UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO,
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICO DOS EXTRATOS DE
Jacaranda decurrens Cham. (Carobinha).
Cristiane Alves de Carvalho
Ribeirão Preto
2007
Cristiane Alves de Carvalho
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO,
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICO DOS EXTRATOS DE
Jacaranda decurrens Cham. (Carobinha).
Dissertação
apresentada
ao
programa de pós-graduação em
Biotecnologia da Universidade de
Ribeirão Preto – UNAERP, para
a obtenção do título de mestre
em Biotecnologia.
Orientador(a)-Profa. Dra. Ana Maria Soares Pereira.
RIBEIRÃO PRETO - SP
2007
DEDICO
A minha família, por ser meu alicerce !
Agradecimentos
A Deus por ter me proporcionado esta benção! A minha família, pelo apoio, amor e carinho! Ao
meu pai, por ter tornado possível este momento e ter me ensinado que nada é impossível quando
se tem um sonho. A minha mãe, pela dedicação e amor. Aos meus irmãos, pela atenção. Aos
amigos, pelo suporte nos momentos de solidão. A todos que contribuíram direta ou indiretamente
na concretização deste trabalho, especialmente a minha orientadora professora doutora Ana
Maria Soares Pereira e professora doutora Ana Lúcia Fachin, pelos conhecimentos passados,
pelo conforto nos momentos difíceis e pela credibilidade dada. A técnica Sarazete Pereira pela
ajuda técnica e paciência.
SUMÁRIO
1.0 Introdução
14
1.1 Plantas medicinais
14
1.2 Jacaranda decurrens Cham.
16
13 Atividade Antifúngica de Extratos vegetais.
18
1.3.1 Trichophyton rubrum mutante (∆ TruMDR2) e a múltipla resistência à
drogas
21
1.4 Atividade antioxidante dos compostos vegetais
23
1.5-Atividade citotóxica de compostos vegetais
26
2.0 Objetivo
30
2.1 Objetivo Geral
30
2.2 Objetivos específicos
30
3.0 Justificativa
31
4.0 Materiais e Métodos
31
4.1 Metodologia de coleta de acessos e produção de extratos
31
4.2.1 Preparação e análise dos extratos
31
4.3 Quantificação dos triterpenos nos extratos hidroacoolicos por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
32
4.4 Fracionamento do extrato hidroalcoólico
33
4.4.1.Fracionamento da Fração Jd-4
35
4.4.2. Purificação em CLAE da fração FR-3 – Preparativa
35
4.4.3. Identificação estrutural do Flavonóide
37
5- Avaliação da atividade antioxidante pelo DPPH
37
6.0 Metodologia de análise antifúngica: ensaio de sensibilidade aos extratoss 38
de
Jacaranda decurrens nas linhagens de dermatófitos
6.1. Linhagens de T. rubrum
38
6.2- Manutenção da linhagem de T. rubrum
39
6.3. Ensaios de sensibilidade a extratos de plantas nas
40
linhagens de dermatófitos
7.0 Manutenção das linhagens tumorais e Ensaios de citotoxicidade
41
7.1- Cultura e estoque da linhagem HeLa
41
7.2. Cultura e estoque da linhagem Melan A e B16
41
7.3- Ensaio com MTT
43
8- Resultados e Discussão
44
8.1 Produção dos extratos brutos e purificados de J.decurrens
44
8.2 Quantificação dos triterpenos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência46
(CLAE) dos extratos hidroalcoolicos de J. decurrens
8.3 Fracionamento do extrato hidroalcoólico de folhas de J. decurrens
47
51
8.4 Identificação do flavonóide ativo obtido do extrato hidroalcoólico de folhas de
J. decurrens
8.5 Avaliação da atividade antioxidante das frações Jd-1, Jd-2 e Jd-4
52
obtidas a partir do extrato hidroalcóolico das folhas de J.decurrens
8.6 Ensaios de sensibilidade a extratos vegetais de J. decurrens
55
sobre as linhagens de dermatófitos
8.7 Ensaio de atividade citotóxica de extratos de J.decurrens
61
9.0 Conclusão
66
10.0 Referências
67
Anexos
85
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Jacaranda decurrens Cham.
