Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Química
Coordenação de Pós-graduação em Química Orgânica
Estudo fitoquímico de Simaba polyphylla (Cavalcante) Thomas e
Simaba guianensis subesp. ecaudata (Cronquist)
Rita de Cássia Saraiva Nunomura
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Curso de Doutorado em Química Orgânica
Orientador: Dr. Angelo C. Pinto.
Rio de Janeiro
2005
FOLHA DE APROVAÇÃO
Estudo fitoquímico de Simaba polyphylla (Cavalcante) Thomas e Simaba
guianensis subesp. ecaudata (Cronquist)
Rita de Cássia Saraiva Nunomura
Tese submetida ao corpo docente do Departamento de Química Orgânica do Instituto de
Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários
à obtenção do grau de Doutor.
Aprovada por:
Dr. Angelo da Cunha Pinto (Orientador) ______________________________________
IQ-UFRJ
Dr. Adrian Martin Pohlit (Co-orientador) _______________________________________
CPPN-INPA
Dra. Ana Cláudia Fernandes Amaral _________________________________________
FIOCRUZ
Dr. Mário Geraldo de Carvalho _____________________________________________
UFRRJ
Dra. Cláudia Moraes Rezende ______________________________________________
IQ-UFRJ
Dr. Carlos Roland Kaiser __________________________________________________
IQ – UFRJ
Dr. Ricardo Machado Kuster (Suplente) ______________________________________
CPPN-UFRJ
Rio de Janeiro
2005
FICHA CATALOGRÁFICA
Nunomura, Rita de Cássia Saraiva
Estudo fitoquímico de Simaba polyphylla (Cavalcante) Thomas e Simaba
guianensis subesp. ecaudata (Cronquist)
Rio de Janeiro: IQ-UFRJ, 2005.
xxxi, 247 p.
Tese de Doutorado em Ciências – Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Química, 2005. Orientador: Angelo da Cunha Pinto
1. Simaroubaceae. 2. Triterpenos. 3. Alcalóides. 3. CLAE.
I. Título.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, Senhor de todas as coisas e que em todos os momentos
da minha vida tem demonstrado sua infinita fidelidade, amor e misericórdia. Ao meu Deus que tem
me capacitado e suprido todas as minhas necessidades, a minha eterna gratidão e louvor.
Aos meus pais, pelo amor, paciência e apoio em todas as etapas da minha vida, inclusive a
profissional que permitiram chegar a mais uma etapa.
Ao Prof. Angelo da Cunha Pinto pela orientação, apoio, amizade e confiança depositada
para a realização desse trabalho. Pela lição de vida e amizade demonstrada a todos nós que
passamos pelo 621.
Ao Dr. Adrian Martin Pohlit pela orientação no INPA, apoio, amizade e oportunidade
oferecida para realização de parte do trabalho na CPPN – INPA.
Ao meu marido, Sergio, pelo apoio em todas horas e auxílio nas análises e execução do
trabalho, pela orientação e paciência. Com certeza, esse trabalho não teria sido realizado sem o
seu apoio, independente da distância.
A Dra. Ana Cláudia F. Amaral pela colaboração, apoio e grande amizade em todas as
horas no período de trabalho na FIOCRUZ.
Ao Prof. Mário Geraldo pela participação na banca de defesa.
Ao Prof. Raimundo Braz-Filho pela participação na banca de defesa.
Ao Prof. Ricardo Kuster pela amizade e participação na banca de defesa.
Ao Prof. Dr. Massayoshi Yoshida pela contribuição nesse trabalho, apoio e amizade.
Aos Professores do IQ-UFRJ que muito contribuíram para o meu aprendizado, Prof. Kover,
Prof. Francisco Radler, Prof. Luiz Nelson, Profa. Lígia Valente, Profa. Rosane S. Gil e Prof. Kaiser.
A Prof. Claudia Rezende, pelo apoio, amizade e contribuição em várias etapas do trabalho.
Aos amigos do Laboratório 621, Flávio, que muito nos ensina com seu exemplo de pessoa,
pela paciência em nos ajudar com o necessário para a realização das atividades de laboratório. A
Núbia, pela grande amizade e pelo exemplo de amor à pesquisa, paciência e perseverança,
também por compartilhar os momentos de saudades de casa. A Josélia, pela amizade e os
v
divertidos momentos de descontração no laboratório. A Michelle, pela amizade e apoio nas
dificuldades para a realização de atividades. A Carol, Bárbara, Adriana, André e Patrícia pela
amizade e momentos de descontração proporcionados. A Ricardo, pela amizade e auxílio nas
análises cromatográficas e na utilização do polarímetro. Aos amigos Túlio, Sandra, Júnior, Adriana,
Marilza, José Celso, Andréia, Emerson, Rogério, Paulo, Rodrigo, Ricardo pela amizade e
momentos no Instituto de Química. Ao amigo Anderson Canuto pelo auxílio nas horas de
dificuldade.
Aos amigos do INPA, em especial a Gláucia, Patrícia, Aline, Yara, Ellen, Erika e Tatiane
pela amizade, pelo auxílio na execução de trabalhos e pelos muitos momentos agradáveis e pelo
apoio nas horas de dificuldade. Aos amigos, Alfeu, Daniel, Suniá, Marycleuma, Isabel, Rodrigo,
Elaine e Miriam pelos momentos agradáveis de convivência.
Aos amigos de Farmanguinhos, Thalia, Carla, Marcos Jun, Wagner, aos amigos do PN-3
pelo apoio, amizade e em especial a Carine, Leandro e Renata pela amizade e auxílio nas horas
necessárias. Ao Zé do Massa, pela amizade, pelos bons momentos de conversa e ensino sobre
química e música. A todos que de alguma forma não têm seus nomes escritos aqui mas, são
lembrados pelos bons momentos que passei em Farmanguinhos-Fiocruz.
Aos meus “pais cariocas” Abner e Gloria que me acolheram nos momentos necessários e
muito me apoiaram, com muito amor e paciência, para cumprir essa etapa. À Rose, minha amiga,
irmã que considero, pela companhia, apoio e amizade inesquecíveis. Aos amigos da PIBB pela
amizade e apoio.
Aos técnicos e pesquisadores da Central Analítica da USP, Farmanguinhos, IQ-UFRJ e
UFAM pela obtenção dos espectros.
Aos amigos do Rio de Janeiro, Fred e Anderson, pela amizade e apoio oferecido no início
do doutorado.
A todos os amigos que de alguma forma deram seu apoio e embora seus nomes não
sejam citados não são menos importantes.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
vi
“O princípio da sabedoria é: Adquire a
sabedoria; sim, com tudo o que possuis,
adquire o entendimento. Estima-a, e ela
te exaltará; se a abraçares, ela te
honrará...”
Provérbios de Salomão
vii
Aos meus pais João e Francisca, aos
meus irmãos e ao meu amado Sergio.
viii
Lista de abreviaturas
AcOEt - Acetato de etila
ACN – Acetonitrila
CCD – Cromatografia em camada delgada
CG – Cromatografia gasosa
CG/EM – Cromatografia gasosa acoplada a Espectrômetro de massas
CV% - Coeficiente de Variação
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CI50 – Concentração inibitória em 50%
CL50 – Concentração letal em 50%
δ - deslocamento químico
d – Dubleto
dd – Duplo dubleto
ddd – Duplo duplo dubleto
DCM – Diclorometano
DEPT – “Distortionless Enhancement by Polarization Transfer”
DMSO - Dimetilsulfóxido
EFS – Extração em Fase Sólida
EM – Espectro de massas
eV – Elétron-Volt
FID – “Flame Ionization Detector” (Detetor de ionização de chama)
FIOCRUZ – Fundação Instituto Oswaldo Cruz
Fr. – Fração
Hex – Hexano
HETCOR – Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 13C-1H
HBBD - Hydrogen Broad-Band Decoupling
HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
ix
HOMOCOSY – Homonuclear Correlation Spectroscopy
HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
IQ-UFRJ – Instituto de Química – Universidade Federal do Rio de Janeiro
IV – Infravermelho;
J – Constante de acoplamento em Hertz
m – Mutlipleto
MeOH – Metanol
Me - Metila
MPLC – Cromatografia líquida de média pressão
NOESY - Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy
PF – Ponto de fusão
p/p - relação peso por peso.
q – Quarteto
RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13C
RP-18 – “Reverse Phase” (Fase Reversa)
s – Singleto
sl – Singleto largo
UFC – Universidade Federal do Ceará
UV - Ultravioleta
UV/VIS – Ultravioleta/Visível
λ - Comprimento de ondas
µg – Microgramas
t – Tripleto;
tR- Tempo de retenção
TFA – Ácido trifluoroacético
TMS – Tetrametilsilano.
x
Sumário
Agradecimentos .............................................................................................................................. iv
Lista De Abreviaturas ...................................................................................................................... viii
Resumo ...........................................................................................................................................xxx
Abstract ...........................................................................................................................................xxxi
1. Introdução ................................................................................................................................... 01
1.1. A família Simaroubaceae............................................................................................... 01
1.2. Triterpenos e a formação dos quassinóides.................................................................. 04
1.3. Alcalóide indólicos β-carbolínicos e tipo cantinona ....................................................... 13
1.4. O gênero Simaba ........................................................................................................... 17
1.4.1. Simaba cedron Planch.......................................................................................... 18
1.4.2. Simaba orinocencis Kunth .................................................................................... 21
1.4.3. Simaba cuneata A. St Hil & Tul............................................................................. 22
1.4.4. Simaba cuspidata Spruce ex Engl........................................................................ 24
1.4.5. Simaba guianensis Aubl. ..................................................................................... 25
1.4.6. Simaba multiflora A. Juss. . .................................................................................. 27
1.4.7 Simaba obovata Spruce ex Engler ........................................................................ 31
1.5. A espécie Simaba polyphylla (Cavalcante) Thomas. ....................................................... 33
1.6. Simaba guianensis subesp. ecaudata Cronquist............................................................... 35
2. Objetivos...................................................................................................................................... 38
3. Parte Experimental...................................................................................................................... 39
3.1. Materiais e métodos....................................................................................................... 39
xi
3.1.1. Equipamentos ...................................................................................................... 39
3.1.2. Métodos cromatográficos..................................................................................... 40
3.1.3. Métodos espectroscópicos .................................................................................. 41
3.1.4. Reagentes e solventes ........................................................................................ 44
3.2. Trabalho fitoquímico realizado com Simaba polyhphylla .............................................. 44
3.1.2. Coleta do material botânico ................................................................................. 44
3.2.2. Preparação de extratos........................................................................................ 44
3.2.3. Preparação dos extratos dos galhos para fracionamento por partição e
cromatográfico ................................................................................................................ 49
3.2.4. Fracionamento do extrato hexânico dos galhos de Simaba polyhphylla ............ 51
3.2.5. Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de Simaba
polyhphylla (SPGC1.46) ................................................................................................. 52
3.2.5.1. Separação cromatográfica da subfração 55-63 da fração 9-10 de
SPGC1.46................................................................................................................. 54
3.3. Trabalho fitoquímico realizado com os galhos de Simaba guianensis subesp. ecaudata
(Cronquist) ............................................................................................................................. 56
3.3.1. Coleta do material botânico .................................................................................. 56
3.3.2. Preparação dos extratos....................................................................................... 56
3.3.3. Preparação dos extratos dos galhos para fracionamento por partição e
cromatográfico ................................................................................................................ 60
3.3.4. Separação cromatográfica do extrato hexânico dos galhos de Simaba guianensis
subesp. ecaudata............................................................................................................ 60
3.3.5. Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de Simaba
guianensis susbesp. ecaudata ....................................................................................... 64
xii
3.4. Quantificação de 9-metoxi-cantin-6-ona nos extratos e frações dos galhos de Simaba
polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata em CLAE ................................................................ 66
3.4.1. Método de análise em CLAE ................................................................................ 66
3.4.2. Curva de calibração .............................................................................................. 66
3.4.3. Preparação das amostras..................................................................................... 67
3.4.3.1. Tratamento dos extratos metanólicos........................................................ 67
3.4.3.2. Tratamento dos extratos aquosos dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis subesp. ecaudata................................................................................ 68
3.5. Avaliação da atividade biológica de extratos e frações de galhos e folhas de Simaba
polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata ....................................................................... 69
3.5.1. Ensaios de atividade letal contra microcrustáceos Artemia franciscana ............ 70
3.5.2. Avaliação da citotoxicidade in vitro de extratos e frações dos galhos de Simaba
polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata................................................................. 71
3.5.2.1. Material e método de análise.................................................................. 71
3.5.3. Teste de atividade biológica contra larvas de Aedes aegypti .............................. 72
4. Resultados e discussão .............................................................................................................. 73
4.1. Isolamento e identificação das substâncias extraídas dos galhos de Simaba polyphylla
(Cavalcante) Thomas ............................................................................................................ 73
4.1.1. Niloticina............................................................................................................... 73
4.1.2. Diidroniloticina...................................................................................................... 79
4.1.3. Taraxerona........................................................................................................... 84
4.1.4. 9-metoxi-cantin-6-ona .......................................................................................... 89
4.1.5. Ácido 7-metoxi-β-carbolin 1 il-(Z)-prop-2-enóico ................................................. 94
xiii
4.2. Isolamento e identificação das substâncias isoladas dos galhos de Simaba guianensis
subesp. ecaudata Cronquist.................................................................................................. 98
4.2.1. Óxido de cariofileno .............................................................................................. 98
4.2.2. Piscidinol A............................................................................................................102
4.2.3. Alcalóides do tipo cantinona de Simaba guianensis subesp. ecaudata ...............109
4.2.3.1. 9-metoxi-cantin-6-ona ........................................................................................109
4.2.3.2. 6-metoxi-β-carbolin-1-il-(Z)-prop-2-enóico ............................................................109
4.3. Quantificação dos extratos e frações dos galhos de Simaba polyphylla e S. guianensis
subesp. ecaudata .....................................................................................................................113
4.3.1. Análise dos extratos metanólicos dos galhos de S. polyphylla e S. guianensis
subesp. ecaudata............................................................................................................114
4.3.2. Análise dos extratos aquosos dos galhos de S. polyphylla e S. guianensis subesp.
ecaudata. ........................................................................................................................117
4.3.3. Análise das frações clorofórmicas dos galhos de S. polyphylla e S. guianensis. ..120
4.3.4. Curva de calibração e quantificação das amostras. ..............................................122
4.4. Avaliação da citotoxicidade in vitro dos extratos e frações de Simaba polyphylla e
Simaba guianensis subesp. ecaudata. ...........................................................................127
4.5. Avaliação da atividade larvicida em Aedes aegypti e citotóxica em microcrustáceos
Artemia franciscana ........................................................................................................133
5. Conclusões .................................................................................................................................137
6. Referências Bibliográficas ..........................................................................................................139
7. Anexos ........................................................................................................................................157
xiv
Índice de Figuras
Figura 1 - Simaba polyphylla........................................................................................................... 33
Figura 2 - Distribuição geográfica da espécie Simaba polyphylla .................................................. 34
Figura 3 - Exsicata da espécie Simaba guianensis subesp. ecaudata ......................................... 36
Figura 4 – Distribuição geográfica da espécie Simaba guianensis subesp. ecaudata .................. 37
Figura 5 - Principais correlações heteronucleares C-H à longa distância observadas em 73....... 77
Figura 6 - Principais correlações heteronucleares observadas no HMBC para diidroniloticina..... 83
Figura 7. Principais correlações heteronucleares observadas no HMBC para taraxerona ........... 87
Figura 8 - Principais correlações C-H à longa distância, observadas para 35 .............................. 93
Figura 9 - Principais correlações C-H observadas no HMBC para piscidinol A.............................107
Figura 10 - Principais correlações observadas no espectro de NOESY para piscidinol A ............107
Figura 11 – Cromatograma de 9-metoxi-cantinona com tr de 21,3 minutos...................................114
Figura 12 - Cromatogramas dos extratos metanólicos dos galhos de Simaba polyphylla.............115
Figura 13. Cromatogramas dos extratos metanólicos dos galhos de Simaba guianensis subesp.
ecaudata .........................................................................................................................................116
xv
Figura 14 - Cromatogramas da fração obtida por EFS do extrato metanólico dos galhos de S.
polyphylla: SPG-2.166 (azul) – eluída com MeOH/AcOEt (7:3); SPG-2.166p (vermelho) – com
adição de padrão.............................................................................................................................117
Figura 15 - Cromatogramas das frações de EFS obtidas do extrato aquoso dos galhos de Simaba
polyphylla.........................................................................................................................................118
Figura 16 - Cromatogramas das frações de EFS obtidas do extrato aquoso dos galhos de S.
guianensis subsp. ecaudata............................................................................................................119
Figura 17 - Cromatogramas da fração 3 do extrato aquoso de Simaba guianensis subsp. ecaudata
com e sem co-injeção de padrão 9-metoxicantin-6-ona.................................................................120
Figura 18 - Cromatogramas da fração clorofórmica de S. polyphylla com e sem coinjeção de
padrão 9-metoxicantin-6-ona ..........................................................................................................121
Figura 19 - Cromatogramas da fração clorofórmica de Simaba guianensis subsp. ecaudata com e
sem co-injeção de padrão 9-metoxicantin-6-ona............................................................................121
Figura 20 – Curva de calibração do alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona a 254 nm ............................123
xvi
Índice de Quadros
Quadro 1 – Esqueletos típicos dos quassinóides ........................................................................... 10
Quadro 2 – Quassinóides isolados de Simaba cedron e Ailanthus altissima................................. 11
Quadro 3 – Esqueletos básicos de alcalóides tipo cantinona ....................................................... 15
Quadro 4 – Exemplos de cantinonas encontradas com diferentes funções orgânicas.................. 16
Quadro 5 - Quassinóides isolados de S. cedron Planch ................................................................ 20
Quadro 6 - Metabólitos isolados de Simaba orinocensis Kunth. .................................................... 22
Quadro 7 - Metabólitos isolados de Simaba cuneata ..................................................................... 23
Quadro 8 - Constuintes químicos de Simaba cuspidata................................................................. 24
Quadro 9 - Metabólitos isolados da casca de Simaba guianensis ................................................ 26
Quadro 10 – Substâncias isoladas de S. multiflora ....................................................................... 29
Quadro 11 – Substâncias isoladas de Simaba multilfora .............................................................. 30
Quadro 12. Constituintes químicos isolados de Simaba obovata .................................................. 32
xvii
Índice de esquemas
Esquema 1 – Formação do precursor dos triterpenos pela junção cauda-cauda de duas unidades
pirofosfato de farnesila .................................................................................................................... 06
Esquema 2 – Formação do triterpeno eufol a partir do epóxido de esqualeno.............................. 08
Esquema 3 – Formação de quassinóides e limonóides a partir do eufol/tirucalol.......................... 09
Esquema 4 – Proposta biossintética para o quassinóide Cedrolactona ........................................ 12
Esquema 5 – Formação de alcalóides β-carbolínicos .................................................................... 14
Esquema 6 – Preparação de extratos e frações dos galhos de Simaba polyphylla (Espécime 1) 46
Esquema 7 – Preparação de extratos e frações dos galhos de S. polyphylla (espécime 2) ......... 47
Esquema 8 – Preparação de extratos e frações das folhas de S. polyphylla ................................ 48
Esquema 9 – Preparação dos extratos e fracionamento por partição dos galhos de Simaba
polyphylla ........................................................................................................................................ 50
Esquema 10 – Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico dos galhos de S. polyphylla ..51
Esquema 11 - Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de S. polyphylla .....53
Esquema 12 - Separação cromatográfica da fração 9-10 de SPGC1.46 ......................................55
xviii
Esquema 13 - Preparação de extratos e frações dos galhos de Simaba guianensis subesp.
ecaudata (espécime 1) .. .......... .................................................. .................................................. 57
Esquema 14 - Preparação de extratos e frações dos galhos de Simaba guianensis subesp.
ecaudata (espécime 2) .. .......... .................................................. .................................................. 58
Esquema 15 - Preparação de extratos e frações das folhas de Simaba guianensis subesp.
ecaudata ......................................................................................................................................... 59
Esquema 16 - Preparação de extratos e fracionamento por partição dos extratos dos galhos de
Simaba guianensis subesp ecaudata ............................................................................................ 61
Esquema 17 - Separação cromatográfica do extrato hexânico de Simaba sp nov. (SNG1.4) ...... 62
Esquema 18 - Separação cromatográfica da fração 64-69 de SNG1.4 ........................................ 63
Esquema 19 - Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de Simaba guianensis
subesp. ecaudata ........................................................................................................................... 65
Esquema 20 - Tratamento dos extratos metanólicos de S. polyphylla e S. guianensis ................ 68
Esquema 21 - Tratamento realizado com os extratos aquosos dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis subsp. ecaudata ........................................................................................................... 69
Esquema 22. Proposta para as principais fragmentações da niloticina (73).................................. 78
Esquema 23. Proposta para as principais fragmentações observadas no espectro de massas da
taraxerona (75)................................................................................................................................ 85
xix
Esquema 24. Proposta para as principais fragmentações de 9-metoxi-cantin-6-ona.................... 90
Esquema 25. Proposta de fragmentação de 76 para formação do pico base de m/z 250 ............ 97
Esquema 26. Proposta para as principais fragmentações do óxido de cariofileno no EM ............ 99
Esquema 27. Proposta para as principais fragmentações de Piscidinol A no EM ..................... 103
xx
Índice de tabelas
Tabela 1 – Comparação da localização dos gêneros sob diferentes classificações da família
Simaroubaceae ............................................................................................................................... 03
Tabela 2 – Deslocamentos químicos observados de RMN 1H e
13
C para a substância (73) em
CDCl3 .............................................................................................................................................. 75
Tabela 3 - Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
substância (73) ............................................................................................................................... 77
Tabela 4 – Deslocamentos químicos observados de RMN 1H e 13C para a substância 74 em CDCl3.
......................................................................................................................................................... 80
Tabela 5 – Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
substância 74. ................................................................................................................................. 82
Tabela 6 – Dados de RMN de 1H (200 MHz) e de
13
C (50 MHz) para a substância 75 em CDCl3 e
dados para a taraxerona da literatura ............................................................................................. 86
Tabela 7 – Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
substância 75. ................................................................................................................................ 88
Tabela 8 – Deslocamentos químicos de RMN 1H e
(35)
13
C observados para a 9-metoxi-cantin-6-ona
.............................................................................................................................................. 91
Tabela 9 – Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
substância 35 .................................................................................................................................. 93
xxi
Tabela 10 - Deslocamentos químicos de RMN1H (500 MHz) e RMN13C (125 MHz) observados para
(76) e correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY e HMBC (em CDCl3). ................. 95
Tabela 11 – Deslocamentos químicos por RMN 1H (300 MHz) e RMN13 (75 MHz) em CDCl3 do
óxido de cariofileno (77) ..................................................................................................................100
Tabela 12 - Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMBC para a
substância (77)................................................................................................................................101
Tabela 13 - Deslocamentos químicos de RMN 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) em CDCl3 observados
para SNGH1.159 e comparação com Piscidinol A ........................................................................104
Tabela 14 – Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMBC para
Piscidinol A .....................................................................................................................................106
Tabela 15 – Correlações observadas no espectro bidimensional de NOESY de Piscidinol A ......108
Tabela 16 – Deslocamentos químicos de RMN 1H (500 MHz), RMN
13
C (125 MHz) e correlações à
longa distância observadas no espectro de HMBC para a substância (79) (em MeOD)...............111
Tabela 17 – Áreas médias correspondentes às soluções padrão de 9-metoxi-cantin-6-ona ........122
Tabela 18 - Valores das áreas médias e concentrações dos extratos e frações de S. polyphylla e S.
