa BLAST, evidenciou
proteinas com identidade de 76 a 93% nos organismos relacionados como L.
donovani (93%), L. infantum (93%), L. mexicana (89%) e L. braziliensis (76%). A
aplicação de restrição as sequências de L. amazonensis não resultou em
sequências similares.
O alinhamento de sequências no Blast resultou na identificação de 14
domínios conservados relacionados à subfamília M14 do CLAN MC no banco de
dados MEROPS, pertencentes a Metalocarboxipeptidases (MCPs). Estas são
exopeptidases que catalizam a hidrólise de aminoácidos do C-terminal do substrato.
A banda de gel PMLA4 e sua correspondente em immuno-blotting
apresentaram
os
seguintes
valores
de
RF
0,53106383
e
0,495821727,
respectivamente. Conforme mencionado anteriormente, a identificação proteômica
automatizada por comparação a banco de dados leva em consideração produtos
gênicos preditos, que não necessariamente possuem evidência experimental
anterior em nível de proteína. Isto pode proporcionar que sejam identificadas nas
amostras, proteínas experimentalmente inéditas, geralmente com funcionalidade
desconhecida.
51
A sequência de resíduos de aminoácidos do produto gênico desconhecido foi
utilizada para a predição das propriedades físico-químicas.
A sequência possui 416 resíduos de aminoácidos, peso molecular de 43,94
kDa, ponto isoelétrico – pI de 8,5 e índice de hidrofobicidade médio (GRAVY) de 0,112. Foi predita hélice transmembrana de 17 resíduos na posição de 376 a 392 e
373 a 395 pelas ferramentas PSORT e SOSUI, respectivamente. Não houve
predição de peptídeo sinal com valores estatisticamente significativos. Não houve
identificação de domínios estruturais ou motivos pelas ferramentas SMART e
Interpro. O alinhamento de sequência pela ferramenta Blastp, apresentou genes de
função desconhecida com similaridades acima de 97% em L. donovani, L. infantum,
L. mexicana e L. braziliensis.
A banda PMLA5 com banda correspondente de sinal imunogênico no
immuno-blotting, apresentaram os seguintes valores de RF 0,5702127 e
0,622562674, respectivamente. O peso molecular aparente foi de 45 kDa.
A identificação proteômica resultou em duas proteínas, sendo uma
previamente conhecida como Tuzina e a outra de função desconhecida. Os
domínios conservados encontrados pelo Blastp foram domínios relacionados a
caracterização de tuzina.
A sequência identificada da proteína similar a tuzina de L. major possui 664
resíduos, peso molecular teórico de 71,88 kDa, valor de (pI) teórico 9,09 e valor de
GRAVY -0,007. Foi predita 1 hélice transmembrana na posição 315-331 e na
posição 313-333 pelas ferramentas PSORT e SOSUI, respectivamente.
Não houve predição de peptídeo sinal. Não houve identificação de domínios
ou motivos.
TEIXEIRA e colaboradores (1995) descreveram um novo gene, que codifica
uma proteína de 45 kDa em T. cruzi, adjacente a sequência gênica de amastina, que
codifica uma proteína de superfície. O papel de tuzina em parasitos cinetoplastida
ainda é desconhecido. Do ponto de vista estrutural, a sequência de amastina é uma
glicoproteína de 174 resíduos de aminoácidos e possui quatro domínios hidrofóbicos
distintos de 20-30 resíduos cada, sugerindo ser 4 passagens transmembrana. A
sequência de amastina é altamente hidrofóbica enquanto que tuzina é altamente
carregada. A relativamente baixa abundância de seu mRNA sugere que tuzina é
uma proteína rara, de difícil detecção em immuno-blotting de frações subcelulares
ou em ensaios de imunolocalização celular. Também não é conhecida relação
52
fisiológica ou estrutural entre amastina e tuzina. O genoma de T. cruzi contém 12
membros de amastinas, oito dos quais são arranjados em grupos re repetição
alternada com genes de tuzina. Tuzina é uma proteína G-símile cujo nível de mRNA
é constitutivo durante o ciclo de vida de T. cruzi (TEIXEIRA; KIRCHHOFF;
DONELSON, 1995).
As amastinas são a maior família de genes de proteínas expressas na
superfície em Leishmania spp. São expressas pelos parasitas no estágio intracelular
no hospedeiro. Assim como em T. cruzi, em L. (L.) major, o maior arranjo de
amastina, que compreende de 21 a 54 genes é alternado com unidades de repetição
de genes de tuzina. Em relação aos parasitos Leishmania cujos projetos genoma
foram concluídos é reportado diferença nas sequências gênicas do arranjo de
amastina e tuzina. Apesar de similar na organização, o arranjo amastina-tuzina e
parece ser reduzido em tamanho, no mínimo pela metade em L. (L.) braziliensis. Em
contraste a expressão de gp63, que é codificada por um agrupamento de genes de
repetição, parece ser quatro vezes maior em L. (L.) brazilienses em comparação a
L.(L.) major ou a L. (L.) infantum (PEACOCK et al., 2007). L. (L.) major possui 57
genes de amastina, muitos dos quais são alocados em agrupamentos de repetição
em vários cromossomos, mas genes de tuzina são encontrados apenas em 3 loci,
nos cromossomos 8, 34 e 36 (IVENS et al., 2005). O papel de tuzina ou amastina
em L.(L.) amazonensis ainda é desconhecido.
A segunda identificação protéica, resultante da banda PMLA5, foi uma
proteína nova em Leishmania (L.) amazonensis e de função desconhecida em
espécies do gênero Leishmania.
Informações a respeito deste gene estão depositadas na base de dados
UniprotKB sob o código de acesso “Q4Q3S2” e apresenta
anotação do Gene
Ontology de motivo de ligação a zinco obtido por inferência eletrônica da sequência.
Este gene também está depositado na base TriTrypDB com a entrada
“LmjF.33.2640”, que indica seus genes ortólogos nos organismos Leishmania
braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania mexicana, Trypanosoma congolense
e Trypanosoma cruzi, e todos têm função desconhecida.
Este registro ainda apresenta anotações do Gene Ontology de função
molecular de ligação a íon de zinco, componente celular cobertura de vesícula COP
II, além dos processos biológicos “transporte mediado por vesícula do RE ao
GOLGI” e “transporte intracelular de proteínas”.
53
O resultado da análise pelo programa SMART apresenta um domínio na
região de 192-245, chamado “LIM” cuja referência no banco Interpro indica pertencer
a uma família de domínios de ligação a zinco. Este domínio está presente em
proteínas de ligação a actina em humanos (ABLM1_HUMAN, O14639 UniprotKB) e
proteína ricas em cisteína (CRIP1) (CRIP1_BOVIN, Q56K04 UniprotKB).
