Volume 10 - número 2 - Ano 2014
ISSN 1808-9909
Volume 10, n. 2, 2014
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 10, n. 2, p. 21-46, 2014
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”, publicada semestralmente pela
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP), divulga
artigos científicos da área de cultura de tecidos de plantas por membros da comunidade científica
nacional e internacional.
PERMUTA
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” deseja fazer permuta com revistas de áreas
afins.
ABCTP
Universidade Federal de Lavras – Departamento de Biologia
Setor de Fisiologia Vegetal – Caixa Postal: 3037 – Lavras – MG – CEP 37200-000
www.abctp.ufla.br
FICHA CATALOGRÁFICA
Plant Cell Culture & Micropropagation = Cultura de Células &
Micropropagação de Plantas. – v. 1, n. 1 (jan./jun. 2005)- .–
Lavras : Ed. UFLA, 2005v. il.
Semestral (junho e dezembro).
Publicação Científica da Associação Brasileira de Cultura de Tecidos
de Plantas (ABCTP)
ISSN 1808-9909
1. Cultura de Tecido de Plantas. I. Associação Brasileira de Cultura
de Tecidos de Plantas. II. Universidade Federal de Lavras. Departamento
de Biologia. Setor de Fisiologia Vegetal.
CDD (22a ed.) 580.72405
INDEXADO por:
AGRIS
AGROBASE
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Editor Chefe
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Conselho Editorial
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Editoração Eletrônica
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Simone de Souza Costa Simão – Editora UFLA
Consultoria científica (v.10, n.2, 2014)
Ana Silva Ledo – Embrapa Tabuleiros Costeiros
Raírys Cravo Herrera – UFPA
Paulo Augusto Alemida Santos – UFOPA
José Eduardo Brasil Pereira Pinto – UFLA
Diogo Pedrosa Correia da Silva – UFLA
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
1. Enraizamento in vitro e aclimatização do porta-enxerto de ameixeira ‘MR. S. 2/5’.
In vitro rooting and aclimatization of ‘MR. S. 2/5’ plum rootstock.
Elizete Beatriz Radmann, Cibele Merched Gallo, Cristina Weiserritterbusch, Valmor João Bianchi, Juliana
Aparecida Fernando, José Antonio Peters ............................................................................................................
21
2. Protocolo para produção de plantas duplo-haplóides de genótipos de arroz da subespécie Indica pela
cultura de anteras.
Protocol for double haploid rice production of Indica subespecie by anther culture.
Gilmar Roberto Zaffari, Klaus Konrad Scheuermann, Rubens Marschalek, Dilnei Souza Medeiros, Alexander
de Andrade ............................................................................................................................................................
32
3. Callus induction in leaf explants of Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis.
Indução de calos em explantes foliares de Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis.
Maurício Reginaldo Alves dos Santos, Josilene Félix da Rocha, Eloísa Santana Paz, Caroline Vivian Smozinski,
Wanessa de Oliveira Nogueira, Milene de Castro Melo Guimarães ....................................................................
41
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 10, n. 2, p. 21-46, 2014
Enraizamentoine aclimatização
do porta enxerto...
ENRAIZAMENTO
vitro E ACLIMATIZAÇÃO
DO
PORTA-ENXERTO DE AMEIXEIRA ‘MR. S. 2/5’
21
In vitro ROOTING AND ACLIMATIZATION OF ‘MR. S. 2/5’ PLUM ROOTSTOCK
Elizete Beatriz Radmann1, Cibele Merched Gallo2, Cristina Weiser Ritterbusch3,
Valmor João Bianchi4, Juliana Aparecida Fernando4, José Antonio Peters4
Prof. Adjunto, UNIPAMPA, Campus Itaqui, Rua Luiz Joaquim de Sá Britto, s/n, Bairro Promorar, Cep. 97650-000. E-mail:
[email protected]
2
Doutoranda do curso de Fisiologia Vegetal da UFLA. E-mail: [email protected]
3
Mestranda do curso de Fisiologia Vegetal da UFPel. E-mail: [email protected]
4
Prof. Adjunto, Dep. de Botânica, Instituto de Biologia, UFPel. E-mails: [email protected], [email protected],
[email protected]
1
RESUMO:
O porta-enxerto ‘Mr. S 2/5’ é propagado comercialmente
na Europa apresentando importantes características agronômicas,
porém, por ser um híbrido pentaplóide, não é produzido por meio
de sementes, necessitando assim que a propagação seja feita via
assexuada.Objetivou-seavaliar o efeito da concentração de AIB e
do tempo de permanência de brotações no meio de cultura, sobre
o enraizamento e a sobrevivência destas na fase de aclimatização.
Brotações com 1,5 cm foram cultivadas em meio MS com metade
da concentração dos sais, com diferentes concentrações de AIB
(0,0; 0,8; 1,6; 3,2 e 6,4 mg L-1). Após ter estabelecido a melhor
concentração de AIB, conduziu-se o segundo experimento,
no qual foi avaliado o tempo de permanência (5, 6, 8, 12 e 14
dias) dos explantes no meio MS com metade da concentração
de sais, suplementado com 1,6 mg L -1 de AIB. Brotações
cultivadas em meio de cultura com 1,6 mg L-1 de AIB por 12
dias, apresentaram porcentagem de enraizamento superior a
85%, e maior porcentagem de plantas sobreviventes na fase de
aclimatização foi de 95%.
Termos para indexação: prunus cerasifera x Prunus spinosa,
raiz, sobrevivência, AIB.
ABSTRACT:
The plum rootstock ‘Mr. S 2/5´ is propagated
commercially in Europe presenting important agronomic traits,
however, as a hybrid pentaploid, it is not produced by seed, thus
requiring that the the propagation is mainly asexual.This work
aimed to evaluate the effects of IBA concentration and the time
shoots remain in the culture medium on rooting and their survival
during the acclimatization stage. Firstly, shoots with 1.5 cm
were cultivated in MS medium with half of salt concentration
and different IBA concentration (0.0, 0.8, 1.6, 3.2 and 6.4 mg
L-1). After establishing the best IBA concentration, the second
trial was carried out by evaluating the time (5, 6, 8, 12 and 14
days) the explants remained in MS medium with half of the
salt concentration, supplemented with 1.6 mg L-1 IBA. Shoots
cultivated in a culture medium with 1.6 mg L-1 IBA for 12 days
presented rooting percentage higher than 85%, and the highest
percentage of plants that survived during acclimation was 95%.
Index terms: prunus cerasifera x Prunus spinosa, root,
survival, IBA.
INTRODUÇÃO
O enraizamento e a aclimatização do material
cultivado in vitro muitas vezes é um fator limitante
no processo da micropropagação de plantas lenhosas
(BASTOS et al., 2007; BORGES et al., 2012),
principalmente em Prunus spp. (DUVAL et al. 2013). A
indução e a formação de raízes adventícias são importantes
para a posterior transferência das plantas às condições ex
vitro para aumentar a sobrevivência das plantas nessa fase
(KRISAN, et al., 2007).
Para promover a indução de raízes e melhorar o
sistema radicular formado, geralmente os meios de cultura
são acrescidos de auxina (LIU et al., 2013; SAINI et al.,
2013). Neste processo as auxinas mais utilizadas são o
ácido indolbutírico (AIB), o ácido naftaleno acético (ANA)
e o ácido 3-indolacético (AIA) (SANTOS-SEREJO et al.,
2006). Dentre elas, o AIB tem sido eficiente na indução de
raízes adventícias em uma grande variedade de espécies
frutíferas (RADMANN et al., 2003; ROGALSKI et al.,
2003a; COSTA et al., 2008; SCHMILDT et al., 2010),
porém uma concentração excessiva no meio de cultura
pode ser tóxica, favorecendo a formação de calos na base
das brotações, comprometendo a rizogênese, o crescimento
da parte aérea, como também a sobrevivência das plantas
na fase de aclimatização (RADMANN et al., 2002).
(Recebido em 5 de setembro de 2014 e aprovado em 1 de novembro de 2014)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
22
RADMAN, E. B. et al.
No Brasil, alguns trabalhos realizados com o
gênero Prunus demonstraram que a adição do AIB no
meio de enraizamento tem sido eficiente para promover
acréscimo na porcentagem de enraizamento (COUTO et
al., 2003; ROGALSKI et al., 2003a; VIAGANÓ et al.,
2007), bem como o número de plantas sobreviventes após
a transferência para as condições ex vitro (ROGALSKI et
al., 2003b), porém, segundo estes autores a concentração
ótima de AIB varia com a cultivar.
Além da concentração de auxina adicionada
ao meio de enraizamento, o tempo de exposição dos
explantes no meio de cultura também pode ser decisivo
para o desenvolvimento do sistema radicular (Negash
et al., 2000). O aumento do tempo de permanência das
brotações enraizadas em meio de cultivo pode torná-las
menos funcionais, podendo levar ao envelhecimento das
raízes, prejudicando a sobrevivência quando estas plantas
copa e produção precoce, rápido crescimento e raízes
profundas, induzindo boa atividade vegetativa ainda
nos primeiros anos após a implantação, porém por ser
um híbrido pentaplóide, não é produzido por meio de
sementes (LORETI et al., 1998), necessitando assim que
a propagação seja feita via assexuada.