guianensis, obtidos por análise em CLAE .....................................................................................124
Tabela 19 – Valores de concentração de 9-metoxi-cantin-6-ona nas diferentes soluções de extratos
aquosos e metanólicos de S. polyphylla e S. guianensis subsp. ecaudata ...................................125
xxii
Tabela 20 – Relação percentual de 9-metoxi-cantinona presente nos extratos e frações dos galhos
de S. polyphylla e S. guianensis. ....................................................................................................126
Tabela 21 – Citotoxicidade dos extratos e frações obtidos dos galhos e folhas de Simaba polyphylla
na concentração de 120 µg/mL.......................................................................................................128
Tabela 22 – Citotoxicidade dos extratos e frações obtidos dos galhos e folhas de S. guianensis
subsp. ecaudata na concentração de 120 µg/mL ..........................................................................129
Tabela 23. Atividade citotóxica em Artemia franciscana (Af) e larvicida em Aedes aegypti (Aa) de
extratos de galhos de folhas de Simaba polyphylla........................................................................133
Tabela 24. Atividade citotóxica (Artemia franciscana – Af) e larvicida (Aedes aegypti – Aa) das
frações obtidas por partição dos galhos de Simaba polyphylla......................................................134
Tabela 25. Atividade citotóxica em Artemia franciscana (Af) e larvicida em Aedes aegypti (Aa) de
extratos de galhos de folhas de Simaba guianensis subesp. ecaudata .........................................135
Tabela 26. Atividade citotóxica (Artemia franciscana – Af) e larvicida (Aedes aegypti – Aa) das
frações obtidas por partição dos galhos de S. guianensis .............................................................135
xxiii
Índice de Anexos
Espectro de IV da niloticina (73). ....................................................................................................158
Espectro de Massas de baixa resoluçao da niloticina (73)............................................................159
Espectro de RMN 1H da niloticina (73) em 200 MHz (CDCl3) ........................................................160
Espectro de RMN 1H da niloticina (73) em 200 MHz (CDCl3) – ampliação....................................161
Espectro de RMN 1H da niloticina (73) em 200 MHz (CDCl3) – ampliação da região alifática ......162
Espectro de RMN 13C (HBBD) da niloticina (73) (50 MHz – CDCl3)...............................................163
Espectro de DEPT 135 da niloticina ...............................................................................................164
Espectro de DEPT 90 da niloticina .................................................................................................165
Espectro de HOMOCOSY da niloticina...........................................................................................166
Espectro de HMQC da niloticina .....................................................................................................167
Espectro de HMQC da niloticina – ampliação ................................................................................168
Espectro de HMBC da niloticina .....................................................................................................169
Espectro de HMBC da niloticina – ampliação.................................................................................170
xxiv
Espectro de IV da diidroniloticina (74)............................................................................ 171
Espectro de Massas de baixa resolução da diidroniloticina. ..........................................................172
Espectro de RMN 1H da diidroniloticina (200 MHz-CDCl3).............................................................173
Espectro de RMN 1H da diidroniloticina (200 MHz-CDCl3) – ampliação ........................................174
Espectro de RMN 13C (HBBD) da diidroniloticina (50 MHz – CDCl3) .............................................175
Espectro de DEPT135 da diidroniloticina. ......................................................................................176
Espectro de DEPT 90 da diidroniloticina.........................................................................................177
Espectro de HOMOCOSY da diidroniloticina..................................................................................178
Espectro de HOMOCSY da diidroniloticina – ampliação ................................................................179
Espectro de HMQC da diidroniloticina ...................................................................................180
Espectro de HMQC da diidroniloticina – ampliação........................................................................181
Espectro de HMBC da diidroniloticina.............................................................................................182
Espectro de IV da taraxerona (75) ..................................................................................................183
Espectro de massas de baixa resolução da taraxerona.................................................................184
Espectro de RMN 1H da taraxerona (200 MHz – CDCl3)................................................................185
xxv
Espectro de RMN 13C (HBBD) da taraxerona (50 MHz – CDCl3)...................................................186
Espectro de DEPT 135 da taraxerona ............................................................................................187
Espectro de DEPT 90 da taraxerona ..............................................................................................188
Espectro de HOMOCOSY da taraxerona .......................................................................................189
Espectro de HMQC da taraxerona..................................................................................................190
Espectro de HMQC da taraxerona – ampliação .............................................................................191
Espectro de HMBC da taraxerona ..................................................................................................192
Espectro de HMBC da taraxerona – ampliação..............................................................................193
Espectro de IV da 9-metoxi-cantin-6-ona (35) ................................................................................194
Espectro de massas de baixa resolução da 9-metoxi-cantin-6-ona...............................................195
Espectro de RMN 1H da 9-metoxi-cantin-6-ona (200 MHz – CDCl3)..............................................196
Espectro de RMN 1H da 9-metoxi-cantin-6-ona – ampliação da região aromática ........................197
Espectro de RMN 13C (HBBD) da 9-metoxi-cantin-6-ona (50 MHz – CDCl3) .................................198
Espectro de HOMOCOSY da 9-metoxi-cantin-6-ona .....................................................................199
xxvi
Espectro de HOMOCOSY da 9-metoxi-cantin-6-ona – ampliação da região aromática................200
Espectro de HMQC da 9-metoxi-cantin-6-ona................................................................................201
Espectro de HMBC da 9-metoxi-cantin-6-ona ................................................................................202
Espectro de HMBC da 9-metoxi-cantin-6-ona – ampliação da região aromática...........................203
Espectro de IV de SPGC2.147 – 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76) .................204
Espectro de massas de baixa resolução de 76 ..............................................................................205
Espectro de RMN 1H de 76 (500 MHz – CDCl3) .............................................................................206
Espectro de RMN 1H de 76 (500 MHz – CDCl3) – ampliação da região aromática .......................207
Espectro de RMN13C (HBBD) de SPGC2.147 (76) (125 MHz – CDCl3) ........................................208
Espectro de HOMOCOSY do ácido 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76) ............209
Espectro de HOMOCOSY do ácido 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76) ............210
Espectro de HMQC de 76 ...............................................................................................................211
Espectro de HMQC de 76 – ampliação...........................................................................................212
Espectro de HMBC de 76................................................................................................................213
xxvii
Espectro de HMBC de 76 –ampliação ............................................................................................214
Espectro de IV do óxido de cariofileno (77) ....................................................................................215
Espectro de massas de baixa resolução do óxido de cariofileno ...................................................216
Espectro de RMN 1H do óxido de cariofileno (200 MHz-CDCl3).....................................................217
Espectro de RMN 1H do óxido de cariofileno – ampliação da região alifática................................218
Espectro de RMN 13C (HBBD) do óxido de cariofileno (50 MHz – CDCl3)...................................219
Espectro de DEPT 135 do óxido de cariofileno ..............................................................................220
Espectro de DEPT 90 do óxido de cariofileno ................................................................................221
Espectro de HOMOCOSY do óxido de cariofileno .........................................................................222
Espectro de HOMOCOSY do óxido de cariofileno – ampliação ................................................223
Espectro de HMQC do óxido de cariofileno....................................................................................224
Espectro de HMBC do óxido de cariofileno ....................................................................................225
Espectro de IV do Piscidinol A (78).................................................................................................226
Espectro de massas de baixa resolução de piscidinol A................................................................227
xxviii
Espectro de RMN 1H de piscidinol A (500 Mhz – CDCl3)..............................................................228
Espectro de RMN 1H de piscidinol A (500 Mhz – CDCl3) – ampliação da região alifática............229
Espectro de RMN 1H de piscidinol A (500 Mhz – CDCl3) – ampliação da região de hidrogênios
carbinólicos e hidrogênio insaturado ..............................................................................................230
Espectro de RMN 13C (HBBD) do piscidinol A (500 MHz – CDCl3)..............................................231
Espectro de HOMOCOSY de piscidinol A ......................................................................................232
Espectro de HOMOCOSY de piscidinol A – ampliação..................................................................233
Espectro de HMQC de piscidinol A.................................................................................................234
Espectro de HMQC de piscidinol A – ampliação ............................................................................235
Espectro de HMBC de piscidinol A .................................................................................................236
Espectro de HMBC de piscidinol A – ampliação.............................................................................237
Espectro de NOESY de piscidinol A ...............................................................................................238
Espectro de IV de SNGC2.146 – ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) ......239
Espectro de massas do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79).....................240
xxix
Espectro de RMN 1H do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) (500 MHz –
MeOD) .............................................................................................................................................241
Espectro de RMN 1H do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) (500 MHz –
MeOD) – ampliação da região aromática .......................................................................................242
Espectro de RMN 13C (HBBD) do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) (125
MHz – MeOD) .................................................................................................................................243
Espectro de DEPT do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) Espectro de
HMQC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) ...........................................244
Espectro de HMQC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) .......................245
Espectro de HMBC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) .......................246
Espectro de HMBC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) .......................247
xxx
Resumo
Espécies da família Simaroubaceae são conhecidas por suas propriedades
medicinais empregadas tradicionalmente na região amazônica. Esse trabalho
descreve o estudo de duas espécies do gênero Simaba. A espécie Simaba
polyphylla, conhecida popularmente como “serve para tudo” e “marupazinho”, e a
espécie Simaba guianensis subesp. ecaudata. O estudo fitoquímico dos galhos de
Simaba polyphylla resultou no isolamento dos triterpenos niloticina, diidroniloticina
e taraxerona, do alcalóide citotóxico 9-metoxi-cantin-6-ona, isolados pela primeira
vez nessa espécie, e do alcalóide 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico,
isolado pela primeira vez como produto natural. O fracionamento dos galhos de S.
guianensis subesp. ecaudata resultou no isolamento do triterpeno citotóxico
piscidinol A, do alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona, do sesquiterpeno óxido de
cariofileno isolados pela primeira vez nessa espécie, e do novo alcalóide 6-metoxi(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico. Foi realizada a quantificação de 9-metoxicantin-6-ona em diferentes extratos e frações dos galhos das duas espécies em
estudo por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência. A concentração de 9-metoxicantin-6-ona, determinada nos extratos metanólicos e aquososos, foi muito inferior
à concentração citotóxica dessa substância. A avaliação da citotoxicidade in vitro
em células tumorais tipo MDA-MB, B-16 e HCT8 de extratos e frações de galhos e
folhas de S. polyhpylla e S. guianensis demonstrou que os extratos hexânicos e
metanólicos dos galhos das duas espécies são altamente citotóxicos.
xxxi
Abstract
Simaroubaceae species are well-known in the medicinal medicine in the
Amazon region. This work describes the study of two species of Simaba genus,
Simaba polyphylla, popularly known as “serve para tudo” and “marupazinho”, and
Simaba guianensis ssp. ecaudata. The phytochemical work from stems of Simaba
polyphylla afforded three triterpenes nilocitin, dihydronilocitin and taraxenon and
the cytotoxic alkaloid 9-metoxy-canthin-6-one, isolated for the first time from this
species and the alkaloid 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-yl)-(Z)- prop-2-enoic, isolated
for the first time as natural product. The fractionation of stems of S. guianensis ssp.
ecaudata resulted in the cytotoxic triterpene piscidinol A, the alkaloid 9-methoxycanthin-6-one, caryophyllene oxide, isolated for the first time from this species and
a new alkaloid 6-methoxy-(9H-β-carbolin-1-yl)-(Z)- prop-2-enoic. Quantification of
9-methoxy-canthin-6-one in different extracts and fractions of stems of both
species by high performance liquid chromatography was also done. The obtained
levels of 9-metoxy-canthin-6-one in methanol and aqueous extracts were inferior to
the known cytotoxic concentration of this compound. Screening of in vitro
cytotoxicity with tumor cells MDA-MB, B-16 and HCT8, of hexanic and methanolic
extracts of stems and leaves of S. polyphylla and S. guianensis have shown a very
high activity.
Estudo fitoquímico de Simaba polyphylla (Cavalcante) Thomas e Simaba
guianensis subsp. ecaudata (Cronquist)
1. Introdução
1.1. A família Simaroubaceae
Essa família é caracterizada por árvores e arbustos distribuídas nas regiões
tropicais e subtropicais, freqüentemente relacionada com as famílias Rutaceae,
Meliaceae e Burseraceae. Dentro deste grupo, está mais próximo à família
Rutaceae no que se refere à composição química, anatomia da madeira, ausência
de vasos condutores de resina na casca e estames livres; diferenciando-se
apenas pela ausência de cavidades secretoras de óleos aromáticos nas folhas e
partes florais (FERNANDO & QUINN, 1992) e a presença de quassinóides
exclusivamente na família Simaroubaceae (THOMAS, 1990).
As espécies vegetais dessa família são conhecidas por apresentarem
princípios amargos com notáveis propriedades medicinais e são muito utilizadas
popularmente como vermífugos, antivirais e no combate a febres, entre outras
propriedades (RIBEIRO, et al 1999).
O principal centro de distribuição das espécies dessa família ocorre na
América tropical, estendendo-se para o oeste da África, Madagascar, Ásia,
Malásia e região da Austrália banhada pelo Pacífico (FERNANDO & QUINN, 1992;
SIMÃO et al., 1991).
2
“A família Simaroubaceae é uma reunião heterogênea de gêneros que não
têm uma única característica em comum, fato esse não encontrado em outras
famílias” (FERNANDO & QUINN, 1992). Pode-se notar essa heterogeneidade
quando observamos as diferentes classificações da família quanto à ordem e o
número de gêneros que são mostrados na Tabela 1. A família é classificada em
três
diferentes
ordens:
Rutales
(RENDLE,
1938;
GUNDERSEN,
1950;
HUTCHINSON, 1959 e 1973; SCHOLZ, 1964; TAKHTAJAN, 1973 e 1987;
THORNE, 1983 e 1992; DAHLGREN, 1980 e 1989 apud FERNANDO & QUINN,
1992), Sapindales (CRONQUIST, 1981 e 1988 apud FERNANDO & QUINN, 1992)
e Geraniales (ENGLER, 1931 apud FERNANDO & QUINN, 1995).
3
Tabela 1. Comparação da localização dos gêneros (em itálico) sob diferentes classificações da
família Simaroubaceae (FERNANDO & QUINN, 1992).
Engler (1931)
ROSALES
CHRYSOBALANACEAE
Stylobasium
Cronquist (1981, 1988)
ROSALES
SURIANACEAE
Stilobasium
Suriana
Cadellia
Guilfoylia
Takhjatan (1987)
SAPINDALES
STYLOBASIACEAE
Stylobasium
Thorne (1992)
SAPINDALES
SAPINDACEAE
Stylobasium
GERANIALES
SIMAROUBACEAE
Surianoideae
Suriana
Cadellia
Guilfoylia
Recchia
SAPINDALES
SIMAROUBACEAE
RUTALES
SURIANACEAE
Suriana
Cadellia
Guifoylia
RUTALES
SURIANACEAE
Suriana
SIMAROUBACEAE
Recchioideae
Recchia
SIMAROUBACEAE
Simarouboideae
Cadellia
Guilfoylia
Recchia
Simarouba
Simaba
Quassia
Samadera
Hannoa
Eurycoma
Recchia
Simarouboideae
Simarouba
Simaba
Quassia
Samadera
Hannoa
Eurycoma
Harrisonia
Holacantha
Castela
Brucea
Picrasma
Perriera
Aeschrion
Picrolemma
Ailanthus
Soulamea
Amaroria
Gymnostemon
Nothospondias
Simarouboideae
Simarouba
Simaba
Quassia
Samadera
Hannoa
Eurycoma
Harrisonia
Holacantha
Castela
Brucea
Picrasma
Perriera
Aeschrion
Picrolemma
Ailanthus
Soulamea
Amaroria
Simarouboideae
Quassia (incluindo Simaba e
Simarouba)
Picramnioideae
Picramnia
Picramnioideae
Picramnia
Picramnioideae
Picramnia
Picramnioideae
Picramnia
Alvaradoideae
Alvaradoa
Alvaradoideae
Alvaradoa
Alvaradoideae
Alvaradoa
Alvaradoideae
Alvaradoa
Kirkioideae
Kirkia
Pleiokirkia
Kirkioideae
Kirkia
KIRKIACEAE
Kirkia
Kirkioideae
Kirkia
Irvingioideae
Irvingia
Klainedoxa
Desbordesia
Irvingioideae
Irvingia
Klainedoxa
Desbordesia
IRVINGIACEAE
Irvingia
Klainedoxa
Desbordesia
Allantospermun
Irvingioideae
Irvingia
Klainedoxa
Desbordesia
Allantospermun
LINALES
IXONANTHACEAE
Allantospermun
Samadera
Hannoa
Eurycoma
Harrisonia
Holacantha
Castela
Brucea
Picrasma
Perriera
Aeschrion
Picrolemma
Ailanthus
Soulamea
Amaroria
Holacantha
Castela
Brucea
Picrasma
Perriera
Aeschrion
Picrolemma
Ailanthus
Soulamea
Amaroria
RUTACEAE
Harrisonia
4
As diferentes classificações taxonômicas da família Simaroubaceae não se
limitam aos dados apresentados na Tabela 1. PLANCHON (1846) foi o primeiro a
propor uma classificação dentro da família dividindo-a em quatro tribos
(Simaroubeae, Harrisoneae, Ailantheae e Spatheliae), baseada na natureza dos
ovários, número de óvulos, tipo de embrião, comprimento do filamento e número
de estames e pétalas. BENTHAN e HOOKER (1862) distinguiram somente duas
tribos na família, a Simaroubeae e Picraminiae, baseados na incerteza se o ovário
era dividido ou não. ENGLER (1874) foi o primeiro a reconhecer três tribos,
Surianeae, Eusimaroubeae e Picramniae, baseados na natureza dos carpos e
número de óvulos. Posteriormente, ele criou oito tribos em quatro subfamílias
(ENGLER, 1896). A classificação subseqüente (ENGLER, 1931) foi baseada no
número e natureza dos carpos, número e posição dos óvulos, presença ou
ausência de escalas na base dos filamentos e composição das folhas. Foram
incluídas nove tribos em seis subfamílias e é ainda a classificação mais aceita nos
dias de hoje (FERNANDO & QUINN, 1992).
1.2
Triterpenos e a formação de quassinóides.
Os triterpenos são formados a partir de isoprenos, presentes em plantas
superiores. Algumas espécies vegetais contêm grandes quantidades de
triterpenos no látex e resinas e entre suas funções está a defesa química contra
herbívoros (BROWN, 1998). A origem biossintética dessa classe de produto
natural é o esqualeno (C30), formado através da junção cauda-cauda de duas
moléculas de pirofosfato de farnesila (FPP, C15) de acordo com o Esquema 1.
5
FPP
Esqualeno sintase
PPO
+
adição eletrofílica cauda-cauda
H H
OPP
+
Perda de íon hidrogênio
formação do anel
ciclopropano
- H+
H
OPP
H
Wagner-Meerwein
1,2-alquil
+
+
H
NADPH
H
H
esqualeno
Esquema 1. Formação do precursor dos triterpenos pela junção cauda-cauda de duas unidades
pirofosfato de farnesila (DEWICK, 2002).
6
A ciclização do esqualeno para a formação dos triterpenos ocorre através
do intermediário 2,3-óxido de esqualeno (Esquema 2). A conformação do epóxido
de esqualeno é importante pois determina a estrutura dos produtos biossintéticos
formados a partir do esqualeno (DEWICK, 2002). A formação das unidades
isoprênicas pode ocorrer através da formação do ácido mevalônico (BROWN,
1998), da deoxixilose (ROHMER et al 1993) e em algumas plantas, de
aminoácidos
(SUGA
et
al,1980).
Entretanto,
estudos
biossintéticos
com
compostos marcados revelaram que o mevalonato é o caminho preferencial para a
formação de triterpenos e esteróides (FLORES-SÁNCHEZ, 2002)
A biossíntese de terpenos em geral (plantas, animais e microorganismos),
envolve classes similares de enzimas. Porém, importantes diferenças existem ao
longo do processo. A produção de terpenóides em plantas é muito mais variada do
que em animais e microorganimos devido a biossíntese desses ocorrer em
diferentes níveis de compartimento nas células. A produção de grandes
quantidades de terpenóides naturais bem como o seu acúmulo, emissão ou
secreção é quase sempre associado com a presença de estruturas anatômicas
altamente
especializadas.
A
biossíntese de terpenóides é caracterizada
fundamentalmente a nível subcelular em diferentes compartimentos celulares. Os
monoterpenos, diterpenos e tetraterpenos são comumente originados nos
plastídeos enquanto que os triterpenos, juntamente com sesquiterpenos e
politerpenos parecem ser metabolizados no retículo endoplasmático da célula.
Logo, essa deve ser a causa dos diferentes caminhos precursores dos
terpenóides que indica que as unidades isoprênicas formadas nos plastídeos
geram os precursores piruvato/fosfato de gliceraldeído enquanto que no retículo
7
endoplasmático se formam unidades isoprênicas a partir do mevalonato, que é o
caminho prefencial para a biossíntese de triterpenos, como citado anteriormente
(BRUCHANAN, GRUISSMAN e JONES, 2000).
H
H
O
epóxido de esqualeno
H+
O
conformação
cadeira-cadeira-cadeira
H
H
+
H
+
HO
H
H
H
HO
cátion damarenil
H
sequência de migrações de
Wagner-Meerwein de hidretos
1,2 e metilas 1,2 terminadas
pela perda de um próton
H
20
H
H
HO
20
H
H
eufol (20R)
tirucalol (20S)
HO
H
eufol
tirucalol
Esquema 2. Formação do triterpeno eufol a partir do epóxido de esqualeno (DEWICK, 2002).
Os triterpenos podem ser submetidos a uma variedade de modificações
estruturais resultando na formação de esteróides, limonóides e quassinóides. Os
8
quassinóides são terpenóides altamente oxigenados, produzidos somente por
espécies da família Simaroubaceae através da degradação de triterpenos do tipo
eufol/tirucalol. Para a formação de intermediários do tipo do eufol/tirucalol, o óxido
de esqualeno cicliza com configuração cadeira-cadeira-cadeira. A ciclização do
esqualeno nessa conformação produz o cátion intermediário damarenil que após
sofrer diversas migrações de hidretos e grupos metila (do tipo Wagner-Meerwein)
resulta no triterpeno eufol ou no seu epímero tirucalol (Esquema 2). Em seguida, o
eufol ou tirocalol sofre uma isomerização alílica, onde ocorre a migração da
ligação dupla da posição 8,9 para a posição 7,8 resultando no intermediário
butirospermol (Esquema 3). Após a migração da ligação dupla, essa sofre uma
epoxidação seguida da abertura do anel epóxido gerando um carbocátion terciário.
O deslocamento 1,2 de Wagner-Meerwein da metila da posição 14 para a posição
8, seguida da perda de um próton formando uma ligação dupla entre os carbonos
C-14 e C-15 e uma hidroxila na posição 7 completam a formação do apo-eufol ou
do apo-tirucalol (DEWICK, 2002). Esse por sua vez, pode perder quatro carbonos
da cadeia lateral seguida da formação de um anel furano resultando nos
limonóides, ou perder dez átomos de carbonos, incluindo uma das metilas ligadas
ao C-4, resultando nos quassinóides (Esquema 3). Embora na maioria dos casos,
a cadeia lateral se perca completamente, há exceções para os quassinóides com
esqueleto C25 com um grupo γ-lactona que é remanescente do anel de furano
presente nos limonóides (POLONSKY, 1973).
9
H
21
12
11
1
HO
10
A
5
4
H
3
20
13
C
9
2
B
8
22
H
17
D
14
24
25
23
H
H
26
isomerização alílica
HO
eufol (20R)
tirucalol (20S)
butirospermol
H
HO
H
diidroniloticina
[O]
H
H
H
H
H
O
HO
H
HO
H
OH
H
apo-eufol (20R)
apo-tirucalol (20S)
H+
- 4C
Limonóides
O
H
H
-10C
incluindo
uma metila
de C-4
clivagem de quatro carbonos
da cadeia lateral e formação do
anel furano
H
OH
Quassinóides
OMe
H
HO
H
OH
OH
16
15
7
6
O
H
27
O
O
12
11
19
20
21
13
14
MeO
2
1
10
9
8
5
3
4
H
6
7
H
O
17
15
16
O
18
quassina*
*numeração do quassinóide segundo normas da IUPAC
Esquema 3. Formação de quassinóides e limonóides a partir do eufol/tirucalol (DEWICK, 2002).
10
Em relação a sua diversidade estrutural, os quassinóides podem ser
divididos em grupos distintos de acordo com seus esqueletos carbônicos e
conectividade (Quadro 1):
O
O
O
O
O
O
B (C19)
A (C20)
C (C18)
HOH2C
12
20
11
10
3
4
9
5
22
13
14
1
2
17
15
7
6
O
16
22
OR
23
O
17
23
8
20
O
O
HO
O
21
O
O
O
O
O
OR
O
F (C19)
E (C25)
D (C25)
O
OR
O
OR
O
O
O
O
O
O
G (C19)
O
O
H (C19)
O
O
O
I (C20)
Quadro 1. Esqueletos típicos de quassinóides (POLONSKY, 1985; HITOTSUYANAGI et al, 2001).
11
A maioria dos quassinóides conhecidos tem o esqueleto do tipo A (C20). O
esqueleto C difere do esqueleto B pela perda de um átomo de carbono no anel A.
O esqueleto E difere do tipo D pelo modo de formação da γ-lactona. No tipo D esta
função é formada pela junção de C-23 a C-21; enquanto no tipo E, a γ-lactona é
formada pela junção de C-23 a C-17. O esqueleto G caracteriza-se pela ausência
do anel A e formação de butenolídeo como substituinte no anel B. O esqueleto H
refere-se ao quassinóide cedronolactona E (1) isolado de Simaba cedron, cuja
proposta biossintética seria resultante do quassinóide cedronolactona C (2)
(Esquema 4) (HITUTOSUYANANGI, et al., 2001). O esqueleto I refere-se apenas
ao quassinóide chinjudilactona (3) isolado de A. altissima (Quadro 2), cuja
estrutura foi determinada por difração de raio-X (POLONSKY, 1985).
OH
HO O
OH
O
OH
O
O
OH
O
O
H
OH
H
H
O
O
(1) Cedronolactona E
O
O
H
H
H
HO
OH
H
O
O
O
(2) Cedronolactona C
O
(3) Chinjudilactona
Quadro 2. Quassinóides isolados de Simaba cedron e Ailanthus altissima
12
OH
OH
HO O
O
O
O
H
H
OH
H
H
H
O
O
H
O
O
OH
OH
H
O
H
O
Cedrolactona C
adição de Michael
OH
O
OH
O
O
OH
H
H
H
O
O
(1) Cedrolactona E
Esquema 4. Proposta biossintética para o quassinóide Cedrolactona E (HITOSUYANAGI, et al.,
2001).
Os quassinóides são conhecidos por apresentarem diversas atividades
biológicas, entre elas, antimalárica (PHILLIPSON e O’ NEILL, 1986), antileucêmica
(POLONSKY, 1985), antitumoral, antiviral, amebicida (POLONSKY, 1973),
antiinflamatória (HALL, et al. 1983), anti-HIV (OKANO, et al. 1996), antituberculose (RAHMAN et al., 1997), inseticida e antifágica (POLONSKY, 1985)
(provoca a inibição do apetite em certos organismos) (SARAIVA, 2001).
13
Apesar da atividade biológica de quassinóides ser bastante significativa,
várias substâncias dessa classe demonstram alta citotoxicidade. Estudos da
atividade antimalárica de certos quassinóides demonstraram que esses podem
não ter uma relação direta com a atividade citotóxica (ANDERSON et al. 1991,
PHILLIPSON e O’NEILL, 1986). Dessa forma, é possível o isolamento e
tranformações químicas de quassinóides naturais em novas estruturas com boa
atividade antimalárica e baixa citotoxicidade. Estudos mais aprofundados sobre a
relação
estrutura/atividade
biológica
de
quassinóides
são
extremamente
necessários.
1.3. Alcalóides indólicos β-carbolínicos e tipo cantinona.
Várias espécies de Simaroubaceae são conhecidas por produzirem
alcalóides indólicos β-carbolínicos e alcalóides do tipo cantinona (OHMOTO e
KOIKE, 1989; SIMÃO et al., 1991; READEL et al., 2003), derivados do triptofano.
O triptofano por sua vez, origina-se através da rota do ácido xiquímico, que forma
grande parte de substâncias aromáticas, particularmente aminoácidos aromáticos
tais como o L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano (DEWICK, 2002).
A formação de alcalóides β-carbolínicos ocorre através da formação de uma
base de Schiff usando um aldeído, com a participação da triptamina (Esquema 5).
14
H+
formação de base de Schiff
usando aldeído
NH2
N
H
N
..
N
H
R-CHO
R
triptamina
[o]
N
N
H
NH
+ H
R
NH
R
Esquema 5. Formação de alcalóides β-carbolínicos (DEWICK, 2002)
Segundo ROMERO e ROBERTS (1996), os alcalóides tipo cantinona
derivam do triptofano via o ácido propiônico β-carbolínico (4) e de 4,5diidroxicantin-6-ona (5).
Nesse mesmo trabalho, através do estudo com culturas de células de
Ailanthus altissima, foi demonstrado que a produção de alcalóides aromáticos
ocorre tanto nos cloroplastos quanto no citoplasma das células.
N
H
N
N
N
O
COOH
4
OH
OH
5
15
Dependendo do número e da posição das carbonilas nos anéis C e D, os
alcalóides tipo cantinona são classificados como cantin-6-onas (A), cantin-2,6dionas (B) e cantin-5,6 dionas (C).
1
11
O
10
A
D
B
9
N
8
N3
N
N
H
O
O
5
A
N
N
H
C
4
O
2
O
B
C
Quadro 3. Esqueletos básicos de alcalóides tipo cantinona.
O primeiro alcalóide indólico isolado dessa classe foi a própria cantin-6-ona
(6) (HAYNES et al, 1952). Posteriormente, o estudo da espécie Pentaceras
australis Hook F., da família Rutaceae, resultou no isolamento desse alcalóide
junto com dois outros alcalóides da mesma classe identificados como 5-metoxicantin-6-ona (7) e 4-metiltio-cantin-6-ona (8) (NELSON e PRICE, 1952).
Os alcalóides tipo cantinona geralmente são mono ou diidroxilados, ou
metoxilados nas posições 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10 ou 11.
16
N
N
O
6
N
N
N
O
OMe
O
7
N
SMe
8
Quadro 4. Exemplos de cantinonas encontradas com diferentes funções orgânicas.
A maioria dos alcalóides tipo cantinona são encontrados nas famílias
Rutaceae e Simaroubaceae, dentro da ordem Rutales. Esses também já foram
encontrados em espécies das famílias Amaranthaceae e Caryophyllaceae da
ordem Centrospermae e na família Malvaceae da ordem Malvales (OHMOTO e
KOIKE, 1989).
De trinta e cinco alcalóides tipo cantinona isolados, vinte e cinco foram de
espécies da família Simaroubaceae, tornando essas substâncias um importante
grupo do ponto de vista quimiotaxonômico nessa família (OHMOTO e KOIKE,
1989).
A maioria dos alcalóides β-carbolínicos é tóxica em animais e pode repelir
predadores (DEWICK, 2002; LUCKNER, 1990). Alcalóides β-carbolínicos isolados
17
de Euricoma longifolia apresentaram citotoxicidade não significativa e fraca
atividade antimalárica (KARDONO et al., 1991; KUO, et al. 2003).
Alcalóides do tipo cantinona podem apresentar diversas atividades
biológicas entre elas: antifúngica, antibacteriana (ODEBIYI e SOFOWORA, 1979;
YOKOTA, et al. 1978; OHMOTO e SUNG, 1982) e citotóxica (KUO, et al. 2003).
THOUVENEL et al (2003) demonstraram que cantin-6-ona e 5-metoxicantin-6-ona
apresentam atividade antifúngica contra fungos do gênero Aspergillus, Candida,
Cryptococcus, Geotrichum, Saccharomyces e Trichosporon. Esses mesmos
alcalóides demostraram atividade in vivo em ratos infectados com Leishmania
amazonensis (FERREIRA, et al. 2002).
1.4. O gênero Simaba
É o segundo maior gênero da família, com cerca de 35 espécies
sulamericanas sendo superado apenas pelo gênero Picramnia (40 espécies). As
espécies desse gênero são encontradas em ambientes ecológicos bastante
diversificados, em mata úmida, alagável ou de terra firme. De um modo geral, a
floração das espécies do gênero Simaba pode ocorrer ao longo de todo o ano,
sendo, entretanto, acentuada nos meses de julho a outubro. A frutificação pode
ocorrer, também, o ano inteiro, porém com maior incidência de setembro a
novembro. Geograficamente, o gênero Simaba distribui-se pelo continente
sulamericano, exceto Argentina, Uruguai e Chile. A espécie Simaba cedron tem a
mais larga distribuição, indo desde a Bahia até Costa Rica, na América Central
(CAVALCANTE, 1983).
