UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
THALITA DA ROSA
AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS
CRICIÚMA, 16 DE NOVEMBRO DE 2009.
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
THALITA DA ROSA
AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS
Projeto de trabalho de conclusão de curso, apresentado para
o curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul
Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck
CRICIÚMA, 16 DE NOVEMBRO DE 2009.
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1 INTRODUÇÃO
O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos (Maciel et al., 2002). O uso de plantas e
extratos vegetais no tratamento de algumas doenças é um hábito bastante difundido no
Brasil, devido a uma importante fonte de produtos naturais biologicamente ativos e, devido a
sua grande diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e biológicas,
podendo assim ser modelo para a síntese de inúmeros fármacos (Jorge et al., 2004; Simões,
2003, p.14-15).
Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de 80% da
população mundial fazem uso de algum tipo de erva, buscando alívio para sintomas
dolorosos ou desagradáveis (Franco, 1998). Segundo Corrêa et al. (2002, p.12), a OMS tem
encorajado o estudo de plantas tradicionais, com a esperança de obter os benefícios que
elas poderiam possivelmente fornecer, enquanto ao mesmo tempo poderia evitar os efeitos
irracionais ou prejudiciais que esse tipo de medicina pode ter.
Sendo assim, existe um grande interesse científico pelo desenvolvimento da
pesquisa de plantas utilizadas na medicina popular, envolvendo áreas multidisciplinares,
como, por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica. O conhecimento existente nas
comunidades tradicionais sobre as propriedades terapêuticas das plantas encontradas em
seu ambiente natural pode ser uma ferramenta poderosa na descoberta de novos
medicamentos (Corrêa et al., 2002, p.18; Almeida, 2004; Maciel et al., 2002).
Os marcadores morfológicos são utilizados para discriminar espécies. Contudo,
quando a morfologia é altamente semelhante, corre-se o risco de equívocos na classificação.
Assim, a identificação da espinheira-santa (Maytenus ilicifolia, Celestraceae) via marcadores
morfológicos não é tão simples, uma vez que existem várias espécies do mesmo gênero com
3
morfologia semelhante, sendo uma destas espécies a Zollernia ilicifolia, que é também
conhecida popularmente como falsa espinheira-santa, mocitaíba, laranjeira-do-mato,
moçataíba, orelha-de-onça e/ou carapicica-de-folha-lisa. Além disso, a discriminação entre a
espinheira-santa e as espécies conhecidas como mata-olho (Sorocea bonplandii) e falsaespinheira-santa (Zollernia ilicifolia) praticamente só pode ser feita in vivo desde que se
tenham conhecimentos botânicos (Coelho et al., 2003; Di Stasi & Hiruma-Lima, 2002, p.312;
Simões, 2003, p.35).
A Zollernia ilicifolia (Fabaceae) é uma planta nativa da Floresta Tropical Atlântica
(Mata Atlântica, Brasil). É utilizada tradicionalmente suas folhas na forma de decocto como
analgésico e antiulcerosa, com as mesmas utilizações tradicionais da verdadeira "espinheirasanta" (Maytenus ilicifolia, Celastraceae) (Gonzalez et al., 2001; Di Stasi et al., 2002).
A Planta é uma árvore de porte médio (aproximadamente 15m); folhas simples
coriáceas com cerca de 15cm de comprimento e 5cm de largura, oblongas, com margens
onduladas e providas de espinhos; estípulas espesas (característica marcante na
diferenciação da Espinheira-santa verdadeira, Maytenus ilicifolia); flores rosadas (Di Stasi &
Hiruma-Lima, 2002, p.312-313).
Em um recente estudo comparativo, Gonzalez et al. (2001) investigou a atividade
analgésica e antiulcerosa do extrato metanólico 70%, de folhas de Zollernia ilicifolia, Sorocea
bomplandii e Maytenus aquifolium. O extrato metanólico da Zollernia ilicifolia mostrou efeitos
analgésico e antiulceroso sobre lesões gástricas induzidas por indometacina/betanecol em
camundongos. Os testes mostraram também que os animais tratados com o extrato de
Zollernia ilicifolia apresentaram aumento de irritabilidade e freqüência respiratória, perda de
reflexos da córnea e diminuição da atividade motora.
