PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA E QUÍMICA
FORENSE
REAGENTES UTILIZADOS NA DETECÇÃO DE MANCHAS DE SANGUE
Wilson Martins De Oliveira¹
Paulo Roberto Martins Queiroz²
1 Licenciado em Química pela Universidade Católica de Brasília. Aluno de Especialização
em Farmácia e Química Forense pela Universidade Católica de Goiás/IFAR.
2 Biólogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília. Professor do
IFAR/PUC-GO. Endereço: IFAR Instituto de Estudos Farmacêuticos. SHCGN 716 Bl B Lj
05 Brasília-DF CEP: 70770-732. e-mail: [email protected]
RESUMO
Uma das principais evidências biológicas encontradas em local de crime é sem dúvida, o
sangue. Para identificar as manchas de sangue deixadas pelos possíveis suspeitos ou
vítimas, os peritos utilizam testes com reagentes especiais nestas amostras, chamados de
testes de presunção. O presente estudo teve como objetivo mostrar as alguns tipos de
reagentes usados na detecção de manchas de sangue no local de crime. A análise de
evidência encontrada pelo perito possibilita a materialização do acontecimento. Amostras
de manchas localizadas em um local de crime são de grande importância para a resolução
do mesmo. Para testar esta hipótese foi feito um levantamento bibliográfico sobre métodos
de detecção de manchas de sangue, empregado em análises forenses. Testes de presunção
são feitos em algumas manchas através de reagentes químicos para a verificação de sangue
genérico. Em caso positivo, a amostra é encaminhada para o laboratório para ser analisada
e comparada entre as diversas técnicas de pesquisa de sangue humano para a confirmação
da sua origem.
Palavras-Chave: sangue, detecção de sangue, teste de presunção.
ABSTRACT
The major biological evidence found at crime scene is undoubtedly the blood. To identify
the bloodstains left by the possible suspects or victims, experts use tests with special
reagents in these samples, called tests presumption. This study aims to show some types of
reagents used in the detection of blood stains at the crime scene. The analysis of evidence
found by the expert allows the materialization of the event. Samples of spots located in a
crime scene are of great importance for solving it. To test this hypothesis we reviewed the
literature on methods for detection of blood stains, used in forensic analysis. Tests are
made assumption in some spots through chemical reagents for checking blood generic. If
so, the sample is sent to the lab to be analyzed and compared between the various research
techniques on human blood to confirm their origin.
Keywords: blood, blood detection test, the presumption
INTRODUÇÃO
Uma grande variedade de produtos químicos pode ser utilizada em testes
presuntivos para detectar sinais de amostra de sangue. Métodos de detecção de sangue ou
são baseados na detecção de hemoglobina e seus derivados (teste catalítico) ou na detecção
de proteínas e aminoácidos (não covalentemente ligada às proteínas). No entanto, o uso de
algumas substâncias químicas pode ter efeitos adversos e, também, tem mostrado
potenciais riscos à saúde do perito. Por exemplo, a benzidina tem propriedades
cancerígenas (ALMEIDA, 2009).
Em diversos artigos tem-se discutido aquilo que o perito espera dos testes de
presunção para o diagnóstico de sangue em local de crime, e sem dúvida, o sangue é um
dos mais frequentes vestígios encontrados em locais de crime, especialmente crimes contra
a pessoa. Pode parecer fácil apontar para uma mancha vermelha e dizer se tratar de sangue.
Caso a mancha seja contígua a uma lesão aberta e hemorrágica de um cadáver, não há
porque que duvidar de sua composição. Mas nem sempre é assim que são encontradas as
manchas de sangue (CRDIAS, 2011).
Crimes violentos, infelizmente, acontecem todos os dias e um dos objetivos básicos
da análise da cena do crime pelo perito é achar evidências de sangue. As técnicas de
investigação com recursos científicos remontam ao século I, quando o romano Quintiliano
descobriu que um homem assassinou a própria mãe depois de analisar vestígios de sangue
nas mãos do culpado. A partir de então muitos foram os avanços no conhecimento
científico que deram suporte às investigações dos mais diversos vestígios (CHEMELLO,
2007).