18
Economicamente, as espécies desse gênero apresentam maior interesse
pelas suas propriedades medicinais, devido a substâncias fortemente amargas
nelas encontradas. Além disso, algumas das espécies do gênero, S. guianensis,
S. multiflora e S. paraensis, fornecem madeira branca, mole e fácil de trabalhar,
podendo dessa forma, serem aproveitadas para construções internas e para o
fornecimento de polpa celulósica.
As espécies do gênero Simaba caracterizam-se como plantas lenhosas cujo
porte varia de um subarbusto de 30-50 cm até uma árvore de 30 m, o que é mais
raro. No geral, são árvores pequenas ou arborescentes. Os tipos mais freqüentes
são árvores medianas em torno de 7-12 m de altura ou arbustos entre 4-6 m
(CAVALCANTE, 1983). Apesar da variedade de espécies dentro desse gênero,
poucas espécies de Simaba são conhecidas quimicamente. Entre as espécies já
estudadas podemos destacar as espécies S. cedron, S. orinocensis, S. cuspidata,
S. cuneata, S. multiflora, S. guianensis e S. polyphylla.
1.4.1. Simaba cedron Planch
A espécie S. cedron é uma arvoreta de 2 a 6 m de altura, com a maior
distribuição geográfica entre as espécies desse gênero. Essa espécie pode ser
encontrada do estado da Bahia, no nordeste do Brasil, até a América Central, nas
ilhas do Caribe. É conhecida como “pau-para-tudo” no Brasil, como “cedron” na
Colômbia, Venezuela e América Central, “huingo-sacha” no Peru e “bergi
kanamboeli” no Suriname (CABRAL, 1989).
19
S. cedron é conhecida popularmente por suas propriedades medicinais no
combate a febres provocadas pela malária (HITOSUYANANGI, et al., 2001).
Acredita-se também, que as sementes dessa espécie apresentam propriedades
protetoras contra venenos de cobras (GRAUCKLER, 1935 apud CABRAL, 1989).
Os primeiros metabólitos isolados de S. cedron foram identificados por
POLONSKY (1960) e denominados de cedronina (9) e cedronolina (10). Estudos
posteriores com o quassinóide cedronina (9) demonstraram que o mesmo possui
atividade antimalárica contra cepas de Plasmodium falciparum resistentes a
cloroquina com CI50 em torno de 0,25 µg/mL e DE50 de 1,8 mg/kg/dia contra P.
vinkei. Além da atividade antimalárica, o mesmo quassinóide apresenta atividade
citotóxica contra células KB com CI50 de 4 µg/mL (MORETTI, et al., 1994).
“Em 1960, KREBS e RUBER isolaram o quassinóide cedrina (11) e
JACOBS et al. (1987) descreveu por raio-x a estrutura do quassinóide, até então
não registrado, denominado como 7-epi-cedronina (12)” (CABRAL, 1989).
OZEKI, et al. (1998) isolaram da madeira de S. cedron os quassinóides
cedronolactonas A-D (13, 14, 2 e 15), identificados pela primeira vez, junto com os
quassinóides conhecidos simalikalactona D (16), chaparrinona (17), chaparrina
(18), glaucarubolona (19), glaucarubol (20), samaderina Z (21), guanepolida (22),
ailanquassina (23) e poliandrol (24) (Quadro 5). HITOTSUYANAGI et al. (2001)
isolaram o novo quassinóide, descrito acima, cedronolactona E (1) da madeira de
S. cedron.
20
O
HO
OH
O
O
O
HO
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
10
9
O
O
O
11
OH
O
HO
O
O
O
O
HO
O
HO
OH
O
OMe
OH
OH
HO O
OR
H
OH
H
H
O
H
O
O
H
O
H
H
O
12
R
H
O
O
14 R = H
13 R =
O
2 R = OH
16 R =
OH
21 R = H
O
O
HO
OH
O
OH R'
O
H
H
HO
H
O
OAc
OH
R"
H
H
H
OH
H
O
19 R' = O; R" = OH
18 R' = α-OH, β-H; R = OH
OH
HO O
O
H
R
H
H
H
O
H
O
H
O
18 R' = α-OH, β-H; R" = H
O
O
H
17 R' = O; R" = H
15
H
OH
O
23 R = H
24 R = OH
Quadro 5. Quassinóides isolados de S. cedron Planch.
H
OH
H
22
O
O
O
21
1.4.2. Simaba orinocensis Kunth
A espécie S. orinocensis é natural da América do Sul e é utilizada pelos
índios da Guiana Francesa como anti-helmíntico (POLONSKY, et al., 1981). O
estudo da casca das raízes dessa espécie realizado por POLONSKY e
colaboradores em 1981 resultou no isolamento dos quassinóides simarinolida (25)
e guanepolídeo (26) junto com outro quassinóide conhecido como simarolídeo
(27). Recentemente, MUHAMMAD et al. (2004) isolaram o quassinóide
antimalárico denominado orinocinolida (28) junto com simalikalactona D (16).
Orinocinolida apresenta atividade antimalárica igualmente potente contra clones
de Plasmodium falciparum D6 e W2 com CI50 de 3,27 e 8,23 ng/mL,
respectivamente, e simalikalactona D apresenta atividade antimalárica na
concentração de. 3,0 ng/mL contra clones D6 e de 3,67 ng/mL contra clones W2.
O quassinóide 28 também demonstrou menor toxicidade do que simalikalactona D
(16) contra células VERO (CI50 10 µg/mL contra CI50 2,3 µg/mL de 16) e atividade
contra Leishmania donovani com CI50 de 0,035 µg/mL. A orinocinolida também
inibiu o crescimento de linhagens de células cancerígenas humanas SK-MEL, KB,
BT-549, e SK-OV-3 com IC50 de 0,8 – 1,9 µg/mL. Simalikalactona D demonstrou
maior atividade com essas células com IC50 de 0,3-1,0 µg/mL.
22
H
HO
H
HO
OAc
O
H
H
O
O
OAc
O
H
H
H
H
O
O
OH
H
H
O
O
26
O
OH
OAc
O
H
H
H
O
H
25
HO
O
O
H
H
O
O
O
HO
HO
OH
O
O
H
H
27
H
H
O
O
O
28
Quadro 6. Metabólitos isolados de Simaba orinocensis Kunth.
1.4.3. Simaba cuneata A. St-Hil & Tul.
Caracteriza-se como uma árvore de 10-12 m de altura, distribuída em
restingas, cerrados e matas, da Bahia até São Paulo. É conhecida popularmente
como “Caixeta preta”, “paratudo” (Espírito Santo) e “quina-quina” (Bahia)
(CAVALCANTE, 1983).
Estudos do caule dessa espécie encontrada no Estado de São Paulo,
realizados por RODRIGUES Fo. et al. (1992) resultaram no isolamento de uma
mistura dos ésteres de lignanas tipo secoisolariciresinol acilados nas posições C-9
23
e C-9’ (29) junto com os ácidos dodecanóico, tetradecanóico e hexadecanóico.
Nesse trabalho também foram isolados os triterpenos 3-oxo-tirucala-7,24-dieno
(30) e 3,21-dioxo-tirucala-7,24-dieno (31). O estudo fitoquímico das partes aéreas
dessa espécie resultou no isolamento dos quassinóides 20 (R) –simarolídeo (27) e
20 (S) –simarolídeo (32) (VIEIRA, et al., 1999).
MeO
1
7
9
OR'
OR"
HO
5
9'
5'
O
OMe
OH
30
29 R' = R" = COCmH2m+1 (m = 11, 13, 15)
O
O
HO
OAc
O
H
O
H
31
Quadro 7. Metabólitos isolados de Simaba cuneata.
O
H
O
H
H
O
32
O
24
1.4.4. Simaba cuspidata Spruce ex Engl.
Estudos com a casca de S. cuspidata encontrada na Guiana Francesa
resultaram no isolamento dos quassinóides 6α-tigloyloxichaparrinona (33) e 6αtigloyloxichaparrina (34) (POLONSKY, et al., 1980). GIESBRECHT et al. (1980)
identificaram no extrato etanólico da casca dessa espécie, coletada no Amazonas,
os alcalóides 9-metoxicantin-6-ona (35) e 3-metoxicantin-2,6-diona (36).
OH
OH
HO
OH
HO
OH
O
O
HO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
33
34
O
MeO
N
N
O
35
Quadro 8. Constuintes químicos de Simaba cuspidata.
N
O
36
N
OMe
25
1.4.5. Simaba guianensis Aubl.
Essa espécie ocorre naturalmente na floresta Amazônica e é utilizada
popularmente para combater febres. Caracteriza-se como um arbusto de 1 a 4 m
ou, às vezes, como arvoreta de até 10 m de altura. Costuma ser encontrada em
sub-bosques de mata de terra firme não alagável (CAVALCANTE, 1983). O estudo
da casca dessa espécie resultou no isolamento dos quassinóides antimaláricos
gutolactona (37) e simalikalactona D (16) (CABRAL, et al. 1993). Dessa espécie
também foram isolados os alcalóides, cantin-6-ona (6), 9-metoxicantin-6-ona (35),
o ácido 7-metoxi-β-carbolínico-propiônico (38), 4-metoxi-3-metilcantin-5,6-diona
(39), 9-hidroxicantin-6-ona (40); 11-hidroxicantin-6-ona (41), cantin-2,6-diona (42)
e as xantonas 43 e 44 (CABRAL, 1989).
26
OH
HO
OH
O
O
O
H
H
H
H
O
O
O
MeO
N
N
H
COOH
38
37
N
N
O
Me
HO
N
OMe
N
O
O
40
39
OH
O
N
N
O
O
42
41
MeO
O
Me
O
N
N
OMe
OH
MeO
O
OH
43
Quadro 9. Metabólitos isolados da casca de Simaba guianensis.
O
44
OMe
OH
27
1.4.6. Simaba multiflora A. Juss.
Caracteriza-se como uma árvore pequena de 4 a 10 m de altura e ocorre na
América do Sul. No Brasil é conhecida popularmente como “cajurana”. Várias
substâncias bioativas contra o câncer foram isoladas dessa espécie serão citadas
a seguir. Os quassinóides chaparrinona (17) e 6-α-senecioiloxichaparrinona (45)
foram identificados por WANI, et al. (1978) e o estudo do tronco dessa espécie,
resultou no isolamento e identificação dos quassinóides karinolida (46) juntamente
com 6-α-senecioiloxichaparrina (47) e 45, a xantona 43, e o alcalóide 9-metoxicantin-6-ona (35) (POLONSKI, et al. 1982).
ARISAWA et al. (1983) estudando a madeira dessa espécie, relataram o
isolamento dos alcalóides 10-metoxicantin-6-ona (48), 10-hidroxicantin-6-ona (49),
10-hidroxi-3-metoxicantin-2,6-diona (50), 3-metoxi-cantin-2,6-diona (36), cantin2,6-diona (42), e a elucidação estrutural da cumarina cleomiscina A (51) isolada
junto com a conhecida escopolentina (52). Em outro estudo, ARISAWA et
al.(1983) isolaram os quassinóides 17, 33, 34, 45 e 47 do extrato etanólico da
madeira de S. multiflora onde 45 e 47 foram citotóxicos em células P-388.
O estudo do extrato etanólico da madeira de S. multiflora, realizado por
ARISAWA e seus colaboradores, em 1985, resultou na identificação do
quassinóide simalikalactona D (16).
MORETTI et al. (1986), estudando os frutos de S. multiflora, isolaram dois
novos quassinóides denominados 13,18-desidro-6-α-senecioiloxichaparrina (53) e
12-oxo-6-α-senecioiloxichaparrina (54).
28
Em 1987, ARISAWA e colaboradores relataram o isolamento de um novo
triterpeno identificado como 3S, 23R, 25-triidroxitirucal-7-en-24-ona (55) e do
triterpeno hispidol B (56).
CARTER et al. (1993) isolaram os quassinóides 6-α-tigloiloxichaparrinona
(33), 6-α-tigloiloxichaparrina (34) e 6-α-hidroxichaparrinona (57).
TINTO et al. (1993) relataram o isolamento do triterpeno tipo esqualeno
quassiol A (58). Em 1995, MILLER e colaboradores descreveram o isolamento de
um triterpeno tipo glabretal (59). Em outro trabalho (MILLER et al., 1995) foi
relatado o isolamento dos triterpenos quassióis B-D (60, 61, 62).
29
OH
OH
HO
OH
R'
O
O
HO
O
HO
OH
RO
R"
O
O
O
O
N
N
O
O
O
48 R = Me
46
45 R' = R" = O
49 R = H
47 R' = OH; R" = H
MeO
R
O
O
O
N
N
O
OMe
O
O
MeO
CH2OH
HO
HO
OMe
O
O
50 R = OMe
51
OH
HO
HO
OH
O
O
HO
O
HO
OH
53
R"
O
R'
R'''
O
O
O
O
52
O
O
HO
O
54
Quadro 10. Substâncias isoladas de S. multiflora.
55 R' = O; R" = H; R''' = OH
OH
56 R' =
; R" = OH; R''' = H
H
OH
30
HO
OH
HO
OH
O
H
O
H
O
TigO
OH
OH
H
57
59
OR''
H
O
OH
OR'
58 R' = R" = H
60 R' = H; R" = Ac
OH
H
O
HO
OR
OH
61
OH
HO
OH
OH
62
Quadro 11. Substâncias isoladas de Simaba multiflora.
H
OH
OH
H
O
HO
O
31
1.4.7 Simaba obovata Spruce ex Engler
A espécie S. obovata caracteriza-se como uma árvore pequena de 5-8 m de
altura, com floração entre abril e junho e frutificação entre novembro e janeiro.
Espécimes de S. obovata são encontradas, freqüentemente, em mata de igapó,
beira de rios, várzea alagável e outras áreas sujeitas à inundação. A distribuição
geográfica dessa espécie vai da parte norte-noroeste do Amazonas, abrangendo
principalmente a bacia do rio Negro, a partir de Manaus ao baixo rio Branco, no
Estado de Roraima e pode ultrapassar a fronteira, chegando até o Casiquiare em
territórios venezuelano e colombiano (CAVALCANTE, 1983).
O estudo químico das folhas e galhos de S. obovata resultou no isolamento
de
α-tocoferol
(63),
glicopiranosilsitosterol
mio-inositol
(65a),
(64),
antraquinona
β-sitosterol
(66),
(65),
3-O-β-D-
1,5-diidroxi-3-metil-7-
metoxiantraquinona (66a), uma mistura de α-amirina (67)
e β-amirina (68),
betulina (69), ácido gálico (70), 1-O-β-etilglicose (71) e o β-(p-hidroxifenil)-etanol
(72) (DUTRA, et al. 1992).
32
H3C
OH
OH
CH3
O
2
OH
HO
3
3
HO
HO
HO
CH3
64
63
R
3
O
2
4
R
R
5
R
R
OR
HO
65: R = H
HO
65a: R =
O
R
R
6
O
R
1
66: R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = R6 = H
66a: R1 = R2 = OH; R2 = Me; R4 = R6 = H; R5 =OMe
OH
OH
1
O
CH2OH
OH
69
67: R = Me; R1 = H
68: R = H; R1 = Me
HO
EtO
O
71
OH
OH
HO
HO
HO
HO
70
OH
OH
HO
72
Quadro 12. Constituintes químicos isolados de Simaba obovata.
33
1.5. A espécie Simaba polyphylla (Cavalc.) Thomas
Essa é uma das espécies em estudo nesse trabalho. É nativa da região
amazônica, caracterizada como uma árvore pequena de 5 a 10 m de altura, folhas
imparipenadas, folíolos de 9-23 com, mais freqüente de 13-17 cm, oblongos,
fortemente
assimétricos,
ápice
abrupto-acuminado.
Flores
amarelas
com
compacta panícula terminal ou subterminal, de 3-7 cm de altura. O período de
floração e frutificação varia de julho a outubro e setembro a novembro,
respectivamente. É freqüentemente encontrada em matas de terra firme ou
capoeira alta e conhecida popularmente na região como “marupazinho” (no
Amapá) ou “serve-para-tudo” (Manaus) (CAVALCANTE, 1983). S. polyphylla é
uma espécie pouco conhecida quimicamente. Dessa espécie, foi relatada a
presença de um único alcalóide identificado como cantin-2,6-diona (42)
(MESQUITA-SAAD E CABRAL, 1997).
Figura 1. Simaba polyphylla
34
De acordo com Cavalcante (1983) a espécie S. polyphylla pode ser
encontrada em Manaus, seu centro de dispersão, onde foi coletada a quase
totalidade dos espécimes. Fora de Manaus, foi coletada uma amostra de um
espécime em Humaitá – AM e outra no Amapá. A Figura 2 descreve a distribuição
geográfica de S. polyphylla segundo três fontes diferentes. A legenda em azul
refere-se à distribuição segundo CAVALCANTE (1983), a legenda em vermelho
segundo espécies coletadas e registradas no herbário do INPA-AM e a legenda
em rosa é a distribuição segundo fonte encontrada no site http://www.mobot.org.
Figura 2. Distribuição geográfica da espécie Simaba polyphylla.
35
1.6. Simaba guianensis subesp. ecaudata Cronquist
A espécie Simaba guianensis subesp. ecaudata caracteriza-se como um
arbusto ou uma pequena árvore de até 10 m de altura, com folíolos cartáceos de
cor verde-pálido ou oliváveos quando secos, elípticos, com ápice obtuso
arredondado, subagudo com um acume curto-obtuso (CAVALCANTE, 1983)
Os espécimes em estudo, quando coletados para esse trabalho foram
identificados como Simaba sp nov. Pirani, no herbário do INPA. De acordo com
RIBEIRO et al. (1999), essa espécie caracteriza-se como uma árvore pequena de
até 10 m de altura com folíolos cartáceos, de cor verde-amarelada, brilhantes, com
margem levemente ondulada. Flores com odor agradável, ráquis de inflorescência
verde-claro aveludada; pedicelos, pétalas, estames e anteras verde-amareladas.
Costumam ser encontradas em matas de terra firme, de solo argiloso. Segundo
consulta ao Dr. Wayt Thomas (Jardim Botânico de Nova York), especialista no
estudo botânico de espécies da família Simaroubaceae, trata-se da espécie
Simaba guianensis subsp. ecaudata, cujas características são muito semelhantes
às da espécie Simaba polyphylla.
O estudo químico dessa espécie na busca de princípios bioativos será
descrito pela primeira vez nesse trabalho uma vez que, o histórico da família
Simaroubaceae demonstra um grande número de espécies com propriedades
medicinais.
36
Figura 3. Exsicata da espécie Simaba guianensis subesp ecaudata.
A distribuição geográfica de S. guianensis subesp. ecaudata se dá em duas
áreas distintas: 1) no Baixo Amazonas, compreendendo quase todos os
municípios ao longo da calha do grande rio, isto é, de Santarém até Faro, 2) Baía
37
de Marajó (Mosqueiro e Soure), prolongando-se pela região do Salgado até
Marapanim, a partir daí desaparece, indo aparecer somente em São Luís do
Maranhão. Fora do Brasil é encontrada no Suriname (CAVALCANTE, 1983).
A Figura 4 descreve a distribuição geográfica de Simaba guianensis
subesp. ecaudata. A legenda em azul refere-se à distribuição descrita segundo a
literatura (CAVALCANTE, 1983). A legenda em vermelho descreve a distribuição
de espécies coletadas e registradas no herbário do INPA – AM.
Figura 4. Distribuição geográfica de Simaba guianensis subesp. ecaudata.
38
2. Objetivos
Gerais
Realizar o estudo fitoquímico e da atividade biológica das espécies Simaba
guianensis subsp. Ecaudata e Simaba polyphylla.
Específicos
Testar diversos extratos de Simaba guianensis subsp. ecaudata e Simaba
polyphylla, para toxicidade in vitro para larvas de Artemia franciscana, atividade
citotóxica em células tumorais MDA-MB, B-16 e HCT8.
Caracterização cromatográfica e isolamento dos constituintes químicos
ativos das espécies a serem estudadas com auxílio de screening de atividade
citotóxica em A. franciscana e larvicida em Aedes aegypti.
Identificação e elucidação estrutural das substâncias isoladas por métodos
espectroscópicos.
39
3. Parte experimental
3.1. Materiais e métodos
3.1.1. Equipamentos
Equipamento para obtenção de pontos de fusão.
IQ-UFRJ: Foram utilizados aparelhos Mel-Temp II – Laboratory Devices
Inc., USA, com amostras acondicionadas em capilares de vidro;
FIOCRUZ: Microquimica Ind. e Com. Ltda - MQAPF - 301 (temp. máx
360ºC). Os pontos de fusão não foram corrigidos.
Liofilizadores: Para liofilização das amostras foram utilizados os seguintes
liofilizadores:
INPA: Liofilizador Christ Beta 1-8K Cód. No. 08184.
FIOCRUZ: Liofilizador Edwards Modulyo Cód. No. F101-02-000
Balanças analíticas: Mettler-Toledo modelo AB204 com limite máximo de
peso de 210 mg; balança Mettler PM2000 com limite máximo de peso de 2100 g e
d = 0,01g; balança Mettler Toledo - AG204 com limite máximo de 210g e d=0,1mg.
40
3.1.2. Métodos cromatográficos
MPLC: O fracionamento por cromatografia líquida de média pressão foi
realizado em aparelho de MPLC Chromatography Pump Büchi 688 Gradient
Former Büchi 687 com detector de UV/VIS Filter-Photometer Büchi e coletor de
frações Büchi 684. Coluna em fase reversa de RP-18 Licmroprep RP-18 (MERCK)
com partículas de 40 ~ 63 µm.
CLAE analítico (INPA): aparelho Shimadzu, modelo LC-10, equipado com
bomba quaternária, detector de ultravioleta SPD-10AVP, válvula de injeção
Rheodyne e Chemstation (CLASS-VP, versão 6.1). Coluna LiChrospher 60 RPSelect B (5 µm) 250 x 4 mm, da Merck.
CLAE analítico (FIOCRUZ): aparelho LC-10 ADvp Shimadzu com autoinjetor SIL-10 ADvp Shimadzu e detetor de arranjos fotodiodos Shimadzu SPD –
M10 Avp em coluna de fase reversa Shimpack C-18 250 x 6 µm.
CLAE preparativo (FIOCRUZ): Foi utilizado um aparelho modelo Shimadzu
LC 8A, bomba LC 8A com controlador de sistema SCL8A, detetor modelo SPD
10A e registrador CRGA Chromatopac.
Cromatografia de CCD analítica: foram utilizadas placas prontas de sílica
gel 60 em alumínio MERCK de 20 x 20 cm com indicador de fluorescência F254. Os
sistemas de revelação utilizados foram lâmpadas de UV a 254 nm e 366nm e
revelação em solução alcóolica de H2SO4 a 5%. Para análise em fase reversa
foram utilizadas cromatoplacas de RP-18, em alumínio, MERCK de 20 x 20 cm
com indicador de fluorescência F254.
41
Cromatografia de placas preparativas: foram utilizadas placas com sílica gel
60 HF254 da MERCK, com 1 mm de espessura e tamanho de placas 20 x 20 cm.
Para CCD preparativa em fase reversa foram utilizadas placas de RP-18 F254S de
20 x 20 cm e 1 mm de espessura. Para revelação foram utilizadas lâmpadas de
UV em 254 e 366 nm.
3.1.3. Métodos espectroscópicos
Espectrofotômetros de infravermelho
IQ-UFRJ: As amostras foram analisadas em um espectrofotômetro Nicolet
Magna IR 760, com pastilhas comprimidas em brometo de potássio anidro
FIOCRUZ: As amostras foram analisadas em um espectrofotômetro Nicolet
Nexus-670, com pastilhas comprimidas em brometo de potássio anidro.
Espectrômetros de RMN 1H. Foram utilizados aparelhos BRUKER, modelo
DRX-200, operando a 200 MHz, modelo DPX-300 operando a 300 MHz e DRX500, operando a 500 MHz, com tetrametilsilano (TMS) ou o núcleo de hidrogênio
residual do solvente deuterado como referencial interno.
Espectrômetros de RMN
13
C. Foram utilizados aparelhos BRUKER, modelo
DRX-200, operando a 50 MHz, DPX-300 operando a 75 MHz e DRX-500,
operando a 125 MHz, com tetrametilsilano (TMS) ou solvente como referencial
interno. Os valores dos deslocamentos químicos foram referidos em unidades
adimensionais (δ), representando parte por milhão da freqüência aplicada.
42
Cromatógrafo a gás de alta resolução acoplado a espectrômetro de
massas.
IQ-UFRJ: aparelho Hewlett-Packard 6890 Series GC System acoplado a um
espectrômetro de massas do tipo Hewlett-Packard HP 5973 Mass Selective
Detector, controlados por computador através do software Standard ChemStation
G1701AA versão A03 (1996). Coluna: DB5, com 25 m x 0,2 mm x 0,11 µm de
espessura de filme. Temperatura do injetor: 270 °C, com divisor de fluxo (1/20);
gás de arraste: He.Temperatura inicial do forno 80°C, por 0,5 minutos, em seguida
aquecimento a 8°C/minuto até 290°C, e temperatura final de 290°C por 5 minutos.
Os espectros de massa foram obtidos por impacto de elétrons a 70 eV;
FIOCRUZ: Aparelho Agilent Tecnologies - 6890N Network GC System
acoplado a um espectrômetro de massas tipo MS: Agilent - 5973 Network Mass
Selective Detector, controlados por computador através do software Standard
ChemStation G1701AA, coluna DB5-MS, 30 m x, 0,25 mm x 0,25 mm de
espessura de filme. Temperatura do injetor: 270 oC, com divisor de fluxo (1/20);
gás de arraste: He. Temperatura inicial do forno de 70 oC por 0,5 minutos seguida
de aquecimento a 5o C/minuto até 300 C com tempo final de 20 minutos. O
espectro de massas foi obtido por impacto de elétrons a 70 eV.
IQ-USP: Os espectros de massas foram realizados por injeção direta em
aparelho Shimadzu quadrupolo de baixa resolução (CG/EM) modelo GCMSQP5050A, com ionização por impacto eletrônico a 70 eV.
43
UFAM: Equipamento sistema Saturno 2100 T CG/EM. Cromatógrafo a gás
Varian 3900 acoplado ao espectrômetro de massas Íon Trap 2000, por impacto de
elétrons com energia de 70 eV. Injetor tipo split/splitless 1177, com autoamostrador 8410, com controle de fluxo programável utilizando seringa de 10 µL.
Coluna VF-5ms LB com dimensões de 30 m x 25 mm x 0,25 µm, fase estacionária
5% fenil e 95% dimetil polisiloxano, utilizando como fase móvel gás Hélio (He).
Temperatura do injetor: 250 oC, com divisor de fluxo (1/20); gás de arraste: He.
Temperatura inicial do forno de 220 oC por 0,5 minuto seguida de aquecimento a
10o C/minuto até 270 C permanecendo nessa temperatura por 15 minutos.
Espectrofotômetro de UV: Espectrofotômetro UV/VIS modelo FEMTO
800XI.
44
3.1.4. Reagentes e solventes
Os solventes utilizados neste trabalho foram de grau técnico e previamente
destilados. Esses não sofreram nenhum processo de purificação exceto CHCl3
que foi secado com Na2SO4 anidro. A água utilizada para extração foi destilada.
Para análises e purificação em HPLC foram utilizados ACN, MeOH grau
HPLC e água tipo Milli-Q.
3.2. Trabalho fitoquímico realizado com Simaba polyphylla.
3.2.1.Coleta do material botânico
Foram coletadas no dia 16 de fevereiro de 2002 (período de chuvas), as
partes aéreas de dois espécimes de Simaba polyphylla (galhos e folhas)
localizadas na reserva Ducke do INPA em Manaus. O material vegetal foi seco à
sombra e depois separado em galhos e folhas para posterior moagem em moinho
de facas. As exsicatas dos espécimes encontram-se no herbário do INPA
identificadas com os números 3003 e 3209.