Em outro estudo, Coelho et al. (2003) observou que a atividade antiulcerosa do
extrato metanólico 70% de Zollernia ilicifolia poderia estar relacionada à presença do
4
flavonóide tetraglicosídeo, uma vez que as estruturas são semelhantes as encontradas em
espécies de Maytenus, plantas com efeitos analgésico e antiulcerosa.
A gastrite é uma lesão gástrica, patologicamente caracterizada pela inflamação
inespecífica da mucosa gástrica (Wang et al., 2009). Apesar da definição ser histológica, o
diagnóstico geralmente é feito pelo clínico e/ou endoscopista, prescindindo da microscopia
(Prado, 2007, p.382).
A gastrite ocorre em qualquer região do globo, a prevalência é alta e aumenta com
a idade. Algumas destas lesões são de natureza microbiana (Helicobacter pylori), mas
também pode ser decorrente de agentes químicos, biológicos ou físicos (álcool, AINES,
intoxicações, infecções). Sua maior prevalência é pela Helicobacter pylori, mas também
ocorre frequentemente pela ingestão de álcool ou de anti-inflamatórios não-esteróides
(AINES) e intoxicações ou infecções (Calabuig et al., 2009; Prado, 2007, p.382).
A expansão mundial do consumo de álcool e AINES têm contribuído para o
crescimento de úlcera gástrica. Os AINES estão entre os medicamentos mais
utilizados/prescritos e que mais desencadeiam efeitos indesejáveis. A maioria desses efeitos
relaciona-se ao sistema digestório, destacando-se a capacidade de causar principalmente
gastrite aguda, dispepsia e úlcera péptica (Prado, 2007, p.382-383; Moraes et al, 2009).
O efeito ulcerogênico dos AINES tem sido relacionado com o potencial deste
medicamento para inibir a síntese de prostaglandina E2. A secreção ácida aumentada
também contribui para este processo prejudicial, tal como o fato de provocar distúrbios na
microcirculação gástrica, aumento da infiltração de neutrófilo, induz a expressão de TNF- , e
perturba o equilíbrio entre óxido nítrico e apoptose. A introdução de antagonistas dos
receptores histamínicos e inibidores de bomba de prótons têm sido associados com um
aumento na taxa de cura da úlcera (Moraes et al, 2009).
Os AINES, tais como a indometacina, tem a capacidade de induzir danos
5
gástricos, especialmente devido à inibição da biossíntese de prostagladinas por inibição da
ciclooxigenase via metabolismo do ácido araquidônico (Rainsford, 1987; Wallace, 2001).
O sucesso dos tratamentos farmacológicos para prevenir ou curar lesões
ulcerativas depende não só do bloqueio da secreção ácida, mas também em aumentar
fatores
protetores
da
mucosa
incluindo
prostaglândinas,
fatores
de
crescimento,
somatostatina, o óxido nítrico e compostos sulfidrílicos (Moraes et al, 2009).
Devido a Zollernia ilicifolia ser uma planta bastante utilizada para gastrite, mas
com poucos estudos comprovando a sua ação farmacológica, torna-se muito importante
verificar se a mesma realmente apresenta efeito gastroprotetor.
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2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL:
- Avaliar o efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia em ratos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Verificar o efeito do tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia sobre os
seguintes parâmetros, em mucosa gástrica de ratos submetidos a gastrite experimental
induzida por indometacina:
1) a medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), um marcador de
lipoperoxidação;
2) a oxidação de proteínas (carbonilação de proteínas e grupos sulfidrila);
3) a atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (I, II, III e IV);
4) análise histológica.
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3 METOLOGIA
3.1 Tipo de pesquisa
Pesquisa básica, quantitativa, experimental.
3.2 Animais
Para realização dos experimentos serão utilizados ratos Wistar machos pesando
entre 250 e 300 g, provenientes do Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense
(UNESC). Os animais serão mantidos em ambiente climatizado (22oC) com ciclos claroescuro de 12 horas, com água e alimentação ad libitum. O projeto será enviado ao Comitê de
Ética de Uso de Animais da UNESC.
3.3 Preparação do extrato
As folhas secas e maceradas serão colocadas em um recipiente contendo o líquido
extrator (álcool 70%) deixando-se em repouso durante um período de 21 dias. Os extratos
sólidos serão obtidos para obtenção da concentração da planta a ser utilizada.
3.4 Preparação do tecido
Os animais serão mortos por decapitação e posteriormente exerese do estômago
para observação das lesões gástricas.