Manchas de sangue estão presentes em quase todo local de crime contra a pessoa
como homicídio, infanticídio, aborto, lesão corporal, maus-tratos e acidentes de um modo
geral. Diante de tais vestígios, é possível extrair muitas informações que serão decisivas
para a investigação policial, como a compatibilidade entre volume sanguíneo e o
ferimento, a dinâmica do fato, a dosagem de algumas drogas, a identificação da vítima e/ou
suspeito, dentre outras possibilidades. Entretanto, para que tudo isso ocorra, é necessário
confirmar se uma determinada mancha, hematóide, é mesmo sangue (DIAS FILHO, 2010).
O sangue detectado em locais de crime, nas roupas usadas pela vítima ou pelo
suspeito, em veículos, ou em objetos apreendidos, é uma das evidências físicas mais
importantes em investigações criminais sendo, muitas vezes, decisivo para a resolução do
inquérito policial. Se adequadamente coletado e preservado, o sangue encontrado pode
estabelecer uma forte relação entre o assassino, a vítima e a cena do crime. Na tentativa de
ocultar vestígios, os criminosos podem lavar as manchas, tornando-as invisíveis a olho nu.
Contudo, o sangue latente pode ser detectado por meio de alguns reveladores químicos,
tais como, a fenolftaleína, benzidina e luminol, dentre outros reagentes. Com o
aperfeiçoamento das técnicas forenses, gradativamente mais centradas na análise
molecular, deve-se ter a preocupação de que os reveladores usados para detecção de
sangue não alterem a estrutura das moléculas biológicas, especialmente, o ácido
desoxirribonucléico (ALMEIDA, 2009).
Essas possíveis alterações comprometem a evidência física e, conseqüentemente,
têm impacto negativo na investigação forense, especialmente, a longo prazo, pois muitas
amostras são armazenadas para testes de confirmação e genotipagem que serão executados
semanas ou meses após sua coleta na cena do crime. Dessa forma, uma análise detalhada
do impacto dos agentes reveladores sobre a integridade molecular do sangue em manchas é
fundamental para uma boa prática forense (ALMEIDA, 2009).
Além disso, segundo Dias Filho (2010) vale ressaltar que o resultado positivo para
o teste colorimétrico, ainda que seja sangue, não necessariamente se trata de sangue
humano. Todos os vertebrados e alguns poucos invertebrados possuem hemoglobina como
metaloproteína responsável pelo transporte dos gases respiratórios e, portanto, o sangue de
qualquer um daqueles organismos resultaria em cor avermelhada no teste. Daí a presunção
do teste: o resultado positivo não descarta a possibilidade de ser sangue (humano ou não).
Dessa forma, tais recursos favorecem o questionamento de quais reagentes devem ser
usados no local de crime por despertar grande interesse na área forense, favorecendo assim
o processo de detecção e análises futuras dos vestígios. Além disso, o perito deve avaliar
quais são os melhores reagentes para o diagnóstico da mancha de sangue, para não
comprometer a amostra que irá seguir para o laboratório.
A partir dessas informações o objetivo desse trabalho foi descrever alguns dos
reagentes que são utilizados na prática forense para a detecção e análise de vestígios de
sangue encontrados em cenas de crime.
METODOLOGIA
Trata-se de uma revisão de literatura baseada em trabalhos científicos que trataram
do tema em questão. Parte do material utilizado foi obtido em bases de dados, tais como,
Scielo, Bireme, Google Acadêmico e artigos disponíveis em sites de Universidades. Outra
parte do material utilizado foi obtido por meio de teses e monografias de mestrado e
doutorado disponíveis na biblioteca da Universidade Católica de Brasília. As palavraschaves utilizadas foram sangue, detecção de sangue e teste de presunção.
DESENVOLVIMENTO
O Sangue
O sangue é o meio líquido que flui pelo sistema circulatório entre os diversos
órgãos transportando nutrientes, hormônios, eletrólitos, água, resíduos do metabolismo
celular e diversas outras substâncias (SOUZA; ELIAS, 2006).
O sangue é um tecido composto por plasma e componentes celulares como, por
exemplo, leucócitos, eritrócitos e plaquetas. Sua principal função é transportar oxigênio
para os tecidos e remover o dióxido de carbono (ALMEIDA, 2009).
Segundo Almeida (2009) a hemoglobina adulta contém quatro cadeias
polipeptídicas, cada uma com um grupo prostético heme, responsável pela coloração
vermelha dos eritrócitos (Figura 1).