17
Figura 2. Fluxograma representativo do fracionamento de extratos de
34
J. decurrens e os ensaios biológicos realizados. Material vegetal
representado por Folhas, raízes e cascas de raízes
Figura 3. Fluxograma representativo do fracionamento das sub-frações de
36
extratos de J. decurrens e isolamento de substância pura
Figura 4. Cromatografia em camada delgada (CCDC) do extrato
48
hidroalcoólico de folhas de J. decurrens 1: fração Jd-1-, 2: fração Jd-2 ,3:
fração Jd-3 , 4: fração Jd-4.
Figura 5. Cromatogramas mostrando o perfil químico de triterpenos à 210 nm, dos
padrões (A), extrato bruto (B) e frações Jd-1 (C), Jd-2 (D) e Jd-4 (E).
Figura 6. Cromatogramas mostrando o perfil químico de flavonóides à 330 nm do 50
extrato bruto (A) e das frações Jd-1 (B), Jd-2 (C) e Jd-4 (D).
Figura 7. Estrutura proposta para o flavonóide isolado do extrato hidroalcoólico
de folha de J. decurrens
52
Figura 8: Porcentagem de sobrevivência da linhagem tumoral HeLa
62
cultivada em meio de cultura suplementado com frações (Jd-1 (F-1), Jd-2
(F-2) e Jd-4 (F-4) ) e extrato bruto (Eb) de Jacaranda decurrens
Figura 9: Porcentagem de sobrevivência da linhagem tumoral B16
63
cultivada em meio de cultura suplementado com frações (Jd-1 (F-1), Jd-2
(F-2) e Jd-4 (F-4)), extrato bruto (Eb) e o flavonóide isolado de folhas
de Jacaranda decurrens
Figura 10: Porcentagem de sobrevivência da linhagem não tumoral
Melan A cultivada em meio de cultura suplementado com frações
(Jd-1 (F-1), Jd-2 (F-2) e Jd-4 (F-4)), extrato bruto (Eb) e o flavonóide
isolado de folhas de Jacaranda decurrens
64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados da produção dos extratos brutos de Jacaranda decurrens
45
Tabela 2: Concentração dos ácidos ursólico e oleanólico nos
47
extratos hidroalcoólicos de J. decurrens
Tabela 3. Atividade antioxidante (em %) de extrato e frações de Jacaranda 53
decurrens
Tabela 4. Concentração inibitória mínima (CIM) em µg/mL dos extratos
hexânico e diclorometano de J.decurrens sobre as linhagens de T.rubrum
56
Tabela 5. Concentração inibitória mínima (CIM) de frações produzidas a partir do
57
extrato hidroalcoolicos de J.decurrens, frente as linhagens de T.rubrum.
Tabela 6. Concentração inibitória mínima (CIM) em (µg /mL )das frações Fr-1 a Fr-10 frente57
linhagem H6 de T.rubrum produzidas a partir do fracionamento da fração Jd-4
Tabela 7. Concentração inibitória mínima (CIM) do flavonóide isolado a partir do
extrato hidroalcoolicos de J.decurrens, e dos controles de referência frente às
linhagens de T.rubrum..
58
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
MDR: Multiple Drug Resistece
MTT: 4,5 dimetilazol- 2yl)- 2-5- difenil- 2H tetrazolato de bromo
ATCC: American Type Culture Collection
CLAE :Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
MeOH-H2O: metanol-agua
AU: Ácido ursólico
AO: ácido oleanólico
CHCl3:MeOH: Clorofórmio metanol
DPPH :2,2-difenil-1-picrilidrazila
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards
RPMI: Roswell Park Memorial Institute.
MOPS :3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
CIM: Concentração inibitória mínima
HeLa: carcinoma de colo de útero
B 16: melanoma murino
Melan A: melanócito
SFB: soro fetal bovino
DEMEM: Dubelco’s Modified Eagle Médium
PBS: solução salina tamponada com fosfato
EDTA : EthyleneDiamineTetrAcetic acid
CCDC: Cromatografia em Camada Delgada
RESUMO
O estudo das plantas medicinais desperta grande interesse científico, principalmente devido
às mesmas serem consideradas como fontes potenciais de moléculas bioativas com
estrutura diferenciada e mecanismo de ação inovador. A importância de pesquisas voltadas
para a descoberta e produção de novos fitoterápicos deve-se a grande contribuição que estes
vêm apresentando diante de diversas patologias. A Jacaranda decurrens é uma espécie
medicinal utilizada amplamente pela população que habita o bioma cerrado e destaca-se
por apresentar alguns compostos especiais como os triterpenos (o ácido ursólico e o
oleanóico) encontrados nas folhas. O presente trabalho teve o objetivo de avaliar o
potencial antifúngico sobre o dermatófito T. rubrum, antioxidante pelo método DPPH e
citotóxico pelo método MTT de extratos e frações de Jacaranda decurren. Os resultados
evidenciaram que o extrato hidroalcoólico produzido a partir das folhas coletadas na cidade
de Altinópolis-SP quanto as frações produzidas a partir deste extrato bruto apresentaram
expressiva atividade antifúngica, antioxidante e citotóxica. O estudo em questão evidenciou
que jacaranda decurrens é uma espécie medicinal promissora para o desenvolvimento de
fitomedicamentos.