A banda de gel PMLA20 e sua correspondente com sinal imunogênico no
immuno-blotting, apresentaram os seguintes valores de RF 0,541385435 e
0,495821727, respectivamente. Os pesos moleculares aparentes foram 65,99 e
56,42 kDa, respectivamente.
A análise da amostra oriunda desta banda resultou na identificação de uma
proteína integral de membrana, conhecida como Galf transferase, e uma Cisteínopeptidase, semelhantes aos produtos gênicos de L. (L.) major.
As Galf transferases são proteínas transmembranas do tipo II com caudas
citoplasmáticas básicas e curtas no N-terminal, em torno de 20 resíduos, seguido
por domínio transmembrana e um domínio C-terminal DXD canônico de
glicosiltransferases. As transferases são localizadas no Golgi. Estas enzimas
participam da síntese de glicosilinositol fosfolípides em L. (L.) major (ZHANG et al.,
2004). Ainda no Golgi, UDP-α-Galf é adicionado ao LPG e/ou GIPL por
Galactofuranosil transferases (GalfTs). A Galft mais bem estudada é aquela
associada ao gene LPG-1 em L. (L.) major e L.(L.) donovani, que adiciona o β-Galf a
estrutura esqueleto de LPG.
A proteína codificada por LPG-1 é uma metaloglicosil transferase com
estrutura de motivos conservada, incluindo uma calda citoplasmática, um domínio
transmembrana e um motivo DXD de ligação a metal.
Além do mais, LPG-1, parece ser responsável pela adição de Galft ao LPG
somente e não estar envolvido na adição de Galf aos GIPL’s, bem como uma
linhagem experimental deste parasita com depleção do gene de LPG-1 apresentou
virulência atenuada (OPPENHEIMER; VALENCIANO; SOBRADO, 2011).
Além de seu papel na síntese glicosilinositol fosfolípides, até o momento não
há descrição de experimentos em nível de proteína, de GILP galf transferases de L.
(L.)
amazonensis
exercendo
interação
antigênica
direta
em
hospedeiros
vertebrados.
A segunda proteína identificada a partir da banda PMLA20 é uma proteína
nova com função ubiquitina C-terminal hidrolases putativa.
54
Após a conclusão do projeto genoma de L. (L.) major, foram identificados dois
homólogos de aspartato peptidase que clivam proteínas de membrana do tipo I e II,
no entanto, os tripanossomídeos não possuem aspartato-peptidases pepsina-símile.
Por outro lado, muitas enzimas da família das cisteíno-proteases como papaína e
calpaína, assim como ubiquitina C-terminal hidrolases são expressas nestes
organismos (IVENS et al., 2005). Estima-se que podem ser codificadas 65 cisteínoproteases em L. (L.) major, agrupadas em quatro classes e treze famílias, dentre as
quais, dezenove genes codificam cisteíno-proteases envolvidas na ubiquinação. Os
membros das famílias de C12 a C19 são ubiquitina C-terminal hidrolases
(MOTTRAM; COOMBS; ALEXANDER, 2004).
Enzimas deubiquitinadoras são um grande grupo de proteases que clivam
proteínas ubiquitinadas ou ubiquitina-símile em diversos processos celulares, como
por exemplo, na degradação de proteínas dependente de lisossoma e proteossoma
(Turcu et al., 2009). As cisteíno-proteases são importantes fatores de virulência em
Leishmania spp, sendo que são preferencialmente expressas em promastigotas
metacíclicos de L.(L.) amazonensis do que em promastigotas procíclicos. (SOARES
et al., 2003). O papel imunomodulatório de cisteíno-proteases parasitos Leishmania
spp. ainda não está totalmente esclarecido. As cisteíno-proteases de L.(L.) mexicana
e L. (L.) amazonensis têm sido implicadas na inibição de apresentação de antígenos
por degradação de moléculas MHC de classe II no vacúolo parasitóforo.
É bem descrita a atividade característica de cisteíno-peptidase de uma
ubiquitina carboxi-terminal hidrolase integral a membrana externa de mitocôndrias
por hélice transmembrana, pertencente à família C19 em Homo sapiens. Ocorrem
em células do tecido esquelético, pâncreas, fígado e rim (NAKAMURA; HIROSE,
2008). Em uma consulta ao banco de dados OrthoMCL, é registrado a predição de
60 peptídeos antigênicos ao gene homólogo em L. (L.) major. O papel das ubiquitino
hidrolases na relação parasita-hospedeiro em L. (L.) amazonensis ainda não foi
elucidado.
O gene de L. (L.) major identificado possui genes ortólogos em L. (L.)
braziliensis, L. (L.) infantum, L. (L.) mexicana, T. brucei, T. brucei gambiensi, T. cruzi
e T. vivax. Embora existam relatos de ubiquitina C-terminal hidrolases em
experimentos com L. (L.) amazonensis, não há uma sequência depositada nos
bancos de dados NCBI e UniprotKB, o que sugere ausência de trabalhos publicados
em que ocorre caracterização em nível de proteína.
55
Da banda PMLA8 foi identificada a proteína integral de membrana ATPase
translocadora de fosfolipídeos tipo-P de L. (L.) major.
O cálculo do peso molecular aparente, em função do fator de retenção das
bandas eletroforéticas, foi realizado através de interpolação gráfica, em que foi
atribuído ao eixo de Y os valores de logaritmo de peso molecular aparente, e ao eixo
de X, os valores em cm dos RF’s (Apendice A).
Os valores dos RF’s das amostras têm que assumir valores intermediários ao
intervalo formado pelos RF’s dos padrões de calibração para ser considerados
estatisticamente significantes. Uma banda de gel de eletroforese apresentou valor
de RF inferior a banda do menor padrão de calibração, cuja diferença numérica foi
de 0,02383 e, consequentemente não pode ser matematicamente relacionada à sua
correspondente no immuno-blotting. Contudo, a inspeção visual demonstra que esta
banda tem posição semelhante a quarta banda imunogênica.
Estudos sobre o mecanismo de ação da droga leishmaniscida Milfetosine,
demonstraram que ocorre atividade de translocação direcionada para dentro,
através da membrana plasmática de L. (L.) donovani. ATPases tipo-P foram
relacionadas a esta atividade, assim como na translocação de fosfolipídios (PEREZVICTORIA et al., 2006).
As P4 ATPases possuem papel essencial na formação de vesículas de
transporte, como vesículas endocíticas (PAULUSMA; ELFERIK, 2010) e também na
manutenção da distribuição assimétrica de fosfolipídeos na membrana de
eucariotos, como fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina.
A exposição de fosfatidilserina à face externa da membrana facilita a
fagocitose por macrófagos (TANAKA; FUJIMURA-KAMADA; YAMAMOTO, 2010). As
ATPases tipo-P são um grupo de bombas que contêm um motivo diagnóstico de
fosforilação [DKTGTLT], localizado no centro hidrofílico do polipeptídeos, no qual é
formado um intermediário aspartil-fosfato durante a hidrólise de ATP.