Figura 1. Representação da estrutura protéica da molécula de hemoglobina. Fonte:
CHEMELLO (2007).
O grupo heme é sintetizado a partir da glicina. É formado por um complexo anel
porfirínico IX e um átomo ferroso (Fe+2) conjugado. Está unido a cada uma das cadeias
polipeptídicas da hemoglobina por meio de uma ligação ao grupo R de um resíduo de
histidina. A sexta ligação de coordenação do átomo de ferro em cada grupo heme é
empregada para ligar o O2 (Figura 2) (ALMEIDA, 2009).
Figura 2 – Complexo heme contendo um átomo de ferro ligado em sua porção
central. Fonte: CHEMELLO (2007).
De acordo com Almeida (2009) grupos heme em uma solução oxigenada são
rapidamente oxidados da forma ferrosa (Fe2+), que liga reversivelmente ao O2, para a
forma férrica (Fe3+), que não se liga ao O2. A liberação do grupo heme da globina leva à
oxidação do ferro e à geração da hematina (Figura 3). O grupo heme, sobretudo no estado
férrico, pode exercer uma “falsa” atividade enzimática, participando de reações de óxidoredução, tais como, na oxidação de moléculas lipídicas (ALMEIDA, 2009).
Figura 3. Liberação do grupo heme da globina formando a estrutura molecular da
hematina. Fonte: ALMEIDA (2009).
Fora do organismo, o sangue está sujeito a uma série de processos de degradação.
Com o passar do tempo e a conseqüente oxidação da hemoglobina, o átomo de ferro muda
de heme para hemina ou hematina. Essa conversão ocasiona a alteração da cor da mancha
de sangue de vermelha para marrom. No estado férrico, o grupo heme possui atividades
catalíticas e capacidade de participar em reações de oxidação e redução como um grupo de
enzimas chamadas peroxidases. Essa atividade é empregada como base dos testes
presuntivos para identificação de sangue (ALMEIDA, 2009).
TESTES PRESUNTIVOS
Após averiguação da evidência para identificar possíveis manchas de substância
hematóide, são realizados exames para pesquisa de sangue genérico. Nestes testes são
aplicadas reações de oxidação, altamente sensíveis, que podem detectar traços de sangue
por meio de reações de cor ou luminescência (SAWAYA; ROLIM, 2003).
Conforme Almeida (2009) os testes presuntivos para detecção de sangue, também
chamados testes de orientação, têm como princípio uma reação de oxidação de uma
substância (indicador) por um agente oxidante, catalisada na presença de sangue.
Segundo Mesquita (2010) exames presuntivos de sangue são geralmente catalíticos,
envolvem o uso de agente oxidante como o peróxido de hidrogênio e um indicador que
muda de cor (ou luminescente), o qual sinaliza a oxidação catalisada pela hemoglobina
como se fosse uma enzima peroxidase. Este comportamento de peroxidase da hemoglobina
foi descoberto em 1863 pelo cientista alemão Schönbein. Desde então, inúmeros testes de
presunção foram elaborados.
Do total de reagentes que existem, apenas um pequeno número tem interesse
prático no campo da ciência forense. Os reagentes aqui apresentados são: Reagente de
Kastle-Meyer, reagente de benzidina e luminol.
FENOLFTALEÍNA (reagente de Kastle-Meyer)
A fenolftaleína mantém-se incolor em soluções ácidas e torna-se cor-de-rosa em
soluções básicas. A sua cor muda a valores entre pH 8,2 e pH 9,8 (RODRIGUES, 2011).
De acordo com Delecave (2011) a fenolftaleína é um indicador de pH e reage
quando em contato com substâncias de caráter básico – como o sangue, que é ligeiramente
básico – e fica com uma cor rosa. Mas se a substância for ácida ou neutra, nada acontece.
Portanto, a fenolftaleína não reage apenas com sangue, mas com qualquer substância de
pH básico, como sabão em pó, por exemplo. Para aumentar a precisão, o teste de
identificação de sangue – conhecido como teste de Kastle-Meyer – também tem água
oxigenada em sua composição (DELECAVE, 2011).
O peróxido de hidrogênio H2O2(aq)(água oxigenada) é usado como catalisador para
acelerar a reação que muda de cor sinalizando que houve a oxidação (DOREA;
STUMVOLL; QUINTELA, 2005).