Palavras-chave: Jacaranda decurrens, antifúngico, antioxidante e citotóxico.
ABSTRACT
The study of medicinal plants arouses great scientific interest, mainly because they are
considered to be potential sources of bioactive molecules with differented structure and
innovative mechanism of action. The importance of research a aiming the discovery and
production of new phytoterapic medicines is due to the great contribution the those are
presenting in the treatment of pathologies. The Jacaranda decurrens is a medicinal species
widely used by the people who live in the biome cerrado and stands out for containing some
special coumpods like the triterpenes ursolic acid and oleanólico acid found in the leaves. The
presented work had the purpose of evaluating the antifungal potential over the dermatophyte
Trichophyton rubrum ,antioxidant by the DPPH method and cytotoxic by the MTT method, of
extracts and fractions of Jacaranda decurrens. The results showed that the hydroalcoholic
extract produced from this raw extract presented remarkable antifungic, antioxidant and
cytotoxic activity. This study made evidence that the J. decurrens is a promising medicinal
species for the development of phytotherapic medicines.
Keywords: Jacaranda decurrens, antifungal and cytotoxic.
1. INTRODUÇÃO
1.1-
Plantas medicinais
Plantas medicinais são fontes potenciais de moléculas bioativas com estrutura
diferenciada e mecanismo de ação inovador, característica que tem motivado a indústria
farmacêutica a direcionar pesquisas com intuito de desenvolver medicamentos fitoteráticos
(ELISABETSKY, 2004). Em geral a produção destas moléculas bioativas, pelas plantas, ocorre
como mecanismo de defesa contra insetos, patógenos, microorganismos ou sob ação de alguma
fonte de estresse (PONTEZAN et al., 2004).
Estima-se que o mercado mundial de fitoterápicos gire em torno de 22 bilhões de
dólares, com crescimento acontecendo de forma gradativa e com maior destaque em países
desenvolvidos (PHILIPSON, 1999; YUNES, 2001). No Brasil, o consumo de fitoterápicos ainda
não despontou como deveria, o que pode ser comprovado por algumas pesquisas, que indicam a
sua posição atrás de países menos desenvolvidos tecnologicamente (YUNES, 2001). Esta
realidade está associada a alguns entraves, como a falta de uma política que incentive o
desenvolvimento da indústria fitofarmacêutica (YUNES, 2001) e a ausência de controle de
qualidade na preparação dos extratos vegetais, a exemplo dos Estados Unidos e dos paises
Europeus, que investem em tecnologia para assegurar a qualidade dos produtos obtidos das
plantas (VEIGA et al., 2005; AZIZ et al., 2004). Entretanto, apesar dos obstáculos supracitados,
no Brasil pesquisas nas áreas da toxicologia e farmacologia envolvendo produtos naturais e
fitoterápico têm assegurado maior credibilidade quanto ao uso e validação dos mesmos
(YUNES, 2001).
A posição de pouco destaque do Brasil na produção de fitoterápicos é contraditória e
contrasta com a extensa diversidade vegetal que o país detém, estimada em 20% do número de
espécies do planeta (CALIXTO, 2005). A flora mundial conhecida gira em torno de 264 mil a
279 mil espécies (PEIXOTO et al., 1999). Todavia, apenas 15 a 17% destas espécies foram
estudadas (SOERJATO et al., 1996). A produção cientifica brasileira com material biológico
vegetal é pouco expressiva, cerca de 0,7% de todas as publicações internacionais nos últimos dez
anos (PALMA, 2000).