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3.5 Indução do modelo de gastrite e tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia
ilicifolia
Os animais serão divididos em quatro grupos: controle, indometacina, extrato,
indometacina+extrato. Os ratos serão tratados por sete dias, sendo que dois grupos serão
tratados com extrato hidroalcoólico da Zollernia ilicifolia (168mg/rato) e dois grupos com água
destilada, por meio de gavagem (Carrier et al., 2002; Ritter et al., 2004; Dal-Pizzol et al.,
2006; Tadros et al., 2005). Do 7° para o 8° dia ficarão em jejum por 24 horas; após esse
período, por meio de gavagem, a indometacina (2,5 mg/rato) será administrada em dois
grupos, e também por meio de gavagem será administrado água destilada nos dois grupos
controle. Após administração da indometacina, os animais ficarão em jejum por 6 horas e
serão mortos por decapitação para exerese do estômago e observação das lesões gástricas.
Depois da avaliação macroscópica, o tecido será armazenado a -70oC para posterior análise
dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial.
3.6 Avaliação Macroscópica
A avaliação será realizada por dois observadores (cegos ao estudo) e o índice de
lesões ulcerativas (ILU), determinado após aplicação dos protocolos referentes aos modelos
de indução, irá ser calculado por meio de somatória dos parâmetros abaixo, de acordo com a
metodologia descrita por Gamberini. A escala é a seguinte: até 10 petéquias: 2 pontos; acima
de 10 petéquias: 3 pontos; úlceras de até 1mm: *n x 2 (*n=número de lesões encontradas);
úlceras maiores que 1mm: *n x 3 (*n=número de lesões encontradas); úlceras perfuradas: *n
x 4 (*n=número de lesões encontradas); hemorragia: 1 ponto; edema: 1 ponto; perda de
pregas: 1 ponto; perda da coloração: 1 ponto.
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3.7 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Como indício de peroxidação lipídica será medida a concentração de TBARS
durante uma reação ácida aquecida como previamente descrito (Dal-Pizzol et al., 2000).
Brevemente, as amostras obtidas serão misturadas com 1ml de ácido tricloroacético 10% e
1ml de ácido tiobarbitúrico, fervidas por 15 minutos e a quantidade de TBARS será
determinada por absorbância em 535 nm.
3.8 Medida do dano oxidativo em proteínas
O dano oxidativo em proteínas será determinado pela medida de grupos carbonil
conforme previamente descrito (Klamt et al., 2001). Brevemente, as amostras obtidas serão
precipitadas e as proteínas dissolvidas com dinitrofenilidrazina. Os grupamentos carbonil
serão medidos pela absorbância em 370 nm.
3.9 Medida de grupos sulfidrila
O ensaio será baseado na redução de 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
pelos tióis, que se tornam por sua vez oxidados, gerando um derivado amarelo cuja absorção
será medida por espectrofotômetro em 412 mm (Aksenov e Markersbery, 2001).
3.10 Atividades dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial
A atividade do complexo I será determinada de acordo com Birch-Machin e
colaboradores (1994) e será baseada na redução da absorbância devido à oxidação do
10
NADH em 340 nm. A atividade do complexo I será medida antes da adição de rotenona
(20g/mL) e a absorbância será acompanhada durante outros 3 minutos. A atividade do
complexo será determinada como atividade sensível à rotenona. A atividade do complexo II +
succinato desidrogenase será medida pelo método descrito por Fischer e colaboradores
(1985), onde a diminuição da absorbância do 2,6-DCIP em 600 nm será usada para o cálculo
da atividade do complexo II. Para o cálculo da SDH será utilizado o mesmo sistema na
presença de metassulfato de fenazina. A atividade do complexo III será determinada de
acordo com Birch-Machin e colaboradores (1994) e será baseada na redução do citocromo c
acompanhada a 550 nm a 37ºC. A reação será iniciada com a adição de decilubiquinol e
será acompanhado o aumento na absorbância a 550 nm durante 3 minutos a 37ºC devido à
redução do citocromo c. Após 3 minutos será acrescentada antimicina A (3µg/mL) e a
absorbância será acompanhada durante outros 3 minutos. A atividade do complexo III será
determinada como atividade sensível à antimicina. A atividade do complexo IV será
determinada de acordo com Rustin e colaboradores (1994), e será calculada pela diminuição
da absorbância causada pela oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm.
3.11 Avaliação da toxicidade
Serão realizados os testes bioquímicos TGO (transaminase glutâmico oxalacética)
e uréia com os kits comerciais.
