UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ALESSANDRO CONRADO DE OLIVEIRA SILVEIRA
ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DE
Drimys brasiliensis
Itajaí, 2011
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ALESSANDRO CONRADO DE OLIVEIRA SILVEIRA
ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DE
Drimys brasiliensis
Dissertação submetida ao Programa de Mestrado
Acadêmico em Ciências Farmacêuticas da
Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz
Itajaí, fevereiro de 2011.
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DEDICATÓRIA
À minha família, Juliane e Victor Hugo,
pelo apoio, amor e compreensão
nos momentos de ausência.
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz, pelos conhecimentos transmitidos, pela
compreensão, amizade e paciência.
À Profa. Dra. Tânia Mari Bellé Bresolin, pela cordialidade e dedicação.
À colega de mestrado Vanessa Duarte Claudino e à Profa. Dra. Ângela Malheiros pelo
trabalho no fracionamento e isolamento dos compostos da Drimys brasiliensis.
Aos colegas Luiz Carlos Klein Júnior, José Roberto Santin e Philipe Costa pelo
companheirismo e amizade.
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, pela
excelência das aulas e auxílio nas atividades práticas.
Aos professores do curso de Farmácia da FURB pela compreensão nos (muitos)
momentos de ausência.
Aos professores Dr. Eduardo Monguilhott Dalmarco, Dra. Michele Debiasi Aberton
Magina e Dr. Caio Maurício Mendes Córdova pela valiosa contribuição na redação desta
dissertação.
Aos meus pais, Niralci e Leila, pelo apoio incondicional nos momentos difíceis.
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ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DE
Drimys brasiliensis
Alessandro Conrado de Oliveira Silveira
Fevereiro /2011
Orientador: Dr. Alexandre Bella Cruz
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.
Número de Páginas: 66
Este estudo avaliou a atividade antibacteriana de cinco extratos brutos, doze frações e cinco
compostos isolados de Drimys brasiliensis. A metodologia utilizada foi diluição em ágar. O
potencial de toxicidade dos extratos brutos foi avaliado utilizando o microcrustáceo Artemia
salina. Os ensaios de atividade antibacteriana demonstraram alguns resultados promissores,
como o extrato diclorometano de cascas com concentração inibitória mínima (CIM) de 62,5
µg/mL para o Bacillus cereus, a fração G2 (7-13) com CIM para Staphylococcus aureus de
62,5 µg/mL e o composto 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial com CIM para Bacillus cereus
de 31,25 µg/mL. Não houve atividade contra as bactérias Gram-negativas. Para Helicobacter
pylori, o extrato diclorometano de cascas apresentou CIM de 1.000 µg/mL. As frações com
melhores resultados foram E (32-49) e G2 (7-9), com CIM de 500 µg/mL. O poligodial, entre
os compostos isolados, foi que demonstrou melhor atividade, com CIM de 250 µg/mL. O
extrato de cascas diclorometano apresentou atividade, com CIM para Ureaplasma
urealyticum, Mycoplasma hominis e Mycoplasma arginini de 125, 500 e 500 µg/mL,
respectivamente. Dentre as frações, a fração G2 apresentou CIM de 15,62 µg/mL para U.
urealyticum e 125 µg/mL para as espécies de micoplasmas. Os ensaios com Artemia salina
demonstraram que apenas o extrato diclorometano das cascas demonstrou toxicidade, com
CL50 de 27,51 µg/mL. Os resultados evidenciam a atividade antibacteriana da Drimys
brasiliensis, com risco de toxicidade. Nesse sentido, fazem-se necessários outros estudos para
avaliar a genotoxicidade, bem como o isolamento de outros compostos que possam estar
contribuindo para a ação antimicrobiana do material vegetal testado.
Palavras-chave: Atividade Antibacteriana. Drimys brasiliensis. Concentração Inibitória
Mínima. Helicobacter pylori. Mollicutes. Toxicidade
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ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND TOXICITY OF DRIMYS BRASILIENSIS
Alessandro Conrado de Oliveira Silveira
February / 2011
Advisor: Alexandre Bella Cruz, PhD.
Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances.
Number of Pages: 66
This study evaluates the antibacterial activity and toxicity of crude extracts, fractions and pure
compounds of Drimys brasiliensis. The antibacterial activity of five extracts, twelve fractions and five
isolated compounds were tested against six Gram-positive and six Gram-negative bacteria, and
Helicobacter pylori. The methodology applied was agar dilution. The potential toxicity of the extracts
was evaluated using the brine shrimp Artemia salina. Antibacterial activity tests showed some promising
results: dichloromethane bark extract with minimum inhibitory concentration (MIC) for Bacillus cereus
of 62.5 µg/mL; fraction G2 (7-13) with MIC for Staphylococcus aureus of 62.5 µg/mL; and p-methoxycinnamoyl-polygodial compound for Bacillus cereus with MIC of 31.25 µg/mL. There was no activity
against the Gram-negative bacteria. For Helicobacter pylori, the dichloromethane bark extract showed
MIC of 1000 µg/mL. The fractions with best results were E (32-49) and G2 (7-13), with a MIC of 500
µg/mL. Of the isolated compounds, polygodial was the one that showed the best activity, with MIC of
250 µg/mL. The dihloromethane bark extracts were active, with MICs for Ureaplasma urealyticum,
Mycoplasma hominis and Mycoplasma arginini of 125, 500 and 500 µg/mL, respectively. Of the
fractions, G2 showed a MIC 15.62 µg/mL for U. urealyticum and 125 µg/mL for the mycoplasma
species. The assays with Artemia salina showed toxicity only for the dichloromethane bark extract, with a
50% lethal dose (LD50) of 27.51 µg/mL. The results showed the antibacterial activity of Drimys
brasiliensis, with a risk of toxicity. Further studies are needed to assess the genotoxicity, and isolate other
compounds that can contribute to the antimicrobial action of the plant material analyzed.
Keywords: Antibacterial activity. Drimys brasiliensis. Minimum Inhibitory Concentration.
Helicobacter pylori. Mollicutes. Toxicity.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Novos agentes antibacterianos aprovados nos Estados Unidos de 1983 a 2002
.................................................................................................................................................. 24
Figura 2 – Foto das flores de D. brasiliensis ....................................................................... 29
Figura 3 - Fluxograma de fracionamento do extrato clorofórmico de cascas das D.
brasiliensis .............................................................................................................................. 31
Figura 4 – Compostos isolados de D. brasiliensis ............................................................... 33
Figura 5 - Bioautograma do extrato clorofórmico de cascas utilizando como sistema
eluente hexano e acetato de etila (9:1) …............................................................................. 41
Figura 6 – Bioautograma de frações D, E e G2, com o composto poligodial como padrão
(eluente hexano: acetato de etila 9:1) .................................................................................. 42
Figura 7 - Microdiluição em caldo de extratos e frações de Drimys brasiliensis utilizando
Ureaplasma urealyticum ........................................................................................................ 48
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Prevalência de doenças de notificação compulsória no Brasil durante os anos
de 2002 a 2006 .........................................................................................................................16
Tabela 2 - Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) dos extratos de Drimys brasiliensis
frente as bactérias Gram positivas .......................................................................................41
Tabela 3 - Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) das frações e compostos isolados de
Drimys brasiliensis frente à bactérias Gram positivas.........................................................43
Tabela 4 - Concentração bactericida mínima (µg/mL) dos extratos de Drimys brasiliensis
...................................................................................................................................................45
Tabela 5 - Concentração bactericida mínima (µg/mL) das frações e compostos isolados
de D. brasiliensis......................................................................................................................46
Tabela 6 – Concentração inibitória mínima (μg/mL) dos componentes de Drimys
brasiliensis frente ao Helicobacter pylori...............................................................................47
Tabela 7 – Concentração inibitória mínima (μg/mL) dos extratos e frações de D.
brasiliensis frente a 3 espécies de Mollicutes ........................................................................50
Tabela 8 – Concentração letal 50% (μg/mL) frente a Artemia salina dos extratos e
frações de Drimys brasiliensis ................................................................................................53
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ATCC: American Type Culture Collection
BHI: Brain Heart Infusion
CBM: Concentração Bactericida Mínima
CCD: Cromatografia de Camada Delgada
CDB: Convenção da Diversidade Biológica
CIM: Concentação Inibitória Mínima
CL50: Concentração Letal 50%
CLSI: Clinical Laboratory Standards Institute
DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
FURB: Fundação Universidade Regional de Blumenau
MeOH: Metanólico
MRSA: Staphylococcus aureus resistente à meticilina
NAD: Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NCCLS: National Comittee Clinical Laboratory Standards
NDM-1: Nova Déli Metallobetalacmase
NO: Óxido Nítrico
OMS: Organização Mundial de Saúde
PABA: Ácido P-Amino Benzóico
RNA: Ácido Ribonucléico
SINAN: Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SUS: Sistema Único de Saúde
UNIVALI: Universidade do Vale do Itajaí
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 12
2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 14
2.1 Objetivo geral ...................................................................................................................14
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................14
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 15
3.1 Doenças infecciosas ..........................................................................................................15
3.2 Bactérias ............................................................................................................................16
3.2.1 Helicobacter pylori .........................................................................................................18
3.2.2 Mollicutes .......................................................................................................................19
3.3 Agentes antibacterianos ...................................................................................................20
3.4 Resistência bacteriana .....................................................................................................22
3.5 Atividade antibacteriana .................................................................................................24
3.6 Plantas medicinais ............................................................................................................25
3.7 Toxicidade .........................................................................................................................27
3.7.1 Teste de toxicidade (Artemia salina) ............................................................................27
3.8 Família Winteraceae .........................................................................................................28
3.8.1 Drimys .............................................................................................................................29
4. MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................................... 30
4.1 Material vegetal ................................................................................................................30
4.1.1 Preparação dos extratos ...............................................................................................30
4.1.2 Fracionamento e identificação dos compostos a partir do extrato clorofórmico de
cascas .......................................................................................................................................30
4.2 Material microbiológico ..................................................................................................33
4.2.1 Manutenção dos micro-organismos .............................................................................34
4.3 Atividade antibacteriana .................................................................................................34
4.3.1 Diluição em ágar ............................................................................................................35
11
4.4 Atividade anti- Helicobacter pilory .................................................................................35
4.5 Atividade contra Mollicutes .............................................................................................36
4.6 Preparo dos inóculos ........................................................................................................38
4.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ..........................................38
4.8 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) ......................................39
4.9 Bioautografia ....................................................................................................................39
4.10 Ensaio de toxicidade com Artemia salina .....................................................................40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................41
5.1 Atividade antibacteriana .................................................................................................41
5.1.1 Concentração inibitória mínima (CIM) ......................................................................41
5.1.2 Concentração Bactericida Mínima (CBM) .................................................................45
5.1.3 Atividade anti-Helicobacter pylori ...............................................................................47
5.1.4 Atvidade contra Mollicutes ...........................................................................................48
5.2 Bioautografia ....................................................................................................................51
5.3 Ensaio de toxicidade (Artemia salina) .............................................................................52
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................................55
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................56
4
12
1. INTRODUÇÃO
As plantas, desde os primórdios dos tempos, são fundamentais tanto na alimentação
como na cura de enfermidades. A sua utilização é uma prática generalizada, baseada na
crença popular e nas várias formações culturais que as usam como recursos terapêuticos.
Apesar do emprego empírico, as plantas medicinais continuam a ser usadas pela população e
jamais foram completamente substituídas pelos fármacos sintéticos. Considerando que o
Brasil tem a flora mais rica do mundo e que apenas 8 % foram estudadas visando a produção
de medicamentos, é de suma importância que se busque nestas plantas uma fonte alternativa
de medicamentos, visando no futuro a obtenção de novos fármacos e medicamentos mais
eficazes e específicos (BRESOLIN; CECHINEL-FILHO, 2003).