MATERIAL E MÉTODOS
As brotações do porta-enxerto‘Mr.S. 2/5’
(Prunus cerasifera x Prunus spinosa) utilizadas para
os experimentos de enraizamento foram incialmente
estabelecidas in vitro a partir de segmentos nodais em
meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) sem regulador
de crescimento, e posteriormente multiplicadas em meio
MS com 0,5 mg L-1 de BAP e 0,01 mg L-1 para a obtenção
de material vegetal para a condução dos experimentos de
enraizamento.
são aclimatizadas (PEREIRA; FORTES, 2001). Além
Experimento 1 - Efeito das concentrações do AIB
disso, raízes mais longas também podem prejudicar a
Com objetivo de identificar a melhor concentração
de AIB no enraizamento in vitro e na aclimatização,
brotações apicais com aproximadamente 1,5 cm, oriundos
de multiplicações prévias, foram transferidos para meio
MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), contendo mioinositol (100 mg L-1), sacarose (30 g L-1), ágar (7 g L-1),
sem regulador de crescimento. Quinze dias após, estes
explantes foram transferidos para meio de enraizamento,
constituído pelo meio MS com metade da concentração
de sais, mio-inositol (100 mg L-1), sacarose (30 g L-1),
ágar (7 g L-1) e AIB nas seguintes concentrações (0,0; 0,8;
1,6; 3,2 e 6,4 mg L-1). Após a inoculação dos explantes,
os frascos contendo os meios foram transferidos para
sala de crescimento, com temperatura de 23°C ± 2°C,
permanecendo por cinco dias no escuro e sete dias em
fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo luminoso
de 38μmol m-2s-1.
Ao final dos 12 dias de cultivo em meio
de enraizamento, avaliaram-se, porcentagem de
enraizamento, número e comprimento de raízes.
Posteriormente, todas as brotações foram transferidas
para bandejas plásticas com tampa com capacidade de
aclimatização das brotações pelo enovelamento destas.
Segundo Mercier (2004), a formação de raízes adventícias
ocorre de uma a três semanas, e o processo pode ser
dividido em três fases, ou seja, indução, iniciação e
alongamento das raízes, sendo cada fase influenciada pela
concentração de auxina e o tempo de exposição a este
regulador de crescimento.
Considerando que no Brasil poucos foram os
trabalhos conduzidos com porta-enxertos de Prunus
visando estudar tais efeitos na fase de aclimatização,
este trabalho teve como objetivo avaliar a influencia da
concentração de AIB e do tempo de permanência das
brotações no meio de cultura, sobre o enraizamento e
a aclimatização de plantas do porta-enxerto de ‘Mr.
S 2/5’.Este porta-enxerto foi selecionado na Itália
e tem origem incerta, sendo um híbrido que possui
características como resistência a asfixia radicular,
ao calcárioe a Agrobacterium tumefaciens. Além
disso, este porta-enxerto é propagado comercialmente
na Europa apresentando importantes características
agronômicas como à indução de baixo vigor na cultivar
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
Enraizamento e aclimatização do porta enxerto...
um litro, contendo vermiculita de granulometria média,
sendo estas mantidas por 30 dias em casa de vegetação
com temperatura de 28°C e umidade relativa de 80%.
Após trinta dias de aclimatização, foram avaliados o
comprimento da maior raiz, comprimento da parte aérea
e porcentagem de sobrevivência.
O experimento foi conduzido em delineamento
completamente casualizado, com cinco tratamentos (0,0;
0,8; 1,6; 3,2 e 6,4 mg L-1de AIB) e seis quatro repetições
contendo cinco brotações cada. Os dados obtidos durante o
cultivo in vitro foram analisados por regressão polinomial,
utilizando o programa WinStat 2.0 (Machado;
Conceição, 2003), e os dados da aclimatização
analisados de forma descritiva.
Experimento 2 - Influência do tempo de cultivo no
meio de enraizamento
Visando identificar o melhor tempo de cultivo
in vitro em meio de enraizamento, na rizogênese e na
aclimatização do porta-enxerto Mr. S. 2/5, brotações
apicais com aproximadamente 1,5 cm, cultivadas nas
mesmas condições do experimento anterior foram
inoculadas no meio MS com metade da concentração de
sais, suplementado com AIB (1,6mg L-1), mio-inositol
(100 mg L-1), sacarose (30 g L-1) e ágar (7 g L-1). Após
a inoculação, as brotações foram mantidas em sala de
crescimento, com temperatura de 23±2°C, por diferentes
tempos em fotoperíodo de 16 horas: [tratamento 1: 5
dias no escuro (5 dias); tratamento 2: 5dias de escuro
+ 1 dia com fotoperíodo (6 dias); tratamento 3: 5 dias
de escuro + 3 dias com fotoperíodo (8 dias); tratamento
4: 5 dias de escuro + 7 dias com fotoperíodo (12 dias);
tratamento 5: 5 dias de escuro + 9 dias com fotoperíodo
(14 dias)].
Ao final de cada período de cultivo em meio
de enraizamento foram avaliados a porcentagem
de enraizamento, a porcentagem de indução de
primórdios radiculares, número de raiz por brotação e
comprimento de raiz, sendo a indução de primórdios
radiculares caracterizada pela formação de protuberâncias
esbranquiçadas na base dos explantes. Adicionalmente,
23
foram realizados cortes anatômicos da base das brotações
com objetivo de avaliar o desenvolvimento do sistema
radicular.
Para as análises anatômicas, as brotações
foram coletadas, fixadas em solução de Karnovsky
(KARNOVSKY, 1965, modificado com a utilização de
tampão fosfato pH 7,2), desidratadas em série etílica
ascendente e infiltradas em resina plástica (Leica
Historesin®). As amostras foram seccionadas em
micrótomo rotativo manual (ANCAP) com navalha
descatável (Feather). As secções com 5 µm de espessura
foram coradas com azul de toluidina 0,05% (SAKAI,
1973) em tampão fosfato e citrato (McILVAINE, 1921) pH
4,5 e montadas em resina sintética “Entellan” (Merck®).
O experimento foi conduzido da mesma forma que
o anterior. Os dados obtidos durante o cultivo in vitro foram
analisados por regressão polinomial, utilizando o programa
WinStat 2.0 (Machado; Conceição, 2003).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O enraizamento foi afetado significativamente
pelas concentrações de AIB. Quando não se utilizou AIB
não houve formação de raízes (Gráfico 1), indicando a
necessidade deste regulador para a formação do sistema
radicular.
Estes resultados corroboram com os obtidos por
outros autores, que apontam a necessidade da utilização
de auxina no meio de cultura para induzir a formação
e a iniciação de raízes adventícias em porta-enxertos
de Prunus (COUTO et al., 2003; FOTOPOULOS;
SOTIROPOULOS, 2005; VIAGANÓ et al., 2005;
MANSSERI-LAMRIOUI et al., 2011),estes autores
observaram a não formação de raízes ou porcentagem
de enraizamento muito baixa, aproximadamente 5%,
em meio de cultura sem AIB.Entretanto, é necessário
ajustar a melhor concentração de auxina para obtenção
de um sistema radicular funcional e uniforme para que se
alcance elevada porcentagem de sobrevivência na fase de
aclimatização (SANTOS-SEREJO et al., 2006; COSTA et
al., 2008; SCHMILDT et al., 2010).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
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RADMAN, E. B. et al.
GRÁFICO 1 – Porcentagem de enraizamento obtido com o porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, cultivado por 12 dias em meio
de enraizamento com diferentes concentrações de AIB. As barras no gráfico indicam o erro padrão.
Para a porcentagem de enraizamento, embora
se obteve uma resposta quadrática, com o ponto de
máxima estimado na concentração de 4,48 mg L-1 de
AIB (91.46%), verificou-se um porcentual absoluto
de enraizamento similar a este, na concentração de 1,6
mg L-1 de AIB (95%) (Gráfico 1). Apesar de não ter
sido observado desenvolvimento de raízes em todas as
brotações, para aquelas que não apresentaram raízes
visíveis, pôde-se verificar a indução de primórdios
radiculares em todos os tratamentos contendo auxina,
sendo estes caracterizados como protuberâncias
esbranquiçadas na base das brotações. Além disso, nas
concentrações mais altas (3,2 e 6,4 mg L-1 de AIB) houve
a formação de calo na base do explante. Segundo Pedrotti;
Voltolini (2001) quando a concentração de auxina no
meio é excessiva, esta pode ser tóxica, induzindo a
formação de calo e comprometendo a formação de
raízes. Este fato pode explicar a menor porcentagem de
enraizamento obtidas nas concentrações mais altas em
comparação a 0,8 mg L-1 de AIB.
Quanto ao número de raízes, a resposta quadrática
inferiu ponto de máxima em 3,8mg L-1 de AIB, ou seja,
aproximadamente de 7,5 raízes por brotação (Gráfico 2).
Já, raízes formadas a partir 3,2 mg L-1 de AIB,
conforme relatado anteriormente apresentaram a formação
de calo na base dos explantes e raízes fibrosas, sendo
estas características não apropriadas para a fase de
aclimatização (RADMANN et al., 2002). Portanto, entre
as concentrações testadas, 1,6 mg L-1 de AIB apresentou
as melhores respostas, pois além da formação de raízes
sem presença de calo, o número de raízes formadas nesta
concentração é apenas 0,5 raízes menor que nos explantes
cultivados com 3,2 mg L-1 de AIB. Estes resultados estão
condizentes com o efeito das auxinas durante a rizogênese,
visto que, estas aumentam o enraizamento e melhoram a
qualidade do sistema radicular para aquelas espécies que
apresentam dificuldade durante este processo até uma
determinada concentração.
Omaior comprimento de raiz foi encontrado em
brotações provenientes do meio contendo 0,8 mg L-1 de
AIB, 0,75 cm (Gráfico 3).
O maior comprimento de raiz observado na menor
concentração de AIB testada pode ser explicado pela
influencia da auxina na indução e no crescimento das
raízes, pois a presença da auxina é necessária para a fase
de indução, conforme se aumenta a concentração, diminui
o comprimento das raízes, ou seja, segundo Mercier
(2004) a concentração de auxina durante o enraizamento
é diferente de acordo com a etapa organogenética, sendo
esta necessária na fase de indução radicular, porém, a
concentração incialmente favorável a indução pode reduzir
ou inibir o crescimento da mesma.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
Enraizamento e aclimatização do porta enxerto...
25
GRÁFICO 2 – Número de raízes obtido por brotação com o porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, cultivado por 12 dias em meio
de enraizamento com diferentes concentrações de AIB. As barras no gráfico indicam o erro padrão.