3.12 Análise estatística
A diferença entre os grupos será avaliada pela análise de variância de uma via
(ANOVA). Quando o valor de F for significativo comparações post hoc serão feitas pelo teste
11
de Duncan. Diferença entre grupos individuais será avaliada com teste t de Student. A
análise de dados não-paramétricos também será realizada para os dados da avaliação
macroscópica de lesão.
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4 CRONOGRAMA DAS ATIVIDADES DE PESQUISA
Tabela 1: Atividades realizadas no ano 2009.
Atividade
Revisão bibliográfica
Preparação extratos
mai jun jul ago set out nov
X
X
X
X
X
X
X
Indução da gastrite e tratamento com o extrato
X
Avaliação macroscópica
X
Testes bioquímicos
X
Análise estatística
X
Término da elaboração do TCC e defesa
X
X
X
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5 ORÇAMENTO
Tabela 2: Orçamento dos gastos com a pesquisa.
Material de consumo
Valores
Animais
R$ 240,00
Indometacina
R$ 100,00
Reagentes para dosagem dos parâmetros de R$ 2.000,00
estresse oxidativo
Reagentes para dosagem dos complexos da R$ 2.000,00
cadeia respiratória
Sub-total: R$ 4.340,00
Este projeto esta sendo financiado pelas seguintes agências financiadoras UNESC, CNPq e
FAPESC.
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NORMAS DA REVISTA
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conhecimento de que serão submetidos a uma revisão editorial e de que não devem ter sido,
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19
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resultados do trabalho. Deve-se levar em conta que muitos serviços bibliográficos utilizam o
resumo tal como está escrito, por isso essa seção deve ser totalmente compreensível por si
mesma. Quando os manuscritos estiverem escritos em português ou espanhol deverão
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manuscrito estiver escrito em português ou espanhol, deverão ser incluídas também as
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Introdução: deve considerar, de forma sucinta, as publicações prévias mais importantes
sobre o tema e explicitar claramente as razões pelas quais o estudo foi realizado.
Materiais e métodos: descrição dos métodos, equipamentos e técnicas (incluindo
tratamentos estatísticos utilizados no estudo).
Resultados.
Discussão (pode ser combinada com a seção anterior).
Conclusões: não devem repetir aspectos mencionados na discussão ou nos comentários
introdutórios, devem ser conclusões genuínas derivadas dos resultados do estudo.
•
Agradecimentos e todas as informações adicionais referentes a subsídios, etc.
Referências: serão numeradas seqüencialmente, na ordem em que são citadas, no texto e
listadas separadamente (solicita-se o uso de recuo a partir da segunda linha). O estilo usado
para citar trabalhos de revistas (1), monografias (2) e capítulos de livros (3) deverá ser
estritamente observado, como segue nos seguintes exemplos:
(4) Souza, H.M., G.R. Borba-Murad, R. Curi, R. Galleto & R.B. Bazotte (2001) Res. Commun.
Molec. Pathol. Pharmacol. 110: 264-72.
Os nomes das revistas deverão ser abreviados de acordo com o critério utilizado pelo ISI
(pode ser consultado para isso o site http://library.caltech.edu/reference/abbreviations/)
21
(5) Minoia, C. & L. Perbellini (2000) Monitoraggio ambientale e biologico dell'esposizione
professionale a xenobiotici: chemoterapici antiblastici. Morgan, Milan, Vol. 3.
(6) Pathak, M.A. (1997) "Photoprotection against harmful effects of solar UVB and UVA
radiation: an update", in "Sunscreens: development, evaluation and regulatory aspects", (N.J.
Lowe, N.A. Shaath, M.A. Pathak, eds.) Marcel Dekker, New York, pp. 59-79.
Tabelas e Figuras: deverão ser numeradas utilizando números arábicos na ordem em que
aparecem no texto. As letras e os símbolos incluídos nas figuras deverão ter tamanho
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22
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
THALITA DA ROSA
AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS
Trabalho de conclusão de curso, apresentado para obtenção
do grau de Farmacêutico no curso de Farmácia da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck
CRICIÚMA, 16 DE NOVEMBRO DE 2009.