3.2.2. Preparação de extratos
Inicialmente foram preparados extratos metanólicos e aquosos de
pequenas quantidades de folhas e galhos de Simaba polyphylla para um
“screening” inicial de atividade letal em Artemia franciscana e larvas de Aedes
aegypti com o objetivo de posteriormente se trabalhar com os extratos e frações
ativos. Esses extratos e frações também foram submetidos a ensaios de atividade
antitumoral em células MCF-7, B-16 e HCT8 no Laboratório de Oncologia
Experimental da UFC que será descrito posteriormente. Os extratos metanólicos e
45
aquosos foram preparados de acordo com o padrão para o banco de extratos do
Laboratório de Princípios Ativos da Amazônia no INPA.
Preparação dos extratos metanólicos. O material vegetal moído de cada espécime
foi extraído, separadamente, em soxhlet por um período de 6h. Repetiu-se o
processo de extração com o material vegetal por mais duas vezes. O extrato
metanólico resultante foi posteriormente submetido a um fracionamento por
partição em hexano, clorofórmio e acetato de etila para testes de atividade contra
Artemia franciscana e Aedes aegypti (Esquemas 6, 7 e 8).
Preparação dos extratos aquosos. Foram adicionados ao material vegetal 400 mL
de água fervente, aguardou-se 15 minutos e em seguida os extratos foram
filtrados. Esses foram congelados para posterior liofilização (Esquemas 6, 7 e 8).
Fracionamento por partição dos extratos metanólicos. Uma porção de cada extrato
metanólico foi dissolvida em MeOH/H2O (9:1) e particionada em hexano por 3
vezes. Em seguida adicionou-se água à fase hidroalcoólica até atingir a proporção
MeOH/H2O (7:3) e extraiu-se com CHCl3 por 3 vezes. Após a partição com
clorofórmio, extraiu-se por três vezes, a fase hidroalcoólica com acetato de etila.
46
Galhos
SP-1
38,8 g
Extração em
H2O quente
28,47g
Extração em MeOH
(Soxhlet)
Extrato aquoso
1,12 g
Extrato MeOH
1,21 g
Af: 87% e CL50 = 191+ou- 72
Aa: 100% e CL50 = 323+ou-38
teor de extrativos: 4,25%
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos: 2,88%
Partição em diferentes solventes (182,4 mg)
Fr. Hexânica
10,4 mg
Af: 37%
Aa: 37%
teor de extrativos: 5,7%
Fr. CHCl3
70,4 mg
Fr. AcOEt
11,5 mg
Fr. hidroalcoólica
54,5 mg
Af: 24%
Af: 84%
Af: 0%
Aa: 0%
Aa: 44%
Aa: 0%
teor de extrativos: 38,5% teor de extrativos: 6,3% teor de extrativos: 29,8%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 6. Preparação de extratos e frações dos galhos de Simaba polyphylla (Espécime 1) e
resultados do screening em Artemia franciscana e Aedes aegypti (extratos em 500 µg/mL e frações
em 250 µg/mL).
47
Galhos
SP-2
23,5 g
Extração em
H2O quente
38,5g
Extração em MeOH
(Soxhlet)
Extrato aquoso
0,63 g
Extrato MeOH
1,78 g
Af: 98% e CL50 = 200 +ou- 19
Aa: 87% e CL50 = 119+ou-16
teor de extrativos: 4,62%
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos: 2,68%
Partição em diferentes solventes (206,6 mg)
Fr. Hexânica
12,1 mg
Af: 64%
Aa: 17%
teor de extrativos: 5,8%
Fr. CHCl3
84,4 mg
Fr. AcOEt
16,1 mg
Fr. hidroalcoólica
65,5 mg
Af: 20%
Af: 87%
Af: 0%
Aa: 0%
Aa: 44%
Aa: 0%
teor de extrativos: 40,8% teor de extrativos: 7,79% teor de extrativos: 31,7%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 7. Preparação de extratos e frações dos galhos de S. polyphylla (espécime 2) e
resultados do screening em Artemia franciscana e Aedes aegypti (extratos em 500 µg/mL e frações
em 250 µg/mL).
48
folhas
SP-1
22,4 g
Extração em
H2O quente
33,2g
Extração em MeOH
(Soxhlet)
Extrato aquoso
3,7 g
Extrato MeOH
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos: ND
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos: 16,5%
Partição em diferentes solventes (305,4 mg)
Fr. Hexânica
3,0 mg
Af: Aa: teor de extrativos: 0,98%
Fr. CHCl3
69,4 mg
Fr. AcOEt
100,2 mg
Fr. hidroalcoólica
92,7 mg
Af: 4,0%
Af: 0%
Af: 4,0%
Aa: Aa: Aa: teor de extrativos: 22,7% teor de extrativos: 32,8% teor de extrativos: 30,3%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 8. Preparação de extratos e frações das folhas de S. polyphylla e resultados do
screening em Artemia franciscana e Aedes aegypti (extratos em 500 µg/mL e frações em 250
µg/mL).
49
3.2.3. Preparação dos extratos dos galhos para fracionamento por partição e
cromatográfico.
2,0 Kg dos galhos de Simaba polyphylla, após extração em Hexano foram
submetidos à extração por maceração em MeOH durante 7 dias. Esse processo
foi repetido por mais duas vezes. Em seguida, o extrato metanólico foi submetido
a um fracionamento por partição com CHCl3 e AcOEt (Esquema 9).
50
Galhos moídos
(2,0 Kg)
Extração em Hexano a frio
Extrato hexânico
22,0 g
" torta"
Af: 64% em 250 µg/mL
Aa: 44% em 500 µg/mL
Extração em MeOH
a frio
Extrato metanólico
71,26 g
Af: 14% em 500 µg/mL
Aa: 0% em 500 µg/mL
Partição em CHCl3 e MeOH/H2O (7:3)
(66,68 g)
Fração clorofórmica
33,73 g
Fase hidroalcoólica
Af: 77% em 250 µg/mL e CL50 = +/- 17,5 µg/mL
Aa: 3% em 250 µg/mL
Fração AcOEt
11,85 g
Af: 0% em 250 µg/mL
Aa: 0% em 250 µg/mL
Partição em AcOEt
Fração hidroalcoólica
22,63 g
Af: 0% em 250 µg/mL
Aa: 0% em 250 µg/mL
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 9. Preparação dos extratos e fracionamento por partição dos galhos de Simaba
polyphylla e resultados do screening em Artemia franciscana e Aedes aegypti.
51
3.2.4. Fracionamento do extrato hexânico dos galhos de Simaba polyphylla.
A extração de 2,0 Kg de serragem dos galhos de Simaba polyphylla em
hexano forneceu um extrato com massa equivalente a 22,09 g. Foi reservada uma
pequena quantidade desse extrato (4,18 g) para realização de testes de atividade
biológica e o restante (17,91 g) foi submetido a uma separação em coluna
cromatográfica de sílica gel com gradiente Hex/AcOEt. Foram obtidas 85 frações
que após análise em CCD foram reunidas resultando em 18 frações. O
procedimento de separação está descrito conforme o Esquema 10.
Extrato hexânico dos galhos
17,91 g
coluna cromatográfica em Si gel
Gradiente Hex/AcOEt
Fr. 14-16
391,5 mg
Fr. 1-13
30,7 mg
Fr. 17-20
71,4 mg
Fr. 21-23
(42,7 mg)
Fr. 24-32
(391,2 mg)
Fr. 33-36
252,4 mg
Fr. 48-51
2,1623 g
Fr. 37-40
562,6 mg
1.Fr. 41-45
(414,7 mg)
2.Fr. 46-47
(166,4 mg)
Fr. 61-65
1,073 g
1.Fr. 52-56
(1,1038 g)
2. Fr. 57-60
(271,3 mg)
Fr. 75-77
618,9 mg
Fr. 78-82
2,2 g
Fr. 66-74
1,75 g
recristalização
em MeOH
a quente
recristalização
em AcOEt
a quente
O
OH
HO
O
OH
Fr. 83
2,59 g
Diidroniloticina (74)
177,8 m g
O
Niloticina (73)
201,7 mg
Esquema 10. Fracionamento cromatográfico do extrato hexânico dos galhos de S. polyphylla.
Fr. 84
2, 5 g
52
3.2.5. Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de
Simaba polyphylla (SPGC1.46)
Inicialmente foi realizada uma separação em coluna filtrante de gel de sílica
de SPGC1.46 com fase móvel inicial de hexano 100%, seguida de clorofórmio
100%, misturas de CHCl3/MeOH nas concentrações de MeOH de 3%, 5% e 30% e
MeOH 100% (Esquema 11). Foram geradas 15 frações. As frações 5 e 6 foram
recristalizadas em AcOEt e resultaram no isolamento de 28,6 mg do triterpeno
taraxerona. A fração no. 8 foi eluída em coluna cromatográfica de gel de sílica
utilizando como sistema gradiente de eluição a mistura de CHCl3/MeOH até 10%
de MeOH. Foram geradas 41 frações que após análise em CCD foram reunidas
resultando em 9 frações. A fração 17-19 foi submetida a um fracionamento
cromatográfico em coluna flash de gel de sílica utilizando como eluição o sistema
gradiente de hexano com a mistura CHCl3/MeOH (98:2) até 100% dessa mistura e
posteriormente, aumentou-se a concentração de MeOH até 4% em CHCl3. Foram
geradas 82 frações que após análise em CCD resultaram em 13 frações reunidas.
A fração reunida no. 5 foi recristalizada em MeOH resultando no isolamento de um
cristal amarelo de 11,6 mg identificado como o alcalóide 9-metoxicantin-6-ona
(Esquema 11).
53
SPGC1.46
22,4 g
coluna filtrante em gel de sílica
1. Hexano 100%
2. CHCl3 100%
3. CHCl3/MeOH (97:3)
4. CHCl3/MeOH (95:5)
5. CHCl3/MeOH (7:3)
15 frações
Fr. 1-4
não reunidas
Fr. 5
52,1 mg
Fr. 7
47,8 mg
Fr. 6
45,6 mg
Fr. 9-10
4,0 g
Fr. 8
1,9 g
Fr. 11-15
não reunidas
coluna em gel de
sílica
gradiente
Hex/CHCl3/MeOH
Recristalização em
AcOEt a quente
Fr. 20-41
não reunidas
Fr. 17-19
718,4 mg
Fr. 1-15
26,9 mg
O
coluna em gel de sílica
gradiente
Hex/CHCl3/MeOH
Taraxerona (75)
28,6 mg
Fr. 1-29
não reunidas
Fr. 30-33
52,7 mg
Fr. 34-82
não reunidas
recristalização em MeOH
a quente
MeO
N
N
O
9-metoxicantin-6-ona (35)
11,6 mg
Esquema 11. Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de S. polyphylla.
54
As frações 9 e 10 foram reunidas e posteriormente submetidas a uma
separação em coluna de gel de sílica com sistema gradiente de eluição de Hexano
com a mistura DCM/MeOH (98:2). Após chegar ao sistema de 100% da mistura
DCM/MeOH, aumentou-se a concentração de MeOH até 10% em DCM. Após
análise em CCD, as frações foram reunidas resultando em 17 frações (Esquema
12). A fração reunida 55-63 que foi posteriormente separada será discutida no
item a seguir.
3.2.5.1. Separação cromatográfica da subfração 55-63 da fração 9-10 de
SPGC1.46
A fração 55-63 foi eluída em coluna flash em gel de sílica. O sistema
gradiente de eluição inicialmente utilizado foi Hexano/DCM. Após a eluição com
DCM 100% foi utilizado o sistema gradiente DCM/MeOH até chegar a
concentração de 10% de MeOH (Esquema 12). Dessa separação foram geradas
18 frações reunidas após análise em CCD. A fração no. 10 (70,3 mg) foi
posteriormente separada em HPLC preparativo em sistema de eluição isocrático
de água/ACN (67:33) com fluxo de 1,5 mL/min durante 16 minutos. Foram
isoladas as substâncias SPGC1.147 (3,5 ,g), SPGC2.147 (3,0 mg) e SPGC 3.147
(5,0 mg).
55
Fr. 9-10 de SPGC1.46
4,0 g
coluna cromatográfica em gel de sílica
Gradiente Hex/DCM/MeOH
Fr. 1-54
10,0 mg
Fr. 64-111
não reunidas
Fr.55-63
416,0 mg
Fr. 112-114
457,0 mg
coluna cromatográfica em
gel de sílica
Gradiente Hex/DCM/MeOH
SPGC1.128
a SPGC9.128
não reunidas
SPGC10.128
70,3 mg
SPGC11.128
51,4 mg
SPGC12.128
a SPGC18.128
não reunidas
HPLC preparativo
água/ACN (67:33)
isocrático
SPGC1.147
3,5 mg
SPGC3.147
5,0 mg
SPGC2.147
3,0 mg
MeO
N
H
N
OH
O
Ácido 7-metoxi-(9H-β -carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76)
Esquema 12. Separação cromatográfica da fração 9-10 de SPGC1.46
Fr. 115-130
não reunidas
56
3.3. Trabalho fitoquímico realizado com os galhos de Simaba guianensis
subsp. ecaudata (Cronquist)
3.3.1.Coleta do material botânico
As partes aéreas de dois espécimes de Simaba guianensis subesp.
ecaudata (Cronquist) foram coletadas no dia 16 de fevereiro de 2002 (período de
chuvas), na reserva Ducke do INPA em Manaus. O material vegetal foi seco à
sombra e depois separado em galhos e folhas para posterior moagem em moinho
de facas. As exsicatas dos espécimes encontram-se no herbário do INPA
identificadas com os números 3861 e 3859.
3.3.2. Preparação dos extratos
O mesmo procedimento utilizado para a preparação dos extratos dos
galhos de Simaba polyphylla foi utilizado para a espécie S. ecaudata. Inicialmente
foram preparados extratos metanólicos em soxhlet e aquosos, na forma de
infusão, de pequenas quantidades de folhas e galhos para um “screening” inicial
de atividade letal em larvas de Artemia franciscana e de Aedes aegypti com o
objetivo de posteriormente se trabalhar com os extratos e frações ativos
(Esquemas 13, 14 e 15).
Fracionamento por partição dos extratos metanólicos. Uma porção de cada extrato
metanólico foi dissolvida em MeOH/H2O (9:1) e particionada 3 vezes em hexano.
Em seguida adicionou-se água à fase hidroalcoólica até atingir a proporção
MeOH/H2O (7:3) e extraiu-se com CHCl3 por 3 vezes. Após a partição com
clorofórmio, extraiu-se por três vezes, a fase hidroalcoólica com acetato de etila.
57
galhos
SSN-1
32,0 g
Extração em
H2O quente
32,28 g
Extração em MeOH
(Soxhlet)
Extrato aquoso
0,82 g
Extrato MeOH
1,07 g
Af:74% CL50 = 249 +ou- 52
Aa: 100%
teor de extrativos: 3,31%
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos:2,56 %
Partição em diferentes solventes (188,0 mg)
Fr. Hexânica
7,9 mg
Af: 80 %
Aa: 24%
teor de extrativos: 4,2%
Fr. CHCl3
43,0 mg
Fr. AcOEt
26,5 mg
Fr. hidroalcoólica
67,2 mg
Af: 7,0%
Af: 84%
Af: 0%
Aa: 0%
Aa: 64%
Aa: 0%
teor de extrativos: 22,8% teor de extrativos: 14,0% teor de extrativos: 35,7%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 13. Preparação de extratos e frações dos galhos de Simaba guianensis subesp.
ecaudata (espécime 1) e resultados do screening com Artemia franciscana e Aedes aegypti
(extratos em 500 µg/mL e frações em 250 µg/mL).
58
Galhos
SSN-2
33,12 g
Extração em
H2O quente
46,2g
Extração em MeOH
(Soxhlet)
Extrato aquoso
0,91 g
Extrato MeOH
1,68g
Af: 47%
Aa: 70% e LC50 = 471 +ou- 44
teor de extrativos: 3,63%
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos: 2,74%
Partição em diferentes solventes (302,3 mg)
Fr. Hexânica
13,2 mg
Af: 10%
Aa: 20%
teor de extrativos: 4,36%
Fr. CHCl3
73,0 mg
Fr. AcOEt
31,6 mg
Fr. hidroalcoólica
153,0 mg
Af: 0%
Af: 40%
Af: 0%
Aa: 0%
Aa: 7,0%
Aa: 0%
teor de extrativos: 24,1% teor de extrativos: 10,4% teor de extrativos: 50,6%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 14. Preparação de extratos e frações dos galhos de Simaba guianensis subesp.
ecaudata (espécime 2) e resultados do screening com Artemia franciscana e Aedes aegypti
(extratos em 500 µg/mL e frações em 250 µg/mL).
59
folhas
SSN-1
25,4 g
Extração em
H2O quente
48,0 g
Extração em MeOH
(Soxhlet)
Extrato aquoso
2,8 g
Extrato MeOH
9,24 g
Af:0%
Aa: 0%
teor de extrativos: 19,25%
Af: 0%
Aa: 0%
teor de extrativos:11,0 %
Partição em diferentes solventes (295,6 mg)
Fr. Hexânica
15,3 mg
Af: Aa: teor de extrativos: 5,17%
Fr. CHCl3
73,1 mg
Fr. AcOEt
71,5 mg
Fr. hidroalcoólica
98,4 mg
Af: 14,0%
Af: 10%
Af: 4,0%
Aa: Aa: Aa: teor de extrativos: 24,72% teor de extrativos: 24,1% teor de extrativos: 33,2%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 15. Preparação de extratos e frações das folhas de Simaba guianensis subesp.
ecaudata e resultados do screening com Artemia franciscana e Aedes aegypti (extratos em 500
µg/mL e frações em 250 µg/mL).
60
3.3.3.
Preparação
dos
extratos
dos
galhos
para
fracionamento
cromatográfico e por partição.
Foram extraídos com hexano a frio 2,0 Kg de galhos moídos no período de
7 dias. O procedimento foi repetido por mais duas vezes com a mesma serragem.
Os extratos foram reunidos e concentrados resultando em 8,9 g de extrato
(Esquema 16). Após extração em hexano, o resíduo foi extraído a frio em MeOH
por mais 7 dias. O procedimento também foi repetido por mais duas vezes. A
massa resultante do extrato metanólico após concentração foi de 63,07 g. Foram
separados 58,0 g desse extrato. Esse foi submetido a um fracionamento por
partição com CHCl3 e AcOEt (Esquema 16).
3.3.4. Separação cromatográfica do extrato hexânico dos galhos de Simaba
guianensis subesp. ecaudata.
O extrato hexânico de Simaba guianensis (8,9 g) foi submetido a uma
separação em coluna de gel de sílica com sistema gradiente de Hexano/AcOEt.
Foram geradas 69 frações que foram reunidas após análise em CCD resultando
em 13 frações (Esquema 17). A fração 1-12 foi submetida a uma separação em
coluna de sílica flash com gradiente Hexano/AcOEt. Foram geradas 22 frações
que após análise por CCD foram reunidas em 7 frações. A fração 4 (103,0 mg),
após análises dos espectros, foi identificada como sendo o óxido de cariofileno
(Esquema 17).
61
galhos
2,0 Kg
Extração em Hexano (T.A.)
Af: 84%
Aa: 90%
Resíduo
Extrato hexânico
8,9 g
MeOH
(T. A.)
Extrato MeOH
63,07 g
Resíduo
Af: 0%
Aa: 0%
Partição
CHCl3 e MeOH/H2O (7:3)
concentração da fase clorofórmica
Fração clorofórmica
(SNGC1.54)
Af: 36%
20,6 g
Aa: 0%
Fase hidroalcoólica
Partição com AcOEt
concentração
Af: 0%
Aa: 0%
Fração AcOEt
(SNGAc1.54)
9,4 g
Fração hidroalcoólica
SPGM1.54
Af: 7%
25,4 g
Aa: 0%
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
Esquema 16. Preparação de extratos e fracionamento por partição dos extratos dos galhos de
Simaba guianensis subesp ecaudata e resultados do screening com Artemia franciscana e Aedes
aegypti (extratos em 500 µg/mL e frações em 250 µg/mL).
62
Extrato hexânico
(SNG1.4)
8,9 g
Af: 84%
Aa: 0%
Coluna em gel de sílica
gradiente Hexano/AcOEt
69 frações
análise em CCD
Af: 100%
Aa: 0%
Fr. 1-12
305,2 mg
Fr. 13-63
(não reunidas)
Fr. 64-69
2,0 g
Af: 44%
Aa: 70%
coluna em sílica flash
gradiente Hexano/AcOEt
22 frações
análise em CCD
Fr. 4
103,0 mg
Fr. 1-3
não reunidas
Fr. 5-7
não reunidas
O
*Af - Artemia franciscana
Aa - Aedes aegypti
óxido de cariofileno (77)
103,0 mg
Af: 84%
CL50 = 103 +/- 11 µg/mL
Esquema 17. Separação cromatográfica do extrato hexânico de Simaba sp nov. (SNG1.4) e
resultados do screening com Artemia franciscana e Aedes aegypti (extratos em 500 µg/mL e
frações em 250 µg/mL).
63
A fração 64-69 de SNG1.4 também foi submetida a uma separação em
coluna de sílica gel, utilizando CHCl3/MeOH como sistema gradiente de eluição,
até chegar à concentração de 10% de MeOH. A separação e posterior análise em
CCD resultou em 10 frações reunidas. Em seguida, a fração 3 foi recristalizada em
AcOEt. Os cristais incolores (164,7 mg) após análise de espectros de RMN mono
e bidimensionais, EM e IV foram identificados como o triterpeno Piscidinol A
(Esquema 18).
SNG1.4(64-69)
1,0 g
coluna cromatográfica em gel de sílica
gradiente CHCl3/MeOH
72 frações
Análise em CCD e reunião de frações iguais
Fr. 1-2
não reunidas
Fr. 3
630,2 mg
Fr. 4-10
não reunidas
recristalização em AcOEt a quente
OH
OH
O
Piscidinol A (78)
164,7 mg
Esquema 18. Separação cromatográfica da fração 64-69 de SNG1.4.
64
3.3.5. Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de
Simaba guianensis subesp ecaudata (SNGC1.54).
A fração clorofórmica dos galhos de Simaba guianensis subesp. ecaudata
(20,6 g) foi inicialmente submetida a uma separação simples em coluna filtrante de
gel de sílica. O eluente inicial foi Hexano 100%, seguido de clorofórmio 100%,
CHCl3/MeOH (97:3), CHCl3/MeOH (95:5), CHCl3/MeOH (7:3) e MeOH 100%,
respectivamente. Foram recolhidas 15 frações. A fração 7, demonstrou por análise
em CCD presença de alcalóides quando revelado com reagente de Dragendorff.
Esta foi dissolvida em uma mistura de MeOH/H2O (9:1) e particionada com
hexano. A fração hidroalcóolica SNGC1.54.7.1 (3,15 g) foi fracionada em coluna
de MPLC de fase reversa (RP-18) com sistema de eluição em EtOH/H2O até a
concentração de 70% de EtOH. Após análise em CCD as frações iguais foram
reunidas em 39 frações. A fração 19 foi recristalizada em MeOH resultando no
isolamento de 62,8 mg do alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona (35), solúvel em CHCl3
e 16,9 mg de um alcalóide com PF 232 oC identificado como 6-metoxi-β-carbolin(Z)-propenóico (79), solúvel em MeOH. A fração 30 foi recristalizada em MeOH a
quente e resultou na formação de um material cristalino incolor pesando 29,0 mg
que identificado como o triterpeno Piscidinol A (78)(Esquema 19).
65
SNGC1.54
20,6 g
coluna filtrante em gel de sílica
Gradiente: Hexano 100%
CHCl3 100%
CHCl3/MeOH (97:3)
CHCl3/MeOH (95:5)
CHCl3/MeOH (7:3)
MeOH 100%
Fr. 7
7,8 g
Fr. 1- 6
não reunidas
Fr. 8-15
não reunidas
Partição Hexano e MeOH/H2O (9:1)
Fr. hidroalcóolica
SNGC1.54.7.1
3,15 g
Fr. hexânica
SNGC1.54.7.2
1,95 g
Separação em MPLC
fase reversa (RP-18)
Gradiente H2O/EtOH
Fr. 1-18
não reunidas
Fr. 19
198,0 mg
Fr. 20-29
não reunidas
recristalização em MeOH
material insolúvel em MeOH
SNGC1.146
9-metoxi-cantin-6-ona (35)
62,8 mg
material solúvel
em MeOH
MeO
N
H
N
Fr. 30
262,0 mg
Fr. 31-39
não reunidas
recristalização em MeOH
SN2.154
Piscidinol A (78)
29,0 mg
COOH
Ácido 6-metoxi-(9H-β -carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79)
16,9 mg
Esquema 19. Separação cromatográfica da fração clorofórmica dos galhos de Simaba guianensis
subesp. ecaudata.
66
3.4. Quantificação de 9-metoxi-cantin-6-ona nos extratos e frações dos
galhos de Simaba polyphylla e S. guianensis subsp. ecaudata por CLAE
Os extratos metanólicos, aquosos e as frações clorofórmicas dos galhos de
Simaba polyphylla e S. guianensis foram submetidos a uma análise por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para avaliação da concentração de
9-metóxi-cantin-6-ona, presente nesses extratos.
3.4.1. Método de análise em CLAE
As análises por CLAE foram realizadas nas seguintes condições:
Modo isocrático ACN/solução aquosa de TFA 0,05% (30:70) por 35
minutos, fluxo de 1,0 mL/min em coluna LiChrospher 60 RP-Select B (5 µm) 250 x
4 mm, da Merck. Todas as injeções foram realizadas com volume de loop de 20
µL. A detecção foi realizada no ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm.
3.4.2. Curva de Calibração
Diferentes soluções metanólicas do padrão de 9-metoxi-cantin-6-ona foram
preparadas, a partir de uma solução-mãe de 1,0 mg/mL, preparada em balão
volumétrico. As concentrações finais do padrão injetadas foram preparadas por
diluições sucessivas da solução-mãe, obtendo-se as soluções do padrão nas
concentrações de 1,00, 0,50, 0,25, 0,12 e 0,625 µg/mL.
67
3.4.3. Preparação das amostras
As amostras foram preparadas filtradas em filtro de membrana de PVDF
da Millipore (0,2 µm) ou cartucho de Sep-pak (Waters) de fase reversa (C-18).
Todas as amostras foram analisadas por CLAE nas condições acima descritas. As
frações clorofórmicas dos galhos de cada uma das espécies foram preparadas em
metanol na concentração de 0,125 mg/mL. Foram analisadas e indicaram a
presença de 9-metoxi-cantin-6-ona em quantidades que permitiam a sua
quantificação.
No caso dos extratos aquosos e metanólicos, foram preparadas
inicialmente, soluções na concentração de 1,00 mg/mL, mas não foi possível
detectar a presença de 9-metoxi-cantin-6-ona. Decidiu-se então pelo tratamento
da amostra empregando técnica de extração em fase sólida (EFS), como descrito
nos itens a seguir.
3.4.3.1 Tratamento dos extratos metanólicos
Os extratos metanólicos dos galhos de Simaba polyphylla e S. guianensis
analisados estão descritos nos itens 2.2.3 e 2.3.3. Estes foram inicialmente
solubilizados em uma mistura de MeOH/H2O (1:1) na concentração de 1 mg/mL e
volume total de 2 mL. Em seguida, foram tratados através do processo de EFS
(extração em fase sólida), segundo o esquema a seguir.
68
Solução de Extrato MeOH
1 mg/mL em 2 mL de MeOH/H2O (1:1)
1. Passagem por SEP PAK (C-18 Waters)
2. Lavagem com 10 mL de MeOH/H2O (1:1)
solução 1
substâncias polares
SEP-PAK
2 mL de MeOH/AcOEt (7:3)
solução 2
analito
SEP-PAK
lavagem com 10 mL
de MeOH/AcOEt (7:3)
Quantificação
por HPLC
solução 3
substâncias lipofílicas
Esquema 20. Tratamento dos extratos metanólicos de S. polyphylla e S. guianensis.