Apesar deste exame apresentar resultados falso positivos, isso não tem ocorrido
com outros fluidos corpóreos. Esse teste não é tão sensível quanto o luminol, contudo,
detecta o sangue mesmo que tenha sido diluído de 1:10.000 e não é carcinogênico
(VIRKLER; LEDNEV, 2009).
O reagente de Kastle-Meyer é constituído por uma mistura de substâncias. Um
exemplo de proporção seria 0,1 g de fenolftaleína, 2,0 g de hidróxido de sódio (sob a forma
de pastilhas ou lentilhas), 2,0 g de pó de zinco metálico e 10 mL de água destilada. Na
Figura 4 tem-se as reações que ocorrem tanto no processo de produção do reagente como
nas que ocorrem quando ele é aplicado na suposta mancha de sangue (CHEMELLO,
2007).
A
B
Figura 4: Representação das reações relacionadas ao preparo do reagente de
Kastle-Meyer (A) e utilização desse reagente em ensaios de orientação para a presença de
sangue (B). Fonte: DIAS FILHO (2010).
Dias Filho (2010) descreve quais são os fundamentos envolvidos nesse teste
presuntivo explicando que o resultado observado deve-se ao fato de ao se adicionar água
oxigenada (peróxido de hidrogênio) a atividade catalítica das moléculas de hemoglobina
entra em ação e decompõe o peróxido em água e oxigênio nascente. Esse último reage com
a fenolftaleína, transformando-a em sua forma oxidada (vermelha).
O produto de interesse é o hidrogênio nascente, que garantirá a forma incolor da
fenolfatelína. Se a amostra for de sangue, esta terá, necessariamente, hemoglobina, a qual
possui a característica de decompor o peróxido de hidrogênio (comportamento de
peroxidase) em água e oxigênio nascente. Então, este oxigênio promoverá a forma colorida
da fenolftaleína, evidenciando ao perito que a amostra pode conter sangue (CHEMELLO,
2007).
LUMINOL (5-amino-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona)
Outro produto químico usado em procedimentos periciais é o 5-amino-2,3-di-hidro1,4-ftalazinadiona, mais conhecido por luminol (Figura 5) é um composto que, sob
determinadas condições, pode fazer parte de uma reação quimioluminescente. Uma das
formas de obtê-lo é a partir do ácido 3-nitroftálico, conforme mostra a figura 6
(CHEMELLO, 2007).
Figura 5. Estrutura molecular da 5-amino-2,3-dihidroftolazina-1,4-diona, reagente
conhecido como luminol (Fonte: ASSUNÇÃO, 2009).
O luminol foi desenvolvido em 1929 por O. H. Albrecht e é capaz de reagir com o
ferro presente no sangue. Quando entra em contato com essa substância química, o sangue
brilha com uma cor azul-fluorescente. Com o uso de luz-negra o brilho pode ser visto mais
claramente (DELECAVE, 2011).
Figura 6. Processo de síntese química do reagente químico luminol. Fonte:
CHEMELLO (2007).
Na cena do crime nem sempre há evidências visíveis de sangue. Alguém poderia,
por exemplo, limpar o local a fim de encobrir o acontecido. Porém, como uma solução a
esse fator limitante da atividade forense, o luminol reage com quantidades muito diminutas
de sangue. Sua sensibilidade pode chegar à escala de nanogramas de vestígio, mesmo este
estando depositado em superfícies, tais como, azulejos, pisos cerâmicos ou de madeira, os
quais tenham sido lavados. Com a utilização desse produto é possível a detecção de sangue
mesmo que já tenham se passado seis anos da ocorrência do crime. A reação química
produzida não afeta a cadeia de DNA, permitindo o reconhecimento dos criminosos ou das
vítimas a partir do DNA recuperado da cena de crime. Por isso, ele é recomendado para
locais nos quais há suspeita de homicídio e superfícies que, aparentemente, não exibem
traços de sangue (Figura 7) (CHEMELLO, 2007).
A
B
Figura 7. Exemplo de aplicação do luminol em um ambiente sem (A) e com a
aplicação do reagente (B). Fonte: HARRIS (2011).