23
AVALIAÇÃO
DO
EFEITO
GASTROPROTETOR
DO
EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS
EVALUATION OF THE GASTROPROTECTIVE EFFECT OF Zollernia
ilicifolia (FABACEAE) EXTRACT IN RATS
Thalita da Rosa1, Giselli Scaini1, Débora D. Maggi1, Daiana P. Pezente1, Wanice L. Valerio1
Angela E. Rossato2, Patrícia A. Amaral2, Vanilde Citadini-Zanette3, Emilio L. Streck1*
1
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Criciúma, SC, Brasil;
2
G-FITO, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Criciúma, SC, Brasil;
3
Herbário Pe. Raulino Reitz, Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Unidade
Acadêmica de Humanidades, Ciências e Educação, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Criciúma, SC, Brasil.
Autor correspondente: Prof. Dr. Emilio L. Streck, Laboratório de Fisiopatologia
Experimental, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo
Sul Catarinense, Avenida Universitária, 1105, Bloco S, CEP 88806-000, Criciúma/SC, Brasil.
Fax: +55 48 3341 2644. E-mail: [email protected]
24
RESUMO
A Zollernia ilicifolia (Fabaceae) é uma planta nativa da Floresta Tropical Atlântica, é utilizada
principalmente contra úlceras e problemas estomacais. O objetivo deste estudo foi avaliar o
efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Z. ilicifolia em ratos, através dos complexos
da cadeia respiratória mitocondrial e da análise histológica do estômago dos ratos
submetidos a um modelo animal de gastrite induzido por indometacina. Ratos Wistar adultos
foram tratados com extrato e água destilada (controle), por meio de gavagem. Os animais
foram submetidos a jejum por 24h; após esse período foi administrado indometacina em dois
grupos e água destilada nos outros dois grupos. Os animais foram mortos após 6 horas por
decapitação para exerese do estômago e observação das lesões gástricas e posteriormente
para avaliação da cadeia respiratória mitocondrial. Os resultados mostraram que o extrato
não foi capaz de prevenir o aumento da lesão induzida pela indometacina e também pode
ser observado que o extrato não pode reverter à inibição da atividade da cadeia respiratória
mitocondrial.
Palavras-chave: Zollernia ilicifolia, gastrite, cadeia respiratória, planta medicinal.
25
ABSTRACT
Zollernia ilicifolia (Fabaceae) is a native plant from Brazil’s Tropical Forest, and is mainly used
for the treatment of gastric ulcers and other stomacal diseases. The aim of the present study
was to evaluate the gastroprotective effect of Z. ilicifolia extract in rats, by measuring the
activities of mitochondrial respiratiry chain and hystological analysis of the stomach in rats
submitted to an animal model of gastritis induced by indomethacin. Wistar adult rats were
treated with extract of distilled water (control group), by gavage. The animals were submitted
to fasting for 24 h; after that they received indomethacin or water. After 6 h, the animals were
killed by decapitation, and the stomach was removed for analysis of gastric lesions and
evaluation of mitochondrial respiratory chain complexes. The results demonstrated that the
extract was not able to prevent the appearance of gastric lesions induced by indomethacin.
Moreover, the extract did not prevent the inhibition in the activity of complexes I and III
caused by indomethacin.
Key words: Zollernia ilicifolia, gastritis, respiratory chain, medicinal plant.
26
INTRODUÇÃO
O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos 1. O uso de plantas e extratos vegetais
no tratamento de algumas doenças é um hábito bastante difundido no Brasil, devido a uma
importante fonte de produtos naturais biologicamente ativos e devido a sua grande
diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e biológicas, podendo
assim ser modelo para a síntese de inúmeros fármacos 2, 3. O Brasil é um país que apresenta
bastante biodiversidade, possuindo em seu território 20% do total de espécies vegetais
conhecidas no mundo. Apesar disso, apenas 8 % das espécies vegetais da flora brasileira foi
estudada em busca de compostos bioativos, sendo que boa parte delas possui patente
estrangeira, sendo exploradas por multinacionais, e 1.100 espécies foram avaliadas em suas
propriedades medicinais. Destas, 590 foram registradas no Ministério da Saúde para
comercialização 3.
Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de 80% da
população mundial faz uso de algum tipo de erva, buscando alívio para sintomas dolorosos
ou desagradáveis 4. Segundo Corrêa et al. 5, a OMS tem encorajado o estudo de plantas
tradicionais, com a esperança de obter os benefícios que elas poderiam possivelmente
fornecer, enquanto ao mesmo tempo poderia evitar os efeitos irracionais ou prejudiciais que
esse tipo de medicina pode ter. Sendo assim, existe um grande interesse científico pelo
desenvolvimento da pesquisa de plantas utilizadas na medicina popular, envolvendo áreas
multidisciplinares, como, por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica. O conhecimento
existente nas comunidades tradicionais sobre as propriedades terapêuticas das plantas
encontradas em seu ambiente natural pode ser uma ferramenta poderosa na descoberta de
novos medicamentos 1,5, 6.
27
A Zollernia ilicifolia (Fabaceae) é uma planta nativa da Floresta Tropical Atlântica
(Brasil), sendo encontrada principalmente nos estados da Bahia, Espírito Santo, São Paulo e
Santa Catarina. É conhecida popularmente como falsa espinheira-santa, mocitaíba,
laranjeira-do-mato,
moçataíba,
orelha-de-onça
e/ou
carapicica-de-folha-lisa.
Tradicionalmente, suas folhas são utilizadas internamente na forma de decocto contra
úlceras e problemas estomacais, inclusive dor 3, 7, 8. A Zollernia ilicifolia é uma árvore de porte
médio (aproximadamente 15 m); folhas simples coriáceas com cerca de 15 cm de
comprimento e 5 cm de largura, oblongas, com margens onduladas e providas de espinhos;
apresentam estípulas espessas (característica marcante na diferenciação da espinheirasanta verdadeira, Maytenus ilicifolia); e flores rosadas 9. Poucos estudos foram realizados
com essa planta. Gonzalez et al.
7
investigaram a atividade analgésica e antiulcerosa do
extrato metanólico 70% de folhas de Zollernia ilicifolia, Sorocea bomplandii e Maytenus
aquifolium. O extrato metanólico da Zollernia ilicifolia mostrou efeito analgésico e antiulceroso
sobre lesões gástricas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Em outro
estudo, Coelho et al.
10
observaram que a atividade antiulcerosa do extrato metanólico 70%
de Zollernia ilicifolia poderia estar relacionada à presença do flavonóide tetraglicosídeo, uma
vez que as estruturas são semelhantes às encontradas em espécies de Maytenus, plantas
com efeito analgésico e antiulceroso.
Considerando que a Zollernia ilicifolia é uma planta popularmente utilizada para
gastrite, mas com poucos estudos comprovando a sua ação farmacológica, o presente
estudo teve como objetivo avaliar o efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Zollernia
ilicifolia em um modelo animal de gastrite induzido por indometacina, através da avaliação da
atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial.
28
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais: Para realização dos experimentos foram utilizados ratos Wistar machos pesando
entre 250 e 300 g, provenientes do Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense
(UNESC). Os animais foram mantidos em ambiente climatizado (22oC) com ciclos claroescuro de 12 horas, com água e alimentação ad libitum.
Preparação do extrato: As folhas secas e maceradas foram colocadas em um recipiente
contendo o líquido extrator (álcool 70%) deixando-se em repouso durante um período de 21
dias. Após este período, com auxílio de funil e gaze, o extrato é filtrado e concentrado em
estufa numa temperatura de 45ºC. A determinação dos sólidos totais foram obtida através
do peso da cápsula de porcelana previamente submetida à estufa a 120ºC por 3 horas e
depois em 24 horas em dessecador vazia (pC1), subtraída pelo peso da cápsula adicionada
10 mL do extrato com total evaporação do solvente em estufa a 120ºC (pC2), realizada
através do cálculo pC2 – pC1 x 100/10. O extrativo sólido foi obtido pela
concentração/evaporação do solvente, para posterior obtenção da concentração da planta a
ser utilizada.
Indução do modelo de gastrite e tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia
ilicifolia: Os animais foram divididos em quatro grupos: controle, indometacina, extrato,
indometacina+extrato. Os ratos foram tratados por sete dias, sendo que dois grupos foram
tratados com extrato hidroalcoólico da Zollernia ilicifolia (168 mg/rato) e dois grupos com
água destilada, por meio de gavagem
11,12,13,14
. Do 7° para o 8° dia ficaram em jejum por 24
horas; após esse período, por meio de gavagem, a indometacina (2,5 mg/rato) foi
administrada em dois grupos, e também por meio de gavagem foi administrada água
29
destilada nos dois grupos controle. Após a administração da indometacina, os animais
permaneceram em jejum por seis horas e foram mortos por decapitação para exerese do
estômago e observação das lesões gástricas. Depois da avaliação macroscópica, o tecido foi
armazenado a -70oC para posterior análise dos complexos da cadeia respiratória
mitocondrial.