Algumas P4-ATPases formam um complexo com uma subunidade-β não
catalítica da família de CDC50 (TANAKA; FUJIMURA-KAMADA; YAMAMOTO,
2010). Estudos em infecção experimental por L. (L.) donovani sugerem que formas
amastigotas do parasita pode se favorecer da regulação de perda de assimetria da
membrana e exposição de fosfatidilserina para invadir e sobrevier em macrófagos.
No entanto, ainda não é claro se a exposição de fosfatidilserina é mandatória
56
para a invasão da célula hospedeira e se a exposição de outros lipídeos também
pode facilitar a infectividade.
Foi demonstrado que o transportador de milfetosina de L. (L.) donovani
(LdMT) forma um complexo estável com a proteína similar a CDC50 LdRos3 de
importância fundamental para manutenção de assimetria de fosfolipídeos de
membrana. No mesmo trabalho é reportado que em promastigotas de L. (L.)
donovani a exposição de fosfatidilserina não é obrigatória para a infecção e também
que a redistribuição de fosfatidiletanolamina à face externa da bicamada não facilita
a invasão à célula hospedeira (WEINGÄRTNER et al., 2010).
Recentemente, o gene para uma P4-ATPase foi identificado em L. (L.)
amazonensis, porém um possível papel em mecanismo apoptótico não está
esclarecido (HORIKAWA, 2010).
Do mesmo gel, cinco bandas adicionais foram submetidas à identificação,
sendo que duas apresentaram RF’s fora do intervalo dos calibrantes, e as outras
duas não são correspondentes a bandas imunogênicas no immuno-blotting. Destas
amostras foram identificadas duas proteínas solúveis, e duas proteínas de
características ainda desconhecidas.
Da banda eletroforética PMLA21A de RF 0,552753108 e massa molecular
aparente de 54,82 kDa foi identificada uma proteína desconhecida semelhante a
proteína de L. major (gi: 68129000). Novos ensaios de immuno-blotting são
necessários para confirmar a correlação imunogênica desta banda, no entanto, o
valor de RF mais semelhante é o da segunda banda imunogênica 0,495821727.
A sequência da proteína identificada de L. major possui 204 resíduos de
aminoácidos, peso molecular teórico de 22,31 kDa , pI teórico de 6,16 e GRAVY de 0,132.
A sequência não apresentou peptídeo-sinal, hélices trans-membrana e sítios
de ligação de âncoras de GPI. Não foram encontrados domínios na análise com os
programas SMART, Prosite e Interpro.
O registro do gene no UniprotKB não apresenta informação estrutural ou
funcional. A análise no BLAST apresentou 10 genes homólogos de função
desconhecida com similaridade acima de 94% em cepas das espécies L. infantum,
L. donovani, L. mexicana, L. braziliensis, T. cruzi, T. vivax e T. brucei. Apresentou
47% de similaridade (E-value 0,16) com a proteína polysacharide deacetylase de
Roseiflexus spp. (GI 148658101).
57
O registro desta proteína inferida eletronicamente a partir da sequência de
nucleotídeos no UniprotKB (A5V0F3) apresenta anotações oriundas do Gene
Ontology de função molecular atividade de hidrolase em ligações C-N, porém não de
peptídeos e de processo biológico de macromolécula de parede celular de processo
catabólico.
Da banda de gel PMLA22A, a proteína desconhecida similar a de L. major (GI
68129370) foi identificada a partir do peptídeo R.GKAYK.I A sequência do produto
gênico possui 1039 resíduos de aminoácidos, peso molecular aparente de 113,46
kDa, pI de 6,45 e GRAVY -0,366.
A análise no Interpro apresentou o domínio Zeta toxinP-loop hydrolase
(IPR01488), também encontrada na família de domínios
IPR008431 Cyclic
nucleotide phosphodiesterase. Este domínio possui anotação oriunda do Gene
Ontology de função ligação a ATP (GO:0005524) e de processo de matar células
(GO:0001906). Este domínio também foi identificado como pertencente à
superfamília de domínios P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolases
(http://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?ipid=SSF52540).
O registro do gene (LmjF.341990) no banco EupathDB apresenta genes
ortólogos em L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. brucei, T. cruzi e T. vivax. O
resultado do alinhamento de sequências, através do programa BLAST, apresentou
13 genes semelhantes de função desconhecida, com similaridades entre 64% e
100%, demonstrando que se trata de uma sequência relativamente conservada
entre eucariotos.
A banda eletroforética PMLA1 obteve o RF de 0,225531915, que está fora do
intervalo de valores de RF dos padrões de calibração usados. No entanto, a fim de
obter mais informações sobre a composição de proteínas do extrato bruto
solubilizado da fração de membrana de L. amazonensis, esta banda foi recortada e
submetida à identificação proteômica. O resultado obtido foi a identificação de uma
proteína de função desconhecida similar a L. major (GI 68129049).
A sequência possui 873 resíduos de aminoácidos, peso molecular aparente
de 92,12 kDa, pI teórico de 6,52 e GRAVY 0,039.
Da análise da sequência pelo programa SMART foi identificado o domínio de
repetições WD40 (IPR001680). A anotação do domínio descreve ser composto de
motivos de 40 resíduos, frequentemente terminados em um dipeptídeo Trp-Asp, que
58
atuam como um sítio para interação proteína-proteína, geralmente na montagem de
complexos protéicos.
O registro do gene no EupathDB (LmjF33.2150) apresenta genes ortólogos e
parólogos de função desconhecida em L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T.
brucei, T. congolensi, T. cruzi e T. vivax.
Da banda de gel PMLA6, houve a identificação da proteína tubulina-β de L.
amazonensis (GI 68128896). Mesmo se tratando de uma fração de membrana, é
plausível a identificação de uma tubulina-β, uma vez que os tripanosomatídeos
possuem uma rede subpelicular de microtúbulos, os quais são formados por
heterodímeros de tubulinas α e β, que envolve todo o corpo celular do parasito
(GUERCIO, 2009). Assim como os microfilamentos, estão tão fortemente associados
a membrana plasmática que estes dois componentes da superfície da célula
permanecem associados mesmo depois da lise do protozoário e/ou isolamento
enriquecimento da fração membranar (revisto por GULL et al., 1999; DE OLIVEIRA,
2008). Além destes, são encontradas outras três estruturas microtubulares nos
tripanosomatídeos: o axonema flagelar, o corpo basal e os eixos mitóticos (KOHL;
GULL, 1998; DE OLIVEIRA, 2008).