Utilizadas de maneira empírica na época, sabe-se que várias plantas e produtos
indicados na Antiguidade e Idade Média apresentam propriedades anti-infecciosas graças a
substâncias presentes em sua composição. É assim que a romã (Punica granatum), utilizada
como anti-helmíntico desde a mais remota Antiguidade, e referida por Dioscórides, deve suas
propriedades a alcalóides denominados peletierinas, presentes, sobretudo na casca da raiz. A
cebola e o alho contêm a aleína, e o rabanete contêm a rafanina, substâncias com ações
antimicrobiana e antiparasitária. O vinho, utilizado por Hipócrates para a lavagem de
ferimentos e pelas legiões romanas sob a forma de compressas, exerce efeito antibacteriano e
antiviral devido à ação do álcool e polifenóis existentes em sua composição. Já o mel,
utilizado em bandagens, exerce efeito antisséptico devido à sua alta osmolaridade,
desidratando as bactérias. Da mesma maneira, a geléia real, segregada por abelhas obreiras e
alimento das abelhas-rainha, exerce ação antimicrobiana, podendo ter ação tópica em feridas
infectadas (TAVARES, 2009).
Um grave e emergente problema frente às infecções é o surgimento de patógenos
resistentes, nos quais a terapêutica torna-se bastante dificultada. Esse fato ocorre
principalmente devido ao uso abusivo e irracional dos antimicrobianos disponíveis,
promovendo a seleção de cepas resistentes e que tendem a se sobressair perante a população
bacteriana. Esse fator, aliado ao aumento da incidência de infecções, impulsiona a pesquisa de
novos agentes com propriedades antimicrobianas. Uma das alternativas na busca de novos
fármacos eficazes na erradicação de processos infecciosos são os produtos naturais,
principalmente os de origem vegetal (HEMAISWARYA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008).
13
O grande interesse por plantas medicinais pode ser quantificado quando demonstramos
que, entre 1966 e 1994 foram publicados 115 artigos avaliando a atividade antimicrobiana de
extratos vegetais. Considerando os anos de 1995 a 2004 esse número subiu para 307, tornando
clara e inequívoca a busca por novos fármacos com propriedades antibacterianas (RIOS;
RECIO, 2005).
Devido à necessidade de pesquisar novos produtos extraídos de plantas com atividade
antimicrobiana, o presente trabalho propõe avaliar a atividade antibacteriana e toxicidade dos
extratos de D. brasiliensis.
14
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade antibacteriana e potencial de toxicidade dos extratos obtidos das
cascas de Drimys brasiliensis.
2.2 Objetivos específicos

Auxiliar no direcionamento e isolamento de substâncias com potencial antimicrobiano
através de ensaios de bioautografia.

Determinar a concentração inibitória mínima e bactericida mínima dos extratos, frações e
compostos isolados da Drimys brasiliensis, frente a bactérias usuais, Helicobacter pylori e
Mollicutes.

Analisar a toxicicidade aguda dos extratos da Drimys brasiliensis sobre o microcrustáceo
Artemia salina.
15
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Doenças Infecciosas
O homem e os micróbios partilham uma vida em comum que se perde na sombra do
tempo, e, certamente, desde a pré-história os micróbios causam doenças no homem.
Entretanto, as causas destas doenças só começaram a ser descobertas no século XIX, a partir
de 1878, graças, sobretudo, aos trabalhos de Pasteur e Koch e de seus contemporâneos, que
demonstraram a origem infecciosa de várias enfermidades no homem e nos animais
(TAVARES, 2009).
A incidência de doenças infecciosas apresentou uma tendência decrescente no século
XX, quando comparada à períodos anteriores. Esse fato pode ser atribuído à melhoria do
saneamento básico, das condições de moradia e ao aumento do nível de escolaridade. Além
disso, o arsenal terapêutico e vacinal e a cobertura dos serviços de saúde foram fundamentais
para a diminuição da morbi-mortalidade por doenças infecciosas (BUCHALLA;
WALDMAN; LAURENTI, 2003).
Ainda que esta tendência continue descendente, quando comparada às doenças não
transmissíveis e à mortalidade por causas externas, como homicídios e acidentes de trânsito,
ainda persistem várias doenças infecciosas crônicas, como a tuberculose e a AIDS. Ademais,
a possibilidade de pandemias em virtude de novos bioagentes e concomitante facilidade de
transmissão global, atualmente é uma preocupação mundial (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2005).
Desde 1998, temos no Brasil um sistema de informações para as doenças de
notificação compulsória, chamado Sistema de Informação de Agravos de Notificação
(SINAN), criado e gerido pelo Sistema Único de Saúde (SUS), cujos dados informativos são
enviados pelas secretarias estaduais de saúde. A partir da sistematização de tais informações
podemos conhecer a incidência destas doenças e sua evolução com o passar dos anos.
Os dados de doenças de notificação compulsória no Brasil entre os anos de 2002 e
2006 estão listados na Tabela 1.
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Tabela 1 – Prevalência de doenças de notificação compulsória no Brasil durante os anos de
2002 a 2006
Doença
2002
2003
2004
2005
2006
AIDS
38816
37406
37135
35965
32628
Coqueluche
750
1036
1343
1273
790
Difteria
54
50
19
23
11
Hanseníase
48600
51597
50470
49506
46535
Hepatites virais (A, B, C)
17709
23109
27514
29088
22542
Meningites bacterianas
32568
25226
25099
25801
28109
5
16
28
39
10
Rubéola
1539
718
465
363
1621
Sarampo
1
-
-
2
40
3648
5149
5206
5832
5755
Sífilis em gestante
84
26
185
1226
2243
Síndrome da rubéola congênita
46
29
21
10
14
98280
99576
99592
101808
92459
Raiva humana
Sífilis congênita
Tuberculose
Fonte: Brasil - 2008
3.2 Bactérias
Apesar de toda a sua complexidade e variedade, todas as células vivas podem ser
divididas em dois grandes grupos: procariontes e eucariontes. São quimicamente semelhantes,
pois ambas contêm ácidos nucléicos, proteínas, lipídios e carboidratos, mas a presença de
parede celular e ausência de organelas citoplasmáticas diferenciam as células procariontes das
eucariontes.
As bactérias são organismos simples, unicelulares, com diâmetro variando de 1 a 100
μm, sendo que os micoplasmas, as menores bactérias de vida livre, tem apenas 0,1 a 0,3 μm
de diâmetro. Não apresentam organelas citoplasmáticas especializadas, sendo que algumas
estruturas protéicas atuam na adesão às células hospedeiras (fímbrias) ou são responsáveis
pela locomoção (flagelos). Estão envoltas pela parede celular, extremamente rígida,
conferindo morfologia característica à célula bacteriana e protegendo-a contra agentes
externos. Seu material genético não está protegido por uma membrana, encontra-se em
cromossomos circulares, chamados nucleóides. Geralmente dividem-se por fissão binária,
17
podendo realizar transferência de material genético através de transdução, conjugação ou
transformação (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010).
Uma maneira bastante simples de classificar as bactérias, um grupo extremamente
numeroso e heterogêneo de micro-organimos, utiliza as propriedades morfo-tintoriais da
parede celular. Em 1884, Hans Christian Gram propôs um método de coloração no qual
poderíamos diferenciar as bactérias em Gram-positivas e negativas. As bactérias Grampositivas são aquelas que apresentam uma espessa camada de peptidoglicano, um
mucopeptídeo constituinte da parede celular. As bactérias Gram-negativas, por sua vez, tem
uma camada delgada de peptidoglicano, apresentando também espaço periplásmico e
membrana externa (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
A coloração de Gram é um método rápido, simples e barato que, além de diferenciar
as bactérias quanto à sua morfologia e propriedades de parede celular, pode auxiliar também
na avalição crítica de materiais clínicos, como urina, escarro, secreção vaginal, dentre outros,
pois permite a visualização de células epitelias, polimorfonucleares e outros tipos celulares,
identificando se o processo de coleta do material foi bem realizado e indicando qual o
provável agente patogênico (GOERING et al., 2008).
As bactérias Gram-negativas são os mais comuns agentes causadores de doenças
infecciosas, podendo causar desde infecções urinárias não complicadas, como até meningite e
septicemia. São as que apresentam maior índice de resistência aos antimicrobianos, devido à
diversos mecanismos pelos quais podem impedir a ação dos agentes disponíveis (BARLOW;
NATHWANI, 2005).
Escherichia coli é, sem dúvida, a bactéria Gram-negativa mais isolada em
laboratórios de microbiologia clínica. É uma importante colonizante do intestino humano,
aparecendo em grande quantidade nas fezes. Apesar disso, é uma das maiores causadoras de
gastroenterites, já que alguns sorotipos são potencialmente invasivos e/ou tóxicos na mucosa
intestinal (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010).
Outra bactéria Gram-negativa muito importante é Pseudomonas aeruginosa, um
micro-organismo ubiquitário, pois pode viver na água, solo, vegetais, alimentos e nos mais
inóspitos ambientes hospitalares, como em soluções de limpeza e desinfetantes. Raramente
causa infecção em pacientes imunocompetentes. É uma bactéria extremamente hábil e
capacitada para resistir aos antimicrobianos. Apresenta resistência intrínseca à um grande
18
número de fármacos, como amoxicilina, ampicilina, ceftriaxona, tetraciclina, cefoxitina,
dentre outros (PICÃO; XAVIER; GALES, 2009).
Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva que apresenta grande
capacidade e adaptabilidade para causar infecções. Seus inúmeros fatores de virulência
permitem que possa causar infecção em praticamente todos os órgãos do nosso organismo.
Apresentam enzimas como catalase, coagulase, nucleases, fibrinolisinas que permitem, além
da invasão tecidual, que a bactéria forme coágulos ao redor do local de infecção, protegendo-a
da ação não só das células inflamatórias, como neutrófilos, bem como dificultando a entrada
de antibióticos (FORBES; SAHM; WEISSFELD, 2007).
O termo “bactéria fastidiosa” tem sido tradicionalmente aplicado a micro-organismos
que não se desenvolvem ou se desenvolvem fracamente em todos os meios de cultura
tradicionais como ágar sangue, ágar chocolate ou ágar Mac Conkey, requerem atmosfera
capnofílica ou microaerofílica e incubação prolongada. As necessidades especiais de
crescimento podem também dificultar a identificação bioquímica dos isolados (MURRAY,
2006).
Haemophilus influenzae é um exemplo típico de bactéria fastidiosa. Não cresce em
meios de cultura tradicionais, pois necessita de fator X e V para seu crescimento. Estes fatores
são hemina e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), respectivamente, dois constituintes
presentes nas hemácias humanas. Causa infecções do trato respiratório, como otite, sinusite e
pneumonia, podendo também causar infecções graves, como septicemia e meningite
(COLLARES; CASTRO; PAIVA, 2005).
3.2.1 Helicobacter pylori
Helicobacter pylori é uma bactéria flagelada, curva, microaerofílica, descrita em 1982
por Marshall e Warren. Coloniza a mucosa do estômago e duodeno e está associada a
patologias gástricas, como gastrite, úlcera péptica e adenocarcinoma (USTUN et al., 2006).
Vários regimes terapêuticos tem sido prescritos para a erradicação do H. pylori, utilizando
múliplos agentes, como anti-histamínicos H2, inibidores da bomba de prótons, antibióticos e
anti-ácidos (COGO et al., 2010).
Por se tratar de uma bactéria Gram-negativa, a composição do envelope celular
dificulta a ação de agentes antimicrobianos. O pH ácido, a dificuldade de adesão da bactéria à
19
mucosa gástrica, o aumento da resistência aos antibióticos e o processo inflamatório crônico
são outros fatores limitantes da terapêutica antimicrobiana (LY et al., 2005).