Avaliação Macroscópica: A avaliação foi realizada por dois observadores (cegos ao estudo)
e o índice de lesões ulcerativas (ILU), determinado após aplicação dos protocolos referentes
aos modelos de indução, foi calculado por meio de somatória dos parâmetros abaixo, de
acordo com a metodologia descrita por Gamberini et al.15. A escala foi a seguinte: até 10
petéquias: 2 pontos; acima de 10 petéquias: 3 pontos; úlceras de até 1mm: *n x 2
(*n=número de lesões encontradas); úlceras maiores que 1mm: *n x 3 (*n=número de lesões
encontradas); úlceras perfuradas: *n x 4 (*n=número de lesões encontradas); hemorragia: 1
ponto; edema: 1 ponto; perda de pregas: 1 ponto; perda da coloração: 1 ponto.
Atividades dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial: A atividade
16
do complexo I foi avaliada pelo método descrito por Cassina & Radi
pela taxa de NADH-
dependente da redução do ferricianeto a 420 nm. As atividades enzimáticas do complexo II
foram medidas pelo método descrito por Fischer e colaboradores
17
, onde a diminuição da
absorbância do 2,6-DCIP em 600 nm é usada para o cálculo da atividade do complexo II. A
atividade enzimática do complexo II-III foram medidas pelo método descrito por Fischer e
colaboradores
17
, onde a redução do citocromo c oxidado na presença de azida e rotenona
acompanhada em 550 nm é avaliado. A atividade do complexo IV foi determinada de acordo
com Rustin e colaboradores
18
, e é calculada pela diminuição da absorbância causada pela
oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm.
30
Análise estatística: A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de
uma via (ANOVA). Quando o valor de F for significativo, comparações post hoc foram feitas
pelo teste de Duncan.
RESULTADOS
O objetivo deste trabalho foi avaliar um possível efeito gastroprotetor em um modelo
animal de gastrite induzido por indometacina. Foi demonstrado que a administração do
extrato de Zollernia ilicifolia não alterou o escore de lesão gástrica, sugerindo que o mesmo
não é tóxico para o estômago. Além disso, como já demonstrado em outros estudos, a
indometacina aumentou o escore de lesão; o tratamento com o extrato não foi capaz de
prevenir esse aumento (Figura 1).
Em relação aos complexos da cadeia respiratória mitocondrial, foi demonstrado que a
atividade dos complexos I e III foi inibida pela indometacina e que o tratamento com o extrato
não foi capaz de prevenir essa inibição (Figuras 2 e 4, respectivamente). O complexos II e IV
não foram alterados pela indometacina ou pelo extrato de Zollernia ilicifolia (Figuras 3 e 5,
respectivamente).
DISCUSSÃO
A gastrite é uma lesão gástrica, patologicamente caracterizada pela inflamação
inespecífica da mucosa do estômago
19
. Apesar de a definição ser histológica, o diagnóstico
geralmente é feito pelo clínico e/ou endoscopista, prescindindo da microscopia
20
. A gastrite
afeta milhões de pessoas em todo o mundo e traz inúmeros custos à sociedade, torna a vida
31
das pessoas difíceis, além de levar muitas vezes à morte. Vários fatores estão associados ao
desenvolvimento das úlceras e gastrites, como o hábito de fumar, utilizar bebidas alcoólicas,
a alimentação, o estresse diário, a presença da bactéria Helicobacter pylori na mucosa do
trato intestinal e a utilização de fármacos anti-inflamatórios utilizados em excesso como é o
caso da indometacina. Sua maior prevalência é pela Helicobacter pylori, mas também ocorre
frequentemente pela ingestão de álcool ou de anti-inflamatórios não-esteróides (AINES) e
intoxicações ou infecções 20,21,22.