Finalmente, da banda de gel PMLA1A, a proteína manose fosfato isomerase
de L. amazonensis (GI 155675728) foi identificada. Esta é uma proteína bem
caracterizada de L. amazonensis, uma isoenzima utilizada na caracterização
filogenética de cepas de Leishmania spp. O registro desta proteína no UniprotKB
apresenta anotações de atividade catalítica de conversão de D-manose-6-fosfato a
D-frutose-6-fosfato e possui de íons de zinco como co-fator.
59
5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
As técnicas de análise proteômica para proteínas solúveis não são
prontamente aplicáveis a proteínas de membrana, requerendo tratamento de
amostra e condições de corrida eletroforética diferenciadas para eletroforese
unidimensional. Frente à complexidade das amostras constituídas de proteínas de
membrana, abordagem de análise de proteínas parcialmente fracionadas em gel de
eletroforese por cromatografia de alta eficiência acoplada à espectrometria de
massas foi bem sucedida na identificação de proteínas de membrana de L. (L.)
amazonensis;
As melhores condições experimentais obtidas para SDS-PAGE foram gel de
10 %T, desnaturação de amostra com SDS e DTT a 37 ºC por 30 minutos e carga
de 85 µg de proteínas por poço, imersão da cuba eletroforética em banho de gelo
durante o período da eletroforese.
É necessário avaliar procedimentos de extração de amostra, minimizando o
teor iônico e/ou salino das preparações, para a análise por eletroforese
bidimensional IEF/SDS-PAGE das proteínas constituintes das frações extraídas em
detergente não-iônico Triton X-114 de membrana de L. (L.) amazonensis, assim
como tratamento enzimático prévio para remover âncoras de GPI de parte lipídicas
das moléculas previamente a corrida em gel e remoção de parte lipídicas das
moléculas;
Foram identificadas doze proteínas de frações de membrana de L. (L.)
amazonensis utilizadas na construção de proteolipossomos e na confecção de um
biosensor nanoestruturado para diagnóstico diferencial de leishmaniose com sinal
em immuno-blotting.
Foram identificadas sete proteínas com atividade imunogênica observável em
immuno-blotting. Sendo quatro proteínas integrais de membrana, duas de função
ainda desconhecida. Uma proteína associada a vesículas de transporte e duas
proteases, possivelmente envolvidas na infectividade do parasita;
Adicionalmente foram identificadas outras três proteínas desconhecidas da
fração de membrana de L. amazonensis, além de duas proteínas solúveis. É
necessário produzir resultado de immuno-blotting com melhor perfil de separação de
proteínas, para evitar dúvidas sobre qual proteína presente na banda apresenta
atividade imunogênica, bem como expandir a detecção de proteínas antigênicas.
60
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AEBERSOLD, R.; GOODLETT, D.R. Mass spectrometry in proteomics. Chem Rev. v. 101,
n. 2, p 269-295, 2001.
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula, 4a Edição, Porto Alegre, Ed Artes
Médicas, 2004.
ALEXANDERSSON, E. et al. Plasma Membrane Proteomics. In: SAMAJ, J.; THELEN, J.J.
(Eds). Plant Proteomics, Berlin, p. 186-202, 2007.
ALMEIDA, M.C. et al. Leishmanial Infection: Analysis of its First Steps. A Review. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, v. 98, n. 7, p. 861-870, Rio de Janeiro, 2003.
ALTSCHUL, S.F. et al. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., v. 215, p. 403-441,
1990.
APWEILER, R. et al. The InterPro database, an integrated documentation resource for
protein families, domains and functional sites. Nucleic Acids Res., v. 29, n.1, p. 37-40,
2001.
ASHBURNER, M. et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology
Consortium. Nat Genet., v. 25, n. 1, p. 25-29, 2000.
ATTA, A.M. et al. Antileishmanial IgG and IgE Antibodies Recognize Predominantly
Carbohydrate Epitopes of Glycosylated Antigens in Visceral Leishmaniasis. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 99, n. 5, p. 525-530, 2004.
AURRECOECHEA, C. et al. EuPathDB: a portal to eukaryotic pathogen databases. Nucleic
Acids Research, v. 38, n. 1, p. D415-D419, 2009.
BALDWIN, M. A et al. Matrix-assisted Laser desorpsation ionization mass spectrometry of
membrane proteins: The scrap prion protein. In: ANGELETTI, R.H. ed. Techniques in
protein chemistry IV, p. 41-45, 1993.
BALL, L. E. et al. Mass spectrometric analysis of integral membrane proteins: Application to
complete mapping of bacteriorhodopsins and rhodopsin. Protein Science, v.7, p. 758-764,
1998.
BARRAL- NETTO, M.; BARRAL, A. Imunização específica nas leishmanioses tegumentares:
revisão. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 82, n.2, Rio de Janeiro, 1987.
BENDTSEN, J. D. et al. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol.,v.
340, p. 783-795, 2004.
BESTEIRO, S. et al. Protein turnover and differentiation in Leishmania. Int. J. Parasitol., v.
37, n. 10, p. 1063-1075, 2007.
BHOWMICK, S.; ALI, N. Identification of Novel Leishmania donovani Antigens that Help
Define Correlates of Vaccine-Mediated Protection in Visceral Leishmaniasis. PLoS ONE, v.
4, n. 6, 2009.
61
BIRNBAUM, R.; CRAFT, N. Innate Immunity and Leishmaniasis. Dermatol Clin., v. 29, p 89102, 2011.
BJELLQVIST, B. et al. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle,
methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods, v. 6, p. 317–339,
1982.
BLUM, H.; BEIER, H. & GROSS, H.J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and
DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, v. 8, p. 93-99. 1987.
BODNAR, W. M. et al. Exploiting the Complementary Nature of LC/MALDI/MS/MS and
LC/ESI/MS/MS for Increased Proteome Coverage. J. Am. Soc. Mass Spectrom., v. 14, p.
971–979, Março, 2003.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Atlas de leishmaniose
tegumentar americana: diagnósticos clínico e diferencial. Brasília: Ministério da Saúde,
2006.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância de
Leishmaniose Tegumentar Americana. 2 ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2007.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Doenças infecciosas e
parasitárias : guia de bolso. 8. ed. Brasília : Ministério da Saúde, 2010.
BROBEY, R.K.B. et al. Comparative Two-Dimensional Gel Electrophoresis Maps for
Promastigotes of Leishmania amazonensis and Leishmania major. The Brazilian Journal of
Infectious Diseases, v.10, n. 1,p. 1-6, 2006.
BRODSKYN, C. et al. Vaccines in leishmaniasis: advances in the last five years. Expert
Rev. Vaccines, v. 2, n. 5, p. 705-717, 2003.
CADENE, M.; CHAIT, B.T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric
Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry, v.72, n. 22, p. 5655-5658,
2000.
COELHO, Z. C. B. et al. In vitro initial immune response against Leishmania amazonensis
infection is characterized by an increased production of IL-10 and IL-13. Braz. J. Infetc. Dis.,
v. 14, n. 5, p. 476-482, 2010.