Devido à característica multifatorial das afecções gástricas, onde as condições de
higiene, alimentação e qualidade de vida são fundamentais para facilitar a disseminação e/ou
a infecção por H. pylori, os fármacos com propriedades gastroprotetoras, anti-inflamatórias e
antibacterianas são fundamentais na terapêutica destas patologias. As plantas medicinais
constituem uma importante fonte de pesquisa para tratamento das desordens gastrointestinais,
incluindo as doenças nas quais o H. pylori atua como cofator (TORRES et al., 2000).
A úlcera péptica é uma doença de evolução crônica, que resulta numa lesão gástrica,
com progressivo aumento da destruição da mucosa devido à ação do ácido clorídrico presente
no suco gástrico. O H. pylori usualmente atua como um cofator nesse processo, pois pode
promover invasão tecidual e posterior reação inflamatória (WITTSCHIER; FALLER;
HENSEL, 2009).
O alto índice de resistência observado no tratamento e erradicação das infecções por
H. pylori torna necessária a pesquisa de novos medicamentos que, além de serem efetivos
contra a bactéria, não apresentem os efeitos colaterais dos fármacos utilizadas no tratamento
convencional, diminuindo a adesão ao tratamento (COGO, 2008).
Plantas medicinais vem sendo usadas para o tratamento das doenças gástricas há
milhares de anos, muitas vezes apresentando, além de ação protetora da mucosa gástrica,
atividade anti-Helicobacter (ZAIDI et al., 2009). Numerosos estudos já foram publicados
demostrando a atividade anti-úlcera de diversos produtos naturais, entretanto poucos
avaliando a atividade destes componentes frente ao H. pylori (SOUZA et al., 2009).
3.2.2 Mollicutes
Os micoplasmas são bactérias pertencentes à classe dos Mollicutes, que causam
doenças urogenitais e respiratórias no homem (MURAINA; PICARD; ELOFF, 2009). São os
menores micro-organismos capazes de auto-replicação, desprovidos de parede celular e
apresentam susceptibilidade variável aos antibióticos. Apresentam crescimento lento, pois
requerem meio de cultura específico para seu crescimento, isolamento e identificação
(MURRAY, 2006).
20
Ureaplasma urealyticum é uma bactéria que pode causar diversas doenças genitourinárias, como uretrite, vaginose, febre pós-parto, corioamniotite e infecções do trato urinário
(KATAOKA et al., 2006; DAXBOECK et al., 2005). Mycoplasma arginini é uma espécie
que infecta animais, principalmente ovelhas, causando uma doença respiratória crônica
(NIANG et al., 1998). Mycoplasma hominis pode infectar mulheres grávidas, podendo causar
doença no feto e neonato, além de vaginose bacteriana. Dentre as infecções associadas, as
mais importantes são endometrite no pós-parto, aborto espontâneo, baixo peso, corioamniotite
e, em circunstâncias especiais, bacteremia, pneumonia e meningite. Em homens é causa
comum de uretrites (WAITES et al., 2009).
Nos últimos anos, observou-se um aumento na resistência das espécies de Mollicutes
aos agentes antimicrobianos tradicionais, limitando seu tratamento (HUANG et al., 2003).
Portanto é necessária a pesquisa de novos agentes antimicrobianos pois, além da resistência,
há um aumento nas infecções oportunistas fatais associadas principalmente a AIDS,
quimioterapia antineoplásica e transplantes (CORDOVA; CUNHA, 2002).
3.3 Agentes antibacterianos
Os agentes antimicrobianos são substâncias químicas capazes de inibir o crescimento
microbiano ou destruir seletivamente os micro-organismos patogênicos (TAVARES, 2009).
Certamente quando Fleming descobriu a penicilina em 1928 nem mesmo ele poderia
imaginar o quão importante seria de fato sua descoberta. Passados mais de 80 anos, ainda
pesquisamos compostos ativos contra as espécies bacterianas e que possuam menores efeitos
colaterais.
Os compostos, além de atividade antimicrobiana, devem ter um mecanismo de ação
que não cause dano às células humanas. A chave para solucionar esse problema surge a partir
de um dos grandes diferenciais das células procarióticas: a presença de parede celular, uma
estrutura externa à membrana citoplasmática que confere rigidez à célula bacteriana. Alguns
grupos de substâncias foram descritos com ação seletiva sobre a parede celular, como por
exemplo, as penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos, todas com um radical químico em
comum: o anel β-lactâmico, responsável pela ligação aos receptores na parede celular, que
age impedindo as reações de transpeptidação, indispensáveis para o alongamento da parede no
21
processo de divisão celular. Devido à presença deste radical químico, os antibióticos desta
classe são chamados de β-lactâmicos (LANGTON; HENDERSON; HERBERT, 2005).
Os glicopeptídeos, vancomicina e teicoplanina, também agem na parede celular, mas
com um mecanismo de ação diferente, já que não possuem o anel β-lactâmico. Inibem a
síntese da parede celular, pois atuam como antagonistas competitivos da polimerização da
cadeia do peptidoglicano. Por atuarem à nível de peptidoglicano, não apresentam ação contra
bactérias Gram-negativas (TAVARES, 2000).
Outros antibióticos podem agir inibindo a síntese protéica de várias maneiras. As
rifamicinas interferem na síntese de RNA. As tetraciclinas e macrolídeos ligam-se à fração
30S ribossomal, impossibilitando o aporte de aminoácidos. Por atuarem dificultando a
produção de substâncias vitais à célula bacteriana, os antibióticos com este mecanismo de
ação são bacteriostáticos, ou seja, não matam a bactéria, apenas impedem sua duplicação
(NETO; NICODEMO; LOPES, 2007).
As sulfas são fármacos capazes de inibir o metabolismo de ácidos nucleicos, pois
inibem as sintetases que transformam ácido p-amino benzóico (PABA) em ácido fólico,
precursor do metabolismo das bases nitrogenadas do DNA (TENOVER, 2006).
A replicação do DNA também pode ser inibida pelo uso de substâncias capazes de
inibir enzimas responsáveis pelo espiralamento do DNA. A conformação estrutural da
molécula é modificada, promovendo um alongamento da estrutura em dupla hélice,
facilitando assim a ação de exonucleases presentes no citoplasma, degradando o material
genético bacteriano (TAVARES, 2009).
As polimixinas são antibióticos polipeptídicos extraídos de culturas de bactérias do
gênero Bacillus. Atuam interferindo na permeabilidade seletiva da membrana citoplasmática,
se ligando aos constituintes lipoproteicos, destruindo a barreira osmótica seletiva, com ação
semelhante à detergente. Com a permeabilidade alterada, a bactéria perde a capacidade
seletiva e acaba morrendo. Como nossas células também apresentam membrana
citoplasmática, acabam tornando-se alvos à ação das polimixinas, o que explica sua elevada
toxicidade (TAVARES, 2009).
O uso inapropriado dos antimicrobianos pode estar relacionado a fatores como: doses
subterapêuticas, falta de atividade da droga escolhida, esquemas terapêuticos curtos, baixa
penetração no local de infecção, idade, imunidade do paciente e não adesão ao tratamento,
22
além dos conceitos de farmacocinética e farmacodinâmica de cada fármaco na escolha
terapêutica (ROSSI; ANDREAZZI, 2005).
3.4 Resistência Bacteriana
As bactérias, procariotos que existem há milhões de anos na superfície terrestre, são
seres extremamente adaptáveis e que, portanto, respondem facilmente às mudanças do
ambiente. A esta capacidade de adaptação podemos atribuir também o desenvolvimento de
resistência aos antimicrobianos. Embora existam diversas classes de antimicrobianos, as
estratégias utilizadas pelas bactérias para driblar a ação destas drogas são ilimitadas (PICÃO;
XAVIER; GALES, 2009).
O conhecimento do fenômeno da resistência a agentes físicos e químicos entre os
micro-organismos data do início da era microbiana. Com a introdução das primeiras
substâncias químicas com finalidade quimioterápica específica, Ehrlich e seus colaboradores
Franke e Roehl, em 1905, descobriram o fenômeno da resistência às drogas, ao observarem
que em culturas de tripanossomas africanos tratados com arsênico ou com determinados
corantes havia a sobrevivência de alguns exemplares da mesma população microbiana. Estes
autores descreveram que infecções por tripanossomas tratadas com doses baixas de arsenicais
recaíam e relataram que um novo tratamento falhava porque os tripanossomas haviam
desenvolvido resistência às drogas e que esta resistência passava a ser hereditária. O advento
do uso clínico de sulfonamidas, em 1933, e, em seguida, da penicilina, em 1941, levou à
constatação de que a resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos podia ser uma
característica natural das espécies de bactérias ou ser adquirida por cepas individuais dentro
de uma população sensível (TAVARES, 2000).
Desde a descoberta dos antibióticos até seu uso como agentes quimioterápicos, havia
uma crença popular na medicina que tal fato levaria à erradicação das doenças infecciosas.
Entretanto, os agentes patogênicos que outrora eram suscetíveis aos antimicrobianos estão
sempre sofrendo alterações que os tornam resistentes (SIBANDA; OKOH, 2007).
A resistência de bactérias aos antibióticos disponíveis clinicamente se tornou um
problema de saúde pública em todo mundo. Além disso, o custo financeiro de uma terapia
fracassada por conta de micro-organismos resistentes é muito grande, onerando ainda mais os
sistemas públicos de saúde. Bactérias resistentes geram nova consulta, novos exames
diagnósticos, nova prescrição, sem contar a provável internação e ocupação de leitos
23
hospitalares. Estima-se que, apenas nos Estados Unidos, o custo com a resistência bacteriana
gire em torno de 4 a 5 bilhões de dólares anualmente (FIOL et al., 2010).
O uso indiscriminado e abusivo de antibióticos, terapêutica ou profilaticamente,
humano ou veterinário, atendendo à interesses pessoais e/ou corporativos, passando ainda
pelo uso no crescimento animal e propósitos agrícolas, tem favorecido a pressão seletiva,
mostrando como resultado a seleção e predominância de espécies bacterianas cada vez mais
resistentes (BARKER, 1999) .
O exemplo clássico de manifestação da resistência é a penicilina. Descoberta em 1928
por Fleming e disponível para uso no início da década de 40, em 1944 Kirby já descreveu os
primeiros isolados resistentes. Em 1946, estimava-se que 5 % dos estafilococos já eram
resistentes à penicilina. Em 1949 a taxa chegava a 29 %, em 1959 80 % dos isolados já eram
resistentes. Atualmente, a probabilidade de isolamento de Staphylococcus aureus sensível à
penicilina é praticamente nula (TAVARES, 2000).
As bactérias podem tornar-se resistentes através de mutações cromossômicas ou por
troca de material genético, nesse caso através de transdução, transformação ou conjugação
(KAPIL, 2005). Os mecanismos de resistência podem ser (LANGTON; HENDERSON;
HERBERT, 2005; PICÃO; XAVIER; GALES, 2009; TAVARES, 2000; TENOVER, 2006):
- impermeabilidade à droga: um dos mais comuns mecanismos, onde a bactéria é
intrinsecamente resistente ao fármaco, pois apresenta características próprias de parede celular
que impedem a penetração do antimicrobiano;
- alteração de moléculas alvo: a bactéria consegue modificar o sítio primário de ligação do
antibiótico, diminuindo a afinidade de ligação. É o exemplo do Staphylococcus aureus
resistente à meticilina (MRSA), no qual a proteína ligadora de penicilina (PBP) é modificada
através da expressão do gene mecA;
- inativação enzimática: há produção de enzimas que inativam o antibiótico. As chamadas
“superbactérias”, descritas na mídia como NDM-1, apresentam metalobetalactamases que
conseguem clivar todos os antibióticos beta-lactâmicos, inclusive os carbapenêmicos;
- efluxo: após a entrada do antibiótico no interior da célula bacteriana, quando este atinge um
gradiente de concentração ativa um mecanismo chamado bomba de efluxo, que promove a
expulsão da droga. É um mecanismo altamente eficiente, pois é capaz de atuar em antibióticos
de diversas classes farmacológicas.