GRÁFICO 3 – Comprimento de raiz obtido com o porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, cultivado por 12 dias em meio de
enraizamento com diferentes concentrações de AIB. As barras no gráfico indicam o erro padrão.
Quando se compara as concentrações de AIB durante
o período de aclimatização pode-se observar, que brotações
cultivadas em meio de enraizamento com 1,6 mg L-1 de AIB,
apresentaram maior porcentagem de aclimatização (95%)
(Tabela 1) e maior comprimento de parte aérea (média de
6,7 cm) (Gráfico 4), porém, o comprimento da maior raiz
foi observado nas plantas oriundas de meio contendo 0,8
mg L-1 de AIB, média de 11 cm, ou seja acompanhando o
resultado obtido in vitro (Gráfico 4).
Estes resultados mostram a dependência
da indução do enraizamento in vitro na fase de
aclimatização do porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, pois
brotações oriundas de meio sem AIB não sobreviveram
após o transplantio para as condições ex vitro. Segundo
Campana et al. (1994), Rogalski et al. (2003b) e
Bandeira et al. (2012) a adição de auxina no meio de
enraizamento tem sido eficiente, promovendo acréscimo
na sobrevivência de cultivares de Prunus na fase
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
26
RADMAN, E. B. et al.
de aclimatização. No entanto, estes autores também
verificaram que concentrações excessivas favorecem
a formação de raízes fibrosas e de calo, prejudicando
a sobrevivência das plantas nesta fase. De acordo com
Santos-Serejo (2006), a formação de raízes fibrosas
podem interferir na funcionalidade do sistema radicular,
comprometendo assim a aclimatização das plantas,
justificando desta forma a redução na porcentagem de
sobrevivência, conforme observado naquelas brotações
cultivadas em meio com 3,2 e 6,4 mg L-1.
Portanto, amaior sobrevivência de plantas e o
maior crescimento da parte aérea observada naquelas
provenientes do meio com 1,6 mg L-1, possivelmente
esta associado a maior porcentagem de explantes
enraizados e ao tipo de raiz formada. No entanto,
a concentração ótima pode variar de acordo com a
cultivar, resultados estes confirmados por Rogalskiet
al. (2003b), os quais obtiveram maior sobrevivência
com os porta-enxertos de Prunus ‘Capdeboscq’ (92%)
e ‘VP411’ (84%), quando estes foram cultivados em
meio de enraizamento com 1,0 mg L-1 e 0,1 mg L-1 de
AIB, respectivamente.
Já, o maior comprimento da raiz observado para
aquelas plantas provenientes de meio com a menor
concentração de AIB (0,8 mg L-1) possivelmente esta
associado ao maior comprimento já observado durante o
cultivo in vitro.
Com relação ao desenvolvimento do sistema
radicular in vitro, aos seis dias de cultivo houve o início
na formação de raízes, com 30% dasbrotações com raízes
visíveis e 25% com indução de primórdios radiculares
(Tabela 2). As maiores respostas para a porcentagem
de enraizamento foram observadas com 12 e 14 dias de
cultivo in vitro, com 95 e 90% de brotações enraizadas,
respectivamente, diferindo significativamente dos demais
tratamentos. Embora não tenha ocorrido desenvolvimento
de raízes visíveis em todas as brotações cultivadas em
meio de enraizamento até 12 e 14 dias de cultivo, pode-se
observar a indução de primórdios radiculares nas demais
brotações destes tratamentos (Tabela 2).
Tabela 1 – Porcentagem de sobrevivência de plantas do porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, após 30 dias de aclimatização,
provenientes de cultivo in vitro em diferentes concentrações de AIB.
AIB (mg L-1)
0
0,8
1,6
3,2
6,4
Porcentagem de sobrevivência
0
40
95
10
20
Gráfico 4 – Comprimento da maior raiz e da parte aérea de plantas do porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, após 30 dias de
aclimatização, provenientes de cultivo in vitro com diferentes concentrações de AIB. As barras no gráfico indicam o
erro padrão.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
Enraizamento e aclimatização do porta enxerto...
27
Tabela 2 – Porcentagem de protuberâncias esbranquiçadas, porcentagem de enraizamento, número de raízes por
explante e comprimento de raiz, obtido com o porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, cultivado por diferentes períodos em meio
de enraizamento com 1,6 mg L-1 de AIB.
Cultivo in vitro
(dias)
14
12
8
6
5
Visualização de protuberâncias
esbranquiçadas (%)
0b
10 b
30 a
25 b
20 b
Percentagem de
enraizamento
95 a
90 a
60 b
30 c
0c
Número de raízes
por explante
11.25 a
7.50 a b
3.25 b c
2.50 c
0.00 c
Comprimento
de raiz (cm)
0.85 a
0.67 a
0.35 b
0.10 c
0.00 c
*Médias seguidas por letras distintas na coluna, diferem entre si (Tukey p≤ 0,05).
Com relação ao número e comprimento das raízes
formadas, as respostas foram semelhantes às obtidas com
a porcentagem de explantes enraizados, ou seja, explantes
cultivados por mais tempo (12 e 14 dias) apresentaram os
melhores resultados, com 7,5 e 11,25 raízes por explante,
e 0,67 cm e 0,85 cm, de comprimento, respectivamente
(Tabela 2).
Os resultados obtidos no presente trabalho
comprovam a influência do tempo de exposição das
brotações em meio de enraizamento no desenvolvimento
da rizogênese in vitro. De acordo com Mercier (2004),
a formação de raízes adventícias ocorre de uma a três
semanas, e pode ser dividida em indução, iniciação e
alongamento das raízes, sendo que as duas primeiras etapas
dependem de auxina no meio de cultura, enquanto que o
alongamento pode ser inibido nestas condições in vitro.
Porém, no presente trabalho 14 dias de cultivo in vitro
não foram suficientes a ponto de inibir o alongamento das
raízes, visto que brotações cultivadas em meio durante este
período formaram raízes de maior comprimento.
Durante o período de aclimatização, verificou-se que
brotações cultivadas por 12 dias no meio de enraizamento
apresentaram maior porcentagem de sobrevivência (95%).
Entretanto, brotações cultivadas no meio de enraizamento
por cinco dias não sobreviveram, e brotações cultivadas
em meio por 6, 8 e 14 dias, apresentaram 45, 60 e 40% de
sobrevivência, respectivamente.
Cabe evidenciar que a origemdas raízes adventícias
é endógenae direta, ocorrendo a partir de divisões das
células cambiais e do parênquima do floema, sendo
possível identificar o início de formação dos primórdios
radiculares no sexto dia de cultivo in vitro (Figura 1A).
No 12° dia observou-se o desenvolvimento do primórdio
e o estabelecimento de conexão vascular com o explante
(Figura 1B). Esta origem endógena das raízes adventícias
e a conexão vascular adequada pode indicar o sucesso
na aclimatização do porta-enxerto ‘MR. S. 2/5’, como
observado para Gomphrenama crocephal, micropropagada
na presença de AIB (MOREIRA et al., 2000).
A baixa sobrevivência das plantas cultivadas
por períodos inferiores a 12 dias, pode ser atribuída à
baixa quantidade de reserva para o crescimento ex vitro
(Costa et al., 2008). A avaliação de enraizamento sob
diferentes concentrações de AIB emCalliandra brevipes
mostrou o armazenamento degrânulos de amido na
medula,fator considerado essencial para a formação
de raízes adventícias (Mayeret al., 2008). Importante
considerar que não se observou a presença deste
carboidrato no parênquima medular dos explantes de
‘MR. S. 2/5’ e que, possivelmente, a conexão vascular
entre raiz adventícia e explante ainda não era adequada
nos períodos inferiores a 12 dias de cultivo in vitro
ocasionando baixo índice de sobrevivência. Também
é importante salientar que o sistema radicular pouco
funcional, seja por baixo tempo de indução ou excesso
de exposição ao regulador de crescimento, provoque
uma baixa taxa de absorção de água e resultem na
morte da planta.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
28
RADMAN, E. B. et al.
Figura 1 – Seção transversal do porta-enxerto ‘Mr.S.2/5’ evidenciando o início de formação do primórdio de raiz (A,
seta) (A) e a conexão vascular entre raiz adventícia e o explante (B), aos 6 e 12 dias de cultivo in vitro, respectivamente.
M = medula; Barras: A = 100 µm; B = 200 µm.
Por outro lado, a baixa sobrevivência observada
no material cultivado com 14 dias pode ser devido
apresença de raízes fibrosas e quebradiças, caraterísticas
não apropriadas para a fase de aclimatização (Figura 2).
Estes resultados corroboram com Santos-Serejo
(2006), os quais suportam a hipótese de que a redução do
cultivo em meio de enraizamento pode aumentar e melhorar
a aclimatização de plantas na casa de vegetação. Estes
autores relataram que a maior sobrevivência com a redução
do período de cultivo in vitro esta associada a formação
de raízes mais curtas, sendo estas mais adequadas para o
transplante, pois além de facilitar o manuseio no momento
do transplante, normalmente as raízes estão numa fase de
crescimento ativo, o que facilita o pegamento e o posterior
desenvolvimento ex vitro das plantas. Resultados positivos
quanto a redução do período de permanência em meio de
enraizamento foram também evidenciados por Pereira
e Fortes (2001), os quais verificaram que o transplante
das brotações de macieira mantidas por 12 dias in vitro
possibilitou sobrevivência média superior a 90%.
Após o período de aclimatização, o comprimento
da maior raiz foi observado para as brotações que foram
mantidas por 6 dias no cultivo in vitro, com 10,8 cm,
enquanto que o maior comprimento da parte aérea foi
observado em plantas cultivadas in vitro por 12 dias, com
6,7 cm (Gráfico 5).