COLHONE, M. C. et al. Incorporation of antigenic GPI-proteins from Leishmania
amazonensis to membrane mimetic systems: Influence of DPPC/cholesterol ratio. Journal
of Colloid and Interface Science, v. 333, n. 1, p. 373-339, 2009.
COSTA, M.M. et al. Analysis of Leishmania chagasi by 2-D difference gel electrophoresis (2D DIGE) and immunoproteomic: identification of novel candidate antigensfor diagnostic tests
and vaccine. J. Proteome Res., v. 6, n.10, p.2172-2184, 2011.
COUGHENOUR, H. D.; SPAULDING, R.S.; THOMPSON, C.M. The synaptic vesicle
proteome: A comparative study in membrane protein identification. Proteomics, v. 4, p.
3141-3155, 2004.
CUERVO, P. et al. Proteomic characterization of the released/secreted proteins of
Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes. Journal of Proteomics, v. 7, n. 3, p. 79-92,
2009.
62
CUERVO, P.;DOMONTI, G.B.; DE JESUS, J.B. Proteomics of trypanosomatids of human
medical importance. Journal of Proteomics, v. 73, p. 845 – 867, 2010.
CUNNINGHAM, A., C. Parasitic Adaptive Mechanisms in Infection by Leishmania.
Experimental and Molecular Pathology v. 72, p. 132–141, 2002.
DAGHASTANLI, KÁTIA REGINA PEREZ. Sistemas carreadores de proteínas antigênicas
da membrana de Pastereulla multocida para a prevenção de pasteurelose. Ribeirão
Preto, USP, 2004. Tese. Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo - FMRP – USP, 2004.
DAY, M.J. Immunoglobulin G subclass distribution in canine leishmaniosis: A review and
analysis of pitfalls in interpretation. Veterinary Parasitology, v. 147, p. 2-8, 2007.
DE ARAÚJO SOARES, R.M. et al. Leishmania (Leishmania) amazonensis: differential
expression of proteinases and cell-surface polypeptides in avirulent and virulent
promastigotes. Exp. Parasitol., v. 104, n. 3, p. 104-112, 2003.
DE SOUZA, A. W.; ATTIAS, M.; RODRIGUES, J.C. Particularities of mitochondrial structure
in parasitic protists (Apicomplexa and Kinetoplastida). Int. J. Biochem. Cell Biol., v. 41, n.
10, p. 2069-2080, 2009.
DE OLIVEIRA, F.L. Análise e identificação das proteínas de frações subcelulares de
Trypanosoma cruzi. Monografia (Bacharel em Ciências Biológicas - Unidade de Genética
Molecular). Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,p.40, 2008.
DUNNING, N. Leishmania vaccines: from leishmanization to the era of DNA technology.
Bioscience Horizons, v. 2, n. 1, p. 73-82, 2009.
EISENHABER, B. et al. Automated annotation of GPI anchor sites: case study C. elegans.
Trends Biochem. Sci., v. 25, n. 7, p. 340-341, 2000.
EMANUELSSON, O. et al. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related
tools. Nat. Protoc., v. 2, n.4, p. 953-971, 2007.
EVANS, K.J.; KEDZIERSKI,L. Development of vaccines against Visceral Leishmaniasis. J.
Trop. Med. v. 2012, 2012.
FEASEY, N. et al. Neglected tropical diseases. British Medical Bulletin, v. 93, n. 1, p. 179200, 2010.
FISCHER, F.; POETSCH, A. Protein cleavage strategies for an improved analysis of the
membrane proteome. Proteome Science, v. 4, n. 2, 2006.
FIVAZ, M. et al. Analysis of glycosyl phosphatidylinositol- anchored proteins by twodimensional gel electrophoresis. Electrophoresis, v. 21, n. 16, p. 3351-3356, 2000.
FLEGONTOV, P. N. et al. Selective amplification of maxicircle classes during the life cycle of
Leishmania major. Mol. Biochem. Parasit. v. 165, n. 2, p. 142-152, 2009.
FORGBER, M. et al. Mapping the Antigenicity of the Parasites in Leishmania donovani
Infection by Proteome Serology. PLoS ONE, v. 1, n. 1, p.40, 2006.
GARNIER, J.; GIBRAT, J.F.; ROBSON, B. GOR secondary structure prediction method
version IV. Methods in Enzymology, v. 266, p. 540-553, 1996.
63
GLEW, R.H. et al. Biochemistry of the Leishmania species. Microbiological Reviews, v. 52,
n. 4, p. 412-432, 1988.
GOMES, R.B. et al. Seroconversion against Lutzomyia longipalpis saliva concurrent with the
development of anti-Leishmania chagasi delayed-type hypersensitivity. J. Infect. Dis., v.
186, p. 1530-1534, 2002.
GONNET, F. et al. MALDI/MS peptide mass fingerprinting for proteome analysis:
identification of hydrophobic proteins attached to eukaryote keratinocyte cytoplasmic
membrane using different matrices in concert. Proteome Science, v. 1, n. 2, 2003.
GONTIJO, B.; CARVALHO, M. L. R. de. Leishmaniose tegumentar americana. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, n. 1, p. 71-80, 2003.
GUPTA, R.; BRUNAK, S. Prediction of glycosylation across the human proteome and the
correlation to protein function. Pacific Symposium on Biocomputing, v.7, p.310-322, 2002
GUPTA, R.; JUNG, E.; BRUNAK, S. Prediction of N-glycosylation sites in human proteins.
NETNGLYC 1.0. 2004. Disposnível em: <http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/>.
Acessado em: 08/06/2011.
HARTINGER, J. et al. 16-BAC/SDS–PAGE: A Two-Dimensional Gel Electrophoresis System
Suitable for the Separation of Integral Membrane Proteins. Analytical Biochemistry, v. 240,
p.1126-133, 1996.
HILLENKAMP, F. et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of
biopolymers. Analytical Chemistry, v. 63, n. 24, p. 1193A – 1203A, 1991.
HIROKAWA, T.; BOON-CHIENG, T.; MITAKU, S. SOSUI: Classification and secondary
structure prediction for membrane proteins. Bioinformatics, v.14, p.378-379, 1998.
HORIKAWA, M. M. Caracterização do efeito de uma translocase de aminofosfolipídio
(APLT) de Leishmania (Leishmania) amazonensis na exposição de fosfatidilserina.
Dissertação (Mestrado em Biologia da Relação Patógeno-hospedeiro, - Instituto de Ciências
Biomédicas), Universidade de São Paulo, São Paulo, p. 27, 2010.
HOTEZ, P.J. et al., Control of Neglected Tropical Diseases. The New England Journal of
Medicine. v. 357, p. 1018-1027, 2007.