24
Infelizmente, em contramão ao aumento da resistência bacteriana, o número de novos
fármacos está caindo com o passar dos anos. A Figura 1 demonstra essa queda:
Figura 1 – Novos agentes antibacterianos aprovados nos Estados Unidos de 1983 a 2002
(SPELLBERG et al., 2004).
Tal fato pode ser explicado pelo elevado custo de pesquisa e desenvolvimento
(estimados em 500 milhões de dólares), além da restrição do uso de novos agentes
antimicrobianos, a fim de evitar a disseminação da resistência. Ademais, torna-se muito mais
interessante financeiramente para as grandes companhias farmacêuticas investir em fármacos
para tratamento de pacientes crônicos, como nos casos dos anti-hipoglicemiantes,
antiretrovirais e anti-hipertensivos, por exemplo (SPELLBERG et al., 2004).
3.5 Atividade Antibacteriana
Devido à infinita diversidade vegetal, devemos adotar critérios na seleção do material
para
pesquisa
de
atividade
antimicrobiana.
Usualmente
utilizam-se
critérios
etnofarmacológicos, ou seja, uso na medicina popular para tratamento de processos
infecciosos. Inicialmente, a espécie deve ser corretamente descrita e identificada, incluindo os
dados de coleta do material, como localização, estação do ano, data e hora da coleta. A
25
escolha dos solventes e sistemas de extração também é muito importante, geralmente
utilizando as mesmas susbtâncias empregadas no uso popular. A escolha da metodologia de
ensaio também é fundamental e deve ser realizada de acordo com as características de
polaridade dos compostos isolados, visto que, compostos apolares tendem a ter dificuldade de
difusão nos meios de cultura utilizados, recomendando-se, nesse caso, técnicas de diluição
(RIOS; RECIO, 2005).
Os métodos mais comumente utilizados para avaliar a atividade antibacteriana são os
de disco difusão, diluição em ágar e microdiluição em caldo. Os resultados obtidos por cada
um desses ensaios podem diferir por várias razões, principalmente aqueles que afetam o
crescimento microbiano, como a exposição do micro-organismo ao extrato, a solubilidade dos
seus componentes em água e o uso de agentes emulsificadores. Cabe ressaltar que os critérios
utilizados pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) são descritos para avaliar
agentes antimicrobianos convencionais como os antibióticos. Quando utilizamos extratos
vegetais, de características químicas bastante heterogêneas, muitas vezes devemos realizar
adaptações nas metodologias visando a sua otimização. As substâncias testadas pelo CLSI
normalmente tem características hidrofílicas, entretanto, os extratos vegetais são pouco
solúveis em água, viscosos e complexos (BELLA CRUZ et al., 2010).
Para minimizar tal interferência, utilizamos agentes emulsificadores, como o
dimetilsulfóxido (DMSO), Tween ou metanol, que irão promover a dispersão do princípio
ativo no meio de cultura. Porém, devemos levar em consideração que a utilização destes
agentes pode promover uma interação com os compostos ativos, bem como pode promover
um efeito antibacteriano direto sobre o micro-organismo testado. Devido a este fato,
recomenda-se que a concentração final do emulsificador não ultrapasse 2,5 %
(NASCIMENTO et al., 2007).
3.6 Plantas Medicinais
A diversidade biológica ou biodiversidade tem sido cada vez mais reconhecida como
um dos elementos centrais para o desenvolvimento e bem-estar da humanidade e grande
responsável pelo equilíbrio ambiental global. Embora apenas uma pequena parte de seus
componentes tenha sido adequadamente estudada e seus benefícios futuros ainda não sejam
totalmente conhecidos, tem-se valorizado cada vez mais sua capacidade de gerar benefícios
26
sócio-econômicos, devido ao seu potencial como matéria-prima para diferentes campos do
conhecimento, como a medicina e diversos setores da indústria (FERRO; BONACELLI,
ASSAD, 2006).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 65 a 80 % da população mundial,
principalmente em países em desenvolvimento, confiam nos produtos a base de plantas
medicinais no tratamento de suas doenças. Esses produtos são utilizados para várias
finalidades, baseados em evidências históricas ou pessoais, onde não são atribuídos efeitos
adversos (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008).
A implementação de programas nacionais de saúde, como o Programa Nacional de
Plantas Medicinais e Fitoterápicos adotado pelo Ministério da Saúde, seguindo uma tendência
da OMS, que incentiva o uso de biodiversidade de países em desenvolvimento para assegurar
maior acesso e cuidados à saúde básica das populações, objetiva estimular a pesquisa e
desenvolvimento de fitoterápicos, especialmente para o tratamento de doenças endêmicas e
negligenciadas pela indústria farmacêutica mundial, tais como malária, doença de Chagas,
esquistossomose e outras (FUNARI; FERRO, 2006).
O Brasil, segundo a Convenção da Diversidade Biológica (CDB), ostenta cerca de 20
% da biodiversidade mundial, aproximadamente 55 mil espécies de plantas, sendo assim
considerado um local propício para a busca de novos medicamentos (BARREIRO;
BOLZANI, 2009).
Há vários caminhos para o estudo das plantas medicinais, destacando-se quatro tipos
básicos de abordagens: randômica, etológica, quimiotaxonômica e etnodirigida. As
investigações randômicas compreendem a coleta ao acaso de plantas para a triagem
fitoquímica e farmacológica. A abordagem etológica tem como orientação avaliar a utilização
de metabólitos secundários por animais, ou outras substâncias não nutricionais dos vegetais,
com a finalidade de combater doenças ou controlá-las. A quimiotaxonomia consiste na
seleção de espécies de uma família ou gênero, para as quais se tenha algum conhecimento
fitoquímico de ao menos uma espécie do grupo. Já a investigação etnodirigida consiste na
seleção de espécies de acordo com a indicação de grupos populacioniais específicos em
determinados contextos de uso, enfatizando a busca pelo conhecimento construído localmente
a respeito de seus recursos naturais e a aplicação que fazem deles em sues sistemas de saúde e
doença (ALBUQUERQUE et al., 2006);
27
A pesquisa de novos agentes antimicrobianos se faz necessária devido ao surgimento
de micro-organismos resistentes, de infecções oportunistas fatais associadas principalmente a
AIDS, quimioterapia antineoplásica e transplantes. Esse estudo de triagem utilizado para
encontrar produtos com atividade farmacológica é de extrema importância, na descoberta de
substâncias mais eficazes e menos tóxicas na corrida contra a resistência e o surgimento de
novos micro-organismos patogênicos (OSTROSKY et al., 2008).
Dentre as diversas plantas com potencial terapêutico se incluem aquelas da família
Winteraceae.
3.7 Toxicidade
Desde a antiguidade as plantas são usadas com fins medicinais pelo homem.
Entretanto, muitas destas plantas tem um grande potencial de toxicidade. A crença de que
medicamentos à base de plantas são isentos de risco à saúde faz parte da bagagem cultural da
população afeita ao seu uso. Entretanto, o caráter natural de tais produtos não é garantia de
isenção de reações adversas e outros problemas decorrentes de tal medicina (LANINI et al.,
2009). Por esta razão, ensaios que avaliam a toxicidade dos produtos naturais são
fundamentais para que estes produtos possam ser utilizados com segurança (PARRA et al.,
2001).
A crença na natureza inócua das plantas medicinais não é facilmente contradita, pois
as evidências científicas de ocorrência de intoxicações e efeitos colaterais relacionados com o
uso de plantas medicinais consistem em informações que dificilmente chegam ao alcance dos
usuários atendidos nos serviços de saúde pública, caracterizados como indivíduos de baixa
escolaridade e acervo cultural (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008).
3.7.1 Teste de toxicidade (Artemia salina)
Atualmente há uma tendência natural a substituir o uso de animais de laboratório em
testes toxicológicos, devido ao alto custo e ao sofrimento causado a estes animais. Os
métodos recomendados incluem testes que diminuem o número de animais utilizados em cada
teste e/ou reduzir a dor e estresse causados. Os métodos alternativos incluem testes de
citotoxicidade, como o que utiliza a Artemia salina (PARRA et al., 2001).
28
Artemia salina é um microcrustáceo da classe Anostracea, que vive em águas salinas e
salobras de todo o mundo. Possui 4 estágios de desenvolvimento: ovo, náuplio, metanáuplio e
adulto. Apresentam alguns mecanismos de adaptação que as tornam cosmopolitas, como a
osmorregulação, a presença de pigmentos respiratórios como a hemoglobina e a
disponibilidade de alternativas reprodutivas que facilitam a dispersão e a perpetuação dessa
espécie (NUNES et al., 2006).
O ensaio de toxicidade utilizando os microcrustáceos é um método seguro, prático e de
baixo custo para determinar a bioatividade de compostos sintéticos e/ou produtos naturais. Há
uma correlação com o ensaio e a inibição in vitro do crescimento de células de tumores
sólidos, estabelecida pelo Instituto Nacional de Câncer dos Estados Unidos, valorizando o
teste com a Artemia salina como screening na pesquisa de células antitumorais (SILVA et al.,
2007).
Em 1982, Meyer e colaboradores estabeleceram uma relação entre o grau de
toxicidade e a concentração letal média (CL50), apresentada por extratos de plantas sobre
larvas de Artemia salina, considerando que valores acima de 250 μg/mL são considerados
com baixa toxicidade, entre 80 e 250 μg/mL moderamente tóxicos e CL50 menor que 80
μg/mL considerados tóxicos (DOLABELA, 1997).
3.8 Família Winteraceae
A família Winteraceae consiste de árvores e arbustos que habitam principalmente as
florestas do lado sul do Oceano Pacífico. Ela contém aproximadamente cem espécies com seis
ou sete gêneros. Talvez devido à falta de importância econômica e a distribuição restrita, a
família Winteraceae não tenha sido tão extensivamente examinada quanto aos seus
constituintes químicos (MALHEIROS, 2001).
É mais diversificada nas regiões subtropicais mas ecologicamente mais bem sucedida
em termos de abundância em ambientes temperados. É encontrada em áreas com abundante
precipitação e/ou pouca demanda de evaporação, como ao longo de rios, em sub-habitats e em
florestas montanhosas (FEILD et al., 2000).
29
3.8.1 Drimys
Dentre as espécies da família Winteraceae, temos as do gênero Drimys, sendo que a
Drimys brasiliensis, conhecida como casca d’anta ou cataia, é característica das savanas e
subosques dos pinhais, ocorrendo também nos topos dos morros da região da floresta da
encosta atlântica, e mais raramente em áreas das florestas estacionais deciduais das bacias
Paraná-Uruguai, apresentando dispersão significativa, porém, distribuição descontínua e
irregular. Floresce de julho a abril e frutifica a partir de outubro (TRINTA; SANTOS, 1997).
Dentre as principais substâncias extraídas da Drimys brasiliensis que possuem
atividade farmacológica podemos citar os sesquiterpenos drimanos poligodial, drimanial, 1-β(p-metoxicinamoil)-poligodial e epifuegina, extraídos principalmente das cascas. Já foram
descritas atividades antifúngicas, antinflamatórias, antinociceptivas e antialérgicas (CUNHA
et al., 2001; MALHEIROS et al., 2005; ANDRE et al., 2006).
O poligodial, composto majoritário das cascas, mostrou-se ativo em contrações
induzidas por vários mediadores químicos que participam da etiologia das doenças
respiratórias e apresentou potente ação antinociceptiva em camundongos. Induz ação vasorelaxante pela liberação de óxido nítrico (NO). É uma molécula promissora para o
desenvolvimento de novos fármacos, devido ser alvo de uma variedade de mecanismos
envolvidos na dor e inflamação (STERNER; SZALLASI, 1997; MENDES et al., 1998).