O maior comprimento dasraízes observado em
plantas provenientes de cultivo in vitro por seis dias, devese possivelmente, por estas serem mais curtas, favorecendo
o seu crescimento no substrato. Além disso, estas plantas
por apresentarem o menor número de raízes formadas
durante o cultivo in vitro, apresentaram menor competição
entre elas, portanto beneficiando o seu crescimento. O
maior comprimento da parte área das plantas provenientes
de 12 dias de cultivo in vitro, provavelmente esta
associado ao número de raízes formadas e ao tipo de
sistema radicular, possibilitando desta forma uma maior
absorção de água e de nutrientes pelas raízes, favorecendo
o crescimento da parte aérea.
A partir dos resultados obtidos no presente
trabalho, verificou-se que a presença da auxina no meio
de cultura para o enraizamento do porta-enxerto ‘Mr.
S. 2/5’ é fundamental para estabelecer um protocolo
de indução do sistema radicular, visando otimizar o
tempo de enraizamento in vitro, porém sem haver perdas
significativas de plantas na fase de aclimatização.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 21-31, 2014
Enraizamento e aclimatização do porta enxerto...
A
B
C
D
29
E
Figura 2 – Brotações enraizadas do porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’ provenientes de diferentes períodos de cultivo in vitro,
(A) 5 dias, (B) 6 dias, (C) 8 dias, (D) 12 dias e (E) 14 dias.
GRÁFICO 5 – Comprimento da parte aérea e da maior raiz do porta-enxerto ‘Mr. S. 2/5’, obtidos a partir de plantas
que sobreviveram após 30 dias de aclimatização, provenientes de diferentes períodos de cultivo in vitro. As barras no
gráfico indicam o erro padrão.
CONCLUSÃO
De acordo com as condições em que foram
conduzidos os experimentos, pode-se concluir que, o
período de cultivo in vitro por 12 dias contendo 1,6
mg L-1 de AIB é recomendado para o enraizamento e
aclimatização do porta-enxerto‘Mr.S 2/5’.
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32
ZAFFARI,
G. R. et al.
PROTOCOLO PARA
PRODUÇÃO
DE PLANTAS
DUPLO-HAPLÓIDES DE GENÓTIPOS DE ARROZ DA
SUBESPÉCIE Indica PELA CULTURA DE ANTERAS
PROTOCOL FOR DOUBLE HAPLOID RICE PRODUCTION OF
Indica SUBESPECIE BY ANTHER CULTURE
Gilmar Roberto Zaffari1, Klaus Konrad Scheuermann2,
Rubens Marschalek3, Dilnei Souza Medeiros4, Alexander de Andrade5
Eng. Agrônomo, Dr. Fisiologia Vegetal, EPAGRI/Estação Experimental de Itajaí, n. 6800, CP 277, CEP 88.318-112, Itajaí, SC,
[email protected].
2
Eng. Agrônomo, Dr. Fitopatologia, EPAGRI/Estação Experimental de Itajaí, n. 6800, CP 277, CEP 88.318-112, Itajaí, SC,
[email protected].
3
Eng. Agrônomo, Dr. Melhoramento, EPAGRI/Estação Experimental de Itajaí, n. 6800, CP 277, CEP 88.318-112, Itajaí, SC,
[email protected]
4
Téc. Química, EPAGRI/Estação Experimental de Itajaí, n. 6800, CP 277, CEP 88.318-112, Itajaí, SC E-mail: dilneimedeiros@
epagri.sc.gov.br.
5
Eng. Agrônomo, Dr. Genética, EPAGRI/Estação Experimental de Itajaí, n. 6800, CP 277, CEP 88.318-112, Itajaí, SC,
[email protected].
1
RESUMO
A cultura de anteras pode ser utilizada no desenvolvimento
de plantas duplo-haplóides em laboratório com a vantagem de
obter plantas homozigotas em apenas uma geração. O trabalho
teve como objetivo desenvolver um protocolo eficiente de cultura
de anteras para a produção de plantas duplo-haplóides a partir de
híbridos F1 de arroz da subespécie indica. Panículas de arroz no
estádio R2, da cultivar Epagri 109 e dos genótipos SCH-09-1926,
SCH-09-1930, SCH-09-2035, SCH-09-1949, SCH-09-1953,
SCH-09-1954, SCH-09-1960, SCH-09-12000 e SCH-09-2013,
foram utilizadas para avaliar o efeito do horário de coleta da
panícula, a maturidade dos micrósporos da antera e a composição
do meio de cultura sobre a formação de calos e regeneração de
plantas. A maior resposta de formação de calos foi obtida quando
a coleta das panículas ocorreu às 8 horas da manhã e a distância
entre o colar da folha bandeira e a lígula da última folha era de 8
cm. A frequência de formação de calo variou de 1,33 a 6,67% para
a cultivar epagri 109 e de 4 a 18% para os genótipos híbridos F1
e a de regeneração de plantas variou de 1 a 100%, porém ambas
as respostas foram dependentes do genótipo e da composição do
meio de cultura. O protocolo estabelecido, coleta da panícula às
8 horas no estádio de emborrachamento, com 8 cm entre a última
folha e a folha bandeira, anteras cultivadas em meio de cultura
N6 adicionado de 4 mg L-1 ANA e 1 mg L-1 CIN para indução
de calo e no MS adicionado de 1 mg L-1 ANA e 1 mg L-1 CIN
e 1 mg L-1 para regeneração de plantas férteis foi eficiente para
obtenção de plantas duplo-haplóide de arroz da subespécie indica.
using lab techniques. This study had the objective to establish
an efficient protocol to raise double haploid rice plants from F1
indica hybrids using anther culture. Rice panicles at booting
stage (R2) were taken from the rice cultivar Epagri 109 and
the F1 genotypes SCH-09-1926, SCH-09-1930, SCH-09-2035,
SCH-09-1949, SCH-09-1953, SCH-09-1954, SCH-09-1960,
SCH-09-12000 e SCH-09-2013. These genotypes were used
to evaluate the effect of timing for panicle selection, anther
microspores maturity and culture medium composition on the
calli formation and plant regeneration. The best response on
calli formation was achieved when panicles were selected at
8 am and the distance between the flag leaf collar and ligule
of the last leaf was 8 cm. The frequency of calli ranged from
1.33% to 6.67% for the cultivar Epagri 109, and between 4 to
18% for the F1 hybrids, while the plant regeneration ranged
from 1 to 100%. Both results were genotype dependent and
dependent of the composition of the culture medium. The
established protocol collecting the booting stage panicle at
8 am, with 8 cm between the last leaf collar and the ligule
of the flag leaf, which anthers were cultured in N6 medium
added by 4 mg L-1 NAA and 1 mg L-1 KIN for calli induction
and MS medium added by 1 mg L-1 NAA and 1 mg L-1 KIN
e 1 mg L-1 BAP for regeneration of normal fertile plants, was
efficient to raise double haploid rice plants of indica subspecie.
Termos para indexação: Oryza sativa, melhoramento genético,
micropropagação.
INTRODUÇÃO
ABSTRACT
Anther culture is a useful tool in the development of
homozygous doubled haploid plants in just one generation
Index terms: Rice, breeding, micropropagation.
A cultura de tecidos in vitro tem sido usada como
uma tecnologia de apoio ao melhoramento genético
convencional, podendo ser empregada em uma ou em
diferentes etapas do desenvolvimento de novas cultivares.
(Recebido em 2 de setembro de 2014 e aprovado em 15 de novembro de 2014)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
Protocolo para Produção de plantas...
Dentre as técnicas de cultivo in vitro, a cultura de anteras
é uma importante ferramenta biotecnológica, utilizada
principalmente na obtenção de plantas duplo-haplóides
(GERMANA, 2011). A vantagem mais evidente no sistema
de duplo-haplóides é a diminuição do tempo necessário
para obtenção de linhagens homozigotas em culturas
anuais (MORAES-FERNANDES et al., 1999; TORRES et
al., 1999). O interesse em trabalhar com a cultura de anteras
de arroz é devido à necessidade de aumentar a eficiência
da seleção nas primeiras gerações de autofecundação,
que é muito baixa, devido principalmente, à ocorrência
de alelos dominantes em heterozigose (BORÉM, 2009;
BECKER, 2011). Ao eliminar o mascaramento causado
pela heterozigose na planta duplo-haplóide, tem-se a
vantagem de ampliar a eficiência de seleção, facilitando
a identificação de genótipos fenotipicamente uniformes
(KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI,
2002).
33
que, a interação de fatores bióticos e abióticos como
o genótipo, o estádio de desenvolvimento do pólen, o
tratamento de frio das anteras, a composição do meio de
cultura e o momento em que é realizada a coleta de pólen,
influenciam diretamente na resposta morfogenética in vitro
(SILVA, 2010). Dessa forma, o presente trabalho teve como
objetivo desenvolver um protocolo de cultura de anteras
para ecotipos de arroz da subespécie indica, cultivados em
região subtropical, que possibilite a obtenção rotineira de
plantas duplo-haplóides a partir genótipos F1.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de
Biotecnologia Vegetal da Epagri na Estação Experimental
de Itajaí em Santa Catarina. Panículas de arroz da
cultivar Epagri 109, safra 2009/2010, foram coletadas
de plantas no estádio R2 (emborrachamento) quando
apresentavam micrósporos no estádio uninucleado
As plantas duplo-haplóides podem ser obtidas
tardio ou binucleado precoce. Coletou-se panículas em
por via ginogênica ou androgênica. A androgênese
dois horários do dia (8 e 12 horas) e em duas fases de
consiste na regeneração in vitro de uma planta a partir
desenvolvimento de planta (6 e 8 cm de distância entre a
de micrósporos imaturos – grãos de pólen presentes na
aurícula da folha bandeira e a última folha). As panículas
antera. A cultura de micrósporos pode reverter o programa
foram mantidas com a base imersa em água a 10ºC
de desenvolvimento gametofítico para esporofítico,
por 7 dias, em frasco coberto com saco plástico. Em
permitindo a geração de plantas duplo-haplóides (SILVA,
seguida, em câmara de fluxo lâminar, as panículas foram
2010). Muitas das respostas morfogenéticas da formação
lavadas em água destilada, posteriormente imersas em
de calos (massas celulares indiferenciadas) e regeneração
álcool 70% (v/v) por 1 minuto, e então mantidas por
in vitro de plantas duplo-haplóides a partir de anteras
20 minutos em solução de hipoclorito de sódio a 4%
são dependentes do genótipo, sendo que normalmente
(v/v). Após essa desinfestação, o material foi lavado três
genótipos da subespécie japônica respondem melhor do
vezes em água destilada esterilizada, permanecendo 60
que os da subespécie indica (RAINA, 1997; TALEBI et
minutos imerso até a manipulação. As panículas foram
al, 2007). A baixa resposta androgênica da subespécie
divididas em três regiões: apical, mediana e basal. A
indica de arroz na produção de plantas duplo-haploides
extração das anteras de cada região foi realizada em
(SENADHIRA et al, 2002) tem limitado a utilização desta
câmara de fluxo laminar. As anteras foram mantidas em
técnica como uma ferramenta auxiliar no melhoramento
placas de petri contendo água estéril até a transferência
genético, principalmente em ecotipos cultivados em
para o meio de cultivo.