IFPMA: INTERNATIONAL FEDERATION OF PHARMACEUTICAL MANUFACTURERS
ASSOCIATIONS. Neglected diseases and the pharmaceutical industry, Geneva, 2003.
Disponível em: <http://www.ifpma.org/.> Acessado em 03/07/2010.
IVENS, C.A. et al. The Genome of the Kinetoplastid Parasite, Leishmania major. Science, v.
309, n. 5733, p. 436-442, 2005.
JAIN, E. et al. Infrastructure for the life sciences: design and implementation of the UniProt
website. BMC Bioinformatics, v. 10, n.136, 2009.
JENNINGS, K. Collision-induced Decompositions of aromatic molecular ions. Int. J. Mass
Spectrom. Ion Phys., v. 1, p. 227-235, 1968.
KAMOUN-ESSGHAIER, S. et al. Proteomic approach for characterization of
immunodominant membrane-associated 30- to 36-kilodalton fraction antigens of Leishmania
64
infantum promastigotes. Reacting with sera from mediterranean visceral leishmaniasis
patients. Clinical and vaccine immunology. Clin. Diagn. Lab. Immunol, v.2, n.2, p.310-320,
2005.
KANE M. M.; MOSSER, D. M. Leishmania parasites and their ploys to disrupt macrophage
activation. Current opinion in hematology, v. 7, n. 1, p. 26-31, 2000.
KARAS, M. et al. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Int. J.
Mass Spec. Ion Proc., v. 78, p. 53-68, 1987.
KHOUDOLI, G.A. et al. Optimization of the two-dimensional gel electrophoresis protocol
using the taguchi approach. Proteome Science, v. 2, n. 6, 2004.
KROGH, A. et al. Predicting Transmembrane Protein Topology with a Hidden Markov Model:
Application to Complete Genomes. J. Mol. Biol., v. 305, p.567-580, 2001.
KUMARI, S. et al. Proteomic approaches for discovery of new targets for vaccine and
therapeutics against visceral leishmaniasis. Proteomics - Clinical Applications,v. 2,n. 3, p.
372–386, 2008.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, v. 227. p. 680-685, 1970.
LARSEN, J. E. P.; LUND, O.; NIELSEN, M. Improved method for predicting linear B-cell
epitopes, Immunome Research, v. 2, n.2, 2006.
LEE, Y. et al. Thermal aggregation of SARS-CoV membrane protein. Journal of Virological
Methods, v. 129, p. 152-161, 2005.
LI, L.; STOECKERT, C. J.; ROOS, D. S. OrthoMCL: identification of ortholog groups for
eukaryotic genomes. Genome Research, v. 13, n. 9, p. 2178-2189, 2003.
LIESE, B.; ROSENBERG, M.; SCHRATZ, A. Programmes, partnerships, and governance for
elimination and control of neglected tropical diseases. Lancet, v. 375, p. 67–76, 2010.
LINDOSO, J.A.L.; LINDOSO, A.A.B.P. Neglected Tropical Diseases In Brazil. Rev. Inst.
Med. Trop. Sao Paulo, v. 51, n. 5, p. 247-253, 2009.
MITROPOULOS, P.; KONIDAS, P.; DURKIN-KONIDAS, M. New World cutaneous
Leishmaniasis: updated review of current and future diagnosis and treatment. J. Am. Acad.
Dermatol., v. 63, n. 2, p. 309-322, 2010.
MODABBER, F. Leishmaniasis vaccines: past, present and future. International Journal of
Antimicrobial Agents, v. 36S, p. 58-61, 2010.
MOLINARI, G. Natural Products in Drug Discovery: Present Status and Perspectives.
In: GUZMAN, C.A.; FEUERSTEIN, G. editors. Pharmaceutical Biotechnology. Landes
Bioscience and Springer Science+ Business Media, p. 13-27, 2009.
MOLLOY, M. P. Two-Dimensional Electrophoresis of Membrane Proteins Using Immobilized
pH Gradients. Analytical Biochemistry, v. 280, n.1, p. 1-9. 2000.
MOTTRAM, J. C.; COOMBS, G.H.; ALEXANDER, J. Cysteine peptidases as virulence
factors of Leishmania. Current Opinion in Microbiology, v. 7, p. 375–381, 2004.
65
NAGILL, R.; KAUR, S. Vaccine candidates for leishmaniasis: A review. International
Immunopharmacology, v. 11, p. 1464 – 1488, 2011.
NAKAI, K.; HORTON, P. PSORT: a program for detecting the sorting signals of proteins and
predicting their subcellular localization. Trends Biochem. Sci., v. 24, n. 1, p. 34-35, 1999.
NAKAMURA, N.; HIROSE, S. Regulation of mitochondrial morphology by USP30, a
deubiquitinating enzyme present in the mitochondrial outer membrane. Mol. Biol. Cell, v. 19,
n. 5, p. 1903-1911, 2008.
O’FARRELL, P. H. High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins. The
Journal of Biological Chemistry, v. 250, n. 10, p. 4007 – 4021, 1975.
OKWOR, I.; UZONNA. J. Vaccines and vaccination strategies against human cutaneous
leishmaniasis. Human Vaccines, v. 5, n. 5, p. 291-301, 2009.
OPPENHEIMER, M.; VALENCIANO, A.L.; SOBRADO, P. Biosynthesis of galactofuranose in
kinetoplastids: novel therapeutic targets for treating leishmaniasis and Chagas' disease.
Enzyme Res., v. 2011, p.1-13, 2011.
PAPPIN, D.J.C. et al. Chemistry, mass spectrometry and peptide-mass databases: Evolution
of methods for the rapid identification and mapping of cellular proteins.In: BURLINGAME,
A.L.; CARR, S.A (eds). Mass Spectrometry in the Biological Science., p. 135-150, 1996.
PAULICK, M.G.; BERTOZZI, C.R. The Glycosylphosphatidylinositol Anchor: A Complex
Membrane-Anchoring Structure for Proteins. Biochemistry, v. 47 n. 27. p. 6991-7000, 2008.
PAULUSMA, C.C.; ELFERINK, O.R.P. P4 ATPases - the physiological relevance of lipid
flipping transporters. FEBS Letters, v. 584, n. 13, p. 2708-2716, 2010.
PEACOCK, C.S. et al. Comparative genomic analysis of three Leishmania species that
cause diverse human disease. Nature genetics, v. 39, n. 7, p. 839-847, 2007.
PEREIRA, B.A.C.; ALVES, C.R. Immunological characteristics of experimental murine
infection with Leishmania (Leishmania) amazonensis. Veterinary Parasitology, v. 158, p.
239–255, 2008.
PÉREZ-VICTORIA, F.J. et al. Phospholipid Translocation and Miltefosine Potency Require
Both L. donovani Miltefosine Transporter and the New Protein LdRos3 in Leishmania
Parasites. The Journal of Biological Chemistry, v. 281, n. 33, p. 23766–23775, 2006.