Figura 2 – Foto das flores de Drimys brasiliensis
Fonte: http://www6.ufrgs.br/fitoecologia/florars/open_sp.php?img=1045
30
4. MATERIAS E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
Os extratos, frações e compostos isolados foram obtidos pela aluna do programa de
mestrado em Ciências Farmacêuticas Vanessa Duarte Claudino, no laboratório de fitoquímica
da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI, sob orientação da professora Dra. Ângela
Malheiros.
Cascas, caule e folhas de Drimys brasiliensis foram coletados no município de Rancho
Queimado, estado de Santa Catarina. A planta foi identificada como Drimys brasiliensis
Miers subespécie sylvatica (Saint Hilaire) Ehrendorfer L Gott sb pelo Dr. Ademir Reis
(Departamento de Botânica, Universidade Federal de Santa Catarina) e um exemplar foi
depositado no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí-SC), com número VC Filho 010.
4.1.1 Preparação dos extratos
As cascas de D. brasiliensis (750 g) foram secas a 40 ºC por 2 dias e após esse período
maceradas e extraídas sucessivamente com diclorometano e metanol à temperatura ambiente
por 10 dias cada e então o material foi filtrado. Os filtrados obtidos foram concentrados sob
pressão reduzida, gerando o extrato bruto clorofórmico e metanólico, com rendimento de 30,2
g e 60,6 g, respectivamente. Os caules coletados (700 g) foram processados da mesma
maneira que as cascas, gerando extratos com rendimento de 17,6 g e 14,8 g, respectivamente.
Uma amostra de 250 g de folhas foi processada de maneira similar à descrita para cascas e
caules, de onde foram obtidos rendimentos de 24,5 g e 10,6 g para o extrato clorofórmico e
metanólico, respectivamente.
4.1.2 Isolamento e identificação dos compostos a partir do extrato clorofórmico de
cascas
O esquema para o fracionamento do extrato clorofórmico e isolamento dos compostos
está descrito na Figura 3.
Figura 3 – Fluxograma de fracionamento do extrato clorofórmio de cascas de Drimys brasiliensis.
31
32
Parte do extrato bruto obtido das cascas (9,21 g) foi submetido à cromatografia em
coluna (coluna DBC1), utilizando como fase fixa sílica-gel e eluída com misturas de hexano,
acetato de etila e metanol, em grau crescente de polaridade. Cento e vinte e uma frações de 50
mL cada foram coletadas, sendo reunidas em oito frações majoritárias (A-H), de acordo com
o perfil cromatográfico após análise por cromatografia de camada delgada (CCD). Da fração
C (18-25) coluna DBC1, foi obtido 358 mg de espatulenol (1), após eluição com hexanoacetato de etila (9:1). Uma fração enriquecida em poligodial (2) foi obtida da fração E (3249), após eluição com hexano-acetato de etila (8:2), sendo este composto purificado por
sucessivas cromatografias, gerando 257,7 mg de composto isolado.
A fração F (50-58) da coluna DBC1 (819,8 mg) foi submetida à cromatografia em
coluna (coluna DBC2) utilizando como fase fixa sílica-gel e eluída com uma mistura de
hexano-acetato de etila (7:3), gradualmente enriquecida com acetato de etila e metanol em
grau crescente de polaridade. Setenta e cinco sub-frações de 20 mL cada foram coletadas, e
após análise por CCD foram agrupadas em seis frações majoritárias (F1-F6), combinadas de
acordo com seu perfil cromatográfico. O poligodial (2) foi isolado novamente a partir da
fração F2 (2-5), após eluição com hexano-acetato de etila (9:1).
A fração G (59-85) coluna DBC1 (1,97 g), foi submetida à coluna cromatográfica em
sílica gel (coluna DBC3), eluída com uma mistura de hexano: acetato de etila (6:4)
enriquecida gradualmente com acetato de etila e etanol, para obtenção de grau crescente de
polaridade. Foram obtidas seis frações majoritárias (G1-G6), combinadas de acordo com a
detecção por CCD. O composto 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial (3) foi obtido a partir da
purificação da fração G2 (7-13), por cromatografia em coluna (eluente: hexano/acetato de
etila (8:2)), gerando 82 mg de composto isolado.
Da purificação cromatográfica da fração G3 (14-24) foram obtidos o 1-β-(poxicumaroil)-poligodial (4) (212,9 mg), após eluição com hexano: acetato de etila (6:4) e uma
fração enriquecida em drimanial (5), após eluição com hexano: acetato de etila (6:4), que foi
encontrado também na fração G4 (25-42). Esta fração foi purificada com sucessivas
cromatografias, gerando 188 mg de drimanial isolado.
33
Figura 4 – Compostos isolados de Drimys brasiliensis
Os compostos obtidos a partir do isolamento cromatográfico foram identificados com
base nos dados espectrais em comparação com dados de compostos anteriormente isolados e
através da comparação cromatográfica direta com padrões (amostras autênticas)
(MALHEIROS et al., 2001).
A atividade antimicrobiana das frações foi triada por bioautografia, sendo que aquelas
que não demonstraram atividade biológica não foram testadas. Foram utilizadas no estudo as
seguintes frações:
B
C
D
E
F
F4
F5
F6
G
G2
G3
G5
H
4.2 Material microbiológico
Os micro-organismos utilizados como cepas padrões para a realização dos ensaios de
atividade antimicrobiana foram as bactérias: Bacillus cereus (ATCC 33019), Escherichia coli
(ATCC 11775), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
34
27857), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Staphylococcus saprophyticus (ATCC 35552), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Listeria
monocytogenes (ATCC 7644), Moraxella catarrhalis (ATCC 25238), Neisseria neningitidis
(ATCC 13090) e Streptococcus pneumoniae (ATCC 11733).
O Helicobacter pylori utlizado foi o (ATCC 43772), cedido pelo laboratório de microorganismos de referência da Fiocruz.
4.2.1 Manutenção dos micro-organismos
As bactérias foram mantidas em alíquotas congeladas em caldo infusão de cérebro e
coração (BHI) e 30% de glicerol, no Laboratório de Microbiologia Clínica do Curso de
Farmácia da FURB, sendo ativadas em caldo BHI, incubadas 12 horas a 37 ºC e
posteriormente semeadas em ágar sangue de carneiro a 5%.
As bactérias exigentes foram mantidas em alíquotas e congeladas com caldo BHI, 30
% de glicerol e 10% de sangue de carneiro. Foram ativadas utilizando caldo BHI com 10% de
sangue de carneiro, incubadas por 12 horas a 37 ºC e microaerofilia, sendo semeadas em ágar
chocolate, com incubação de 24 a 48 horas em tensão de CO2.
O Helicobacter pylori foi congelado em caldo Brucella com 30% de glicerol e 10% de
sangue de carneiro e mantido a -70 ºC. Para ativação, foi utilizado caldo Brucella, com
incubação por 24 horas, posteriormente a bactéria foi semeada em ágar sangue de carneiro a
10 % e incubada por 48-72 horas a 37 ºC em microaerofilia.
4.3 Atividade antibacteriana
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais foi avaliada através da determinação
de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o crescimento do microorganismo teste. Esse valor é conhecido como concentração inibitória mínima (OSTROSKY
et al., 2008).
A determinação das concentrações inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima
(CBM) dos extratos, frações e compostos isolados de Drimys brasiliensis foram realizadas
através do método de diluição em ágar.
35
Os compostos isolados não tiveram a atividade anti-Mollicutes e a toxicidade aguda
avaliadas devido à pequena quantidade disponível, insuficiente para a realização destes testes.
4.3.1 Diluição em ágar
O método consiste em preparar diluições sucessivas dos extratos em ágar Mueller
Hinton, inoculados com a bactéria em estudo, incubado por 24 horas em estufa a 37 ºC e,
posteriormente, verificar a menor concentração de extrato que inibiu o crescimento do microorganismo.
Os extratos foram dissolvidos em solução de dimetisulfóxido (DMSO) e água
destilada (4:6), atingindo uma concentração de 40 mg/mL. Em seguida, foram adicionados 50
μL em séries de 10 frascos com capacidade para 5 mL, com posterior diluição dos mesmos.
Em seguida, a cada frasco foi adicionado 950 μL de ágar Mueller-Hinton, seguido de imediata
homogeneização da mistura. O primeiro frasco apresentou concentração final de 1000 μg/mL
e o último 1,95 μg/mL. Com a solidificação dos respectivos meios de cultura, os microorganismos, previamente ativados, foram inoculados nas séries correspondentes, sendo então
incubados a 37 ºC por 18 a 24 horas (NCCLS, 2003; CAMPOS et al., 2006).
4.4 Atividade anti- Helicobacter pilory
Para determinar a atividade dos extratos, frações e substâncias isoladas de Drimys
brasiliensis frente ao H. pilory utilizamos o método de diluição em ágar sólido (VEGA et al.,
2009), de acordo com as recomendações do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI,
2005). A partir de soluções estoque dos extratos de 40 mg/mL, foram realizadas diluições
seriadas. Em vidros individuais, 50 µL de cada diluição foi adicionado à 950 µL de ágar
Brucella acrescido de 10 % de sangue carneiro, líquido a 45-50 ºC, atingindo concentrações
de 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,625 µg/mL. O inóculo bacteriano foi preparado
baseado na escala turbidimétrica 0,5 de MacFarland. Após solidificação do meio de cultura,
foi semeado 1 µL da suspensão bacteriana em cada vidro com os extratos diluídos em ágar.
Foram incubados em condições ideais de microaerofilia e umidade, a 35 ºC por 48-72 horas.
36
4.5 Atividade contra Mollicutes
Os micro-organismos utilizados foram Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominis
e Ureaplasma urealyticum, fornecidos pelo laboratório de Bioquímica Clínica da FURB,
sendo que algumas cepas estavam conservadas à temperatura de -20 ºC e outras
comercializadas liofilizadas e foram ativadas através da cultura.
Para reativar os micro-organismos foi realizado o crescimento até fase log
contendo 10³ micro-organismo/mL (BEBEAR; ROBERTSON, 1996), inoculando-os em
tubos contendo os meios de cultura líquidos, meio de uréia (U10) (SHEPARD, 1974) no caso
do U. urealyticum e meio líquido de arginina (MLA) (VELLECA; BIRD; FORRESTER,
1979) nos casos do M. arginini e M. hominis.
Posteriormente os tubos foram incubados a 36 ºC ± 1 ºC por 48 a 72 horas em
microaerofilia. A confirmação do crescimento foi realizada através da mudança de cor devido
a presença do indicador vermelho de fenol, sendo que o micro-organismo degrada a uréia no
caso do meio U10, e a arginina no caso do MLA, liberando amônia e alcalinizando o pH do
meio, fazendo com que haja uma mudança de cor do amarelo para o vermelho.
Para preparação dos extratos e frações foram pesados 20 mg de cada extrato ou
fração, solubilizadas em 1 mL de solvente DMSO e completadas com água até 10 mL,
gerando concentrações de 2 mg/mL. A necessidade de completar o volume com água em vez
de utilizar os 10 mL de DMSO é devido ao fato de que este exerce um efeito tóxico sobre as
espécies de Mollicutes como pôde ser observados em estudos anteriores (BENFATTI et al.,
2010).
O DMSO exerce certo efeito tóxico sobre o crescimento de molicutes. Este fato
provavelmente se deve à característica destas bactérias de serem desprovidos de parede
celular, tornando-as mais sensíveis a alterações osmóticas e outras agressões celulares. Esta é
uma característica peculiar desta classe, assemelhando-se, neste sentido, às células dos microorganismos eucariotos (BENFATTI et al., 2010). Tal característica também limita o uso de
antimicrobianos, já que boa parte dos fármacos utilizadas na clínica atualmente tem como
alvo a parede celular, como é o caso das penicilinas e cefalosporinas.