3.4.3.2. Tratamento dos extratos aquosos dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis subesp. ecaudata.
Os extratos aquosos dos galhos das espécies em estudo foram preparados
por infusão (item 2.2.2). A partir dos extratos secos, preparou-se uma solução de 5
mg/mL que foi submetida a um tratamento por EFS, conforme o Esquema 21.
69
Extrato aquoso
5 mg/mL (10 mL)
SEPPAK (C-18 Waters)
solução 1
substâncias polares
SEP-PAK
10 mL de MeOH/H2O (1:1)
solução 2
substâncias polares
SEP-PAK
1 mL de MeOH/AcOEt (7:3)
solução 3
analito
SEP-PAK
10 mL de MeOH/AcOEt (7:3)
CLAE
solução 4
substâncias lipofílicas
Esquema 21. Tratamento realizado com os extratos aquosos dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis subsp. ecaudata.
3.5. Avaliação da atividade biológica de extratos e frações de galhos e folhas
de Simaba polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata.
Os ensaios de atividade biológica foram realizados inicialmente para melhor
direcionar o fracionamento fitoquímico dos constituintes químicos das espécies em
estudo. Entretanto, alguns ensaios, tais como os de atividade antitumoral, não
70
permitiram
o
biomonitoramento
e
direcionamento
adequado
diante
das
dificuldades e demora na obtenção dos resultados. Porém os resultados obtidos
não podem deixar de ser citados, uma vez que, foram realizados como parte
desse trabalho.
3.5.1. Ensaios de atividade letal contra microcrustáceos Artemia franciscana.
Os ensaios de citotoxicidade em Artemia franciscana foram realizados no
Laboratório de Princípios Ativos da Amazônia, no INPA, pela bolsista Cíntia
Portela, sob a orientação do Dr. Ettienne Quignard.
Solubilização das amostras: Depois de pesadas em frascos de Eppendorf
as amostras foram solubilizadas em 1 mL de solvente adequado (Tween – 80
(25%) para amostras apolares, DMSO para as de média polaridade, água para
amostras aquosas). A concentração de extratos testados foi 500 µg/mL e das
frações obtidas por partição 250 µg/mL.
Screening padrão com placa 3 x 4: Preencheu-se cada poço com 1800 µL
de solução salina. Com auxílio de uma pipeta de Pasteur previamente calibrada,
transferiu-se dez larvas para cada poço com o cuidado de não ultrapassar 160 µL.
Em seguida, aplicou-se 200 µL e completou-se o volume para 5,0 mL. As placas
foram acondicionadas e protegidas de luminosidade intensa, em repouso por 24
horas.
71
3.5.2. Avaliação da citotoxicidade in vitro de extratos e frações de galhos e
folhas de Simaba polyphylla e S. guianensis subsp. ecaudata.
Os ensaios in vitro de citotoxicidade dos extratos e frações das espécies em
estudo foram realizados como parte de um screening inicial para a determinação
do potencial antitumoral das espécies S. polyphylla e S. guianensis. Esses foram
realizados pela equipe de pesquisadores Manoel O. de Moraes, Cláudia do Ó
Pessoa, Letícia Veras Lotufo e Maria Elisabete A. de Moraes, do Laboratório de
Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará.
3.5.2.1 Material e método de análise
Células: As linhagens utilizadas, MDA-MB (mama - humano), HCT-8 (cólon
- humano) e Melanoma (pele – murino), foram cedidas pelo Mercy Children´s
Hospital, tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10% de
soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37°C e atmosfera
contendo 5% de CO2.
Amostras: Foram testadas amostras (extratos, frações e subfrações
cromatográficas) de galhos e folhas de Simaba polyphylla e S. guianensis: As
amostras foram diluídas em DMSO na concentração estoque de 25 mg/ml.
A citotoxicidade dos extratos foi avaliada pelo método da Sulforodamina B
(SKEHAN et al., 1990). Foram plaqueadas 4 placas de 96 cavidades por
experimento, uma para cada linhagem celular testada (MDA-MB, Melanoma e
72
HCT-8) e uma placa de tempo-zero com as três linhagens . As células foram
plaqueadas nas seguintes concentrações: HCT-8 e melanoma, 0,4 x 105cél/mL, e
MDA-MB, 1x106cél/mL. Após 24 horas de incubação, foi fixada a placa de tempo
zero em ácido tricloroacético 50% “gelado” e, nas demais placas foram incubadas
as drogas na dose de 120 µg/mL. As amostras foram testadas em duplicata. Estas
placas foram fixadas após 48 horas de incubação com as drogas. Todas as placas
foram coradas com sulforodamina B e lidas em espectrofotômetro de placa no
comprimento de onda de 540 nm.
3.5.3. Teste de atividade biológica contra larvas de Aedes aegypti
O teste de atividade larvicida em Aedes aegypti foi realizado no Laboratório
de Princípios Ativos da Amazônia no INPA pela bolsista Érika de Oliveira Gomes
sob a orientação do Dr. Ettiene Quignard. As amostras foram solubilizadas na
concentração de 50 mg/mL em solvente adequado (idem teste com A.
franciscana). Em copos descartáveis de 50 mL foram adicionados 9,0 mL de água
de torneira, 10 larvas de 3o. estádio (aproximadamente 0,5 mL), alimento líquido
(0,5 mL) e 100 µL da amostra a ser testada ou do solvente controle. Para cada
solvente utilizado para dissolver as amostras há um controle do solvente. Os
copos foram colocados na estante em fileira de 3 (as amostras foram testadas em
triplicata). Após 24 h, contou-se o número de larvas sobreviventes e calculou-se a
percentagem de mortalidade resultante dos extratos e frações analisados.
73
4. Resultados e discussão
4.1. Identificação de substâncias extraídas dos galhos de Simaba polyphylla
(Cavalcante) Thomas.
4.1.1. Niloticina
22
21
20
18
24
12
1
19
17
11
13
9
2
4
OH
26
25
27
16
15
10
O
O
23
7
5
30
6
28
29
73
O fracionamento cromatográfico do extrato hexânico dos galhos de Simaba
polyphylla (Esquema 10) resultou no isolamento de 201,7 mg de uma substância
cristalina incolor e com ponto de fusão entre 145-147o C e [α]d = -59,8o (DCM; c
0,05).
O espectro de IV (pág.156) apresentou como bandas principais, uma em
3.468 cm-1 sugerindo a presença de função hidroxila na molécula, outra banda
intensa em 1.705 cm-1 referente à presença de carbonila, possivelmente de
cetona, e uma bem menos intensa em 1664 cm-1, referente à insaturação entre
dois átomos de carbono.
74
A análise inicial dos espectros de RMN de 1H e
13
C (Tabela 2) e EM, assim
como a comparação com os dados da literatura (GRAY et al. 1988, WANG et al
2003, KAMPERDICK et al 2003) indicou tratar-se de um triterpeno, com esqueleto
tirucalano.
Na análise dos espectros de RMN de
13
C (HBBD e DEPT135), observou-se
a presença de 30 carbonos. O grande número de triterpenos registrados na
literatura demonstra que alguns deslocamentos químicos nos espectros de RMN
de
13
C são muito característicos em cada esqueleto básico. Observou-se que o
espectro de 73 apresenta 3 carbonos sp2 cujos deslocamentos são δ 217,0;
δ 118,1 e δ 145,9. Deslocamentos químicos na região de δ 215-217 indicam a
função carbonila em C-3. Os carbonos em δ 118,1 e δ 145,9 indicam uma
insaturação entre os carbonos C-7 e C-8, muito comum em triterpenos tipo
tirucalanos (GRAY et al. 1988, WANG et al 2003, KAMPERDICK et al 2003;
OLEA-GALLEGOS e ROQUE, 1990). Triterpenos do tipo tirucalano são
conhecidos como precursores dos quassinóides e estão presentes em espécies
da família Simaroubaceae (DEWICK, 2002). Comparando-se os valores obtidos
com os dados publicados na literatura para triterpenos do tipo tirucalano, foi
possível identificar a substância 73 como sendo a niloticina.
De acordo com o espectro de DEPT, foi observada a presença de oito
metilas. Estas foram confirmadas pelo espectro de RMN 1H e correlações no
HMQC (pág. 162, 163 e 165).
Os demais sinais observados foram comparados inicialmente com
deslocamentos químicos de outros triterpenos tirucalanos (GRAY et al. 1988,
75
WANG et al 2003, KAMPERDICK et al 2003) e posteriormente confirmados por
análise de espectros bidimensionais HOMOCOSY e HMBC, discutidos na página
74.
Tabela 2. Deslocamentos químicos observados de RMN 1H e 13C para a niloticina (73) em CDCl3.
Posição
1
δC (50 MHz)
38,6
2
35,0
3
4
5
6
217,0
48,0
52,4
24,6
7
8
9
10
11
118,1
145,9
48,6
35,1
19,1
12
33,8
13
14
15
16
43,7
51,3
34,1
29,0
17
18
19
20
21
22
53,4
21,7
12,9
33,6
20,0
41,0
23
69,3
δH (200 MHz)
1,40 (m)
1,96 (m)
2,21 (t; 3,5)
2,76 (dt; 14,2; 5,2)
1,72 (m)
2,28 (t; 3,5)
2,08 (m)
5,31 (d; 3,0)
2,28 (t; 3,5)
1,60 (m)
1,39 (m)
1,65 (m)
1,89 (m)
1,46 (m)
1,64 (m)
2,12 (m)
1,57 (m)
0,82 (s)
1,00 (s)
1,86 (m)
0,95 (d; 5,7)
1,43 (m)
1,67 (m)
3,58 (m; 5,0; 8,0; 8,0)
Literatura1 (δC)a
38,1
68,6
2,66 (d; 8)
24
60,3
25
19,9
1,33 (s)
26
24,6
1,32 (s)
27
25,0
1,05 (s)
28
21,9
1,12 (s)
29
27,5
1,02 (s)
30
1
GRAY et al. (1988).
a
Campo magnético 362,2 MHz para 1H e 90,5 MHz para
CDCl3.
ND = valores não determinados na literatura1.
117,6
145,3
48,3
34,6
17,9
Literatura1 (δH)a
1,40 (m)
2,02 (m)
2,27 (m)
2,75 (td; 14,5; 5,5)
ND
2,27 (m)
2,08 (m)
5,27 (td; 3,5; 3,0)
2,02 (m)
ND
33,3
ND
43,2
50,8
33,7
28,3
ND
ND
52,9
12,4
19,4
33,2
19,6
40,4
ND
0,94 (s)
0,75 (s)
1,20 (m)
0,89 (d; 6,0)
1,40 (m)
1,55 (m)
3,49 ( dtd; 8,4; 5,2;
2,7)
2,64 (d; 8,4)
1,25 (s)
1,26 (s)
1,05 (s)
0,95 (s)
0,95 (s)
34,4
215,1
47,4
52,0
24,0
68,8
68,2
59,4
21,2
24,2
24,5
21,4
27,0
13
C. As amostras foram analisadas em
76
A confirmação da estrutura, inclusive a atribuição dos carbonos e
hidrogênios da cadeia, lateral foi realizada pela análise dos espectros
bidimensionais HOMOCOSY, HMQC e HMBC (Tabela 3).
O carbono em δ 68,6 apresenta correlação no espectro HMQC com o
hidrogênio em δ 2,66, um dubleto com constante de acoplamento de 8 Hz,
característico de epóxido. Esse hidrogênio acopla com o hidrogênio H-23 com
uma constante J de 8 Hz, sugerindo tratar-se do carbono vizinho, C-24, da cadeia
lateral e formando a ponte de epóxido com o carbono quaternário C-25 com sinal
em δ 60,3.
O sinal de carbono observado em δ 69,3 é característico de um carbono
carbinólico (ligado a uma hidroxila). Este apresenta correlação direta, em espectro
de HMQC, com o hidrogênio em δ 3,58. Através da análise de HOMOCOSY
observou-se que este hidrogênio apresenta correlação com os hidrogênios δ 1,67
e 2,66, respectivamente atribuídos a H-22 e H-24, sugerindo que os sinais de
carbono e hidrogênio observados correspondem à posição 23, na cadeia lateral do
triterpeno.
De acordo com a curva de Karplus, o acoplamento vicinal entre os
hidrogênios em δ 2,66 e δ 3,58 com J = 8 Hz sugerem que esses hidrogênios
estejam distanciados com ângulo diedro entre 22 e 36o corroborada pela ligação
hidrogênio entre a hidroxila e o oxigênio do epóxido (FRIEBOLIN, 1998).
Foi possível realizar algumas reatribuições dos dados publicados na
literatura (GRAY et al, 1988). Foram reatribuídos os deslocamentos químicos de
carbono referentes às metilas 18 e 19 como sendo em 21,7 e 12,9,
77
respectivamente. Esses puderam ser confirmados através das correlações C-H à
longa distância observada para os hidrogênios da metila 18 com os carbonos C-13
e C-14. Também foi observada a correlação à longa distância do carbono C-5 com
os hidrogênios da metila 19 (Figura 5).
Tabela 3. Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
substância (73).
H-H
Me-21 – H-22
H-1 – H-5
H-1 – H-1
H-1 – H-2
H-1 – H-2
H-2 – H-2
H-11- H-12
H-11 – H-9
H-15 – H-16
H-16 – H-17
H-22 – H-23
H-23 – H-24
δH-δH
0,95 - 1,43
1,40 - 1,72
1,40 - 1,96
1,40 - 2,76
1,96 – 2,76
2,21-2,76
1,39-1,65
1,39-2,28
1,46 – 2,12
2,12 – 1,57
1,67 – 3,58
3,58 – 2,66
C-H
C-1 – H-1
C-2 – H-2
C-2 – H-2
C-5 – H-5
C-6 – H-6
C-7 – H-7
C-12 – H-12
C-15 – H-15
C-16 – H-16
C-17 – H-17
Me-18 – H-18
Me-19 – H-19
C-20 – H-20
Me-21 – H-21
C-22 – H-22
C-23 – H-23
C-24 – H-24
Me-26 – H-26
Me-27 – H-27
Me-28 – H-28
Me-29 – H-29
Me-30 – H-30
δC-δH (1J)
38,6 – 1,96
35,0 – 2,21
35,0 – 2,76
52,4 – 1,72
24,6 – 2,28
118,1 – 5,31
33,8 – 1,89
34,1 – 1,46
29,0 – 2,12
53,4 – 1,57
21,7 – 0,82
12,9 – 1,00
33,6 – 1,86
20,0 – 0,95
41,0 – 1,43
69,3 – 3,57
68,6 – 2,66
19,9 – 1,33
24,6 – 1,32
25,0 – 1,05
21,9 – 1,12
27,5 – 1,02
C-H
C-1 – H-2
C-2 – H-1
C-3 – H-2
C-3 – Me-29
C-4 – H-6
C-4 – Me-28
C-5 – Me-29
C-5 – H-7
C-5 - Me-28
C-9 – H-5
C-9 – H-7
C-9 – H-12
C-9 – H12
C-10 – H-2
C-13 – Me-18
C-14 – Me-18
Me-19 - H-5
Me-28 – H-29
Me-28 – H-5
Me-29 – H-28
Me-29 – H-5
Me-30 – H-15
Me-30 – H-16
δC-δH (2,3J)
38,6 – 2,76
38,6 – 1,96
217,0 – 2,76
217,0 – 1,12
48,0 – 2,28
48,0 – 1,05
52,4 – 1,12
52,4 – 5,31
52,4 – 1,05
48,6 – 1,72
48,6 – 5,31
48,6 – 1,65
48,6 – 1,89
35,1 – 2,21
43,7 – 0,82
51,3 – 0,82
12,9 – 1,72
25,0 – 1,12
25,0 – 1,72
21,9 – 1,05
21,9 – 1,72
27,5 – 1,46
27,5 – 2,12
O
18
19
OH
13
14
5
O
Figura 5. Principais correlações heteronucleares C-H à longa distância observadas em 73
78
O espectro de massas obtido não apresentou o correspondente íon
molecular (m/z 456), mas foram observadas as fragmentações m/z 384 (18), 369
(100), 351 (38), 325 (54), 271 (17), 213 (10), 147 (22) e 133 (25) que estão de
acordo com aquelas publicadas para a niloticina (GRAY et al. 1988). As
fragmentações observadas de m/z 384, 369 e 351 correspondem às perdas
sucessivas dos grupamentos 2,2-dimetil-oxirano, metil e água da cadeia lateral do
triterpeno.
.
+
O
.
O
H
H
O
OH
O
O
m/z 384
m/z 456
.CH3
H
.
+
O
H2O
O
O
m/z 351
m/z 369
Esquema 22. Proposta para as principais fragmentações da niloticina (73).
.
+
.+
79
4.1.2. Diidroniloticina
O extrato hexânico dos galhos de Simaba polyphylla resultou no isolamento
de 177,8 mg de uma substância cristalina com PF 173-174 oC e [α]d = -42,8o
(DCM, c 0,05), cujos dados de RMN de 1H e
13
C, IV e EM e comparação com
dados da literatura (GRAY et al., 1988) indicam tratar-se do triterpeno, do tipo
tirucalano, denominado diidroniloticina (74).
22
21
20
18
24
12
1
19
17
11
13
9
2
4
OH
26
25
27
16
15
10
HO
O
23
7
5
30
6
28
29
74
O espectro de IV da diidroniloticina (74) apresentou uma banda intensa e
larga em 3468 cm-1 referente à presença de função hidroxila e uma banda fraca
em 1651 cm
–1
indicando presença de uma ligação dupla na molécula, além da
ausência da banda característica para a função carbonila.
O espectro de massas da substância 74 apresentou íon molecular [M]+ m/z
458 (32 %), e as fragmentações com m/z de 441 (20), 425 (16), 407 (4), 387 (26),
371 (100), 353 (54), 327 (15), 273 (4), 147 (18) e 135 (26). As fragmentações
observadas são compatíveis com os dados da literatura (Gray et al., 1988, Tinto et
al 1991).
80
A confirmação do esqueleto tirucalano e a identificação estrutural da
substância 74 foram feitas por análise e comparação dos deslocamentos químicos
de RMN 1H e 13C observados com aqueles publicados na literatura (Tabela 4).
Tabela 4. Deslocamentos químicos observados de RMN 1H e 13C para a substância 74 em CDCl3.
Posição
δC (50 MHz)
δH (200 MHz)
1
37,3
2
27,8
3
4
5
6
79,3
39,0
53,4
24,0
7
8
9
118,2
145,7
49,1
1,73 (m)
1,66 (m)
1,55 (m)
1,64 (m)
3,24 (dd; 4,4; 11,0)
1,56 (m)
1,96 (m)
2,19 (m)
5,26 (dd; 3,0; 6,6)
2,19 (m)
10
11
35,0
18,2
12
13
14
15
16
33,8
43,7
51,3
34,1
28,9
1,51 (m)
1,56 (m)
1,53 (m)
1,45 (m)
2,04 (m)
2,10 (m)
1,38 (m)
0,94 (s)
0,74 (s)
1,76 (m)
1,32 (s)
1,40 (m)
3,57 (dt; 5,3; 8,3; 8,3)
2,66 (d; 8,3)
1,33 (s)
0,97 (s)
0,81 (s)
0,86 (s)
0,98 (s)
Literatura1
(δC)a
37,3
Literatura1 (δH)a
28,8
ND
79,3
39,0
59,7
24,0
35,0
18,2
3,25 (dd; 10,0; 5,0)
ND
ND
2,00(m)
2,30 (m)
5,27 (td; 3,2; 3,0)
ND
2,00 (m)
2,30 (m)
ND
ND
34,1
43,7
51,2
34,1
27,7
ND
ND
ND
ND
ND
118,1
145,6
49,1
ND
50,8
53,3
ND
17
19,9
13,1
0,81 (s)
18
13,2
19,8
0,75
19
33,7
33,7
ND
20
20,1
20,0
ND
21
40,9
40,9
ND
22
69,4
69,4
ND
23
68,7
68,5
2,66 (d; 8,2)
24
60,4
60,2
ND
25
25,0
21,7
1,34 (s)
26
27,8
24,9
1,32 (s)
27
21,9
27,3
0,99 (s)
28
14,9
14,8
0,86 (s)
29
27,3
27,9
0,97 (s)
30
1
GRAY, et al. (1988).
a
Campo magnético de 250 MHz para 1H e 62,5 MHz para 13C. Amostras analisadas em
CDCl3.
81
Nos espectros de RMN
13
C (HBBD e DEPT 135) foram observados dois
carbonos sp2 em δ 118,2 e δ 145,9, típicos de insaturação. No espectro de HMQC,
o carbono em δ 118,2 apresentou correlação com o hidrogênio em δ 5,26. O sinal
em δ 145,9 é um carbono quaternário. Em comparação com os dados da literatura
(GRAY et al. 1988, WANG et al. 2003, KAMPERDICK et al. 2003), sugere-se que
os sinais em δ 118,2 e δ 145,9 sejam atribuídos aos carbonos C-7 e C-8,
respectivamente.
Os sinais em δ 79,3 e δ 69,4 são característicos de carbonos ligados a
oxigênio. De acordo com dados da literatura o sinal em δ 79,3 refere-se ao
carbono C-3 ligado a uma hidroxila e o sinal em δ 69,4 ao carbono ligado a função
hidroxila na posição C-23.
Os sinais em δ 68,7 e δ 60,4, característicos de epóxidos, também foram
observados em 74. Em comparação com dados da literatura e com o triterpeno 73,
sugere-se que esses sinais em δ 68,7 e δ 60,4 são dos carbonos C-24 e C-25,
respectivamente. Esses sinais foram confirmados através de correlações
observadas nos espectros de HOMOCOSY do hidrogênio em C-23, com os
hidrogênios em C-20, C-22 e C-24, e correlações heteronucleares no HMBC entre
os hidrogênios e carbonos em C-24 e C-23.
Alguns deslocamentos químicos de carbono tais como o C-5 (δ 53,4) e C-17
(δ 50,4) apresentam uma significativa diferença com dados apresentados da
literatura. O deslocamento químico de C-5 foi confirmado através das correlações
à longa distância observadas em HMBC do C-5 com Me-28 e Me-19.
82
O carbono C-17 apresenta correlação no HMQC com o hidrogênio em δ
1,38. Este apresenta correlação no HMBC (3JCH) com a metila Me-21. Os
deslocamentos químicos das metilas Me-18 e Me 19 foram reatribuídas com base
nas correlações à longa distância observadas. Os hidrogênios da metila Me-19
apresentam correlação à longa distância com o C-10, C-9, C-1e C-5 e os
hidrogênios da metila Me-18, apresentam correlação no HMBC com os carbonos
C-12 e C-13 (Figura 6).
Tabela 5. Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
diidroniloticina 74.
H-H
δH-δH
C-H
δC-δH (J1)
C-H
H-1 – H-3
H-1 – H-3
H-2 – H-3
H-2 – H-3
H-5 – H-3
H-5 – H-6
H-5 – H-9
H-6 – H-7
H-6 – H-7
H-7 – H-9
H-9 – H-11
H-9 – H-12
H-11 – H-12
H-15 – H-16
H-16 – H-17
H-17 – Me-18
H-20 – H-23
H-22 – H-23
H-23 – H-24
1,66 – 3,24
1,73 – 3,24
1,55 – 3,24
1,64 – 3,24
1,56 – 3,24
1,56 – 2,19
1,56 – 2,19
1,96 – 5,26
1,96 – 5,26
5,26 – 2,19
2,19 – 1,51
2,19 – 1,53
1,51 – 1,53
1,45 – 2,10
2,10 – 1,38
1,38 – 0,94
1,60 – 3,57
1,40 – 1,60
3,57 – 2,66
C-1 – H-1
C-2 – H-2
C-3 – H-3
C-5 – H-5
C-6 – H-6
C-6 - H-6
C-7 – H-7
C-9 – H-9
C-11 – H-11
C-12 – H-12
C-15 – H-15
C-16 – H-16
C-16 – H-16
C-17 – H-17
C-18 – Me-18
C-19 – Me-19
C-20 – H-20
C-21 – Me-21
C-22 – H-22
C-23 – H-23
C-24 – H-24
C-26 – Me-26
C-27 – Me-27
C-28 – Me-28
C-29 – Me-29
C-30 – Me-30
37,3 – 1,73
27,8 – 1,64
79,3 – 3,24
53,4 – 1,56
24,0 – 1,96
24,0 – 2,19
118,11 – 5,26
49,1 – 2,19
18,2 – 1,51
33,8 – 1,53
34,1 – 1,45
28,9 – 2,04
28,9 – 2,10
50,8 – 1,38
19,9 – 0,94
13,2 – 0,74
33,7 – 1,60
20,1 – 1,32
40,9 – 1,40
69,4 – 3,57
68,7 – 2,66
25,0 – 1,33
27,8 – 0,97
21,9 – 0,81
14,9 – 0,86
27,3 – 0,98
C-1 – Me-19
C-3 – Me-29
C-4 – Me-29
C-5 – Me-28
C-5 – Me-19
C-6 – H-7
C-7 – H-15
C-7 – H-6
C-8 – H-9
C-8 – H-30
C-9 – H-7
C-9 – Me-19
C-10 – H-9
C-10 – H-1
C- 10 – H-1
C-10 – Me-19
C-12 – Me-18
C-13 – H-16
C-13 – Me-18
C-14 – Me-30
C-14 – H-7
C-15 – H-16
Me-21 – H-17
C-23 – H-24
C-24 – H-23
δC-δH (à longa
distância)
37,3 – 0,74
79,3 – 0,86
39,0 – 0,86
53,4 – 0,81
53,4 – 0,74
24,0 – 5,26
118,1 – 1,45
118,1 – 2,19
145,7 – 2,19
145,7 – 0,98
49,1 – 5,26
49,1 – 0,74
35,0 – 2,19
35,0 – 1,66
35,0 – 1,73
35,0 – 0,74
33,8 – 0,94
43,7 – 2,10
43,7 – 0,94
51,3 – 0,98
51,3 – 5,26
34,1 – 2,10
20,1 – 1,38
69,4 – 2,66
68,7 – 3,57
83
21
23
18
24
12
19
1
3
HO
9
13
14
O
22
20
17
OH
26
25
27
16
10
4
7
5
30
6
28
29
Figura 6. Principais correlações heteronucleares observadas no HMBC para diidroniloticina.
84
4.1.3. Taraxerona
30
29
19
11
1
2
25
12
26
9
10
8
4
O
27
18
20
21
17
22
13
14
28
16
15
7
6
23
24
75
O triterpeno taraxerona (75), isolado da fração clorofórmica dos galhos de
S. polyphylla, cujos dados de deslocamentos químicos de carbono estão na
Tabela 6 foram atribuídos em comparação com deslocamentos químicos de RMN
de
13
C e 1H anteriormente publicados (SAKURAI et al.,1986; SOUZA et al., 2001).
Os deslocamentos químicos observados também foram confirmados através das
correlações observadas em espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMBC (Tabela 7
e anexo pág. 187-190). O triterpeno 75 apresentou PF 220-221o C. As freqüências
observadas no espectro de IV (anexo pág. 181) em 3048 e 1640 cm
–1
são
referentes à deformação axial C-H e entre carbonos da ligação dupla entre C-15 e
C-16, respectivamente. A freqüência de absorção em 1709 cm-1 corresponde ao
estiramento C=O de carbonila presente nesse triterpeno.
85
O espectro de massas de 75 apresentou [M]+ com m/z 424 (33 %) e as
fragmentações em m/z 409 (22), 300 (99,5), 285 (74), 272 (15), 257 (12), 204
(100), 189 (34) e 133 (65) são condizentes com dados da literatura (SOUZA et al.,
2001).
.
+
.
+
. CH
3
O
O
m/z 409
m/z 424
. C15H24O
.
.
.
+
+
O
m/z 204 (pico base)
m/z 300
Esquema 23. Proposta para as principais fragmentações observadas no espectro de massas da
taraxerona (75).
86
Os deslocamentos químicos de carbono e hidrogênio que estão
apresentados na Tabela 6 foram atribuídos pela comparação com os dados
anteriormente publicados para a taraxenona (SAKURAI et al.,1986; SOUZA et al.,
2001).
Tabela 6. Dados de RMN de 1H (200 MHz) e de
13
C (50 MHz) para a substância 75 em CDCl3 e
dados publicados para a taraxerona na literatura1,2.