PERINOTO, A.C. et al. Biosensors for Efficient Diagnosis of Leishmaniasis: Innovations in
Bioanalytics for a Neglected Disease. Analytical Chemistry, v. 82, n. 23, p. 9763–9768,
2010.
PERKINS, N.D. et al. Probability-based protein identification by searching sequence
databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, v. 20, n. 18, p.3551 - 3567,
1999.
PONTE-SUCRE, A. Physiological consequences of drug resistance in Leishmania and their
relevance for chemotherapy. Kinetoplastid Biology and Disease, v. 2, n. 14, 2003.
PRUITT, K.D. et al. NCBI Reference Sequences: current status, policy, and new initiatives.
Nucleic Acids Res, v. 37, p. D32-D36, 2009.
66
RABILLOUD, T. et al. Analysis of membrane proteins by two dimnsional electrophoresis:
comparison of the proteins extracteds from normal or Plasmodium falciparum infected
erythrocyte ghosts. Electrophoresis, v. 20, p. 3606-3610, 1999.
RABILLOUD, T. et al. Fully denaturing two-dimensional electrophoresis of membrane
proteins: a critical update. Proteomics, v. 8, n. 19, p. 3965-3973, 2008.
REAL, F.; MORTARA, R.A.; RABINOVITCH, M. Fusion between Leishmania amazonensis
and Leishmania major Parasitophorous Vacuoles: Live Imaging of Coinfected Macrophages.
Plos Negleted. Trop. D., v. 4, n.12, p. 1-9, 2010.
REDEBY, T.; EMMER, A. Membrane protein and peptide sample handling for MS analysis
using a structured MALDI target. Anal. Bioanal. Chem., v. 381, p. 225–232, 2005.
REITHINGER, R. et al. Cutaneous leishmaniasis. Lancet Infect. Dis., v. 7, p. 581-596,
2007:
REYES-TURCU, F.E..; VENTII, K.H.; WILKINSON, K.D.. Regulation and cellular roles of
ubiquitin-specific deubiquitinating enzymes. Annu. Rev. Biochem., v. 378, p. 363-397, 2009.
SAKTHIANANDESWAREN, A.; FOOTE, S.J.; HANDMAN, E. The role of host genetics in
leishmaniasis. Trends in Parasitology, v. 25, n.8, p. 383 -391, 2009.
SAHA, S. et al. Immune responses in kalaazar. Indian J. Med. Res., v. 123, p. 245-266,
2006.
SANTONI, V.; MOLLOY, M.; RABILLOUD, T. Membrane proteins and proteomics: un amour
impossible? Electrophoresis, v. 21, p. 1054-1070, 2000.
SANTOS, L.E.R. et al. Lipid microspheres loaded with antigenic membrane proteins of the
Leishmania amazonensis as a potential biotechnology application. Journal of Colloid and
Interface Science, v. 340, p. 112–118, 2009.
SCHAGGER, H.; VON JAGOW, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical
Biochemistry, v.166, p. 368-379, 1987.
SCHAGGER, H. SDS Electrophoresis Techniques. In: HUNTE, C.; VON JAGOW, G. &
SCHÄGGER, H. (eds) Membrane Protein Purification and Crystallization 2/e: A
Practical Guide. Academic Press, Elsevier Science (USA), p. 85-103, 2003.
SCHULTZ, J. et al. SMART, a simple modular architecture research tool: Identification of
signaling domains. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., v. 95, n. 11, p. 5857-5864, 1998.
SCOTT, P. Development and Regulation of Cell-Mediated Immunity in Experimental
Leishmaniasis. Immunologic Research, v. 27 n.2, p.489–498, 2003.
SHEVCHENKO, A. et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained
polyacrylamide gels. Analytical Chemistry,v. 68, n. 5, p. 850-858, 1996.
SHI, Q.; JACKOWSKI, G. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In: HAMES,
B.D.; RICKWOOD, D. (eds.) 1998. Gel Electrophoresis of Proteins—A Practical
Approach. 3a ed. p. 46.
67
SILVEIRA, F. T. et al. Immunopathogenic competences of Leishmania (V.) braziliensis and
L. (L.) amazonensis in American cutaneous leishmaniasis. Parasite Immunology, v. 31, p.
423–431, 2009.
SILVEIRA, F.T. et al. Revisão sobre a patogenia da leishmaniose tegumentar americana na
Amazônia, com ênfase à doença causada por Leishmania (V.) braziliensis. Revista
Paraense de Medicina, v. 22, n. 1, p. 9 - 20, 2008.
SILVERMAN, J.M. et al. An exosome-based secretion pathway is responsible for protein
export from Leishmania and communication with macrophages. Journal of Cell Science, v.
123, n. 6, p.842 - 852, 2010.
SIMPSON, L. Effect of acriflavin on the kinetoplast of Leishmania tarentolae. Mode of action
and physiological correlates of the lost of kinetoplstid DNA. J. Cell. Biol., v. 37, n. 3, p. 660682, 1968.
SOTO, M. et al. Searching genes enconding Leishmania antigens for diagnosis and
Protection. Scholarly Research Exchange, v. 2009, 2009.
TANAKA, K.; FUJIMURA-KAMADA, K.; YAMAMOTO, T. Functions of phospholipid flippases.
The Journal of Biochemistry, v. 149, n. 2, p. 131-143, 2010.
TARLETON, R.L. et al. The Challenges of Chagas Disease— Grim Outlook or Glimmer of
Hope? PLoS Med, v. 4, n. 12, p. 1852-1857, 2007.
TEIXEIRA, S.M.; KIRCHHOFF, L.V.; DONELSON, J.E. Post-transcriptional elements
regulating expression of mRNAs from the amastin/tuzin gene cluster of Trypanosoma cruzi. J
Biol Chem, v. 270, p. 22586-22594, 1995.
TOWBIN, H.;STAEHELIN,T. & GORDON,J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA , v. 76, no. 9, p. 4350–4354,
1979.
TSIROGIANNI, I.; TSIOTIS, G. Preparative Isoelectric Focusing. In: Membrane Protein
Purification and Crystallization 2/e: A Practical Guide. 2003, p. 131-142.
WALKER, J. et al. Identification of developmentally-regulated proteins in Leishmania
panamensis by proteome profiling of promastigotes and axenic amastigotes. Molecular &
Biochemical Parasitology, v. 147, p. 64 – 73, 2006.
WATSON, J.T.; SPARKMAN, O.D. Introduction to mass spectrometry. Instrumentation,
applications, and strategies for data interpretation, 4th ed, John Wiley and Sons, 862p.,
Inglaterra, 2007.