Depois de solubilizados, os extratos e frações foram filtrados com filtros Millex
(Millipore®) de 0,22 µm para garantir a esterilidade dos mesmos, haja visto a grande
facilidade de contaminação do meio por outros micro-organismos. Permaneceram
37
conservadas em geladeira para evitar contaminações externas ou degradação dos compostos
químicos pela luz ou temperatura.
Os testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram realizados por
microdiluição em caldo. Primeiramente adicionou-se 100 µL de meio de cultura nas colunas 1
a 6 e 200 µL de meio de cultura nas colunas 7 e 8.
Nas colunas 1 a 6 foram feitas as microdiluições dos extratos e frações obtidos de
D. brasiliensis, de modo que no poço da primeira linha adicionou-se 100 µL da fração aos
100 µL do meio de cultura e homogeneizou-se, gerando uma concentração de 500 μg/mL.
Retirou-se 100 µL e misturou-se ao próximo, gerando uma concentração de 250 μg/mL. Este
procedimento foi realizado até o oitavo poço.
Depois de realizar este procedimento com as 6 colunas adicionou-se 100 µL de
inóculo bacteriano em todos os poços de 1 a 6. Este inóculo foi previamente diluído 1:100 em
meio de cultura. Na coluna 7 (controle positivo) adicionou-se 200 µL de inóculo bacteriano
aos 200 µL do meio de cultura no primeiro poço e homogeneizou-se, dos quais foram
retirados 200 µL homogeneizando, e assim sucessivamente.
Foram realizados controles negativo e positivo. No controle negativo, não foi
adicionada a suspensão bacteriana, a fim de verificar a que não houve contaminação do meio
de cultivo. Já no controle positivo, não foi adicionado o extrato ou fração, com o objetivo de
demonstrar a viabilidade bacteriana.
Por fim, adicionou-se em todas as cavidades 2 a 3 gotas de vaselina líquida para evitar
o ressecamento do meio líquido, e também para isolar cada cavidade do meio externo criando
um ambiente de microaerofilia. Depois destes procedimentos as placas foram incubadas a 36º
C ± 1 ºC por 48 a 72 horas, e o crescimento foi observado a partir da mudança de cor do meio
de cultura. Aquelas cavidades que não apresentaram mudança de coloração do amarelo para o
vermelho são as que se caracterizaram como ausência de crescimento, e pode ser comprovada
a atividade antimicrobiana, comparada com o crescimento bacteriano no controle positivo.
Foram realizadas diluições sucessivas dos extratos, frações e substâncias isoladas, de
modo a obter concentrações de 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62 e 7,8 µg/mL.
38
4.6 Preparo dos inóculos
Para o preparo dos inóculos bacterianos foram utilizadas as bactérias Gram-positivas
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus
faecalis, Streptococcus pneumoniae e Listeria monocytogenes e as Gram-negativas: Proteus
mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella
catarrhalis e Neisseria meningitidis. Foram realizados testes bioquímicos para comprovar a
identificação das bactérias.
Cada bactéria foi transferida do meio de manutenção para o meio ágar Mueller-Hinton
e incubada a 37 ºC por 18-24 horas, para a ativação da respectiva cultura.
Para o preparo do inóculo foram selecionadas de 4 a 5 colônias da bactéria ativada em
ágar Mueller – Hinton, sendo transferidas para tubo de ensaio com 5 ml de solução de NaCl
0,86% estéril, seguido de homogeneização em agitador de tubos por 15 segundos. A
densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 620 nm, com uma absorbância
entre 0,08 e 0,1, comparativa com a escala 0,5 de Mc Farland (NCCLS, 1993).
O inóculo final foi obtido pela diluição da suspensão das respectivas culturas
bacterianas, obtendo-se concentração de aproximadamente 1,5 x 108 células/ml para o método
de diluição em ágar. Foi inoculado em cada frasco (meio) com uma alça calibrada de 1 μL
(1,5 x 105 células) (NCCLS, 1993).
4.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O método consiste em preparar diluições sucessivas do extrato a ser testado, em meios
de cultura sólidos e líquidos, semear a bactéria em estudo, e após incubação, verificar a menor
concentração da amostra que inibiu o crescimento do microorganismo utilizado no ensaio.
Os valores da CIM foram determinados através da diluição dos componentes obtidos
dos diferentes extratos e frações de Drimys brasiliensis em ágar sólido, empregando a
metodologia descrita por NCCLS (1993) com modificações.
Após o período de incubação, foram realizadas leituras da CIM através da verificação
visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi considerada CIM a
inibição total do crescimento microbiano.
39
Durante os testes foram utilizados controles, como os meios de cultura e solvente
utilizado na solubilização dos extratos, a fim de verificar seu efeito sobre o micro-organismo.
A concentração final de DMSO nos ensaios não excedeu a 2%. A leitura dos resultados foi
considerada válida somente quando houve crescimento microbiano nos controles. Todos os
ensaios foram realizados em triplicata.
4.8 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
Para determinar a concentração bactericida mínima foram selecionadas as culturas que
apresentaram inibição do desenvolvimento bacteriano no ensaio de CIM, sendo realizadas
suas respectivas subculturas em meio ágar Mueller – Hinton, incubadas a 37 ºC por 18 a 24
horas. Após a incubação as culturas foram inspecionadas para a verificação visual do
crescimento microbiano.
Para a interpretação dos resultados foi considerado que a inibição no ensaio de CIM e
crescimento de micro-organismos na subcultura (CBM) significa ação bacteriostática e a
ausência do crescimento na subcultura significa ação bactericida (BARON; FINEGOLD,
1990).
4.9 Bioautografia
Para o direcionamento das pesquisas na localização dos componentes com potencial
antimicrobiano da planta em estudo foi realizado o ensaio de bioautografia (RAHALISON et
al., 1994; HAMBURGUER; CORDEL, 1987).
Os extratos e frações foram dissolvidos em solvente apropriado e aplicados em placas
de cromatografia de camada delgada (CCD) e em seguida, as placas foram submetidas à
eluição em diferentes solventes para a escolha daquele que favorecesse a melhor resolução.
Após a eluição e eliminação dos resíduos de solventes foi distribuída uma fina camada de
meio de cultura contendo inóculos de micro-organismo susceptível (106 células/mL) sobre as
placas de CCD e em seguida, estas foram incubadas a 37 ºC por 18 a 24 horas.
Para facilitar a leitura dos resultados, após o período de incubação, foi borrifado nas
placas uma solução aquosa de cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólio (TTC) (20 mg/mL) e estas
novamente incubadas a 37 ºC por mais 4 horas.
40
O critério empregado para a interpretação dos resultados de bioautografia foi o
aparecimento de zonas claras em torno dos compostos isolados na CCD, indicando a
respectiva atividade antimicrobiana (RAHALISON et al., 1994; HAMBURGUER; CORDEL,
1987).
4.10 Ensaio de toxicidade com Artemia salina
O ensaio de toxicidade dos extratos de Drimys brasiliensis foi realizado conforme o
método descrito por Meyer et al. (1982) utilizando o microcrustáceo Artemia salina.
Os componentes dos diferentes extratos e frações de Drimys brasiliensis foram
dissolvidos em solução de DMSO e posteriormente em água marinha sintética.
Ovos de Artemia salina, adquiridos comercialmente, foram colocados em um béquer
contendo água marinha sintética com pH entre 8 e 9, e incubados em banho-maria entre 20 a
25 ºC, por 48 horas para eclodirem. Após este período, em microplacas (2000 μL) foram
preparadas diferentes concentrações dos extratos e frações, que variaram de 2 a 1000 μg/mL e
a cada uma delas foram adicionadas em placa entre 6 e 12 larvas de microcrustáceo, seguido
de nova incubação em banho-maria (20 a 25 ºC) por 24 horas.
Apos este período, o número de microcrustáceos vivos e mortos em cada diluição
(concentração) foi contado, com auxilio de um microscópio binocular E Lentz Wetzlar (10x).
Como controle positivo, foi utilizada uma solução de dicromato de potássio nas concentrações
de 400, 600 e 800 μg/mL e como controle negativo 200 μL de água marinha. Foram
adicionados controles com o solvente utilizado para a dissolução das amostras.
A leitura dos resultados foi validada somente quando nos controles positivos foi
observada a morte de todos os indivíduos (A. salina) e no controle negativo a sobrevivência
de todos os indivíduos.
Para o calculo final de CL50 e seu respectivo intervalo de confiança de 95% utilizamos
o método de próbitos de análise. Os extratos e frações foram considerados tóxicos quando a
CL50 for menor que 250 μg/mL (DOLABELA, 1997).
41
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Atividade antibacteriana
5.1.1 Concentração Inibitória Mínima (CIM)
As plantas contém milhares de componentes e são uma excelente fonte para pesquisa
de compostos com atividade antimicrobiana. A escolha correta dos solventes, processos de
extração e, principalmente, dos métodos de avaliação da atividade antimicrobiana são
fundamentais para o isolamento e identificação dos compostos com atividade biológica (DAS;
TIWARI; SHRIVASTAVA, 2010; OSTROSKY et al., 2008).
Para a classificação da atividade antimicrobiana, de extratos e frações podem ser
empregados alguns critérios: para CIM entre 10 e 100 µg/mL podem ser considerados ativos;
entre 100 e 500 µg/mL a atividade é moderada e quando a CIM for maior que 1000 µg/mL
são classificados como inativos (HOLETZ et al., 2002).
Os extratos e frações que apresentaram CIM menor que 1000 µg/mL foram
considerados ativos. A Tabela 2 mostra os resultados obtidos.
Tabela 2 – Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) dos extratos de Drimys brasiliensis
frente às bactérias Gram-positivas.
S. aureus
S. saprophyticus
E. faecalis
B. cereus
L. monocytogenes
S. pneumoniae
Extrato Folhas CH2Cl2
1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Folhas MeOH
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Cascas MeOH
1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Cascas CH2Cl2
250
500
500
62,5
250
500
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Caule MeOH
Os extratos, frações e compostos isolados de Drimys brasiliensis apresentaram
atividade contra bactérias Gram-negativas com CIM superiores a 1000 µg/mL, sendo, por este
motivo, considerados inativos contra estas bactérias.
As bactérias Gram-negativas apresentam uma delgada camada de peptidoglicano, com
a presença de um espaço periplásmico e de uma membrana externa. Tal fato explica a
dificuldade da terapêutica antimicrobiana nestes micro-organismos, já que a membrana
externa funciona como uma barreira extra à entrada de diversas substâncias (TENOVER,
42
2006). Além disso, temos no espaço periplásmico a produção de numerosas enzimas que
hidrolisam moléculas ativas como, por exemplo, as beta-lactamases.
Avaliando a atividade contra Staphylococcus aureus, verificou-se que, dentre os
extratos, somente o diclorometano das cascas demonstrou atividade (250 µg/mL). Dentre as
frações estudadas, foram obtidos resultados promissores, com CIM de 62,5 e 125 µg/mL para
as frações G2 e E, respectivamente.
Contra Staphylococcus saprophyticus, o extrato diclorometano das cascas de Drimys
brasiliensis apresentou CIM de 500 µg/mL e as frações G2 e E foram as que demonstraram a
melhor atividade, com CIM de 125 e 250 µg/mL, respectivamente.
Com relação ao Enterococcus faecalis, os resultados mostram novamente o extrato
diclorometano de cascas como o único com atividade (500 µg/mL). As CIM das frações
demonstraram que G2 (125 µg/mL) e E (250 µg/mL) tem uma excelente atividade contra esta
bactéria.
Dentre as bactérias testadas, indiscutivelmente foi contra o Bacillus cereus que os
componentes testados da planta demonstraram melhor atividade, com CIM de 62,5 µg/mL
(extrato diclorometano de cascas), 31,25 µg/mL (fração G2) e 125 µg/mL (fração E).