δH
Literatura1 (δC)a
1,90 m
38,4
2,58 (ddd; 7,1; 12,0; 15,8)
34,1
2,33 (ddd; 3,4; 6,1; 15,8)
217,7
217,3
3
48,8
47,6
4
55,9
1,31 (m)
55,8
5
20,1
1,60 (m)
20,0
6
35,2
1,40 (m)
35,2
7
37,9
38,9
8
48,9
1,01 (m)
48,7
9
35,8
37,6
10
17,5
1,62 (m)
17,5
11
36,8
1,33 (m)
35,8
12
1,40 (m)
37,7
37,7
13
157,3
157,6
14
117,3
5,56 (dd; 3,0; 8,1)
117,2
15
37,8
1,31 (m)
36,7
16
37,7
37,7
17
48,9
1,41 (m)
48,8
18
40,8
2,08 (dt; 3,0; 3,0; 12,3)
40,7
19
28,9
1,33 (m)
28,8
20
33,7
1,33 (m)
33,6
21
33,2
1,31 (m)
33,1
22
26,2
1,08 (s)
26,2
23
21,6
1,07 (s)
21,6
24
14,9
1,08 (s)
14,8
25
30,0
0,83 (s)
29,9
26
25,7
1,14 (s)
25,6
27
30,1
0,91 (s)
29,9
28
33,5
0,95 (s)
33,4
29
21,5
0,91 (s)
21,4
30
1
SOUZA et al. (2001); 2 SAKURAI et al. (1986)
a
Análise com campo magnético de 50 MHz em CDCl3.
b
Análise com campo magnético de 200 MHz em CDCl3.
c
Análise com campo magnétido de 50 MHz em CDCl3.
ND = valores não determinados na literatura.
Posição
1
2
δC
38,5
34,2
Literatura 1,2 (δH)b,c
ND
2,5 (ddd;7,1; 11,6; 15,8)5
2,3 (ddd; 3,2; 6,3; 15,7)6
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
5,5 (dd; 3,3; 8,1)
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
1,05 (s)
1,04 (s)
1,05 (s)
0,80 (s)
1,11 (s)
0,88 (s)
0,93 (s)
0,88 (s)
87
No espectro de RMN 13C (HBBD e DEPT) podemos observar a presença de
8 metilas na molécula. Também foi observada a presença dos carbonos sp2 com
sinais em δ 217, δ 157,6 e δ 117,3. O sinal em δ 217,7 refere-se à carbonila de
cetona em C-3. O sinal em δ 157,6, característico de um carbono quaternário, foi
atribuído ao carbono C-14. O sinal em δ 117,3, característico de um carbono
insaturado apresenta correlação direta com o hidrogênio em δ 5,56. De acordo
com a literatura (SAKURAI et al.,1986; SOUZA et al., 2001), o deslocamento
químico do carbono em δ 117,3 é atribuído ao carbono em C-15.
Os demais deslocamentos químicos observados foram atribuídos com base
nos dados disponíveis anteriormente publicados (SAKURAi et al.,1986; SOUZA et
al., 2001) e confirmados através dos espectros bidimensionais de HOMOCOSY,
HMQC e HMBC descritos na Tabela 7. A Figura 7 apresenta as principais
correlações heteronucleares C-H, à longa distância, observadas para 75.
29
21
19
22
12
1
25
13
17
9
28
2
O
5
6
7
15
23
Figura 7. Principais correlações heteronucleares C-H observadas no HMBC para taraxerona.
88
Tabela 7. Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
taraxerona (75).
H-H
H-1 – H-5
H-1 – H-2
H-1 – H-2
H-2 – H-5
H-2 – H-5
H-5 – H-6
H-5 – H-7
H-7 – H-9
H-9 – H-12
H-11 – H-12
H-15 – H-19
H-16 – H-19
H-21 – H-22
δH-δH
1,90 – 1,31
1,90 – 2,33
1,90 – 2,58
2,33 – 1,31
2,58 – 1,31
1,31 – 1,60
1,31 – 1,40
1,40 – 1,01
1,01 – 1,40
1,62 – 1,40
5,56 – 2,08
1,31 – 2,08
1,33 – 1,31
C-H
C-1 – H-1
C-2 – H-2
C-5 – H-5
C-6 – H-6
C-7 – H-7
C-9- H-9
C-11 – H-11
C-12 – H-12
C-15 – H-15
C-16 – H-16
C-18 – H-18
C-19- H-19
C-21 – H-21
C-22 – H-22
C-23 – H-23
C-24 – H-24
C-25 – H-25
C-26 – H-26
C-27 – H-27
C-28 – H-28
C-29 – H-29
C-30 – H-30
δC-δH (1J)
38,5 – 1,90
34,2 – 2,58
55,9 – 1,31
20,1 – 1,60
35,2 – 1,40
48,8 – 1,01
17,5 – 1,62
36,8 – 1,33
117,3 – 5,56
37,8 – 1,31
48,9 – 1,41
40,8 – 2,08
33,7 – 1,33
33,2 – 1,31
26,2 – 1,08
21,6 – 1,08
14,9 – 1,08
30,0 – 0,83
25,7 – 1,14
30,1 – 0,91
33,5 – 0,95
21,5 – 0,91
H-C
H-1 – C-2
H-7 – C-6
H-9 – C-5
H-11 – C-9
H-12 – C-13
H-15 – C-16
H-16 – C-17
H-19 – C-17
H-22 – C-16
H-23 – C-5
H-24 – C-23
H-25 – C-5
H-26- C-9
H-28 – C-21
H-29 – C-21
δH-δC (2,3J)
1,90 – 34,2
1,40 – 20,1
1,01 – 55,9
1,62 – 48,9
1,33 – 37,7
5,56 – 37,8
1,31 – 37,7
1,40 – 37,7
1,31 – 36,8
1,08 – 55,9
1,07 – 26,2
1,08 – 55,9
0,83 – 48,9
0,91 – 33,7
0,95 – 33,7
89
4.1.4. 9-metoxi-cantin-6-ona
1
11
14
12
10
13
MeO
9
15
N
N
8
O
2
6
16
4
5
35
O alcalóide 9-metoxi-cantinona (35) foi isolado na forma de cristais
amarelos com PF 175-176 oC (Esquema 11, pág. 50). O espectro de massas (pág.
193) apresentou-se compatível com o descrito na literatura (GIESBRECHT, et al.
1980) com íon molecular [M]+ 250 m/z (100 %) e fragmentações com m/z 235 (1),
221 (21), 207 (32), 192 (4), 179 (17), 153 (9), 126 (6) e 125 (8). O pico base, com
m/z 250, é atribuído à alta densidade eletrônica da molécula que estabiliza o íon
molecular.
90
.+
- CO
MeO
N
N
MeO
N
N
O
. Me
m/z 250 (pico base)
+.
O
MeO
N
N
O
N
m/z 207
H
CHO
.+
MeO
N
N
m/z 221
Esquema 24. Proposta para as principais fragmentações de 9-metoxi-cantin-6-ona.
N
91
O espectro de UV apresentou absorções com λmax (MeOH) nm (log ε) em
208 (2,36), 265 (0,77), 273 (1,02), 309 (0,35) e 355 (0,50) de acordo com a
literatura (GIESBRECHT, et al. 1980).
O espectro de RMN de 1H (pág. 192) sugere que a metoxila ligada à
molécula esteja na posição 9, através das constantes de acoplamento entre os
hidrogênios H-8 e H-10 de 2,4 Hz, indicando que os hidrogênios têm relação meta.
Os hidrogênios H-10 e H-11 mostram constantes de acoplamento de 8,5 Hz,
indicando uma relação orto. Além disso, no espectro de RMN
13
C pode-se
observar que o carbono em C-8 tem deslocamento químico em δ 101,5 que é
influenciado pelos efeitos dos substituintes em C-9 (ligado à metoxila) e em C-13
(ligado ao nitrogênio da posição 7) corroborando para a posição da metoxila em C9 (SILVERSTEIN, 2000). Os deslocamentos químicos de RMN de 1H e C13 são
descritos na Tabela 8.
Tabela 8. Deslocamentos químicos de RMN 1H e 13C observados para a 9-metoxi-cantin-6-ona
(35).
Posição
δH (200 MHz)
δC (50 MHz)
δH (100 MHz)/ (literatura1)
1
7,83 (d; 5,2)
115,7
7,76 (d; 5,0)
2
8,75 (d; 5,2)
146,1
8,72 (d; 5,0)
4
8,00 (d; 10,0)
140,0
7,96 (d; 10,0)
5
6,94 (d; 10,0)
128,7
6,90 (d; 10,0)
6
159,9
8
8,18 (d; 2,4)
101,5
8,13 (d; 2,0)
9
162,7
10
7,06 (dd; 2,4; 8,5)
114,3
7,01 (dd; 7,0; 2,0)
11
7,93 (d; 8,5)
123,5
7,85 (d; 7,0)
12
117,3
13
141,4
14
130,7
15
132,5
16
135,8
OMe
3,98 (s)
56,1
*Espectro analisado em solução de CDCl3 e constantes de acoplamento J em Hz.
1
GIESBRECHT et al., 1980
92
A completa atribuição dos deslocamentos químicos dos hidrogênios e
carbonos de 35 foi feita através da análise dos espectros de HOMOCOSY, HMQC
e HMBC (Tabela 9) e comparação com dados da literatura. O deslocamento
químico em δ 8,75 (J = 5,2 Hz) foi atribuído ao hidrogênio na posição C-2, vizinho
ao nitrogênio pirimidínico na posição 3 e por isso, mais desprotegido (PRETSCH,
et al. 2000; SILVERSTEIN, 2000; FRIEBOLIN, 1998). Este correlaciona no HMQC
com o carbono em δ 146,1 e no HMBC com o carbono em δ 115,7 que foi
atribuído ao carbono em C-1. No HMQC, este carbono correlaciona com o
hidrogênio em δ 7,83 (J=5,2 Hz) que acopla em orto com H-2. O dubleto em δ 6,94
foi atribuído ao hidrogênio na posição C-5 que correlaciona no HOMOCOSY com
o dubleto em δ 8,00. A constante de acoplamento de 10 Hz entre esses
hidrogênios confirma que os hidrogênios estão na posição cis entre si. No HMQC,
os sinais de hidrogênio em δ 6,94 e 8,00 correlacionam com os sinais de carbono
em δ 128,7 e 140,0, respectivamente. No HMBC o sinal em δ 8,00 correlaciona
com o sinal de carbonila em δ 159,9, característico de carbonila α,β-insaturada.
Além dessas, as correlações à longa distância entre C-9 e os hidrogênios da
metoxila e o hidrogênio H-10 com os carbonos C-12 e C-8, confirmam a estrutura
como 9-metoxi-cantin-6-ona. A Figura 8 apresenta as principais correlações
observadas no espectro de HMBC.
93
Tabela 9. Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMQC para a
substância 35.
H-H
H1-H2
H4-H5
H8-H-10
H10-H11
δH-δH
7,83-8,75
8,00-6,94
8,18-7,06
7,06-7,93
δH-δC (1J)
7,83-115,7
8,75-146,1
8,00-140,0
6,94-128,7
8,18-101,5
7,06-114,3
7,93-123,5
3,98-56,1
H-C
H1-C1
H2-C2
H4-C4
H5-C5
H8-C8
H10-C10
H11-C11
H(MeO)-MeO
11
13
MeO
15
N
N
9
8
δC-δH (2,3J)
115,7-8,75
146,1-7,83
159,9-8,00
101,5-7,06
162,7-8,18
162,7-3,98
162,7-7,93
117,3-7,06
117,3-7,83
141,4-8,18
141,4-7,93
132,5-8,00
132,5-7,83
135,8-8,75
1
12
10
C-H
C1-H2
C2-H1
C6-H4
C8-H10
C9-H8
C9-H(MeO)
C9-H11
C12-H10
C12-H1
C13-H8
C13-H11
C15-H4
C15-H1
C16-H2
4
O
6
Figura 8. Principais correlações C-H à longa distância, observadas para 35.
94
4.1.5. Ácido 7-metoxi- (9H-β-carbolin-1-il)-(Z)- prop-2-enóico.
5
4
4b
4a
6
N
9
7
MeO
3
8a
8
N
H
9a
2
1
3'
2'
OH
1'
O
76
O fracionamento cromatográfico da fração SPGC10.128 por CLAE
preparativa (Esquema 12) resultou no isolamento de 3,0 mg de um sólido amareloavermelhado (SPGC2.147) com tempo de retenção em 21,06 minutos.
SPGC2.147 apresenta fluorescência amarelo-esverdeada quando dissolvida em
solvente orgânico. A análise em CCD da substância apresentou teste positivo para
alcalóides, quando revelado com reagente de Dragendorff.
O espectro de IV (anexo pág. 202) dessa substância apresentou uma
banda larga de absorção em 3460 cm-1 indicando presença de grupamento OH,
freqüência de estiramento C-H de carbono sp2 em 3063 cm-1, em 2925 e 2855 cm1
de estiramento C-H de alifáticos, deformação axial de carbonila α,β-insaturado
em 1673 cm-1, freqüência em 1634 e 1661 cm-1 de estiramento de ligação dupla
entre carbonos. No UV (MeOH) com λmax (log ε), apresentou absorções em 204
(0,91), 210 (1,23), 220 (0,62), 309 (0,20) e 351 (0,28).
95
Os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN de 1H e 13C
são descritos na tabela 10. As atribuições dos carbonos e hidrogênios da molécula
foram realizadas nas correlações observadas nos espectros bidimensionais
HOMOCOSY, HMQC e HMBC e com base em dados da literatura (FACUNDO, et
al. 2002, GIESBRECHT et al., 1980).
Tabela 10. Deslocamentos químicos de RMN1H (500 MHz) e RMN13C (125 MHz) observados para
(76) e correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY e HMBC (em CDCl3).
Posição
1
3
4
5
6
7
8
4a
4b
8a
9a
1’
2’
3’
OMe
OH
δC
133,3
142,7
115,9
124,4
115,2
164,0
101,4
132,0
116,2
142,0
132,2
158,8
130,8
136,0
56,2
-
δ H (m, J (Hz))
8,80 (sl)
7,91 (sl)
7,99 (d, 8,0)
7,10 (d, 8,0)
8,22 (s)
6,99 (d, 9,0)
8,09 (d, 9,0)
3,91 (s)
12,2 (s)
HOMOCOSY (H-H)
7,91
8,80
7,10
7,99
8,09
6,99
-
HMBC (J2,3)
164,0; 142,0
142,0; 115,2
136,0
-
Os deslocamentos químicos observados são bastante similares aos
observados para a 9-metoxi-cantin-6-ona. Entretanto, no espectro de IV, foi
observada uma banda em 3460 cm-1 indicando a presença de grupamento
hidroxila.
O hidrogênio em δ 7,10 (J = 8,0 Hz) acopla com o hidrogênio em δ 7,99 (J =
8,0 Hz), acoplamento orto, característico do anel A de cantinonas.
96
Com base em dados da literatura (GIESBRECHT et al., 1980; ARISAWA et
al., 1983; MITSUNAGA et al., 1994) de alcalóides do tipo cantinona, os sinais em δ
8,80 e δ 7,91 foram atribuídos aos hidrogênios nos carbonos C-3 e C-4,
respectivamente.
Além das constantes de acoplamento observadas, as correlações
heteronucleares C-H à longa distância do hidrogênio em δ 7,99 com o sinal de
carbono em δ 164,0 confirma a posição da metoxila na posição 7. Esse hidrogênio
está em posição orto em relação ao hidrogênio em δ 7,10. O singleto largo em δ
8,22 é atribuído ao hidrogênio na posição C-8.
Os dubletos em δ 6,99 e em δ 8,09, com constante de acoplamento de 9,0
Hz, indicam a presença de uma ligação dupla com configuração cis, nas posições
C-2’ e C-3’ (C-5 e C-4 para cantinonas), respectivamente (GIESBRECHT et al.,
1980 KARDONO et al., 1991).
O sinal observado em δ 12,2 é característico de hidrogênio de um grupo
carboxílico e assim, sugere-se que SPGC2.147 seja o novo alcalóide, ácido 7metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76)1. Essa proposta é corroborada
pela presença de uma banda em 3460 cm-1, no espectro de IV, devido à presença
de grupamento hidroxila.
O espectro de RMN
13
C revelou a presença de 15 carbonos dos quais foi
observado a presença de uma metoxila em δ 56,2 e 7 carbonos metínicos na
região acima de δ 100 característico de carbonos aromáticos que foram
confirmados pelo espectro de DEPT 135.
1
Nomenclatura seguindo guia IUPAC por PANICO, et al. (2002)
97
Os deslocamentos químicos de SPGC2.147 foram comparados com o
alcalóide similar, o ácido 3-(9H-b-carolin-1-il)-(Z)-2-propenóico, isolado de
Zanthoxylum rugosum (FACUNDO, et al. 2002).
O espectro de massas de 76, não apresentou íon molecular, indicando
perda de H2O e fragmentações de m/z 250 (100), 221 (10), 207 (9), 178 (6). O
pico base de m/z 250 observado deve-se à perda da molécula de água (M+-18)
que provavelmente gera o íon correspondente à 9-metoxi-cantin-6-ona, mostrado
no esquema a seguir.
.
+
MeO
N
H
HOOC
.
H2O
+
N
MeO
N
N
O
m/z 250
Esquema 25. Proposta de fragmentação de 76 para formação do pico base de m/z 250.
98
4.2. Isolamento e identificação das substâncias isoladas dos galhos de
Simaba guianensis subsp. ecaudata Cronquist.
4.2.1. Óxido de cariofileno
A separação cromatográfica da fração 1-12 do extrato hexânico dos galhos
de Simaba guianensis subsp. Ecaudata (Esquema 17), resultou no isolamento de
103,0 mg de uma substância incolor identificada como óxido de cariofileno (77).
12
O
4
6
7
3
5
2
9
1
13
11
15
10
14
77
O espectro de EM (anexo pág. 214) da substância 77 apresentou o íon
molecular com m/z de 220 (M+), e as seguintes fragmentações: 205 (4), 177 (10),
149 (14), 121 (33), 93 (79), 79 (95), 69 (61) e 41 (100), compatíveis com dados da
literatura (KREBS, RAKOTOARIMANGA e HABERMEHL, 1990).
99
.
+
.
O
O
O
+
m/z 41 (pico base)
m/z 220
Me
.
O
+
O
m/z 69
m/z 69
m/z 205
.
.
+
O
O
.+
O
+
m/z 177
m/z 220
Esquema 26. Proposta para as principais fragmentações do óxido de cariofileno no EM.
100
O espectro de IV (anexo pág. 213) mostrou as seguintes absorções: em
3066 cm-1, indicando estiramento C-H de carbonos insaturados, 2950, 2932 e
2861 cm-1 (estiramento C-H de carbonos saturados), 1629 cm-1 referentes ao
estiramento C=C.
As análises dos espectros de RMN 1H e 13C e bidimensionais
HOMOCOSY, HMQC e HMBC permitiram confirmar a substância SNGH2.33 como
sendo o óxido de cariofileno. Os deslocamentos químicos da substância são
apresentados na Tabela 11 (KREBS, RAKOTOARIMANGA e HABERMEHL,
1990).
Tabela 11. Deslocamentos químicos por RMN 1H (300 MHz) e RMN13 (75 MHz) em CDCl3 do óxido
de cariofileno (77).
C
m
δC
δH (m; J(Hz))
δ C1
50,9
CH
1,75 (t; 9,6; 9,4)
50,9
1
30,3
CH2
1,29 (sl)
30,3
2
39,3
CH2
2,10 (m); 1,08 (d; 5,7)
39,3
3
59,6
C
59,6
4
63,9
CH
2,86 (dd; 3,9; 10,5)
63,7
5
29,9
CH2
2,10(m); 2,29 (m)
29,9
6
30,0
CH2
2,10 (m); 2,30 (m)
30,0
7
151,9
C
151,9
8
48,8
CH
2,60 (m)
48,8
9
39,9
CH2
1,60 (d; 2,2)
39,9
10
34,0
C
34,0
11
17,1
CH3
1,18 (s)
17,0
12
27,3
CH3
0,99 (s)
27,3
13
21,8
CH3
0,97 (s)
21,9
14
112,9
CH
4,85(d; 1,32); 4,96 (d; 1,32)
112,9
15
1
KREBS, RALOTOARIMANGA e HABERMEHL (1990) – 75 MHz e em CDCl3.
101
Tabela 12. Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMBC para a
substância (77).
H-H
δH-δH
C-H
δC-δH (J1)
C-H
H1 - H2
H2 - H3
H3 - H3
H3 - H2
H3 - H1
H5 – H6
H5 - H7
H9 – H10
H12 – H3
H15 – H9
1,75 – 1,29
1,29 – 2,10
1,08 – 2,10
1,08 – 1,29
2,10 – 1,75
2,86 – 2,29
2,86 – 2,30
2,60 – 1,60
0,99 – 2,10
4,96 – 2,60
C1 - H1
C2 - H2
C3 - H3
C3 - H3
C5 - H5
C6 - H6
C6 - H6
C7 - H7
C7 - H7
C9 - H9
C10 - H10
C12 - H12
C13 - H13
C14 - H14
C15 - H15
C15-H15
50,9 – 1,75
30,3 – 1,29
39,3 – 2,10
39,3 – 1,08
63,9 – 2,86
29,9 – 2,10
29,9 – 2,29
30,06 – 2,108
30,06 – 2,30
48,8 – 2,60
39,9 – 1,60
17,15-1,18
27,36 – 0,99
21,8 – 0,97
112,9 – 4,85
112,9 – 4,96
C1 - H2
C1 - H3
C2 - H1
C5 - H6
C5 - H6
C5 - H12
C6 - H5
C6 - H7
C7 - H6
C7 - H6
C7 - H9
C9 - H10
C9 - H15
C11 - H1
C11 - H10
C11 - H13
C11 - H14
C12 - H3
C13 - H14
C14 - H13
C15 - H7
Foi observada, no espectro de RMN
13
δC-δH (à longa
distância)
50,9 – 1,29
50,9 – 1,08
30,3 - 1,75
63,9 - 2,101
63,9 - 2,29
63,9 - 1,18
29,9 - 2,86
29,9 - 2,108
30,0 - 2,29
30,0 – 2,101
30,0 – 2,60
48,8 – 1,60
48,8 – 4,91
34,0 – 1,75
34,0 – 1,60
34,0 – 0,99
34,0 – 0,97
17,15 – 1,08
27,3-0,97
21,8 – 0,99
112,9-2,109
C, a presença de dois carbonos sp2
através dos deslocamentos químicos em δ112,9 e δ151,9. Os deslocamentos
químicos dos hidrogênios em δ 4,85 e 4,96 são característicos de ligação dupla
terminal. O espectro HMQC mostra que estes hidrogênios estão ligados ao
carbono em δ 112,9.
Os sinais observados em δ 59,6 e δ 63,9 são característicos de carbonos
ligados a um oxigênio. O espectro de IV não indica a presença de hidroxila na
molécula. Estes carbonos pertencem a uma função epóxido.
102
4.2.2. Piscidinol A
O fracionamento cromatográfico do extrato hexânico dos galhos de S.
guianensis subsp. ecaudata resultou em 69 frações. A fração 64-69 foi submetida
a uma coluna cromatográfica utilizando como eluente o sistema gradiente da
mistura Hex/AcOEt. Esse procedimento resultou no isolamento de 164,7 mg de
uma substância com PF = 198-200 oC e [α]d = -62,1o (DCM; c 0,024), identificada
como Piscidinol A (78). Essa mesma substância foi isolada da fração 7 (Esquema
18), por MPLC em fase reversa C-18.
21
22
OH
25
23
18
24
OH
12
11
19
1
2
3
10
8
27
16
14
15
7 30
4
O
OH
17
9
26
5
6
28
29
78
O triterpeno piscidinol A (78) mostrou no espectro de IV absorções
principais em 3570 e 3374 cm-1 de estiramento O-H, 2881 a 2982 cm-1 de
estiramento C-H de alifáticos e 1697 cm-1 intenso, sugerindo estiramento de
carbonila de cetona.
O espectro de massas de 78 (pág. 225) apresentou íon m/z 476 [M+2]+ e
fragmentações com m/z 457 (21), 441 (19), 398 (11), 384 (22), 369 (100), 365
(13), 351 (18), 325 (33), 205 (20) e 59 (35). As fragmentações observadas
103
apresentam compatibilidade com os dados da literatura (GRAY et al 1988 e TINTO
et al 1991).
a
.+
OH
.+
b
H
OH
OH
O
a
O
O
m/z 474
m/z 384
O
. Me
b
O
.+
H
H
OH
O
O
O
H2O
m/z 369 (pico base)
.+
O
O
m/z 398
Esquema 27. Proposta para as principais fragmentações de Piscidinol A no espectro de massas.
A estrutura do triterpeno 78 foi confirmada através da análise dos espectros
de RMN 1H,
13
C e bidimensionais HOMOCOSY, HMQC, HMBC e NOESY, e
104
comparação com dados da literatura (GRAY et al., 1988; TINTO et al., 1991). Os
deslocamentos químicos de RMN 1H e 13C são apresentados Tabela 13 (espectros
– anexos pág. 226-236).
Tabela 13. Deslocamentos químicos de RMN 1H (300 MHz) e
13
C (75 MHz) em CDCl3 observados
para SNGH1.159 e comparação com Piscidinol A.
1
δC
38,5
2
34,9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
217,0
47,8
52,3
24,3
117,9
145,7
48,4
35,0
18,3
33,8
13
14
15
43,5
51,2
34,0
16
28,4
17
18
19
20
21
22
53,8
22,0
12,8
33,7
18,9
40,5
23
24
25
26
27
28
29
30
OH
69,7
75,0
74,3
27,4
26,2
24,5
21,6
27,4
-
δH (m, J em Hz)
1,40 (m)
1,96 (m)
2,20 (t; 3,3; 3,9)
2,71 (dd; 5,4; 14,4)
1,73 (m)
2,06(m)
5,29 (dd; 3,3; 10,5)
2,25 (m)
1,51 (m)/
1,62 (m)
1,82 (m)
1,45 (m)
1,47 (m)
2,00 (m)
1,48
0,81 (s)
1,00 (s)
1,34 (m)
0,91 (d; 6,0)
1,18 (m)
1,84 (m)
4,09 (m)
3,15 (d; 8,1)
1,30 (s)
1,28 (s)
1,03 (s)
1,10 (s)
0,99 (s)
2,82 (sl)
2,78 (sl)
Tinto et al, 19911, Gray et al, 19882
a
Em CDCl3 – 100 MHz
b
Em CDCl3 – 400 MHz
c
Em CDCl3
δC 1,a
38,47
34,88
217,09
47,83
52,24
24,29
117,86
145,70
48,38
34,95
18,09
33,70
43,46
51,13
33,93
28,40
53,73
21,99
12,75
33,59
18,84
40,33
69,66
74,87
74,30
27,35
26,23
24,88
21,55
27,35
-
δH 1,b
1,47
1,91
2,25
2,76
1,72
2,09
5,31
2,27
1,57
1,63
1,82
1,46
1,50
1,31
2,00
1,49
0,82
1,01
1,39
0,92
1,19
1,88
4,12
3,16
1,32
1,30
1,05
1,11
1,02
δH2,c
1,97 (ddd; 13; 5,7; 3,2)
2,23 (dt; 14,6; 3,2)
2,74 (td; 14,6; 5,7)
ND
2,23/2,10
5,30 (td; 3,3; 3,0)
2,10 (m)
ND
ND
ND
ND
ND
0,99 (s)
0,81(s)
ND
0,91 (d; 6,3)
1,25 (m)
4,10 (td; 8,7; 4,1)
3,15 (d; 8,7)
1,31 (s)
1,29 (s)
1,10 (s)
1,00 (s)
1,10 (s)
2,62 (d; 8,7)
2,58 (d; 4,1)
2,57 (s)
105
Os deslocamentos químicos observados nos espectros de 78 apresentam
semelhança com triterpenos do tipo tirucalano. Inicialmente, foram realizadas
atribuições com base em dados de triterpenos tirucalano encontrados na literatura
(GRAY et al., 1988; TINTO et al., 1991).