Para a formação de calos, 75 anteras foram
inoculadas em placas de petri contendo dois meios de
cultura semi-sólidos N6 + 2,0 mg L-1 2,4-D + 2,0 mg
L-1 ANA + 0,5 mg L-1 CIN (MC8) e N6 + 4,0 mg L-1
regiões tropicais e subtropicais.
Ajustes das condições pré e pós-cultura das anteras
são necessários para a obtenção de maiores porcentagens
de indução de calo e de regeneração de plantas, uma vez
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
34
ZAFFARI, G. R. et al.
ANA + 1,0 mg L-1 CIN (MC9). Esses meios de cultura
foram constituídos pelos sais de CHU et al. (1978) (N6),
adicionados de sacarose 50 g L-1, ágar-agar 0,7% e pH
5,8; além da adição de reguladores de crescimento (Tabela
1). Após o plaqueamento das anteras inteiras, as culturas
foram mantidas em sala escura por 120 dias a 25 ± 1°C.
O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado
com 75 repetições.
para vasos plásticos contendo casca de arroz calcinada,
irrigadas uma vez por semana com solução nutritiva
MS diluída 1:10, permanecendo por 15 dias na sala de
crescimento, à temperatura de 25 ± 1ºC e fotoperíodo
de 16 horas, cobertas com plástico. Posteriormente,
as plantas foram transferidas para casa de vegetação,
permanecendo até o final do ciclo da cultura.
Em um segundo experimento, 50 anteras da
panícula inteira, coletadas em nove híbridos F1 da
Tabela 1 – Composição dos meios de cultura N6 (Chu
et al, 1978) utilizados para o cultivo das anteras de arroz
durante a formação de calos (MC). 2,4-D (ácido 2,4
diclorofenoxiacético); ANA (ácido naftaleno acético);
CIN (cinetina).
Tratamento
MC1
MC2
MC3
MC4
MC5
MC6
MC7
MC8
MC9
Meio de
cultura
N6
N6
N6
N6
N6
N6
N6
N6
N6
Regulador de crescimento
(mg L-1)
2,4-D
ANA
CIN
0,5
1
2
4
0,5
1
2
-
2
2
2
2
2
2
2
4
0,5
0,5
0,5
1
Para a regeneração de plantas, os calos com
tamanho ≥ 2 mm de diâmetro foram transferidos para
os meios semi-sólido MS + 1,0 mg L-1 ANA + 1,0 mg
L-1 BAP + 1,0 mg L-1 CIN, sacarose 30 g L-1, ágar-agar
(0,7%) e pH 5,8 (MR1) e MS 50% + 1,0 mg L-1 ANA
+ 1,0 mg L-1 BAP + 0,5 mg L-1 CIN, sacarose 20 g
L -1, ágar-agar (0,7%) e pH 5,8 (MR2), constituídos
pelos sais de Murashige & Skoog (1962) (MS) e
mantidos em sala de crescimento à temperatura de 25
± 1ºC e fotoperíodo de 16 horas, com luz branca fria
fluorescente, de intensidade de 30 mmol.m2.s-1. As plantas
regeneradas foram transferidas para meio semi-sólido
MS, permanecendo 30 dias, para o desenvolvimento
do sistema radicular. Em seguida foram transplantadas
subespécie indica, SCH-09-1926, SCH-09-1930, SCH09-2035, SCH-09-1949, SCH-09-1953, SCH-09-1954,
SCH-09-1960, SCH-09-12000 e SCH-09-2013, foram
cultivadas em nove meios de cultura para a formação
de calos (Tabela 1), com o objetivo de avaliar a melhor
resposta dos genótipos. A coleta das panículas foi
realizada às 8 e às 10 horas da manhã, quando a distância
entre a aurícula da folha bandeira e a última folha
era de 8 cm. Os procedimentos para a desinfestação,
extração e cultivo das anteras foram os mesmos
descritos anteriormente. Após sete dias do cultivo, os
calos foram transferidos para os meios semi-sólidos de
regeneração de planta MR1 e MR2. As culturas foram
incubadas durante 90 dias, e as plantas regeneradas
foram enraizadas e aclimatizadas nas mesmas condições
descritas anteriormente. O delineamento experimental
foi o inteiramente causalizado com 50 repetições. Como
fomação de calo foi considerada toda massa celular
diferenciada na antera, independente do número de
massas por anteras, visualizada em estereomicroscópio.
A frequência de formação de calos, de calos
viáveis e de regeneração de plantas foi calculada da
seguinte maneira: Frequência de formação de calos (%)
= número de anteras que formaram calos/número de
anteras inoculadas x 100; Frequência de formação de calos
viáveis (%) = número de calos viáveis/número de calos
formados x 100; Frequência de regeneração de plantas
verdes ou albinas (%) = número de plantas verdes ou
albinas regeneradas/número de calos viáveis x 100. Para
efeito de análise estatística, os dados de percentagem dos
parâmetros avaliados foram transformados em arcoseno
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
Protocolo para Produção de plantas...
raiz (x). Os dados foram submetidos á análise de variância
e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de
5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A transformação dos dados percentuais e
a comparação das médias pelo teste de Tukey não
apresentou diferença significativa entre os tratmentos,
para as variáveis analisadas. Entretanto, foi observado
que anteras coletadas a 8 cm em relação ao colar da folha
bandeira apresentavam o melhor estádio fisiológico,
com anteras mais responsivas a formação de calos e
o tempo em dias para a formação foi muito variável
(Tabela 2). Em relação ao horário de coleta, os melhores
resultados de formação de calo foram obtidos às 8 horas
da manhã e principalmente nas regiões apical e mediana
35
da panícula de arroz, 6,67 e 5,33%, respectivamente.
Entretanto, a região basal também apresentou formação
de calo, porém em menor índice, 2,67 % (Tabela 3).
Segundo Silva (2010) o estádio de desenvolvimento
do micrósporo é crítico para a eficiência da indução
haplóide ou duplo-haplóide. Possivelmente, a coleta
as 8 horas da manhã, de paniculas a 8 cm entre o colar
da folha bandeira e a lígula da última folha representa
a melhor condição fisiológica dos micrósporos entre
o estádio uninucleado tardio e o binucleado precoce
(JAHNE & LORZ, 1995). Os resultados obtidos no
presente trabalho corroboram com Reynolds (1997)
que afirma que fatores abióticos tornam o micrósporo
competente para a androgênese. A condição fisiológica
da planta doadora das anteras parece ser determinante na
resposta morfogenética in vitro do processo esporofítico.
Tabela 2 – Frequência da formação de calos em anteras de Oryza sativa L., cultivar Epagri 109, safra 2009-2010,
no cultivo in vitro, em meio N6 (Chu et al., 1978).
Fase do
Horário da
desenvolvimento* coleta (hora)
Região da
panícula
Frequência da formação de calo
Tempo de formação do calo
(%)
(dias)
Meio de cultura
MC8
1,33
1,33
Meio de cultura
MC9
MC8
107
107
84
08:00
Apical
Mediana
Basal
MC9
1,33
12:00
Apical
Mediana
Basal
-
-
-
-
08:00
Apical
Mediana
Basal
6,67
5,33
2,67
-
99
108
112
-
12:00
Apical
Mediana
Basal
1,33
1,33
92
106
6 cm
8 cm
* Distância da aurícula da folha bandeira à penúltima folha no estádio R2 (emborrachado); MC9= N6 + 4,0 mg L-1ANA + 1,0 mg
L-1 CIN; MC8= N6 + 2,0 mg L-1ANA + 0,5 mg L-1 CIN + 2,0 mg L-1 2,4-D; 2,4-D (ácido 2,4 dicloofenoxiacético); ANA (ácido
naftaleno acético); CIN (cinetina).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
36
ZAFFARI, G. R. et al.
A resposta das anteras favorável a formação de calo,
possivelmente pode ter sido influenciada pela nutrição,
pela hora do dia, pelo comprimento do dia, pela radiação
solar e pelas temperaturas noturnas que a planta foi
submetida (RAINA, 1997).
No presente trabalho, os melhores resultados para a
formação de calos foram obtidos com a relação 2,4-D:ANA
de 1:4, porém adicionada de 0,5 mg L-1 CIN e com 1:1:1 e
1:2:2 entre CIN:BAP:ANA para a regeneração de plantas.
Estes resutlados corroboram com Rukmini et al. (2013)
que obtiveram formação de calo com 1:4 entre os tipos
de auxinas 2,4-D e ANA e regeneração de plantas com a
proporção 1:3:1 das citocininas CIN, BAP e auxina ANA.