43
Tabela 3 – Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) das frações e compostos isolados de
Drimys brasiliensis frente às bactérias Gram-positivas.
S. aureus
S. saprophyticus
E. faecalis
B. cereus
L. monocytogenes
S. pneumoniae
Fração B
1000
>1000
1000
>1000
>1000
>1000
Fração C
500
1000
>1000
500
1000
500
Fração D
500
1000
1000
250
1000
500
Fração E
125
250
250
125
250
250
Fração F
500
1000
1000
250
1000
1000
Fração F4
500
500
1000
500
500
1000
Fração F5
1000
1000
>1000
500
>1000
>1000
Fração F6
500
>1000
1000
125
1000
500
Fração G
250
500
500
125
500
1000
Fração G2
62,5
125
125
31,25
125
250
Fração G3
250
1000
1000
125
500
500
Fração G5
500
>1000
1000
125
500
500
Fração H
1000
>1000
1000
1000
>1000
1000
Drimanial
500
500
>1000
125
NR
NR
Espatulenol
125
250
125
62,5
NR
NR
Poligodial
125
250
125
62,5
NR
NR
1-β-(p-metoxicinamoil)-
125
125
125
31,25
NR
NR
250
500
500
125
NR
NR
poligodial
1-β-(p-oxicumaroil)poligodial
Legenda: S. aureus: Staphylococcus aureus; S. saprophyticus: Staphylococcus saprophyticus;
E. faecalis: Enterococcus faecalis; B. cereus: Bacillus cereus; L. monocytogenes: Listeria
monocytogenes; S. pneumoniae: Streptococcus pneumoniae; NR: não realizado.
As frações que demonstraram melhor atividade foram a G2 e E, das quais foram
isolados o 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial e o poligodial, respectivamente. Comparando-se
o resultado de CIM obtido das frações e compostos isolados, podemos verificar que a fração
G2 e o 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial apresentaram resultados semelhantes, sendo que
podem haver outros compostos com atividade sinérgica ou aditiva. No caso da fração E, os
resultados demonstram a maior atividade do poligodial em relação à fração que o originou e
baseado nos dados bioautográficos, pode-se sugerir que seja o único composto com atividade
antibacteriana em tal fração.
Os extratos e frações de D. brasiliensis mostraram boa atividade frente à Listeria
monocytogenes e Streptococcus pneumoniae, principalmente o extrato de diclorometano das
cascas (250 e 500 μg/mL), a fração G2 (250 e 125 μg/mL) e a fração E (250 μg/mL),
respectivamente.
Analisando os compostos isolados, o poligodial, extraído da fração E, apresentou
atividade principalmente contra B. cereus, com CIM de 62,5 µg/mL. Comparando à fração da
44
qual foi isolado, apresentou atividade bastante similar, com diferença de, no máximo, uma
diluição, sugerindo sua presença majoritária nesta fração. Além de atividade antimicrobiana,
este composto apresenta atividade antinociceptiva, anti-inflamatória e anti-alérgica (CUNHA
et al., 2001). Por outro lado, o drimanial não demonstrou boa atividade, podendo, inclusive,
ser considerado inativo contra E. faecalis. Já o espatulenol, quando comparado à fração da
qual foi isolado, C, demonstrou um significativo aumento na atividade, entretanto não
podendo ser considerado um resultado promissor. O 1-β-(p-oxicumaroil)-poligodial, da
mesma maneira, não apresentou resultados satisfatórios para um composto isolado. Já o 1-β(p-metoxicinamoil)-poligodial foi, juntamente com o poligodial, aquele que demonstrou
resultados mais importantes, apresentando um valor de CIM para B. cereus de 31,25 µg/mL, o
melhor resultado dentre todos os compostos testados.
O efeito de associação entre os diversos compostos presentes em uma determinada
planta pode ser aditivo ou sinérgico, sendo observado em muitos casos e também devendo ser
levado em consideração. Isto poderia explicar a razão de que alguns compostos apresentaram
menor atividade antimicrobiana do que a fração da qual foi extraído, como foi verificado com
o composto 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial e a fração G2. Da mesma forma, torna-se
necessário isolar os compostos ativos e repetir os testes, para que possa ser demonstrada quais
substâncias são efetivamente ativas (HEMAISWAYRA; KRUTHIVENTI; DOBLE, 2008).
Os resultados apresentam um perfil de atividade extremamente promissor, em vista
que os extratos e frações apresentam CIM menor que 100 µg/mL e os compostos isolados
com CIM inferior a 10 µg/mL (RIOS; RECIO, 2005). Mesmo o 1-β-(p-metoxicinamoil)poligodial, composto que apresentou menor CIM no estudo (31,25 µg/mL), dificilmente
poderá ser utilizado isoladamente no tratamento de processos infecciosos, visto que os agentes
antimicrobianos utilizados na prática médica são ativos em concentrações menores que 10
µg/mL. O aumento na posologia e/ou concentração do fármaco também promoverá a
potencialização dos seus efeitos adversos (TAVARES, 2000). Porém, a partir do
conhecimento do seu mecanismo de ação, pode-se promover alterações estruturais a fim de
otimizar sua atividade antimicrobiana e minimizar os efeitos indesejáveis.
A atividade antifúngica de alguns compostos isolados de Drimys brasiliensis, já foi
demonstrada. Em particular o 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial e o 1-β-(p-oxicumaroil)poligodial, evidenciam a ação antimicrobiana do material vegetal (MALHEIROS et al.,
2005).
45
As cascas de D. brasiliensis são utilizadas popularmente para o tratamento de diversas
doenças, como câncer, úlcera, dor e patologias do trato respiratório, pois apresenta ação antiinflamatória, antifúngica, anti-alérgica, anti-edematogênica e antinociceptiva (CUNHA et al.,
2001; TRATSK et al., 1997; MATSUDA et al., 2001; CECHINEL-FILHO et al., 1998;
MALHEIROS et al., 2005; KUBO, FUJITA, 2001; MALHEIROS et al., 2001).
5.1.2 Concentração Bactericidade Mínima (CBM)
A concentração bactericida mínima é a menor quantidade de agente antimicrobiano
necessária para inviabilizar a célula bacteriana, ou seja, provocar danos irreversíveis. Quando
os valores de CBM são comparados com a CIM, pode-se avaliar se o composto tema ação
bactericida ou bacteriostática (BARON; FINEGOLD, 1990).
A Tabela 3 lista a CBM dos componentes de D. brasiliensis. Como pode ser
observado, os extratos, frações e compostos isolados de Drimys brasiliensis demonstraram
ação bacteriostática frente aos micro-organismos testados, visto que a CBM é maior que a
CIM, comprovando que causam efeitos que não são letais à célula bacteriana, apenas
impedindo a sua reprodução.
Tabela 4 – Concentração Bactericida Mínima (µg/mL) dos extratos de Drimys brasiliensis.
S. aureus
S. saprophyticus
E. faecalis
B. cereus
L. monocytogenes
S. pneumoniae
Extrato Folhas CH2Cl2
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Folhas MeOH
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Cascas MeOH
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Extrato Cascas CH2Cl2
>1000
>1000
>1000
250
>1000
>1000
Extrato Caule MeOH
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Dentre os extratos testados, apenas o extrato de cascas diclorometano apresentou
atividade bacteriostática, somente contra o micro-organismo Bacillus cereus com CBM de
250 µg/mL.
46
Tabela 5 – Concentração Bactericida Mínima (µg/mL) das frações e compostos isolados de
Drimys brasiliensis.
S. aureus
S. saprophyticus
E. faecalis
B. cereus
L. monocytogenes
S. pneumoniae
Fração B
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Fração C
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Fração D
>1000
>1000
>1000
500
>1000
>1000
Fração E
500
>1000
500
250
1000
1000
Fração F
>1000
>1000
>1000
500
>1000
>1000
Fração F4
>1000
>1000
>1000
1000
>1000
>1000
Fração F5
>1000
>1000
>1000
1000
>1000
>1000
Fração F6
>1000
>1000
>1000
250
>1000
>1000
Fração G
500
>1000
>1000
500
>1000
>1000
Fração G2
125
>1000
500
125
500
500
Fração G3
1000
>1000
>1000
250
>1000
>1000
Fração G5
>1000
>1000
>1000
250
>1000
>1000
Fração H
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
Drimanial
>1000
>1000
>1000
250
NR
NR
Espatulenol
1000
>1000
1000
125
NR
NR
Poligodial
500
>1000
500
250
NR
NR
1-β-(p-metoxicinamoil)-
500
>1000
500
125
NR
NR
1000
>1000
>1000
250
NR
NR
poligodial
1-β-(p-oxicumaroil)poligodial
S. aureus: Staphylococcus aureus; S. saprophyticus: Staphylococcus saprophyticus; E.
faecalis: Enterococcus faecalis; B. cereus: Bacillus cereus; L. monocytogenes: Listeria
monocytogenes; S. pneumoniae: Streptococcus pneumoniae; NR: não realizado.
Considerando todos os componentes testados, apenas a fração G2 apresentou atividade
bactericida, com CBM de 125 µg/mL para Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.
Avaliando os compostos isolados, tanto o espatulenol como o poligodial apresentaram CBM
de 125 µg/mL frente ao Bacillus cereus.
Atualmente, em face do aumento da prevalência de pacientes imunossuprimidos,
principalmente associado à AIDS, é de fundamental importância a utilização de agentes
bactericidas, visto que, com a imunodeficiência instalada, o uso de agentes bacteriostáticos
pode levar à falha terapêutica (PICÃO; XAVIER; GALES, 2009).
Cabe ressaltar que o conceito de agente bactericida é dose-dependente, isto é, qualquer
agente essencialmente
bacteriostático tornar-se-à bactericida quando em
concentrações (TAVARES, 2000).
elevadas
47
5.1.3 Atividade anti-Helicobacter pylori
A erradicação do H. pylori é importante para acelerar a cicatrização e diminuir a
possibilidade de recidivas de úlceras pépticas. Os regimes habituais de tratamento apresentam
várias limitações, como custo elevado, contra-indicações, vários efeitos colaterais, diminuindo
a adesão do paciente ao tratamento. Aliado à este fato, a emergência de cepas resistentes aos
antibióticos utilizados na rotina, diminui as opções disponíveis para tratamento (ALI et al.,
2005).
Em estudos anteriores, o atividade anti-úlcera do poligodial e compostos relacionados
foi investigada e confirmada, utilizando o modelo experimental de úlcera induzida pelo etanol
(MATSUDA et al., 2002). Vários estudos tem demonstrado a atividade antibacteriana de
plantas medicinais, porém poucos avaliaram a atividade frente ao H. pylori (SOUZA et al.,
2009). Um dos objetivos deste estudo foi avaliar a atividade in vitro de extratos, frações e
compostos puros extraídos de D. brasiliensis.
Os resultados de CIM frente ao H. pylori estão listados na tabela 4:
Tabela 6 – Concentração inibitória mínima (µg/mL) dos componentes de Drimys brasiliensis
frente ao Helicobacter pylori
Componente
CIM (µg/mL)
Extrato cascas CH2Cl2
1000
Fração E
500
Fração G2
500
Espatulenol
500
Poligodial
250
1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial
500
Considerando os extratos brutos de D. brasiliensis, apenas o extrato diclorometano das
cascas apresentou atividade contra o H. pylori, conforme mostra a Tabela 4. Os componentes
com CIM superior a 1000 µg/mL não foram apresentados na tabela, por serem considerados
inativos. Dentre as frações obtidas do extrato diclorometano das cascas, apenas a G2 e E
apresentaram CIM de 500 µg/mL. Da mesma forma, os compostos isolados apresentaram
atividade, sendo o poligodial com melhor resultado (CIM 250 µg/mL). Entretanto, os
compostos espatulenol e 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial também demonstraram ação
48
sobre o H. pylori. É importante salientar que, como no extrato bruto vários compostos estão
presentes, há a possibilidade de ocorrer ações sinérgicas entre os compostos, podendo
acarretar no aumento da atividade contra o H. pilory.