O espectro de RMN
13
C de 78 indica a presença de uma insaturação entre
os carbonos C-7 (δ 117,9) e C-8 (δ 145,7) e uma carbonila em C-3 (δ 217,0),
típicos de esqueleto tirucalano. O sinal em δ 117,9 apresenta correlação no
espectro de HMQC com o hidrogênio em δ 5,29. As atribuições dos sinais de
carbono e hidrogênios vizinhos a esses foram realizadas com auxílio dos
espectros bidimensionais HOMOCOSY e HMBC (Tabela 14).
Os sinais em δ 69,7, δ 74,3 e δ 75,0 são característicos de carbono
carbinólico (ligado à hidroxila). Os sinais δ 69, 7 e δ 75,0 correlacionam com os
sinais de hidrogênio em δ 4,09 e δ 3,15, respectivamente. O sinal δ 74,3 é
correspondente a carbono quaternário. A correlação à longa distância deste
carbono com o hidrogênio em δ 3,15, sugere que as hidroxilas estejam ligadas aos
carbonos C-24 (δ 75,0) e C-25 (δ 74,3). A correlação homonuclear entre δ 4,09 e
δ 3,15 indica que o primeiro refere-se ao hidrogênio na posição C-23.
106
Tabela 14. Correlações observadas nos espectros de HOMOCOSY, HMQC e HMBC para
Piscidinol A.
H-H
δH-δH
C-H
δC-δH (J1)
C-H
H-1 – H-1
H-1 – H-2a
H-1 – H-19
H-1 – H-2e
H-1 – H-2a
H-2e – H2a
H-5 – H-6
H-5 – H-11
H-6 – H-7
H-6 – H-9
H-9 – H-11
H-9 – H-12
H-11 – H-12
H-12 – H-12
H-15 – H-16
H-16 – H-17
H-16 – H-20
H-17 – H-21
H-19 – H-11
H-20 – H-21
H-20 – H-22
H-22 – H-22
H-22 – H-23
H-22 – H-23
H-23 - OH
H-24 - OH
1,40 – 1,96
1,40 – 2,71
1,40 – 1,00
1,96 – 2,20
1,96 – 2,71
2,20 – 2,71
1,73 – 2,06
1,73 – 1,51
2,06 – 5,29
2,06 – 2,25
2,25 – 1,51
2,25 – 1,82
1,51 – 1,82
1,82 – 1,62
1,45 – 2,00
2,00 – 1,48
2,00 – 1,34
1,48 – 0,91
1,00 – 1,51
1,34 – 0,91
1,34 – 1,84
1,18 – 1,84
1,18 – 4,09
1,84 – 4,09
4,09 – 2,78
3,15 – 2,78
C-1 – H-1
C-1 – H-1
C-2 – H-2a
C-2 –H-2e
C-5 – H-5
C-6 – H-6
C-7 – H-7
C-9 – H-9
C-11 – H-11
C-12 – H-12
C-12 – H12
C-15 – H-15
C-16 – H-16
C-16 – H-16
C-17 – H-17
C-18 – H-18
C-19 – H-19
C-20 – H-20
C-21 – H-21
C-22 – H-22
C-22 – H-22
C-23 – H-23
C-24 – H-24
C-26 – H-26
C-27 – H-27
C-28 – H-28
C-29 – H-29
C-30 – H-30
38,5 – 1,40
38,5 – 1,96
34,9 – 2,71
34,9 – 2,20
52,3 – 1,73
24,3 – 2,06
117,9 – 5,29
48,4 – 2,25
18,3 – 1,51
33,8 – 1,62
33,8 – 1,82
34,0 – 1,45
28,4 – 1,47
28,4 – 2,00
53,8 – 1,48
22,0 – 0,80
12,8 – 1,00
33,7 – 1,34
18,9 – 0,91
40,5 – 1,18
40,5 – 1,84
69,7 – 4,09
75,0 – 3,15
27,43 – 1,30
26,2 – 1,28
24,5 – 1,03
21,6 – 1,10
27,4 – 0,99
C-1 - H-19
C-2 – H-19
C-3 – H-28
C-3 – H-2e
C-3 – H-2a
C-4 – H-5
C-4 – H-28
C-4 – H-29
C-5 – H-6
C-5 – H-7
C-5 – H-28
C-5 – H-29
C-6 – H-5
C-6 – H-7
C-6 – H-29
C-7 – H-6
C-7 – H-9
C-8 – H-6
C-8 – H-9
C-9 – H-7
C-10 – H-1
C-10 – H-5
C-11 – H-12
C-11 – H-12
C-12 – H-11
C-12 – H-18
C-13 – H-16
C-13 – H-18
C-14 – H-30
C-20 – H-21
C-22 – H-21
C-22 – H-23
C-22 – H-24
C-23 – H-22
C-23 – H-24
C-24 – H-23
C-25 – H-26
C-27 – H-26
C-29 – H-5
C-29 – H-28
C-30 – H-15
δC-δH (à longa
distância)
38,5 – 1,00
34,9 – 1,00
217,0 – 1,03
217,0 –2,21
217,0 – 2,71
47,8 – 1,73
47,8 – 1,03
47,8 – 1,10
52,3 – 2,06
52,3 – 5,29
52,3 – 1,03
52,3 – 1,10
24,3 – 1,73
24,3 – 5,29
24,3 – 1,10
117,9 – 2,06
117,9 – 2,25
145,7 – 2,06
145,7 – 2,25
48,7 – 5,29
35,0 – 1,96
35,0 – 1,73
18,3 – 1,62
18,3 – 1,82
33,8 – 1,51
33,8 – 0,80
43,1 – 2,00
43,1 – 0,80
51,2 – 0,99
33,7 – 0,91
40,5 –0,91
40,5 – 4,09
40,5 – 3,15
69,7 – 1,84
69,7 – 3,15
75,0 – 4,09
74,3 – 1,30
26,2 – 1,30
21,6 – 1,73
21,6 – 1,03
27,4 – 1,45
107
OH
OH
OH
O
Figura 9. Principais correlações C-H observadas no HMBC para piscidinol A
A análise do espectro de NOESY (Tabela 15) permitiu confirmar a posição
das hidroxilas na cadeia lateral através das correlações dos sinais de hidrogênio
em δ 1,34 e δ 3,15, nas posições C-20 e C-24, respectivamente. O hidrogênio em
δ 1,34 também está correlacionado com o hidrogênio em δ 4,09, na posição C-23.
As principais correlações observadas no espectro de NOESY são apresentadas
na figura 10.
OH
OH
H
OH
a
O
Figura 10. Principais correlações observadas no espectro de NOESY para piscidinol A
108
Tabela 15. Correlações observadas no espectro bidimensional de NOESY de Piscidinol A.
H-H
H-2 – H19
H-5 – H- 9
H-6 – H-7
H-7 – H-15
H-15 – H-16
H-18 – H-9
H-18 – H-17
H-19 – H-12
H-20 – H-16
H-20 – H-24
H-21 – H-12
H-21 – H-15
H-21 – H-22
H-21 – H-23
H-22 – H-22
H-23 – H-26
H-23 – H-20
H-26 – H-16
H-28 – H-6
H-29 – H-6
H-30 – H-6
δH - δH
2,71 – 1,00
1,73 – 2,25
2,06 – 5,29
5,29 – 1,45
1,45 – 2,00
0,80 –2,25
0,80 – 1,48
1,00 –1,82
1,34 – 2,00
1,34 – 3,15
0,91 – 1,62
0,91 – 1,45
0,91 – 1,18
0,91 – 4,09
1,18 – 1,84
4,09 – 1,30
4,09 – 1,34
1,30 – 2,00
1,03 – 2,06
1,10 – 2,06
0,99 – 2,06
109
4.2.3. Alcalóides do tipo cantinona de S. guianensis subesp. ecaudata.
4.2.3.1. 9-metoxicantin-6-ona.
A separação por cromatográfica da fração 7 (Esquema 18), resultou no
isolamento de um alcalóide (SNGC1.146) identificado como 9-metoxicantin-6-ona
(35), anteriormente isolado dos galhos de S. polyphylla (pág 88). Os espectros
obtidos apresentam-se em anexo. Os dados dos deslocamentos químicos
observados por RMN, de espectros de massa e freqüências no IV são todos
característicos da 9-metoxicantin-6-ona.
4.2.3.2. 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)- prop-2-enóico
5
MeO
6
4
4b
4a
3
N
9
7
8a
8
N
H
9a
2
1
COOH
3'
2'
1'
79
Junto com a 9-metoxicantin-6-ona foi isolado um outro sólido amarelo mais
escuro, solúvel em MeOH, que se decompõe a 232 oC, e que através de análise
em CCD deu teste positivo para alcalóides, com o reagente de Dragendorff.
O espectro de IV apresenta uma banda intensa em 3447 cm-1,
característico de presença de grupamento hidroxila, freqüências de estiramento C-
110
H de carbono insaturado em 3096 e 3021 cm-1, freqüências de estiramento de
carbonila α,β-insaturada em 1660 cm-1, estiramento C=C em 1619 cm-1 e uma
freqüência intensa de deformação angular característica de substâncias
aromáticas em 837 cm-1. O espectro de UV (MeOH) apresentou λmax (log ε) em
206(3,00), 216 (1,81), 309 (0,40) e 355 (0,56).
No espectro de RMN1H é observado um sinal em δ 3,90 que correlaciona
no HMQC com o sinal em δ 56,5, sendo característico de uma metoxila. O
hidrogênio em δ 7,74 correlaciona com o carbono em δ 102,1, no HMQC e acopla
em relação meta com o hidrogênio em δ 6,96. Esse acopla em relação orto com o
hidrogênio em δ 7,89 e correlaciona no HMBC com o sinal em δ 164,3 no HMBC.
Esse carbono corresponde ao carbono ligado à metoxila pois também correlaciona
à longa distância com o hidrogênio em δ 3,90. Esses deslocamentos químicos
mostram-se característicos de alcalóides tipo cantinona onde a metoxila está
ligada ao anel A do alcalóide (ARISAWA, et al. 1983). Apesar de não ser
observado sinal de hidrogênio acima de δ 12,0, o espectro de IV mostra a
presença de função hidroxila na molécula através da banda em 3447 cm-1.
Assim, sugere-se que SNGC2.146 seja um alcalóide β-carbolínico com
carbonila α,β-insaturada de ácido.
111
O sinal de hidrogênio em δ 6,88 correlaciona com o hidrogênio em δ 7,93 no
espectro de HOMOCOSY e apresenta constante de acoplamento em 9,5 Hz,
sugerindo que este esteja em posição cis em relação ao hidrogênio em δ 7,93.
Esse mesmo hidrogênio em δ 6,88 apresenta correlação no HMBC com o carbono
em δ 160,3 que corresponde à carbonila da molécula. Os deslocamentos químicos
de hidrogênio e carbono são descritos na Tabela 16, juntamente com as
correlações correspondentes observadas à longa distância no espectro de HMBC
e dados da literatura para 10-metoxi-cantin-6-ona que apresenta deslocamentos
químicos parecidos com SNGC2.146 (ARISAWA, et al. 1983).
Tabela 16. Deslocamentos químicos de RMN 1H (500 MHz), RMN
13
C (125 MHz) e correlações à
longa distância observadas no espectro de HMBC para a substância (79) (em MeOD).
Posição
δC
δ H (m, J (Hz))
HMBC (J2,3)
δ H de 481
4
117,4
7,94 (d, 5,0)
145,3; 133,0
7,64 (d, 5,0)
3
145,3
8,62 (sl)
-
8,65 (d, 5,0)
3’
134,4
7,93 (d, 9,5)
-
7,89 (d, 9,8)
2’
130,3
6,88 (d, 9,5)
160,3; 134,4
6,83 (d, 9,8)
1’
160,3
-
-
-
8
125,4
7,89 (d, 8,5)
142,4; 117,8
7,74 (d, 8,5)
7
115,1
6,96 (dd, 8,5, 2,0)
164,3; 102,1
6,91 (dd, 2,4; 8,5)
6
164,3
-
-
5
102,1
7,74 (d, 2,0)
164,3; 142,4; 115,1;
7,97 (d, 2,4)
117,8
1
4b
117,8
-
-
-
8a
142,4
-
-
-
4a
133,0
-
-
-
9a
132,5
-
-
-
1
134,4
-
-
-
OMe
56,5
3,90 (s)
164,3
3,91 (s)
Arisawa et al (1983) – analisado em CDCl3 (60 MHz).
112
Os deslocamentos químicos observados sugerem a posição da metoxila em
C-6, através das constantes de acoplamento entre os hidrogênios H-7 (2,0 Hz) e
H-5 (2,0Hz) e ainda o acoplamento com relação orto do hidrogênio H-7 (8,5 Hz)
com H-8 (8,5 Hz). As correlações heteronucleares C-H à longa distância entre o
hidrogênio H-7 e C-6, H-5 e C-6 sugerem SNGC2.146 como 6-metoxi-(9H-βcarbolin-1-il)-(Z)-2-propenóico, isolado pela primeira vez como um produto natural.
O espectro de massas apresenta as fragmentações com m/z de 250 (100),
235 (7), 221 (30), 207 (54), 192 (19), 179 (57) e 153 (27). A ausência do íon
molecular no espectro de massas pode ser devido à perda de molécula de água
durante a fragmentação da molécula gerando o pico base de m/z 250.
113
4.3. Quantificação de 9-metoxi-cantin-6-ona em extratos e frações dos galhos
de Simaba polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata.
O alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona foi isolado das frações clorofórmicas dos
galhos das espécies, Simaba polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata.
Embora tenha sido isolado em pequenas quantidades, esse alcalóide é conhecido
por apresentar forte atividade citotóxica em ensaios in vitro contra células tumorais
tipo MCF-7 (câncer de mama) e A-549 (câncer de pulmão) nas concentrações de
4,5 e menor que 2,5 µg/mL, respectivamente (KUO et al. 2003). Decidiu-se então
pela realização da quantificação desse alcalóide por cromatografia líquida de alta
eficiência em diferentes extratos dessas duas espécies.
A análise quantitativa dessa substância em diferentes extratos foi realizada
com o intuito de comparar a eficiência de diferentes solventes na extração desse
alcalóide. No caso dos extratos aquosos, a quantificação foi realizada na espécie
S. polyphylla, pois a mesma é utilizada na medicina tradicional, na forma de chás,
para o combate às febres (CAVALCANTE, 1983; MESQUITA-SAAD e CABRAL,
1997).
O padrão da substância 9-metoxi-cantin-6-ona foi facilmente isolado das
frações
clorofórmicas,
com
o
emprego
de
técnicas
cromatográficas
e
recristalização, com um bom grau pureza, conforme descrito no capítulo 3. Esta
substância passou a servir como padrão.
114
A Figura 11 apresenta o cromatograma do padrão analisado, nas condições
de análise, com tempo de retenção médio em torno de 20 minutos.
0,0015
0,0010
0,0015
Detector A - 1 (254nm)
SPGC-1.2c
SPGC_1_02c
Retention T im e
0,0010
0,0005
0,0000
0,0000
-0,0005
-0,0005
-0,0010
-0,0010
-0,0015
-0,0015
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
Volts
Volts
21,308
0,0005
35,0
Minutes
Figura 11. Cromatograma de 9-metoxi-cantinona com tr de 21,3 minutos.
4.3.1. Análise dos extratos metanólicos dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis subesp. ecaudata.
Inicialmente foram analisados os extratos metanólicos (1,0 mg/mL) de
ambas as espécies. A presença de 9-metoxi-cantin-6-ona não foi detectada nas
análises preliminares desses extratos, devido a sua baixa concentração nos
mesmos. Para que a detecção do padrão, na análise por CLAE fosse possível, foi
necessário então realizar um tratamento de cada amostra através de extração em
fase sólida (EFS), utilizando cartuchos de Sep pak de fase reversa da Waters
(Esquema 20). Foram obtidas três frações. A primeira, eluída com 10 mL de
115
solução MeOH/H2O (1:1) contendo as substâncias polares, a segunda, eluída com
2 mL de solução MeOH/AcOEt (7:3), contendo o analito e a terceira, eluída com
10 mL de solução MeOH/AcOEt (7:3) para obtenção de outras substâncias
lipofílicas.
As três frações obtidas através do tratamento por EFS para cada extrato
foram analisadas por CLAE e foi possível então detectar a 9-metoxi-cantin-6-ona
na fração eluída com mistura MeOH/AcOEt (7:3) (Figuras 12 e 13).
0,14
Detector A - 1 (254nm)
SPGM1.22
SPGM_1_22
Detector A - 1 (254nm)
SPG1.166
SPG_1_166
Detector A - 1 (254nm)
SPG-2.166
SPGM_2_166
Detector A - 1 (254nm)
SPG3.166
0,14
SPG3_166
0,12
0,12
0,10
0,10
0,08
0,08
Volts
Volts
9-metoxi-cantin-6-ona
0,06
0,06
0,04
0,04
0,02
0,02
0,00
0,00
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
35,0
Minutes
Figura 12. Cromatogramas dos extratos metanólicos dos galhos de Simaba polyphylla;
SPGM_1_22 corresponde ao extrato metanólico sem tratamento por EFS, as demais após
tratamento por EFS: SPG_1_166 (verde) à fração eluída com 10 mL MeOH/H2O (1:1) (constituintes
polares), SPGM_2_166 (vermelho) à fração eluída com 2 mL de MeOH/Oac (7:3) (fração com
cantinona), SPG3_166 (azul) à fração eluída com 10 mL de MeOH/OAc (7:3) (fração apolar).
116
Volts
0,12
Detector A - 1 (254nm)
SNG3.166
SNG3_166
Detector A - 1 (254nm)
SNG2.166
SNG_2_166
Detector A - 1 (254nm)
SNG1.166
0,12
SNG1_166
0,10
0,10
0,08
0,08
9-metoxi-cantin-6-ona
0,06
0,06
0,04
0,04
0,02
0,02
0,00
0,00
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
Volts
Detector A - 1 (254nm)
SNGM1.22
SNGM_1_22
35,0
Minutes
Figura 13. Cromatogramas dos extratos metanólicos dos galhos de Simaba guianensis subesp.
ecaudata; SNGM_1_22, corresponde ao extrato metanólico sem tratamento por EFS, as demais
após tratamento por EFS: SNG3_166 (verde) à fração eluída com 10 mL MeOH/H2O (1:1)
(constituintes polares), SNG_2_166 (vermelho) à fração eluída 2 mL de MeOH/OAc (7:3) (fração
com cantinona), SNG1_166 (azul) à fração eluída com 10 mL de MeOH/OAc (7:3) (fração apolar).
A confirmação do pico identificado como sendo correspondente a 9-metoxicantin-6-ona, para cada extrato ou fração, foi realizada, a partir da co-injeção dos
extratos analisados com o padrão. Na Figura 14 são apresentados sobrepostos, o
cromatograma da fração analisada do extrato metanólico e o respectivo
cromatograma obtido após a co-injeção de S. polyphylla. O mesmo procedimento
foi realizado para a espécie S. guianensis.
117
Detector A - 1 (254nm)
SPG-2.166
SPGM_2_166
0,015
Detector A - 1 (254nm)
SPG-2.166p
SPGM_2_166p
0,015
0,010
0,005
0,005
0,000
0,000
Volts
Volts
0,010
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
Figura 14. Cromatogramas da fração obtida por EFS do extrato metanólico dos galhos de S.
polyphylla: SPG-2.166 (azul) – eluída com MeOH/AcOEt (7:3); SPG-2.166p (vermelho) – com
adição de padrão.
4.3.2. Análise dos extratos aquosos dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis subsp. ecaudata.
Os extratos aquosos dos galhos (1,0 mg/mL) de S. polyphylla e S.
guianensis foram inicialmente analisados por CLAE, sem tratamento prévio e
nesses extratos não foi detectada a presença de 9-metoxi-cantin-6-ona nas
condições de análise utilizadas. Para que o padrão 9-metoxi-cantin-6-ona fosse
detectado nesses extratos, preparou-se então os extratos aquosos das espécies
na concentração de 5,0 mg/mL. A presença da cantinona nos extratos a 5,0
mg/mL também não foi observada, e então, esses extratos foram submetidos a um
tratamento por EFS (Esquema 21) que resultaram em quatro frações que foram
analisadas em CLAE. A análise das frações eluídas com 1,0 mL de MeOH/AcOEt
118
(7:3), confirmou a presença de 9-metoxi-cantin-6-ona nas mesmas. Essas frações
foram utilizadas na análise quantitativa nos extratos aquosos (Figuras 15 e 16).
0,05
Detector A - 1 (254nm)
SPGA-1
SPGA_1
Detector A - 1 (254nm)
SPGA-2
SPGA_2
Detector A - 1 (254nm)
SPGA-3b
SPGA_3b
0,05
Detector A - 1 (254nm)
SPGA-4
SPGA_4
0,04
0,04
0,03
0,03
0,02
0,02
0,01
0,01
0,00
0,00
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
Volts
Volts
9-metoxi-cantin-6-ona
35,0
Minutes
Figura 15. Cromatogramas das frações de EFS obtidas do extrato aquoso dos galhos de Simaba
polyphylla; SPGA_1 (preto) - fração 1 eluída com 10 mL de H2O; SPGA-2 (verde) - fração 2 eluída
com 10 mL de MeOH/H2O (1:1); SPGA_3b (vermelho) - fração 3 eluída com 1 mL do sistema
MeOH/AcOEt (7:3); SPGA-4 (azul) - fração 4 eluída com 10 mL de lavagem com MeOH/AcOEt
(7:3).
119
Volts
0,150
Detector A - 1 (254nm)
SGEGA-2
SGEGA__2
Detector A - 1 (254nm)
SGEA-3
SGEGA_3
Detector A - 1 (254nm)
SGEGA-4
0,150
SGEGA__4
0,125
0,125
0,100
0,100
9-metoxi-cantin-6-ona
0,075
0,075
0,050
0,050
0,025
0,025
0,000
0,000
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
Volts
Detector A - 1 (254nm)
SGEGA-1
SGEGA__1
35,0
Minutes
Figura 16. Cromatogramas das frações de EFS obtidas do extrato aquoso dos galhos de S.
guianensis subsp. ecaudata. SGEGA_1 (preto) - fração 1 eluída com 10 mL de H2O; SGEGA-2
(verde) - fração 2 eluída com 10 mL de MeOH/H2O (1:1); SGEGA_3 (vermelho) - fração 3 eluída
com 1 mL do sistema MeOH/AcOEt (7:3); SGEGA-4 (azul) - fração 4 eluída com 10 mL de lavagem
com MeOH/AcOEt (7:3).
A identificação do pico com tempo de retenção médio de 21,1 minutos
como sendo de 9-metoxi-cantin-6-ona foi realizada através do método da coinjeção de padrão (Figura 17).
120
Volts
0,02
Detector A - 1 (254nm)
SNGA-3p
SNGA_3p
0,02
0,01
0,01
0,00
0,00
0
5
10
15
20
25
30
Volts
Detector A - 1 (254nm)
SGEA-3
SGEGA_3
35
Minutes
Figura 17. Cromatogramas da fração 3 do extrato aquoso de Simaba guianensis subsp. ecaudata
com (vermelho) e sem co-injeção (azul) de padrão 9-metoxicantin-6-ona.
4.3.3. Análise das frações clorofórmicas dos galhos de S. polyphylla e S.
guianensis.
As frações clorofórmicas dos galhos das espécies S. polyphylla e S.
guianensis foram inicialmente analisadas por CLAE nas mesmas condições que
os extratos aquosos e metanólicos. As concentrações das frações analisadas
previamente foram de 1,0 mg/mL em metanol. Para essas frações não foi
necessário um tratamento, uma vez a 9-metoxi-cantin-6-ona pode ser detectada
nessas condições de análise.
121
Novamente a confirmação do pico correspondente a 9-metoxi-cantin-6-ona
nas frações analisadas foi feita pelo método da co-injeção (Figuras18 e 19).
Detector A - 1 (254nm)
SPGC1.46
SNGC_1_046
0,04
Volts
Volts
0,04
Detector A - 1 (254nm)
SPGC1.46p
SNGC_1_046p
0,02
0,02
0,00
0,00
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
Figura 18. Cromatogramas da fração clorofórmica de S. polyphylla com (vermelho) e sem coinjeção (azul) de padrão 9-metoxicantin-6-ona.
Volts
0,08
Detector A - 1 (254nm)
SNGC1.54p
SNGC_1_054p
0,08
0,06
0,06
0,04
0,04
0,02
0,02
0,00
0,00
0
5
10
15
20
25
30
Volts
Detector A - 1 (254nm)
SNGC1.54
SNGC_1_054
35
Minutes
Figura 19. Cromatogramas da fração clorofórmica de Simaba guianensis subsp. ecaudata com
(vermelho) e sem co-injeção (azul) de padrão 9-metoxicantin-6-ona.
122
4.3.4. Curva de calibração e quantificação das amostras.
A quantificação de 9-metoxi-cantin-6-ona foi realizada pelo método do
padrão externo, a partir de uma curva de calibração obtida pela injeção de
diferentes concentrações do padrão, em CLAE, nas mesmas condições de análise
utilizadas para os extratos e frações das duas espécies estudadas.
Os valores das concentrações das soluções do padrão (faixa de
concentração)
foram
definidos
com
base
nos
resultados
das
áreas
correspondentes ao pico da 9-metoxi-cantin-6-ona nas frações obtidas por EFS
dos extratos aquosos. As concentrações das soluções do padrão foram analisadas
em triplicata, e as áreas médias obtidas estão descritas na Tabela 17.
A curva de calibração foi obtida por regressão linear do gráfico de áreas
médias versus concentrações do padrão (Figura 20).
Tabela 17. Áreas médias correspondentes às soluções padrão de 9-metoxi-cantin-6-ona.
Concentração
Área
Desvio
Coeficiente de Variação
(µg/mL)
média
padrão
(%)
0,0625
3389
195
5,74
0,1250
5996
308
5,13
0,2500
11754
477
4,06
0,5000
22968
66
0,29
1,0000
46695
937
2,01
123
50000
y = 46604x
2
R = 0,9997
45000
40000
35000
Área
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
C (ug/mL)
Figura 20. Curva de calibração do alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona a 254 nm.
A curva de calibração obtida apresentou excelente linearidade (expresso
em R2), na faixa de concentrações analisadas. A precisão de análise (expresso
em CV %) pode ser considerada aceitável, em virtude das concentrações
analisadas.
Algumas amostras foram diluídas para que os valores das concentrações
de 9-metoxi-cantin-6-ona pudessem ser obtidos na faixa de concentração em que
a curva de calibração foi obtida. As frações obtidas por EFS dos extratos
metanólicos foram diluídas pela metade e as frações clorofórmicas, que não foram
submetidas a nenhum tratamento, foram preparadas na concentração de 0,125
mg/mL. Todas as amostras foram analisadas em duplicata e em seguida calculouse o valor médio das áreas obtidas para cada amostra. A Tabela 18 apresenta os
valores obtidos.
124
Tabela 18. Valores das áreas médias e concentrações dos extratos e frações de S.
polyphylla e S. guianensis, obtidos por análise em CLAE.
Amostra
Áreas médias
Desvio padrão
CV (%)
C (µg/mL)
SPGA – 3a
6.778
416
6,14
0,1454
SGEGA-3a
12.414
491
3,95
0,2664
SPGM.2.166b
29.975
272
0,91
0,6432
SNGM.2.166b
33.068
1167
3,53
0,7096
SPGC-0125c
24.626
403
1,64
0,5284
SGEGC-0125c
36.149
2234
6,18
0,7757
a
Frações resultantes do tratamento dos extratos aquosos por EFS.
b
Frações resultantes do tratamento dos extratos metanólicos por EFS e diluídas à metade.
c
Frações clorofórmicas dos galhos de Simaba polyphylla e S. guianensis na concentração de
0,125 mg/mL.