Os calos obtidos a partir das anteras da cultivar
Epagri 109 e dos Híbridos F1 apresentaram frequência
média de regeneração de plantas de 100 a 1520% (Tabela
4). A maior capacidade morfogenética na regeneração de
plantas foi obtida com o híbrido F1 SCH-09-2013 para
plantas verdes e com o SCH-09-1954 para plantas albinas,
1520 e 917, respectivamente. Os resultados da frequência
de regeneração de plantas evidenciam que a resposta
morfogenética dos calos é do tipo genótipo-dependente.
Os mesmos efeitos interativos do genótipo com o meio
de cultura sobre a resposta para a indução de calo e a
regeneração de plantas, também foram observados nas
variedades de arroz da subespécie indica por Talebi et al.
(2007) e Javed et al. (2007).
Ao final do ciclo da cultura em casa de vegetação e a
campo, as plantas duplo-haplóides apresentaram diferentes
graus de fertilidade; plantas férteis, plantas parcialmente
férteis e plantas completamente estéries. Entretanto, as
plantas férteis cultivadas no campo produziram uma
quantidade de sementes dentro do esperado (100 a 150
sementes/panícula) para os genótipos testados (Figura 1).
Tabela 3 – Frequência da formação de calos a partir do cultivo in vitro de anteras de nove genótipos híbridos F1 de
Oryza sativa L, safra 2010-2011, em meio semi-sólido N6 (Chu et al, 1978), acrescido de reguladores de crescimento,
após 90 dias de cultivo.
Meio de
cultura N6
MC1
MC2
MC3
MC4
MC5
MC6
MC7
MC8
MC9
Regulador de crescimento
(mg L-1 )
2,4-D
0,5
1
2
4
0,5
1
2
-
ANA
2
2
2
2
2
2
2
4
CIN
0,5
0,5
0,5
1
Genótipo com
formação de calo (%)
8h
22,22
66,66
44,44
22,22
10 h
11,11
44,44
22,22
22,22
-
Frequência de
Tempo para formação
formação de calo de calo (dia)
(%)
8h
8
18
18
4
10 h
9
8
8
-
2,4-D (ácido 2,4 dicloofenoxiacético); ANA (ácido naftaleno acético); CIN (cinetina).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
8h
45
58
51
59
10 h
47
50
50
50
-
Protocolo para Produção de plantas...
37
Tabela 4 – Frequência de regeneração de plantas de Oryza sativa L., a partir de calos de anteras da cultivar Epagri
109, safra 2009-2010 e de híbridos F1, safra 2010-2011, cultivados em meio de cultura Murashige e Skoog (1962)
(MS) acrescido de reguladores de crecimento, após 30 dias de cultivo in vitro.
Meio de cultura
Número de calos
inoculados
Genótipo
Calo com regeneração
de planta (%)
Frequência de regeneração
de planta (%)
Verde
Albina
Epagri 109
6
50
0
100
MR1
SCH-09-1960
1
100
200
0
SCH-09-2013
5
60
1520
500
SCH-09-2035
7
2
0
214
Epagri 109
5
40
450
0
SCH-09-1954
6
1
0
917
SCH-09-2035
7
50
171
MR2
0
MR1 = MS + 1,0 mg L ANA + 1,0 mg L BAP + 1,0 mg L CIN, sacarose 30 g L ; MR2 = MS 50% + 1,0 mg L ANA + 1,0
mg L-1 BAP + 0,5 mg L-1 CIN, sacarose 20 g L-1; ANA (ácido naftaleno acético); CIN (cinetina); BAP (benzilaminopurina).
-1
-1
-1
-1
-1
Figura 1 – Etapas sequenciais do processo de cultura de anteras de arroz para a produção de plantas duplo-haplóides:
(a) - Panícula no estádio R2; (b) - Formação de calo a partir dos micrósporos da antera; (c) - Planta regenerada a partir
do calo; (d) - Crescimento da parte aérea e do sistema radicular da planta; (e) - Plantas duplo-haplóides aclimatizadas
e cultivadas em vasos na casa de vegetação; (f) - Plantas duplo-haplóides férteis, com sementes, cultivadas a campo.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
38
ZAFFARI, G. R. et al.
CONCLUSÕES
A resposta androgênica dos genótipos híbridos F1
de arroz da subespécie indica para a formação de calos e
a regeneração de plantas duplo-haplóides é influenciada
pela hora da coleta da panícula, pelo estádio de maturação
dos micrósporos na antera e pela composição do meio de
cultura.
As anteras de arroz coletadas às 8 horas da manhã,
no estádio R2 com 8 cm de distância entre a aurícula da
folha bandeira e a última folha possuem maior capacidade
de resposta morfogenética na obtenção de plantas duplohaploides.
A maior relação auxina:citocinina no meio de
cultura promove a formação de calo e a menor relação a
regeneração de plantas duplo-haplóides.
O protocolo de cultura de anteras para a
produção de plantas duplo-haplóides de ecotipos
de arroz da subespécie indica, cultivados em região
subtropical, é viável e pode ser utilizado para a
obtenção de linhagens homozigotas em programa de
melhoramento genético.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a FAPESC e o CNPq pelo
financiamento da pesquisa.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 32-40, 2014
Callus inductionIN
in leaf
explants...
CALLUS INDUCTION
LEAF
EXPLANTS OF
Cissus verticillata (L.) NICOLSON & C. E. JARVIS
41
INDUÇÃO DE CALOS EM EXPLANTES FOLIARES DE Cissus verticillata (L.)
NICOLSON & C. E. JARVIS
Maurício Reginaldo Alves dos Santos1, Josilene Félix da Rocha2,
Eloísa Santana Paz3, Caroline Vivian Smozinski4, Wanessa de Oliveira Nogueira3,
Milene de Castro Melo Guimarães3
Doutor – Embrapa Rondônia – Caixa Postal 127 – 76815-800 – Porto Velho, RO – [email protected]
Bióloga, Doutoranda em Biotecnologia Vegetal – Universidade Federal de Lavras, UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 –
Lavras, MG – [email protected]
3
Bióloga, Mestranda em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente – Universidade Federal de Rondônia, UNIR – Porto
Velho, RO – [email protected], [email protected], [email protected]
4
Graduanda em Ciências Biológicas, Bolsista PIBIC/CNPq – Embrapa Rondônia – Porto Velho, RO – [email protected]
1
2
ABSTRACT
Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis is
a perennial plant native to the Amazonian Rainforest. This
species is used in Brazilian folk medicine for the treatment of
diabetes, which has motivated several botanical, chemical and
pharmacological studies. The objective of this research was to
develop a protocol for callus induction in leaf explants of C.
verticillata, aiming to provide support for further establishment
of cell suspension systems for in vitro production of secondary
metabolites. The leaves were cut into 1 cm2 explants, individually
inoculated in test tubes on Murashige & Skoog culture medium
supplemented with 3.0% sucrose, 0.6% agar, 2,4-D (0, 1, 2, and 4
mg L-1) and BA (0, 1, 2, and 4 mg L-1) in factorial combinations.
On the 42nd day after inoculation, callus induction, percentage of
the leaf area covered by callus cells (%LACC), and fresh weight
of the explants were evaluated. No callus induction was observed
without growth regulators. All the other treatments resulted in
100% induction. However, 2,4-D caused tissue necrosis in all
the explants. In the media supplemented with BA and in the
absence of 2,4-D, explants did not necrose and callus growth
occurred. Highest percentages of LACC were observed in the
media supplemented with 1.0 and 4.0 mg L-1 BA, in which all the
explants presented 100% of the explant area covered by callus
cells. The greatest fresh mass, 18.19 g, was achieved with 4.0
mg L-1 BA in the culture medium.
Index terms: Callogenesis, medicinal plant, secondary
metabolites.
RESUMO
Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis é uma
planta perene nativa da Floresta Amazônica. Possui hábito
herbáceo, escandente ou trepador. É utilizada na medicina
popular brasileira para o tratamento de diabetes, o que tem
motivado diversos estudos botânicos, químicos e farmacológicos.
O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um protocolo para
indução de calos em explantes foliares de C. verticillata, visando
subsidiar o futuro estabelecimento de sistemas de células em
suspensão para a produção de metabólitos secundários in vitro.
As folhas foram segmentadas em explantes de 1 cm2, os quais
foram individualmente inoculados em tubos de ensaio contendo
meio de cultura Murashige & Skoog suplementado com 3,0%
de sacarose, 0,6% de ágar, 2,4-D (0, 1, 2 e 4 mg L-1) e BAP (0,
1, 2 e 4 mg L-1) em combinações fatoriais. No 42º dia após a
inoculação, foi avaliada a indução de calos, a porcentagem da
área foliar coberta por células de calo (%AFCC) e o peso fresco
dos explantes. Não se observou indução de calos sem reguladores
de crescimento. Os demais tratamentos resultaram em 100%
de indução. Porém, 2,4-D causou necrose tecidual em todos os
explantes. Nos meios suplementados com BAP e na ausência
de 2,4-D, os explantes não necrosaram e os calos cresceram. As
maiores porcentagens de AFCC foram observadas nos meios
suplementados com 1,0 e 4,0 mg L-1 de BAP, nos quais todos os
explantes apresentaram 100% da área do explante coberta por
células de calo. A maior massa, 18,19 g, foi obtida com 4,0 mg
L-1 de BAP no meio de cultura.
Termos para indexação: Calogênese, planta medicinal,
metabólitos secundários.
INTRODUCTION
Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis
is a perennial plant native to the Amazonian Rainforest.
Its habit is herbaceous, scandent or climbing (LORENZI
& MATOS, 2008). In Brazil, it is colloquially known
as “insulin” (BRAGA et al., 2011) due to its use in the
Brazilian folk medicine for the treatment of diabetes,
which has motivated several botanical, chemical and
pharmacological studies (BELTRAME et al., 2001;
PEPATO et al., 2003; BARBOSA-FILHO et al., 2005).