Por se tratar de uma bactéria Gram-negativa, a composição do envelope celular
dificulta a ação de agentes antimicrobianos. O pH ácido, a adesão da bactéria à mucosa
gástrica, o aumento da resistência aos antibióticos e o processo inflamatório crônico são
outros fatores limitantes da terapêutica antimicrobiana (LY et al., 2005).
Outras pesquisas tem demonstrado a ação gastroprotetora dos componentes dos
extratos de Drimys brasiliensis, em particular do poligodial (CUNHA et al., 2001;
MATSUDA et al., 2002). A presença da atividade gastroprotetora, anti-ínflamatória e antiHelicobacter deste composto e de outros compostos isolados podem justificar o uso popular
desta planta medicinal. Avaliação farmacológica in vivo torna-se fundamental para a
avaliação do potencial terapêutico deste produto natural.
5.1.4 Atividade anti-Mollicutes
Os micoplasmas são micro-organismos de crescimento lento e nutricionalmente
exigentes, dificultando seu cultivo in vitro. Tais características explicam a escassez de
trabalhos avaliando a atividade de produtos naturais contra estas bactérias (MURAINA;
PICARD; ELOFF, 2009).
As cepas de U. urealyticum, M. hominis e M. arginini foram utilizadas para verificar a
atividade anti-Mollicutes. Como os micoplasmas são desprovidos de parede celular, não
turvam os meios de cultura. O crescimento bacteriano pode ser evidenciado através da
mudança de cor do meio líquido, de amarelo para vermelho, conforme demonstra a Figura 7.
49
Figura 7 - Microdiluição em caldo de extratos e frações de Drimys brasiliensis utilizando
Ureaplasma urealyticum.
Legenda: 1 – Fração F4; 2 – Fração G; 3 – Fração G2; 4 – Fração F6; 5 – Fração G3; 6 –
Fração B; 7 – Fração D; 8 – Fração G5; 9 - Fração E; 10 – Fração C; 11 – Fração H; 12 –
Fração F5; 13 – Extrato Caule MeOH; 14 – Extrato Cascas CH2Cl2 ; 15 – Extrato Folhas
MeOH; 16 – Extrato Folhas CHCl3; 17 – Extrato Cascas MeOH; C- - Controle Negativo,
Sem crescimento microbiano; C+ - Controle Positivo, com crescimento microbiano.
Dentre os extratos avaliados, somente o de cascas de diclorometano apresentou
atividade contra as 3 espécies de Mollicutes. Da mesma forma, entre as frações, a G2
apresenta a melhor atividade dentre todos os compostos testados, com CIM para U.
urealyticum de 15,62 µg/mL. Os resultados obtidos frente às espécies de M. hominis e M.
arginini não demonstraram atividade promissora, com CIM de 125 µg/ml na fração G2 para
ambas as bactérias. Todos os resultados estão demonstrados na tabela 5.
50
Tabela 7 – Concentração inibitória mínima (µg/mL) dos extratos e frações de D. brasiliensis
frente a 3 espécies de Mollicutes.
Componente
U. urealyticum
M. hominis
M. arginini
125
500
500
Extrato caule MeOH
>1000
>1000
>1000
Extrato cascas MeOH
1000
>1000
>1000
Extrato folhas MeOH
>1000
>1000
>1000
Extrato folhas CHCl3
>1000
>1000
>1000
Fração B
>1000
>1000
1000
Fração C
>1000
>1000
1000
Fração D
>1000
1000
1000
Fração E
125
250
250
Fração F4
250
500
250
Fração F5
500
1000
500
Fração F6
125
500
500
Fração G
31,25
250
250
Fração G2
15,62
125
125
Fração G3
125
500
500
Fração G5
125
500
500
Fração H
500
1000
500
Extrato cascas CH2Cl2
Legenda: U. urealyticum: Ureaplasma urealyticum; M. hominis: Mycoplasma hominis; M.
arginini: Mycoplasma arginini
Comparando os resultados obtidos de CIM das frações G2 e G para U. urealyticum
com antibióticos largamente utilizados na prática clínica, como o ciprofloxacino, verifica-se
que o CIM descrito para o ciprofloxacino de 8 µg/mL (WAITES; CRABB; DUFFY, 2008) é
muito próximo ao obtido com as frações supra citadas. Cabe salientar que, com o isolamento e
identificação dos compostos biologicamente ativos, existe a possibilidade de utilização de
substâncias com atividade biológica ainda mais importante.
O estudo etnodirigido pode facilitar a descoberta de novos agentes com propriedades
anti-mollicutes. Devido ao uso popular de D. brasiliensis em infecções que possam ser
causadas por bactérias desta classe, a atividade demonstrada nesse estudo justifica o uso
popular deste produto natural (CRUZ; SILVA, 1973; CECHINEL-FILHO et al., 1998;
MALHEIROS et al., 2003), sendo entretanto necessária a realização de testes para avaliação
da toxicidade destes compostos.
51
5.2 Bioautografia
A bioautografia é um método útil para a localização de substâncias com ação
antimicrobiana em um cromatograma de um extrato ou fração complexa de produtos naturais.
Isto permite o isolamento biodirecionado de substâncias ativas (DE SOUZA et al., 2003;
HAMBURGER; CORDELL, 1987).
Ensaios preliminares de atividade antimicrobiana de D. brasiliensis demonstraram a
atividade biológica somente do extrato diclorometano de cascas, sendo os extratos
diclorometano e mtanólico de folhas, o extrato metanólico de cascas e caule considerados
inativos. Foram utilizadas as bactérias Escherichia coli, como representante das Gramnegativas, e Staphylococcus aureus, representando as Gram-positivas. O extrato demonstrouse ativo somente contra Staphylococcus aureus, sendo este micro-organismo utilizado nos
outros ensaios bioautográficos.
Com o intuito de facilitar a identificação dos compostos isolados com atividade
antimicrobiana, realizamos a bioautografia do extrato clorofórmico de cascas de D.
brasiliensis.
Foi utilizado o sistema eluente representado na Figura 5, preparado com hexano e
acetato de etila (9:1), apresentando um bom resultado, pois conseguiu separar as substâncias
ativas.
Figura 5 - Bioautograma do extrato clorofórmico de cascas utilizando como sistema eluente
hexano e acetato de etila (9:1)
52
A bioautografia também foi utilizada para triagem das frações com atividade
antimicrobiana. A Figura 6 demonstra a atividade das frações D, E e G2, utilizando um
padrão de poligodial para avaliar a presença deste composto, comparando-se os perfis de
índices de retenção (rf). Como pode ser observado, na fração E o poligodial apresentou ação
preponderante, sendo que na fração G2 outros compostos também estão contribuindo para a
atividade biológica.
Os ensaios bioautográficos, apesar de qualitativos, são uma ferramenta importante no
auxilio para o isolamento e identificação dos compostos com atividade antimicrobiana.
Figura 6 – Bioautograma de frações D, E e G2, com o composto poligodial como padrão
(eluente hexano: acetato de etila 9:1).
5.3 Ensaio de toxicidade (Artemia salina)
Para avaliação dos extratos e frações da Drimys brasiliensis, utilizou-se o parâmetro
da CL50, que foi determinado pela análise de Próbitos, e definido como a concentração
necessária para causar a morte das larvas da Artemia salina em 24 horas.
53
Os critérios estabelecidos para a avaliação foram CL50 acima de 250 μg/mL são
considerados com baixa toxicidade, entre 80 e 250 μg/mL moderamente tóxicos e CL50 menor
que 80 μg/mL considerados tóxicos (PARRA et al., 2001).
Estudos de toxicidade auxiliam na triagem de uma grande variedade de compostos
com atividade biológica para definir seu potencial de aplicação terapêutica mensurando a
toxicidade apresentada dos possíveis futuros fármacos (CARBALLO et al., 2002).
Na Tabela 6 estão demonstradas todas as CL50 dos extratos e frações de D.
brasiliensis:
Tabela 8 – Concentração letal 50% (µg/mL) frente a Artemia salina dos extratos e frações de
Drimys brasiliensis.
Componente
CL50
Extrato folhas CH2Cl2
> 1000
Extrato folhas MeOH
> 1000
Extrato cascas MeOH
486,07 ± 122,41
Extrato cascas CH2Cl2
27,51 ± 4,82
Extrato caule MeOH
> 1000
Fração B
209,03 ± 21,4
Fração C
577,15 ± 68,3
Fração D
44,57 ± 8,9
Fração E
25,29 ± 6,4
Fração F
NR
Fração F4
> 1000
Fração F5
609,05 ± 71,5
Fração F6
51,3 ± 14,6
Fração G
218 ± 27
Fração G2
139,7 ± 19,5
Fração G3
431,06 ± 45,87
Fração G5
472,3 ± 51,3
Fração H
141,24 ± 17.6
Legenda: NR: não realizado
Como pode ser observado, o extrato diclorometano de cascas apresentou uma elevada
toxicidade, com CL50 de 27,51 μg/mL. Dentre as frações com maior atividade antibacteriana,
constatou-se que a fração G2, com CL50 de 139,7 μg/mL, apresenta moderada toxicidade. A
fração E, por sua vez, foi considerada tóxica pois sua CL50 foi de 25,29 μg/mL.
54
Os resultados do ensaio de toxicidade mostram que há componentes em D. brasiliensis
que matam as larvas de A. salina em baixas concentrações. Entretanto, a toxicidade em A.
salina não pode ser diretamente extrapolada para a toxicidade no homem, visto que o homem
e outros mamíferos tem meios fisiológicos para eliminar substâncias tóxicas (OKOLI;
IROEGBU, 2004).
Além disso, os resultados obtidos neste bioensaio podem conduzir a novos estudos,
visto que esta avaliação de citotoxicidade está relacionada com possível atividade contra as
células tumorais, quando os valores de CL50 forem inferiores a 250 μg/mL (SIQUEIRA et al.,
1998).
A citotoxicidade de drimanos sesquiterpenóides constituintes do gênero Drimys já foi
demonstrada, como o poligodial (JANSEN; GROOT, 1991), porém tal composto
nãoapresentou mutagenicidade segundo o teste de Ames. Estudos toxicológicos in vivo e
testes de genotoxicidade são fundamentais para uma avaliação mais criteriosa do potencial de
toxicidade desta planta.
55
6. CONCLUSÕES
 Através dos ensaios de bioautografia das frações, foi possível identificar quais
compostos exerciam a atividade biológica, orientando a fitoquímica no isolamento
destes compostos.
 O extrato diclorometano de cascas de Drimys brasiliensis e os compostos espatulenol,
poligodial e 1-β-(p-metoxicinamoil)-poligodial apresentaram promissora atividade
inibitória contra as bactérias Gram-positivas (CIM entre 31,25 e 250 µg/mL), mas
foram inativos contra as Gram-negativas.
 Alguns componentes de D. brasiliensis foram capazes de inviabilizar a célula
bacteriana de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Bacillus cereus, com
CBM entre 125 e 1000 µg/mL
 Dentre todos os componentes de D. brasiliensis testados, o poligodial que demonstrou
melhor atividade contra Helicobacter pylori, com CIM de 250 µg/mL.
 Verificou-se atividade da fração G2 frente a Ureaplasma urealyticum, com CIM de
15,62 µg/mL, valor muito próximo aos antimicrobianos utilizados na terapêutica.
 Tanto o extrato diclorometano de cascas como as frações com maior atividade
antibacteriana, G2 e E, apresentaram elevada toxicidade sobre o microcrustáceo
Artemia salina, devendo ser avaliadas posteriormente quanto a sua possível atividade
antitumoral.
56
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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