A expansão mundial do consumo de álcool e AINES têm contribuído para o
crescimento de úlcera gástrica. Os AINES estão entre os fármacos mais utilizados/prescritos
e que mais desencadeiam efeitos indesejáveis. A maioria desses efeitos relaciona-se ao
sistema digestório, destacando-se a capacidade de causar principalmente gastrite aguda,
dispepsia e úlcera péptica
20, 23
. Os AINES, tais como a indometacina, tem a capacidade de
causar lesões hemorrágicas na mucosa gástrica decorrentes da inibição da síntese de
prostanglandinas, inibição da ciclooxigenase via metabolismo do ácido araquidônico e assim
reduzindo o efeito protetor da superfície da mucosa causando as gastrites e as úlceras
22, 24,
25
. A secreção ácida aumentada também contribui para este processo prejudicial, tal como o
fato de provocar distúrbios na microcirculação gástrica, aumento da infiltração de neutrófilos ,
induz a expressão de TNF- , e perturba o equilíbrio entre óxido nítrico e apoptose. A
introdução de antagonistas dos receptores histamínicos e inibidores de bomba de prótons
têm sido associados com um aumento na taxa de cura da úlcera 23.
O sucesso dos tratamentos farmacológicos para prevenir ou curar lesões ulcerativas
depende não só do bloqueio da secreção ácida, mas também em aumentar fatores
protetores da mucosa incluindo prostaglândinas, fatores de crescimento, somatostatina, o
óxido nítrico e compostos sulfidrílicos 23.
Os compostos ativos da Zollernia ilicifolia ainda não são conhecidos, mas a presença
32
de flavonóides, triterpenos e taninos identificados nesta planta podem ser considerados
como possíveis compostos ativos contra lesões gástricas por aumento dos fatores de
proteção. Estes dados justificam a utilização popular desta planta como analgésica e
antiulcerosa. Além disso, os dados fitoquímicos obtidos são importantes para o controle da
qualidade deste produto 7.
Vários estudos demonstram que defeitos da cadeia respiratória podem levar a
estresse oxidativo, que pode, por sua vez, danificar os complexos da cadeia respiratória,
gerando um ciclo vicioso que pode resultar na morte da célula. Por exemplo, a rotenona,
inibidor do complexo I, a azida, inibidor do complexo IV e o malonato, inibidor da sucinato
desidrogenase, aumentam a produção de radicais livres in vivo e in vitro. Por outro lado, o
grupamento Fe-S, presentes no complexo I da cadeia respiratória e na sucinato
desidrogenase, é sensível ao ataque de radicais superóxido, que são produzidos pela própria
cadeia respiratória. Além disso, substratos energéticos apresentam efeitos neuroprotetores
que podem ser aumentados por antioxidantes. O complexo III também é especialmente
sensível ao estresse oxidativo 25.
Sendo assim, os resultados apresentados neste estudo indicaram que a Zollernia
ilicifolia não obteve efeito gastroprotetor no modelo animal utilizado, isto pode estar
relacionado com o solvente utilizado para obtenção do extrato da planta, pois o solvente
utilizado foi o álcool 70%, sendo que Gonzalez e colaboradores 7, utilizaram em seu estudo o
metanol para obtenção do extrato, podendo este ter uma eficácia melhor em relação aos
compostos extraídos desta planta. Além disso, a indometacina inibiu a atividades dos
complexos I e III, os mais sensíveis ao estresse oxidativo. Mais estudos são necessários
para verificar se outros parâmetros de metabolismo energético, inflamação e estresse
oxidativo estão alterados no estômago dos animais submetidos a esse modelo animal de
gastrite.
33
CONCLUSÃO
Com base em nossos dados, é possível afirmar que o extrato hidroalcoólico da
Zollernia ilicifolia não possui efeito gastroprotetor neste modelo animal de gastrite, como
demonstrado pelo fato de não prevenir o dano causado pela indometacina na mucosa
gástrica. Esses resultados foram contraditórios a resultados obtidos em outro estudo com a
mesma planta, considerando assim que devido a poucos estudos realizados sobre a ação
farmacológica da Zollernia ilicifolia, serão necessários outros estudos para a confirmação do
efeito gastroprotetor da planta.
34
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36
Figura 1. Avaliação macroscópica da mucosa gástrica após a indução do modelo animal de
gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. *Diferente do grupo
controle, p<0,05 (n=6).
37
Figura 2. Atividade do complexo I na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de
gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. *Diferente do grupo
controle, p<0,05 (n=6).
38
Figura 3. Atividade do complexo II na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de
gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. Não houve diferença
significativa entre os grupo (n=6).
39
Figura 4. Atividade do complexo III na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de
gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. *Diferente do grupo
controle, p<0,05 (n=6).
40
Figura 5. Atividade do complexo IV na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de
gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. Não houve diferença
significativa entre os grupo (n=6).