Its hypoglycemic action was confirmed under laboratory
(Recebido em 28 de maio de 2014 e aprovado em 10 de dezembro de 2014)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 41-46, 2014
42
SANTOS, M. R. A. dos et al.
conditions by the administration of the tea made from
by cutting the leaves into 1 cm2 pieces in sterile Petri
its leaves to normoglycemic rats (BARBOSA et al.,
dishes. The leaf explants were individually inoculated
2002). It is also employed in cases of abscesses, muscle
with the adaxial surface up in test tubes containing 10.0
inflammation, epilepsy, stroke, hypertension, and used to
mL of MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) medium
promote blood circulation (VASCONCELOS et al., 2007).
supplemented with 3.0% (w/v) sucrose, 0.6% (w/v)
In relation to its antifungal activity, studies have shown the
agar, and factorial combinations of the growth regulators
potential of the hydroalcoholic extract of C. verticillata
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) (0.0, 1.0, 2.0, and
leaves against four Candida species (BRAGA et al., 2011).
4.0 mg L-1) and benzylaminopurine (BA) (0.0, 1.0, 2.0, and
The use of phytotherapy as an alternative to
4.0 mg L-1), totaling 16 treatments. The pH of the medium
synthetic medicines and the increasing investment
was adjusted to 5.8 before addition of agar followed by
in research towards new active principles demand
autoclaving at 121°C for 20 minutes. All the cultures
studies on the establishment of in vitro cell suspension
were incubated in a growth chamber at 24±1°C under
cultures for the production of relevant substances from
50 µmol.m-2.s-1 photosynthetic photon flux density light
a pharmacological standpoint (ARNALDOS et al.,
provided by cool white fluorescent tubes, with a 16 h.d-1
2001; LIMA, 2008; MORAIS et al., 2012). Secondary
photoperiod. Treatments were arranged in a completely
metabolites can be produced in significant amounts in cell
randomized design, each one of the 16 treatments with
suspension systems, often surpassing the levels achieved
four replications, each replication represented by four
by intact plants, without agricultural problems such as
test tubes with one explant, totaling 256 explants. The
seasonality and the need for pesticides, among others.
evaluations of callus induction, percentage of the leaf
Moreover, production in these systems can be maximized
area covered by callus cells (%LACC), and fresh weight
by genetic breeding and operational adjustments of the in
of the explants were performed 42 days after inoculation.
vitro conditions (MORAIS et al., 2012; OLIVEIRA et al.,
Each explant was carefully cleaned with tissue paper and
2009; CID, 1998).
weighed in an analytical scale. Three evaluators attributed
The objective of this research was to develop
scores of 1, 2, 3, and 4 to explants whose leaf area was
a protocol for callus induction in leaf explants of C.
covered by callus cells in the proportions of 0-25%, 26-
verticillata, aiming to provide support for the establishment
50%, 51-75%, and 76-100%, respectively (LAMEIRA et
of cell suspension systems for in vitro production of
al., 1997). All collected data were submitted to analysis of
secondary metabolites.
variance, and the means were compared by Tukey’s test
MATERIAL AND METHODS
The experiments were carried out at the Laboratory
of Plant Tissue Culture of Embrapa, in Porto Velho,
(P ≤ 0.05). Analyses were carried out by using the Biostat
5.0 statistical program.
RESULTS AND DISCUSSION
Rondonia, Brazil. Leaves were collected from 12 month
Seven days after inoculation all concentrations of
old plants cultivated under greenhouse conditions, 30%
2,4-D and BA caused tumescence in 100% of the explants,
shading and watering three times a day. At the laboratory,
which was not observed in the treatment without growth
they were washed with running tap water and a detergent
regulators. However, 2,4-D caused a toxic effect with
agent for five minutes and then immersed in 70% (v/v)
tissue necrosis in all the explants, which started at the
ethanol for one minute and soaked in a 5.0% (w/v) calcium
portion in contact with the media. In all the treatments
hypochlorite solution for 30 minutes, and then rinsed
where this growth regulator was not present no necrosis
three times with sterile water. Explants were produced
was observed, including the experimental control.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 41-46, 2014
Callus induction in leaf explants...
At 14 days after inoculation no callus induction was
observed in the control treatment. All the other treatments
resulted in 100% induction. Necrosis in 2,4-D treatments
increased considerably, impeding the growth of the callus.
In the media supplemented with BA and in the absence
of 2,4-D, explants did not necrose and the callus growth
was noticeable.
On the 42nd day after inoculation, no necrosis or
callogenesis was observed on the experimental control. The
explants were still green, without alterations. The explants
and callus that had been grown in media supplemented
with 2,4-D necrosed completely. The utilization of BA
in all concentrations, in the absence of 2,4-D, resulted in
induction and growth of friable white callus (Figure 1).
Specifically in relation to callus induction, the treatments
with growth regulators did not differ, for all of them caused
100% of callus induction (Table 1).
In general, slightly similar concentrations of
auxin and citocinin in the culture medium promote callus
induction, but the responses to the interaction of these
classes of growth regulators can vary according to the
regulator, explant and genotype peculiarities (CORDEIRO
et al., 2007). They can act together in synergistic interaction
43
or not, leading to the dedifferentiation (SANTOS, 2001).
However, in this study the highest percentages of LACC
were observed in the media supplemented with 1.0 and
4.0 mg L-1 BA, in which all the explants had 100% of the
explant area covered by callus cells.
Rodrigues & Almeida (2010) also observed a
positive effect of BA alone on callus induction in leaf
explants of Cissus sicyoides L. in MT (MURASHIGE
& TUCKER, 1969) solid medium. The researchers
supplemented the medium with 1.0 mg L-1 NAA and 2.0,
4.0, 6.0, and 12.0 mg L-1 BA. The concentration of 4.0 mg
L-1 BA promoted the highest number of compact callus
while the highest number of friable callus was achieved
with 12.0 mg L-1 BA. Nevertheless, the concentration of
6.0 mg L-1 BA resulted in the highest number of explants
with 100% of their area covered by callus cells.
Lima et al. (2008) observed the opposite in a study on
callus induction in leaf explants of Croton urucurana Baill.
The authors studied the interaction of different concentrations
and combinations of 2,4-D, TDZ, BA and NAA and observed
that the use of BA without combination or with NAA did not
promote callogenesis, while 2,4-D alone resulted in callus
induction with the highest callus fresh mass.
Figure 1 – Callus induced in leaf explant of C. verticillata on MS medium with 4.0 mg L-1 BA, 42 days after
inoculation.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 41-46, 2014
44
SANTOS, M. R. A. dos et al.
Table 1 – Percentages of callus induction and leaf area covered by callus cells (%LACC) in leaf explants of C.
verticillata submitted to factorial combinations of 2,4-D and BA in MS medium, 42 days after inoculation.
%LACC
BA (mg L-1)
2,4-D (mg L-1)
Callus induction (%)*
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
0
1
2
4
0
1
2
4
0
1
0b
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
0-25%
0e
0e
0e
0e
0e
0e
5.9 de
37.5 b
0e
1.7 c
26-50%
0h
58.8 bc
94.4 a
100.0 a
0h
11.8 f
58.8 bc
43.8 d
0h
66.7 b
51-75%
0g
41.2 c
5.5 gh
0f
0f
70.6 a
29.4 d
12.5 fg
18.8 ef
11.1 fg
76-100%
0d
0d
0d
0d
100.0 a
17.6 c
5.9 d
6.3 d
81.2 b
5.6 d
2
2
4
4
4
4
2
4
0
1
2
4
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
100.0 a
33.3 b
50.0 a
0e
0e
6.2 de
14.3 cd
40.0 d
50.0 cd
0h
0h
6.2 fg
28.6 e
26.7 de
0f
0f
23.5 de
62.6 ab
57.1 b
0d
0d
100.0 a
76.5 b
25.0 c
0d
*Averages followed by the same letter within the same column do not differ by Tukey’s test at 5.0%.
Santos et al. (2010) utilized factorial combinations
of NAA and IBA to induce callus in leaf explants of
Coffea canephora cv. Conilon. The authors observed
a positive interaction between the two regulators and
reported that the half strength MS medium supplemented
with 2.0 mg L -1 NAA + 5.0 mg L -1 IBA resulted in
callogenesis in all the explants and the highest LACC.
Thomé et al. (2004) studied the micropropagation
of Kalanchoe blossfeldiana Poelln. and observed 100%
of callogenesis in leaf explants by using 1.0 mg L-1 BA
+ 0.03 mg L-1 NAA with subsequent organogenesis in
two cultivars, Gold Trike and Klabat.
Considering the convergence of certain data
obtained in relation to the percentage of callus induction
and the LACC, the fresh mass was studied in order to
access information about the callus cell proliferation.
The greatest fresh mass, 18.19 g, was achieved with
4.0 mg L-1 BA in the culture medium (Table 2). The
supplementation with 1.0 and 2.0 mg L-1 BA resulted in
14.03 and 12.33 g of fresh mass, respectively.
The highest fresh weight of callus induced
in leaf explants and lateral buds of Ducrosia
anethifolia, a medicinal plant native to Iran, was
achieved by Kermanshahi et al. (2012) in MS medium
supplemented with 2.0 mg L-1 NAA + 1.0 mg L-1 BA.
The fresh mass of callus obtained from leaf explants
of Cleome viscosa was evaluated by Anburaj et al.
(2011). The authors achieved the highest fresh mass
in MS medium supplemented with 2.0 mg L-1 IAA.
Porto et al. (2014) evaluated the fresh mass of callus
from cotyledon leaves of Sthyphnodendron adstringens
(Mart.) Coville and observed the highest weights in
MS medium with 0.5 mg L-1 TDZ and 2.0 mg L-1 KIN
+ 0.5 mg L-1 Picloram.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.10, n.2, p. 41-46, 2014
Callus induction in leaf explants...