Para se obter o valor da concentração de 9-metoxi-cantin-6-ona nos
diferentes extratos e frações inicialmente preparados foi necessário multiplicar os
valores obtidos das amostras analisadas pelo respectivo fator de correção. Para
os extratos metanólicos, que na análise por CLAE foram diluídos pela metade,
multiplicou-se o valor obtido na curva por 2 para obter o valor da concentração do
padrão em 1,0 mg/mL de extrato. No caso dos extratos aquosos, partiu-se
inicialmente de 10 mL de extrato na concentração de 5,0 mg/mL. No tratamento
por EFS foi coletado 1,0 mL da fração eluída com MeOH/AcOEt (7:3) contendo o
analito, ou seja, a concentração do padrão nesses extratos foi aumentada cerca
125
de 10 vezes. Logo, o fator de correção utilizado para calcular o valor da
concentração de padrão em 5,0 mg/mL de extrato foi a multiplicação por 0,10.
Tabela 19. Valores de concentração de 9-metoxi-cantin-6-ona nas diferentes soluções de extratos
aquosos e metanólicos de S. polyphylla e S. guianensis subsp. ecaudata.
Amostra
Amostras
analisada
Fator
Amostra final
C (µg/mL)
de correção
C (µg/mL)
0,1454
0,10
0,014
0,2664
0,10
0,027
0,6432
2
1,27
0,7096
2
1,42
Extrato aquoso dos galhos de
S. polyphylla (5,0 mg/mL)
Extrato aquoso dos galhos de
S. guianensis (5,0 mg/mL)
Extrato metanólico dos galhos de
S. polyphylla (1,0 mg/mL)
Extrato metanólico dos galhos de
S. guianensis (1,0 mg/mL).
A quantidade de 9-metoxi-cantin-6-ona presente nos diferentes extratos e
frações analisados foi finalmente expresso em termos percentuais (peso
cantinona/peso seco de extrato ou fração) (Tabela 20) para fins de comparação.
126
Tabela 20. Relação percentual de 9-metoxi-cantinona presente nos extratos e frações dos galhos
de S. polyphylla e S. guianensis.
Amostra
Relação p/p (%)
Extrato aquoso de S. polyphylla
0,00029
Extrato aquoso de S. guianensis
0,00053
Extrato metanólico de S. polyphylla
0,13
Extrato metanólico de S. guianensis
0,14
Fração clorofórmica de S. polyphylla
0,42
Fração clorofórmica de S. guianensis
0,62
A
9-metoxi-cantin-6-ona
nestas
concentrações
não
apresenta
citotoxicidade. Como citado anteriormente a concentração em que 9-metoxicantin-6-ona apresenta atividade citotóxica é de 2,0 a 4,5 µg/mL (KUO et al. 2003).
Para que os extratos aquosos apresentassem atividade citotóxica seria necessário
que este alcalóide estivesse presente em concentrações em torno de 100 a 200
vezes maiores.
.
Os extratos metanólicos e frações clorofórmicas apresentam maiores
quantidades de 9-metoxi-cantin-6-ona. Esses resultados já eram esperados devido
a menor polaridade de 9-metoxi-cantin-6-ona, que é extraída com maior facilidade
com solventes orgânicos tais como metanol e clorofórmio.
127
4.4. Avaliação da citotoxicidade in vitro dos extratos e frações de Simaba
polyphylla e S. guianensis subesp. ecaudata.
Os ensaios de atividade citotóxica dos extratos e frações de galhos e folhas
de S. polyphylla e S. guianensis foram realizados como parte de um “screening”
inicial para a determinação do potencial antitumoral das espécies em estudo.
Esses
extratos
e
frações
foram
preparados
preliminarmente
antes
do
fracionamento cromatográfico. O extrato hexânico, obtido para fracionamento,
também foi submetido à avaliação da citotoxicidade junto com os extratos e
frações inicialmente preparados para esse fim.
Para análise dos resultados obtidos, o percentual de crescimento celular
(%G) foi calculado comparando a absorbância do teste com o controle (100%),
tempo-zero (0%) e os padrões de paclitaxel e etoposídeo (120 µg/mL), (-100%).
As frações foram classificadas, para cada linhagem testada, em:
- SA, sem atividade;
- PA: com pouca atividade (inibição de até 50% do crescimento);
- MO: com moderada atividade para aquelas que provocaram inibição entre
50% e 75% do crescimento;
- MA: com muita atividade para aquelas que provocaram inibição maior que
75% do crescimento.
As Tabelas 21 e 22 apresentam os resultados obtidos com as amostras de
Simaba polyphylla e S. guianensis nas diferentes linhagens de células tumorais
128
(MDA – MB – tumor de mama humano; B16 – Melanoma de pele – murino; HCT-8
– tumor de cólon humano).
Tabela 21. Citotoxicidade dos extratos e frações obtidos dos galhos e folhas de Simaba polyphylla
na concentração de 120 µg/mL.
Amostras
MDA-MB
B16
HCT8
Extrato hexânico dos galhos (SPG 1.4)
MA
MA (8x)
MA
Extrato aquoso dos galhosa
MO
MA (2x)
SA
Extrato (MeOH) dos galhosb
SA
MA
MA (9x)
Fração hexânica. dos galhosb
MO
MA (5x)
PA
Fração cloroformica dos galhosb
MA
MA (7x)
MO
Fração AcOEt dos galhosb
MA
MA (5x)
PA
Fração hidroalcoólica dos galhosb
MO
SA
SA
Extrato aquoso dos galhosb
SA
SA
SA
Extrato aquoso dos galhosc
SA
SA
SA
Extrato aquoso das folhasc
SA
SA
MO
Extrato metanólico das folhasc
SA
SA
PA
a
Extração com água quente dos galhos após maceração em hexano.
b
Extratos e frações do espécime 2 (SP-2; Esquema 5).
c
Extratos obtidos do espécime 1 (SP-1, Esquema 4 e 6).
129
Tabela 22. Citotoxicidade dos extratos e frações obtidos dos galhos e folhas de S. guianensis
subesp. ecaudata na concentração de 120 µg/mL.
Amostras
MDA-MB
B-16
HCT-8
Extrato hexânico dos galhos (SNG 1.4)
MO
MA (6x)
MA
Extrato aquoso dos galhosa
MA
SA
SA
Extrato aquoso dos galhosb
SA
SA
SA
Extrato metanólico dos galhosb
SA
SA
SA
Fração hexânica dos galhosb
MO
MA (5x)
MO
Fração clorofórmica dos galhosb
MO
MA (7x)
MO
Fração AcOEt dos galhos
PA
MA (6x)
PA
Fração hidroalcóolica dos galhosb
MA
MA (5x)
PA
Extrato aquoso dos galhosb
SA
SA
SA
Extrato aquoso das folhasc
SA
SA
SA
Extrato metanólico das folhasb
SA
SA
SA
Extrato metanólico das folhasc
SA
SA
PA
a
Fração obtida por extração em água quente após maceração em hexano.
b
Extratos e frações do espécime 2 (SSN-2 – Esquema 13).
c
Extratos do espécime 1 (SSN-1 – Esquema 14).
130
Os extratos e as frações lipofílicas de ambas as espécies apresentaram
atividade, enquanto que os aquosos não apresentaram atividade citotóxica.
Entretanto, observou-se que os extratos aquosos dos galhos passaram a
apresentar atividade quando extraídos após maceração com hexano. No caso do
extrato aquoso dos galhos de S. polyphylla, observa-se uma atividade moderada
contra células MDA-MB e um aumento significativo de até duas vezes mais ativo
que o controle positivo utilizado nos ensaios, contra melanoma. O extrato aquoso
dos galhos de S. guianensis, obtido após maceração com hexano, passou a
apresentar atividade significativa apenas com células tumorais de mama, não
apresentando atividade com as outras linhagens testadas. Provavelmente, a
extração com hexano, remove a barreira lipofílica, que impediria uma melhor
extração em água quente dos constituintes mais polares.
Observa-se também que os extratos dos galhos apresentam maior
atividade do que os extratos das folhas. No caso de Simaba guianensis os
extratos metanólicos e aquosos das folhas não apresentaram atividade para as
três linhagens de células testadas.
Os extratos hexânicos dos galhos de S. polyphylla e S. guianensis
apresentaram atividade significativa em todas as linhagens de células testadas,
principalmente frente às células B-16, com atividades maiores que os controles
positivos. O extrato hexânico de S. polyphylla apresenta atividade 8 vezes maior
que os padrões e S. guianensis 6 vezes maior. O fracionamento do extrato
hexânico de S. polyphylla resultou no isolamento de dois triterpenos citotóxicos
niloticina (63) e diidroniloticina (64).
131
Dados na literatura, mostram que a niloticina apresenta CI50 = 1,5 µg/mL
contra células P388 e CI50 = 8,3 µg/mL contra células KB. Já a diidroniloticina
apresenta CI50 = 20 µg/mL e 0,55 µg/mL contra células P388 e KB,
respectivamente (ITOKAWA, KISHI e TAKEIA, 1992). O extrato hexânico de
Simaba guianensis resultou no isolamento do triterpeno piscidinol A (67) cuja
atividade citotóxica também foi descrita no mesmo trabalho (ITOKAWA, KISHI e
TAKEIA, 1992) com CI50 = 1,2 µg/mL e 5,0 µg/mL contra células P388 e KB,
respectivamente. A forte atividade desses extratos pode ser explicada pela
considerável quantidade isolada desses três triterpenos.
Dos extratos metanólicos testados, o extrato metanólico dos galhos de S.
polyphylla apresenta atividade significativa em B-16 e é bastante ativo contra
células HCT-8 com atividade cerca de 9 vezes maior que os padrões utilizados
nos ensaios. O extrato metanólico das folhas dessa espécie apresenta uma
pequena atividade somente com células HCT-8. Apesar de o extrato metanólico
dos galhos dessa espécie não ter apresentado atividade contra células MDA-MB,
observou-se considerável atividade das frações obtidas por partição desse extrato.
Nas células B-16 observou-se que houve significativo aumento da atividade
para o extrato hexânico e frações obtidas por partição do extrato metanólico,
sendo todos 5 a 7 vezes mais ativos que os padrões. O mesmo não foi observado
para células de cólon. Enquanto o extrato metanólico dos galhos de S. polyphylla
foi mais ativo que os padrões, observou-se que as frações obtidas por partição do
mesmo apresentaram atividade moderada a pouca atividade.
132
Os extratos metanólicos de S. guianensis, por sua vez, não apresentaram
atividade citotóxica. No entanto, as frações geradas por partição mostraram
atividade frente às três linhagens de células. Como em S. polyphylla, todas as
frações foram 5 a 7 vezes mais ativas que os padrões em células de melanoma de
pele.
A atividade citotóxica observada nos extratos metanólicos e frações
clorofórmicas dos galhos de S. polyphylla e também de S. guianensis pode ser
atribuída aos alcalóides tipo cantinona.
No geral, pode-se observar que a espécie S. polyphylla apresenta-se mais
ativa que a espécie S. guianensis e que os princípios ativos estão presentes nos
galhos dessas espécies. A atividade citotóxica dos extratos é maior frente às
células de melanoma do que às células tumorais de mama e de cólon.
133
4.5. Avaliação da atividade larvicida em Aedes aegypti e citotóxica em
microcrustáceos Artemia franciscana.
Antes do fracionamento cromatográfico para isolamento dos constituintes
químicos, foram preparados extratos e frações dos galhos e folhas de S.
polyphylla e S guianensis segundo o método utilizado para o banco de extratos do
Laboratório de Princípios Ativos da Amazônia no INPA (Parte experimental,
Esquemas 6, 7, 8, 13, 14 e 15). Esses foram submetidos a um screening de
atividade citotóxica em microcrustáceos A. franciscana e de atividade larvicida
contra Aedes aegypti (POHLIT, et al. 2004).
Os resultados de atividade dos extratos e frações dos galhos e folhas de
Simaba polyphylla e S. guianensis contra A. franciscana e Aedes aegypti são
descritos nas tabelas 23 a 26.
Tabela 23. Atividade citotóxica em Artemia franciscana (Af) e larvicida em Aedes aegypti (Aa) de
extratos de galhos de folhas de Simaba polyphylla.
Amostra
Af (%)
CL50 Af (µg/mL)
Aa (%)
CL50 Aa (mg/mL)
4,25
87
191 ± 72
100
323 ± 38
2,88
0
-
0
-
4,62
98
200 ± 19
87
119 ± 16
2,68
0
-
0
-
ND
0
-
0
-
16,5
0
-
0
-
Teor de
extrativos (%)
Extrato MeOH
Galhos (SP-1)
Extrato aquoso
gahos (SP-1)
Extrato MeOH
galhos (SP-2)
Extrato aquoso
galhos (SP-2)
Extrato MeOH
(folhas)
Extrato aquoso
(folhas)
ND = Não determinado
134
Tabela 24. Atividade citotóxica (Artemia franciscana – Af) e larvicida (Aedes aegypti – Aa) das
frações obtidas por partição dos galhos de Simaba polyphylla.
Frações
Teor de extrativos (%)
Af (%)
Aa (%)
Hexânica (SP-1)
5,7
37
37
Hexãnica (SP-2)
5,8
64
17
Clorofórmica (SP-1)
38,5
84
44
Clorofórmica (SP-2)
40,8
87
44
AcOEt (SP-1)
6,3
0
0
AcOEt (SP-2)
7,8
0
0
Hidroalcoólica (SP-1)
29,8
24
0
Hidroalcoólica (SP-2)
31,7
20
0
Os resultados apresentados nas tabelas 23 e 24 demonstram que as
atividades
citotóxica
e
larvicida
concentraram-se
somente
nos
extratos
metanólicos dos galhos de S. polyphylla.
Das frações obtidas por partição dos extratos metanólicos dos galhos,
observa-se que somente as frações mais lipofílicas apresentaram atividade
significativa. As frações obtidas por partição, dos extratos metanólicos das folhas
não apresentaram atividade.
135
Tabela 25. Atividade citotóxica em Artemia franciscana (Af) e larvicida em Aedes aegypti (Aa) de
extratos de galhos de folhas de Simaba guianensis subesp. ecaudata.
Amostra
Af (%)
CL50 Af (µg/mL)
Aa (%)
CL50 Aa (mg/mL)
3,31
74
249 ± 52
100
-
2,56
0
-
0
-
3,63
47
-
70
471 ± 44
2,74
0
-
0
-
19,25
0
-
0
-
11,0
0
-
0
-
Teor de
extrativos (%)
Extrato MeOH
Galhos (SSN-1)
Extrato aquoso
gahos (SSN-1)
Extrato MeOH
galhos (SSN-2)
Extrato aquoso
galhos (SSN-2)
Extrato MeOH
(folhas)
Extrato aquoso
(folhas)
Tabela 26. Atividade citotóxica (Artemia franciscana – Af) e larvicida (Aedes aegypti – Aa) das
frações obtidas por partição dos galhos de S. guianensis.
Frações
Teor de extrativos (%)
Af (%)
Aa (%)
Hexânica (SSN-1)
4,2
80
24
Hexãnica (SSN-2)
4,3
10
20
Clorofórmica (SSN-1)
22,8
84
64
Clorofórmica (SSN-2)
24,1
40
0
AcOEt (SSN-1)
14,0
0
0
AcOEt (SSN-2)
10,7
0
0
Hidroalcoólica (SSN-1)
35,7
7
0
Hidroalcoólica (SSN-2)
50,6
0
0
136
Como para a espécie Simaba polyphylla, na espécie S. guianensis, as
atividades citotóxica e larvicida são mais concentradas nos extratos metanólicos
dos galhos, enquanto que os extratos aquosos destes e os extratos das folhas não
apresentam atividade. Nas frações obtidas por partição dos extratos metanólicos
dos galhos, as atividades citotóxica e larvicida são mais significativas nas frações
lipofílicas.
Os resultados obtidos nesses ensaios contribuíram para o direcionar o
fracionamento cromatográfico das espécies em estudo com o objetivo de isolar os
princípios ativos existentes. Entretanto, no caso de atividade larvicida contra
Aedes aegypti, nenhuma das substâncias isoladas tanto dos galhos de S.
polyphylla quanto S. guianensis apresentou atividade.
137
5. Conclusões
O estudo fitoquímico das espécies Simaba polyphylla e Simaba guianensis
subesp. ecaudata foram realizados com base em alguns ensaios de atividade
citotóxica com células antitumorais e microcrustáceos de Artemia franciscana. As
substâncias
isoladas
dos
galhos
das
espécies
em
estudo
apresentam
citotoxicidade descritas na literatura (ITOKAWA, et al. 1992, KUO et al.,2003).
O isolamento de triterpenos tetracíclicos do tipo tirucalano com insaturação
na posição C-7, como registrado nesse trabalho, é comum em espécies da família
Simaroubaceae, visto que triterpenos dessa classe são precursores de
quassinóides1, os principais marcadores quimiotaxonômicos dessa família. A
presença de alcalóides do tipo cantinona também é comum em espécies da
família em estudo. Os triterpenos niloticina (3), diidroniloticina (4), taraxerona (5) e
o alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona (2) são descritos pela primeira vez na espécie
Simaba polyphylla. O triterpeno Piscidinol A e o alcalóide 9-metoxi-cantin-6-ona
também são descritos pela primeira vez na espécie Simaba guianensis subesp.
ecaudata. Os alcalóides 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-2-propenóico e 6-metoxi9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-2-propenóico, isolados de Simaba polyphylla e Simaba
guianensis, respectivamente, são registrados pela primeira vez como produtos
naturais.
A análise quantitativa por CLAE, de constituintes químicos isolados de
plantas é uma ferramenta de grande auxílio não somente para a verificação dos
componentes de uma planta como para a validação da mesma quando utilizada
138
tradicionalmente na medicina popular, através da análise da concentração de
princípios ativos em produtos naturais uma vez que o teor desses quando
avaliado, podem ser comparados com os valores de concentração em que
apresentam determinada atividade biológica. A quantificação de 9-metoxi-cantin-6ona nos extratos e frações dos galhos de S. polyphylla e S. guianensis subesp.
ecaudata demonstra que a concentração desse alcalóide citotóxico não é
significativa para conferir toxidez aos extratos aquosos dessas espécies.
Entretanto, para a validação dessas espécies para uso tradicional na medicina
popular é necessário um estudo mais aprofundado sobre outros possíveis
constituintes citotóxicos presentes nas espécies estudadas.
A avaliação da citotoxicidade in vitro dos extratos e frações de S. polyphylla
e S. guianensis revelou que os extratos orgânicos são potencialmente citotóxicos
enquanto que os aquosos não apresentam citotoxicidade ou esta não é muito
significativa. Também foi observado que os extratos e frações de Simaba
polyphylla são mais ativos que os de Simaba guianensis.
Apesar de os extratos metanólicos dos galhos de Simaba polyphylla e S.
guianensis subesp. ecaudata demonstrarem atividade significativa no “screening”
em larvas de Aedes aegytpi, nenhuma das substâncias isoladas apresentou
atividade larvicida em A. aegytpi.
139
6. Referências bibliográficas
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vitro citotoxicity of a series of quassinoids from Brucea javanica fruits against KB
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Xenopus. Journal of Natural Products, v. 66, n. 5, p. 630-633, 2003.
156
WANI, M. C.; TAYLOR, H. L.; THOMPSON, J. B.; WALL M. E. Plant Antitumor
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Alkaloids. Ed. Academic Press, 1989. vol. 36, p. 135 – 170.
157
7. Anexos
Espectro de IV da niloticina (73).
158
Espectro de Massas de baixa resoluçao da niloticina (73).
159
Espectro de RMN 1H da niloticina (73) em 200 MHz (CDCl3)
160
Espectro de RMN 1H da niloticina (73) em 200 MHz (CDCl3) – ampliação.
161
Espectro de RMN 1H da niloticina (73) em 200 MHz (CDCl3) – ampliação da região alifática.
162
Espectro de RMN 13C (HBBD) da niloticina (73) (50 MHz – CDCl3).
163
Espectro de DEPT 135 da niloticina
164
Espectro de DEPT 90 da niloticina
165
Espectro de HOMOCOSY da niloticina
166
Espectro de HMQC da niloticina.
167
Espectro de HMQC da niloticina – ampliação.
168
Espectro de HMBC da niloticina.
169
Espectro de HMBC da niloticina – ampliação.
170
Espectro de IV da diidroniloticina (74).
171
Espectro de Massas de baixa resolução da diidroniloticina.
172
Espectro de RMN 1H da diidroniloticina (200 MHz-CDCl3).
173
Espectro de RMN 1H da diidroniloticina (200 MHz-CDCl3) - ampliação
174
Espectro de RMN 13C (HBBD) da diidroniloticina (50 MHz – CDCl3).
175
Espectro de DEPT135 da diidroniloticina.
176
Espectro de DEPT 90 da diidroniloticina.
177
Espectro de HOMOCOSY da diidroniloticina
178
Espectro de HOMOCSY da diidroniloticina – ampliação.
179
Espectro de HMQC da diidroniloticina
180
Espectro de HMQC da diidroniloticina – ampliação.
181
Espectro de HMBC da diidroniloticina.
182
Espectro de IV da taraxerona (75).
183
Espectro de massas de baixa resolução da taraxerona
184
Espectro de RMN 1H da taraxerona (200 MHz – CDCl3).
185
Espectro de RMN 13C (HBBD) da taraxerona (50 MHz – CDCl3).
186
Espectro de DEPT 135 da taraxerona.
187
Espectro de DEPT 90 da taraxerona.
188
Espectro de HOMOCOSY da taraxerona.
189
Espectro de HMQC da taraxerona.
190
Espectro de HMQC da taraxerona – ampliação.
191
Espectro de HMBC da taraxerona.
192
Espectro de HMBC da taraxerona – ampliação.
193
Espectro de IV da 9-metoxi-cantin-6-ona (35).
194
Espectro de massas de baixa resolução da 9-metoxi-cantin-6-ona.
195
Espectro de RMN 1H da 9-metoxi-cantin-6-ona (200 MHz – CDCl3).
196
Espectro de RMN 1H da 9-metoxi-cantin-6-ona – ampliação da região aromática.
197
Espectro de RMN 13C (HBBD) da 9-metoxi-cantin-6-ona (50 MHz – CDCl3).
198
Espectro de HOMOCOSY da 9-metoxi-cantin-6-ona.
199
Espectro de HOMOCOSY da 9-metoxi-cantin-6-ona – ampliação da região aromática.
200
Espectro de HMQC da 9-metoxi-cantin-6-ona.
201
Espectro de HMBC da 9-metoxi-cantin-6-ona
202
Espectro de HMBC da 9-metoxi-cantin-6-ona – ampliação da região aromática.
203
60
59
7
98
18
9
58
57
56
55
54
T
%
3
6
0
3
53
52
51
7
32
57
7
4
3
7
1
5
5
8
2
0
6
4
3
74
87
33
1 9
01 20
3
3 31
4 3
1 1
9
6
5
7
4
2
1
1
5
2
2
1
5
7
1
1
2
5
1
1
4
1
8
2
4
8
3
7
6
1
5
2
9
2
50
1
1
6
1
4
3
6
1
3
9
4
1
97
95
00
1 11
3
0
1
6 7
2 4
6 5
49
48
47
46
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Wavenumbers (cm-1)
Espectro de IV de SPGC2.147 – 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76).
204
Espectro de massas de baixa resolução de 76.
205
Espectro de RMN 1H de 76 (500 MHz – CDCl3).
206
Espectro de RMN 1H de 76 (500 MHz – CDCl3) – ampliação da região aromática.
207
Espectro de RMN13C (HBBD) de SPGC2.147 (76) (125 MHz – CDCl3).
208
Espectro de HOMOCOSY do ácido 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76).
209
Espectro de HOMOCOSY do ácido 7-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (76).
210
Espectro de HMQC de 76.
211
Espectro de HMQC de 76 – ampliação.
212
Espectro de HMBC de 76.
213
Espectro de HMBC de 76 -ampliação.
214
Espectro de IV do óxido de cariofileno (67)
215
Espectro de massas de baixa resolução do óxido de cariofileno.
216
Espectro de RMN 1H do óxido de cariofileno (200 MHz-CDCl3).
217
Espectro de RMN 1H do óxido de cariofileno – ampliação da região alifática.
218
Espectro de RMN 13C (HBBD) do óxido de cariofileno (50 MHz – CDCl3).
219
Espectro de DEPT 135 do óxido de cariofileno.
220
Espectro de DEPT 90 do óxido de cariofileno.
221
Espectro de HOMOCOSY do óxido de cariofileno.
222
Espectro de HOMOCOSY do óxido de cariofileno – ampliação.
223
Espectro de HMQC do óxido de cariofileno.
224
Espectro de HMBC do óxido de cariofileno.
225
Espectro de IV do Piscidinol A (78).
226
Espectro de massas de baixa resolução de piscidinol A.
227
Espectro de RMN 1H de piscidinol A (500 Mhz – CDCl3).
228
3.61
3.61
7.48
3.70
3.65
1.72
7.98
1.50
1.57
7.52
1.99
2.99
2.41
2.35
0.61
1.32
2.00
1.477
1
0
100
288
302
002
1 990
032
1.486
1.499
1.544
1.512
1.553
1.585
1.568
1.626
1.655
1.678
1.708
1.784
1.736
1.793
1.818
1.825
1.847
1.856
1.869
1.892
1.899
1.944
1.955
1.962
1.972
1.980
1.989
1.998
2.007
2.017
2.028
2.035
2.056
2.067
2.107
2.097
2.079
2.230
2.218
2.207
2. 194
SNGH1.159
500000
400000
300000
200000
100000
0
Espectro de RMN 1H de piscidinol A (500 Mhz – CDCl3) – ampliação da região alifática.
ppm (t1)
1.00
229
2.731
2
2 683
701
2.750
2.767
2.780
2.798
2.855
3.136
3.163
4.073
4.070
4.100
4.093
4.087
4.117
5.280
5.291
5.301
5.312
500000
400000
SNGH1.159
300000
200000
100000
0
3.50
1.98
4.00
2.13
4.50
0.96
0.84
1.00
5.00
3.00
ppm (t1)
Espectro de RMN 1H de piscidinol A (500 Mhz – CDCl3) – ampliação da região de hidrogênios carbinólicos e hidrogênio
insaturado.
230
Espectro de RMN 13C (HBBD) do piscidinol A (500 MHz – CDCl3).
231
Espectro de HOMOCOSY de piscidinol A.
232
SNGH1.159 - COSY
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
ppm (t1)
4.00
ppm (t2)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0. 50
Espectro de HOMOCOSY de piscidinol A – ampliação.
233
Espectro de HMQC de piscidinol A.
234
0.50
SNGH1.159 - HETCORR
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
ppm (t1)
60
ppm (t2)
50
40
30
20
10
Espectro de HMQC de piscidinol A – ampliação.
235
Espectro de HMBC de piscidinol A.
236
SNGH1.159 - HMBC
10
20
30
40
50
60
70
80
90 (t1)
ppm
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
ppm (t2)
Espectro de HMBC de piscidinol A – ampliação.
237
Espectro de NOESY de piscidinol A.
238
Espectro de IV de SNGC2.146 – ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79).
239
Espectro de massas do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79).
240
1.259
3.306
3.898
6.891
6.872
8.629
7.953
7.943
7.924
7.899
7.882
7.744
7.739
6.976
6.972
6.959
6.955
700
600
500
400
300
200
100
0
0.99
3.00
1.07
1.10
1.02
1.04
0.56
1.56
1.00
5.0
0.0
ppm (t1)
Espectro de RMN 1H do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) (500 MHz – MeOD).
241
6.872
6.891
6.959
6.955
6.976
6.972
7.744
7.739
7.899
7.882
7.924
7. 943
7.953
700
600
500
400
300
200
100
0
7.50
1.07
1.10
1.02
1.04
0.56
1.56
8.00
ppm (t1)
7.00
Espectro de RMN 1H do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) (500 MHz – MeOD) – ampliação da
região aromática.
242
Espectro de RMN 13C (HBBD) do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79) (125 MHz – MeOD).
243
Espectro de DEPT do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79)
244
Espectro de HMQC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79).
245
Espectro de HMBC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79).
246
SNGC2.146 - HMBC
100
150
ppm (t1)
8.00
7.50
7.00
6.50
ppm (t2)
Espectro de HMBC do ácido 6-metoxi-(9H-β-carbolin-1-il)-(Z)-prop-2-enóico (79).
247