De acordo com Albertin et al. (1998) além do luminol, são necessárias para a
ocorrência de quimioluminescência um reagente oxidante como, por exemplo, peróxido
(H2O2), oxigênio (O2) e hipoclorito (HClO) e, normalmente, um catalisador (metais de
transição, por exemplo, o íon do elemento ferro que está presente nos grupos heme da
hemoglobina).
Como desvantagem, o reagente apresenta baixa especificidade, gerando resultados
falso-positivos com peroxidases de plantas, íons metálicos como cobalto, cobre e ferro,
hipoclorito, algumas tintas esmaltadas e outros reagentes oxidantes (ALMEIDA, 2009).
A reação mostra-se mais eficiente em meio básico, podendo ser feita em solventes
próticos (normalmente água) ou dipolares apróticos (como o dimetilsulfóxido - DMSO).
Fora do organismo, o centro metálico dos grupos heme presente na hemoglobina do sangue
oxida-se de ferro (II) a ferro (III) e este último catalisa a oxidação do luminol pelo
peróxido de hidrogênio e, também, o mecanismo de decomposição do próprio peróxido
(ALBERTIN et al., 1998).
De acordo com Chemello (2007) é possível, por meio da análise do espectro
eletromagnético, identificar o comprimento de onda emitido pelo processo de
quimioluminescência do luminol (aproximadamente 431 nm) quando da reação de
oxidação com o peróxido de hidrogênio.
Benzidina (Teste de Adler-Ascarelli)
A benzidina (4,4’-diaminobifenil) é o reagente que apresenta maior sensibilidade,
característica fundamental para um teste de triagem. A reação de oxidação da benzidina em
meio ácido resulta na formação de um intermediário de coloração azul e, após alguns
minutos, de um produto final de coloração marrom (Figura 8). A estabilidade do
intermediário azul é maximizada em pH 4,5, assim, a reação é conduzida na presença de
ácido acético. O teste é realizado em dois estágios para reduzir a ocorrência de resultados
falso-positivos (ALMEIDA, 2009).
Figura 8. Reação de oxidação da benzidina em presença do peróxido de hidrogênio
(ALMEIDA, 2009).
O uso da benzidina tem sido evitado em muitos laboratórios forenses devido ao seu
potencial carcinogênico (BLUM; ESPERANÇA; ROCQUEFELTE, 2006). Em estudo
realizado por Pascual; Grifo (1999), resultados falso-negativos para o teste da benzidina
foram observados quando suco de limão foi adicionado a amostras de sangue. Isso pode ter
ocorrido devido à presença de ácido ascórbico presente no limão, o qual é um forte agente
redutor.
Os testes de orientação são largamente utilizados para detectar sangue diluído ou
que não pode ser visto a olho nu. Embora sua utilidade seja inquestionável, para decidir o
melhor reagente a ser utilizado é aconselhado observar seus benefícios e limitações,
considerando-se que podem ser obtidos: reações com resultados falsos positivos,
sensibilidade em traços extremamente diluídos, mas também é muito importante observar
as limitações para a tipagem de DNA (GAROFANO et al., 2006).
As técnicas de investigação de presunção de sangue são de uso simples, apesar de
todas exigirem a utilização de produtos químicos na sua preparação estes processos são
elementares e os testes podem ser comprados em forma de kits (WEBB; CREAMER;
QUICKENDEN, 2006).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Pode-se comprovar que o êxito da abordagem pericial depende, em grande parte,
das técnicas que permitem a detecção da mancha de sangue para que a amostra siga para
um estudo mais detalhado nos laboratórios forenses.
Dos reagentes estudados neste trabalho, observa-se que o reagente de Kastle-Meyer,
reagente de benzidina e luminol apresentam os resultados mais confiáveis de presunção
quando utilizados em campo pelos peritos. Entretanto, há que se atentar para as
desvantagens de cada reagente. Sabe-se que além de serem tóxicos os reagentes usados nos
testes de presunção não são capazes de determinar a origem do sangue em questão, ou seja,
se é humano ou não.
Mesmo sabendo-se que esses reagentes não sejam totalmente eficientes, são de
grande importância nas investigações policiais, em especial para a perícia, tendo em vista,
que é a correta utilização destes testes que irá, com confirmações laboratoriais mais
avançadas, constatar a natureza do sangue em um vestígio.
Além disso, o emprego desses reagentes na prática forense é a possibilidade de uso
do sangue para outras análises, tais como, a obtenção de DNA para estudos de vínculo
genético.
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