WEINGÄRTNER, A. et al. Disruption of the Lipid-Transporting LdMT-LdRos3 Complex in
Leishmania donovani Affects Membrane Lipid Asymmetry but Not Host Cell Invasion. PLoS
ONE, v. 5, n. 8, ed. 12443, p. 1-10, 2010.
WILKINS, M. R., et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server.
Methods Mol. Biol., v. 112, p. 531-552, 1999.
WHO: WORLD HEALTH ORGANIZATION. Control of the leishmaniasis: report of a
meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, Geneva, 2226 March 2010. WHO technical report series; n. 949.
68
WU, C.C. et al. A method for the comprehensive proteomic analysis of membrane proteins.
Nature Biotechnology, v. 21, p. 532-538, 2003.
WU, C.C.; YATES, J. R. C. The application of mass spectrometry to membrane proteomics.
Nature Biotechnology, v. 21, p. 262-267, 2003.
YATES, J. R. et al. Proteomics of organelles and large cellular structures. Nature Reviews
in Molecular Cell Biology, v. 6, p. 702-714, 2005.
ZHANG, K. et al. The LPG1 gene family of Leishmania major. Molecular & Biochemical
Parasitology, v. 136, p. 11-23, 2004.
ZISCHKA, H. et al. Improved mass spectrometric identification of gel-separated hydrophobic
membrane proteins after sodium dodecyl sulfate removal by ion-pair extraction.
Proteomics, v. 4, p. 3776–3782, 2004.
69
APÊNDICE A
Fatores de retenção e massas moleculares aparentes calculadas das bandas
eletroforéticas
Banda log(Pmcal)
PMLA1
PMLA2
PMLA3
PMLA4
PMLA5
PMLA6
PMLA7
PMLA8
116000
97200
66400
55600
42700
34600
27000
5,064458
4,9876663
4,8221681
4,7450748
4,6304279
4,5390761
4,4313638
COMP. GEL
(cm)
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
11,75
ME (cm)
RF
2,65
3,95
5,12
6,24
6,7
9,1
9,56
9,84
2,89
3,21
4,37
5,75
6,88
8,04
9,67
0,225531915
0,336170213
0,435744681
0,53106383
0,570212766
0,774468085
0,813617021
0,837446809
0,245957447
0,273191489
0,371914894
0,489361702
0,585531915
0,684255319
0,822978723
log(PM)
antilog
4,9156
4,8099
4,7087
4,6672
4,4503
4,4088
82337,94052
64550,55788
51132,85003
46472,92417
28203,30474
25633,0332
5,064458
4,9876663
4,8221681
4,7450748
4,6304279
4,5390761
4,4313638
a
b
c
Estatísticas e interpolação gráfica calculadas com o software BioEstat 5.0
Fontes de variação
GL
SQ
Regressão
1
0.3133
Erro
5
0.0075
Total
6
0.3208
F (regressão) =
Variável dependente =
Variável independente =
Média (X) =
Média (Y) =
Coef. de Determinação (R2) =
R2 (ajustado) =
Coeficiente de Correlação =
Intercepto (a) =
Coef. de Regressão (b) =
IC 95% (a)
IC 95% (b)
Equação
2,084,692
Coluna 1
Coluna 2
0.4962
47,457
0.9766
0.9719
0.9882
52,725
-10,616
5.171 a 5.374
-1.251 a -0.873
Y' = a + bX
GEL1
5,2725
-1,062
-0,988
QM
0.3133
0.0015
---
p = 0.0002
t = 134.1135
t = -14.4385
p < 0.0001
p < 0.0001
70
Banda
PMLA20
PMLA21a
212000
158000
116000
97200
66400
55600
42700
34600
27000
20000
log(Pmcal)
5,326336
5,198657
5,064458
4,987666
4,822168
4,745075
4,630428
4,539076
4,431364
4,30103
COMP.
ME (cm)
GEL (cm)
28,15
15,24
28,15
15,56
28,15
2,33
28,15
4,76
28,15
6,74
28,15
8,26
28,15
11,11
28,15
14,43
28,15
16,83
28,15
23,21
28,15
23,21
28,15
27,62
RF
0,541385
0,552753
0,082771
0,169094
0,239432
0,293428
0,394671
0,512611
0,597869
0,824512
0,824512
0,981172
log(PM)
antilog
4,7515 56428,69
4,7392 54825,95
5,326336
5,198657
5,064458
4,987666
4,822168
4,745075
4,630428
4,539076
4,431364
4,30103
71
Fontes de variação
Regressão
Erro
Total
GL
1
8
9
SQ
0.9943
0.0318
10,261
F (regressão) =
Variável dependente =
Variável independente =
Média (X) =
Média (Y) =
Coef. de Determinação (R2) =
R2 (ajustado) =
Coeficiente de Correlação =
Intercepto (a) =
Coef. de Regressão (b) =
IC 95% (a)
IC 95% (b)
Equação
2,504,083
Coluna 1
Coluna 2
0.4920
48,046
0.9690
0.9652
0.9844
53,348
-10,775
5.245 a 5.425
-1.234 a -0.920
Y' = a + bX
p < 0.0001
QM
0.9943
0.0040
---
t = 136.8608 p < 0.0001
t = -15.8243 p < 0.0001
72
Banda
BANDA1
BANDA2
BANDA3
BANDA4
175000
80000
58000
46000
30000
25000
17000
log(PM)
5,24303805
4,90308999
4,76342799
4,66275783
4,47712125
4,39794001
4,23044892
COMP. GEL (cm) ME (cm)
7,18
2,39
7,18
3,56
7,18
4,47
7,18
6,11
7,18
1,64
7,18
2,91
7,18
3,39
7,18
4,35
7,18
5,52
7,18
6,16
7,18
6,91
RF
0,332869081
0,495821727
0,622562674
0,85097493
0,228412256
0,405292479
0,472144847
0,605849582
0,768802228
0,857938719
0,962395543
Fontes de variação
Regressão
Erro
Total
GL
1
5
6
SQ
0.6787
0.0172
0.6959
F (regressão) =
Variável dependente =
Variável independente =
Média (X) =
Média (Y) =
Coef. de Determinação (R2) =
R2 (ajustado) =
Coeficiente de Correlação =
1,970,158
Coluna 1
Coluna 2
0.6144
46,683
0.9752
0.9703
0.9875
p = 0.0003
Intercepto (a) =
54,518
Coef. de Regressão (b) =
-12,753
IC 95% (a)
IC 95% (b)
Equação
5.297 a 5.606
-1.509 a -1.042
Y' = a + bX
t=
90.7576
t=14.0362
log(PM)
5,0273
4,8195
4,6578
4,3666
5,243038049
4,903089987
4,763427994
4,662757832
4,477121255
4,397940009
4,230448921
QM
0.6787
0.0034
---
p<
0.0001
p<
0.0001
antilog
106487,8356
65993,32343
45477,85786
23259,47994