Table 2 – Total fresh mass of C. verticillata explants
submitted to factorial combinations of 2,4-D (0.0, 1.0, 2.0
and 4.0 mg L-1) and BA (0.0, 1.0, 2.0 and 4.0 mg L-1), 42
days after inoculation.
BA (mg L-1)
2,4-D (mg L-1)
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
4
4
4
4
0
1
2
4
0
1
2
4
0
1
2
4
0
1
2
4
TOTAL FRESH
MASS (g)*
0.91 g
5.42 cdef
3.95 ef
2.78 fg
14.03 b
7.81 c
6.09 cde
5.51 cdef
12.33 b
5.22 cdef
4.63 def
3.39 efg
18.19 a
11.82 b
7.62 cd
5.73 cdef
*Averages followed by the same letter within the same column
do not differ by Tukey’s test at 5.0%.
CONCLUSIONS
BA and 2,4-D are effective for callus induction
in leaf explants of Cissus verticillata, however, 2,4-D
causes necrosis of the explants, which impedes the callus
growth. The utilization of 4.0 mg L BA results in high
-1
callus proliferation, covering 100% of the explant area,
with an average of 18.19 grams of fresh mass in 42 days
of cultivation.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors wish to thank CAPES (Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –
Coordination for the Improvement of Higher Education
Personnel) for providing scholarships to J.F. Rocha,
W.O. Nogueira and M.C.M. Guimarães, and to CNPq
(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
45
e Tecnológico – National Council for Scientific and
Technological Development) for providing a scholarship
to C.V. Smozinsky. Financial support was also provided by
Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária –
Brazilian Agricultural Research Corporation).
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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS E COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation
é editada semestralmente pela Editora da Universidade
Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos
científicos e comunicações científicas da área de cultura
de tecidos de plantas, elaborados por membros da
comunidade científica nacional e internacional. Não é
cobrada taxa para publicação de trabalhos, desde que
um dos autores seja sócio e esteja em dia com a ABCTP
(Associação de Cultura de Cultura de Tecidos de Plantas).
É condição fundamental que os artigos/comunicações
submetidos à apreciação da revista “Plant Cell Culture
& Micropropagation” não foram e nem serão publicados
simultaneamente em outro lugar. Com a aceitação do
artigo para publicação, os editores adquirem amplos e
exclusivos direitos sobre o artigo para todas as línguas e
países. A publicação de artigos/comunicações dependerá
da observância das Normas Editoriais, dos pareceres do
Corpo Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os pareceres
têm caráter sigiloso e imparcial, e tanto os autores quanto
os membros do Corpo Editorial e/ou Comissão ad hoc não
obtêm informações identificadoras entre si.
Os conceitos e afirmações contidos nos artigos
e comunicações serão de inteira responsabilidade do(s)
autor(es).
1. SUBMISSÃO:
Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas e
junto do mesmo deverá ser encaminhado ofício dirigido ao
Editor Chefe da revista, solicitando a publicação do artigo.
Esse ofício deverá conter o pedido de apreciação
na revista ao editor chefe, a declaração de ser um trabalho
original e não ter sido submetido a nenhuma outra revista,
ser assinado por todos os autores, constar o endereço
completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão,
exclusão ou alteração na ordem dos autores, deverá ser
notificada mediante ofício assinado por todos os autores
(inclusive do autor excluído).
Originais: quatro vias impressas e uma via em CDR, com
texto e ilustrações e gráficos. Das 4 vias impressas apenas
1 deve conter os nomes completos dos autores e rodapé
na primeira página.
Processador de texto: Word for Windows (version 98,
2000, XP ou 2003)
Redigido em português, inglês ou espanhol
Espaçamento do texto: Duplo. Margens: esquerda (3cm),
direita (2cm), inferior e superiores (2,5cm). Cabeçalho e
Rodapé (2,5cm).
Papel: formato A4
Fonte: Times New Roman, tamanho 12
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas
consecutivamente, incluindo as ilustrações
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser
apresentadas no módulo tabela do Word. O título deve
ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados
em preto e branco, nítidos e com contraste, escaneados,
inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão “tif” ou “jpg”,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10,
sem negrito, sem caixa de textos e agrupados, em
arquivo à parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para
nota de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias
do manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor
está filiado – endereço da instituição – CEP – cidade,
estado – endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que 250
palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo,
não ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução
próxima do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito aborda
e enfatizar a relevância do estudo, sem constituir-se em
extensa revisão e, na parte final, os objetivos da pesquisa.
Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das
Referências Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O
estilo, também aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as
razões pelas quais se fazem os agradecimentos
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e
na seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada
na seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para
nota de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias
do manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor
está filiado – endereço da instituição – CEP – cidade,
estado – endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que 250
palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo,
não ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução
próxima do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300
dpi. As figuras deverão ser elaboradas com letra Times
New Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de
textos e agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos mesmos,
dentro do próprio texto, elaborado preferencialmente em
Excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para
que o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este
não esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio
de ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p.
74-80, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55
p. Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.”
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS
EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada
de madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO,
6., 1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão:
SBS/SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado
em evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da
expressão “Disponível em:” e da data de acesso ao
documento, precedida da expressão “Acesso em:”.
Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico
de curta duração nas redes” (ABNT, NBR6023/2000, p.
4). Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
Monografia (acesso online):
b) Parte de livro com autoria específica:
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//www.
socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília:
IPEA/IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade
tecnológica de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de
Rhyzopertha dominica (F.) durante o armazenamento
em atmosfera controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos) –
Universidade Federal de Lavras, Lavras, 1997.
a) livro no todo
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de projeto
excelência na pesquisa tecnológica. In: CONGRESSO
ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de institutos de pesquisa
tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000. Disponível em: <http://
www.abipti.org.br>. Acesso em: 01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua
brasileira de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação
(Mestrado em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua)
- Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, São
Paulo, 1997. Disponível em: <http://www.terra.com.br/
virtualbooks/ freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em:
28 nov. 2000.
POSTERIORMENTE, O INFORMARÁ SOBRE SUA
PUBLICAÇÃO. OS ARTIGOS QUE NECESSITAREM
DE MODIFICAÇÕES SERÃO DEVOLVIDOS AO
AUTOR PARA A DEVIDA REVISÃO.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM
DE APROVAÇÃO.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de
um conceito contemporâneo. Informação e Sociedade,
Recife, v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em:
<http://www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em:
30 nov. 2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL &
TORRIE, 1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et
al., 1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR
DO RECEBIMENTO DO ORIGINAL E,
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO
DEVOLVIDOS.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS
PELA COMISSÃO EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras – MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
“Plant Cell Culture & Micropropagation”,
a semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. One of the authors
must be associated and have paid all charges required by
the ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order
to be tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies
that it is neither under consideration for publication
elsewhere nor has appeared previously in part or in whole.
On acceptance for publication, authors assign to the
Editors full copyright of the manuscript in all languages
and countries. Publications will depend on editorial rules
and on the review of experts and ad hoc commission.
Reviewer and editorial opinions will be anonymously
communicated to authors.
Concepts and affirmations included in articles and
communications are of the entire responsibility of the
authors.
1. SUBMISSION
The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be
signed by all authors and also contain the full address,
telephone number and e-mail of the authors. Any
inclusion, exclusion or alteration in the authors order
must be notified and signed by all authors including
the one excluded.
Original: Four copies and CD with text and illustrations.
Only one of the 4 printed copies must contain the full
names of the authors and footnote in the first page.
Format: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou
2003)
Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper
and lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for
the footnote
Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the
illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper
and they must be presented in Word or Excel. The title
should be above and be presented in the language in which
the article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in the
text after citation and also in a separate file (on the same
diskette as the article) saved in extension “tif” or “jpg”,
with resolution of 300 dpi. The title should be below and
presented in the language in which the article was written
and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented
using a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words
in capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation – name of the institution to which the
authors belong – address of institution – ZIP CODE – city,
state – mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all
written in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five.
They should not repeat words that are already in the title.
These may include phrases as well as individual words
and should be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject
area that the paper will discuss. It should neither give
an extensive review nor should it include details about
the results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIAL AND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
RESULTS AND DISCUSSION
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(s) OF THE AUTHOR(s)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation – name of the institution to which the
authors belong – address of institution – ZIP CODE – city,
state – mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must not
exceed 250 words. Index terms must be enclosed after the
abstract using terms different from those used in the title
and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and
small letters, and express the content of the article
ABSTRACT and INDEX TERMS in
Portuguese
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE
SHOULD OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their
citation and also in a separate file (on the same diskette as
the article) saved in extension “tiff” or “JPEG” with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear and
with contrast, inserted in the text after their citation and also
in a separate file (on the same diskette as the article) saved in
extension “tiff” or “JPEG” with resolution of 300 dpi.
They must be elaborated using Times New Roman font, size
10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New
Roman font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according
to NBR6023/2002 of ABNT. All references and their
correct citation in the text are of the entire responsibility
of the author(s).
5. THE BRAZILIAN ASSOCIATION OF PLANT
TISSUE CULTURE (ABCTP) WILL INFORM THE
AUTHOR THE RECEIPT OF THE ORIGINAL
MANUSCRIPT AND EVENTUALLY IT WILL
ALSO SEND INFORMATION REGARDING ITS
PUBLICATION. MANUSCRIPTS THAT REQUIRE
MODIFICATIONS WILL BE RETURNED TO THE
AUTHOR FOR THE RESPECTIVE REVISION
ANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON’T BE
RETURNED TO THE AUTHOR.
7. ARTICLES WILL BE PUBLISHED ACCORDING
TO THE ORDER OF RECEIPT AND APPROVAL.
8. IF ANY OF THESE RULES ARE NOT ATTENDED
THE MANUSCRIPT WILL BE RETURNED TO THE
AUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED
BY THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWING ADDRESS:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 – Lavras – MG – BRAZIL