A importância de pesquisas voltadas à descoberta e produção de novos fitoterápicos
deve-se ao intenso uso de vários medicamentos derivados de plantas e ao custo elevado do
desenvolvimento de drogas sintéticas, que atualmente ultrapassa
500 milhões de dólares
(CALIXTO, 2003). Aproximadamente um terço dos medicamentos mais prescritos e vendidos
no mundo foram desenvolvidos a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2005). O potencial
terapêutico de muitas espécies de plantas medicinais compreende uma extensa variedade de
aplicações, que pode relacionar-se com patologias de fácil manejo, até complicações mais
severas como aquelas decorrentes da infecção provocada pelo vírus HIV (NASER et al., 2005,
ZHU et al., 1999). Além disso, vários estudos também demonstram a atividade preventiva das
plantas medicinais em relação a diversas enfermidades, incluindo o tratamento de processos
carcinogênicos (ASSIMOPOULOU et al., 2005; KHAN et al., 2005). Dezenas de classes de
substâncias têm sido apontadas como responsáveis por esses efeitos, sendo os alcalóides e os
compostos fenólicos os exemplos importantes (NAM et al, 2005; PERONA et al, 2005;
ASSIMOPOULOU, 2005).
Apesar do grande potencial terapêutico das espécies vegetais, centenas delas têm sido
dizimadas anualmente, sem antes terem sido estudadas do ponto de vista químico e
farmacológico. Jacaranda decurrens é uma espécie vulnerável a extinção devido à coleta
indiscriminada e a devastação do seu habitat natural, o Cerrado. A investigação de possíveis
atividades biológicas do extrato de J. decurrens corroborará com a conservação da espécie,
processo já iniciado por um projeto temático-Biota (99/10610-1) denominado “Monitoramento e
ampliação do banco de germoplasma de plantas medicinais do Cerrado”, desenvolvido por
equipe de pesquisadores da Unidade de Biotecnologia (UNAERP) .
1.2-
Jacaranda decurrens Cham.
É conhecida como carobinha, caracteriza-se por ter poucos ramos, podendo atingir
até trinta centímetro de altura, sendo considerada a única espécie anã do gênero Jacaranda .
Apresenta raiz lenhosa e bastante grossa, caule coberto de pêlos finos quando jovem, perdendoos após maturidade. Seus ramos são verdes ou acinzentados e suas folhas têm aspecto
¨paribipinatifidas ¨, com 6 a 9 rugas ou mais, e com folíolos decorrentes, estreitos e sem pêlos na
parte superior e pilosos na inferior. Suas flores são grandes, pentâmeras com colorações variando
em tons azulados e roxos. Os frutos são octaráceos e possuem uma cápsula suborbicular, com
ápice reto e base fina, atingindo cerca de 9 centímetros de comprimento e 7 de largura. As
sementes são elípticas, irregularmente ¨crenuladas¨ e com dilatações (CÔRREA, 1984).
Figura 1. Jacaranda decurrens Cham.
A classificação taxonômica hierárquica da J. decurrens é:
Filo: Plantae
Divisão: Magnoliophyda
Classe: Magnoliopsida
Ordem: Tubiflorae
Família: Bignoniaceae
Gênero: Jacaranda
Espécie: Jacaranda decurrens
A distribuição geográfica de Jacaranda decurrens é ampla, ocorre nos estados de Goiás,
Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e São Paulo e segundo FARIAS & PROENÇA
(2003) no Estado do Mato Grosso do Sul, no município de Dourados, é encontrada a subespécie
J. decurrens ssp. symmetrifoliolata.
A raiz de J. decurrens, imersa em aguardente, é amplamente utilizada pela população
como depurativo do sangue e também recomendada para o tratamento das afecções cutâneas,
úlceras externas, entre outros (RODRIGUES & CARVALHO, 2001). É uma espécie endêmica
do Cerrado, o segundo maior bioma do Brasil (MACHADO & WALTER, 1995; VARANDA et
al., 1992).
Levantamento etnofarmacológico realizado, no século XIX, em tribos indígenas do Brasil
mostrou que várias espécies de Jacaranda, inclusive a J. decurrens eram utilizadas no combate a
impinges (CASTRO, 1878).
O extrato hidroalcoólico de folhas contém os triterpenos ácidos ursólico e o
oleanólico (VARANDA et al., 1992), ambos apresentam propriedades farmacológicas
importantes como: ação antimicrobiana, antivirais, hepatoprotetora, imunorreguladora e
inibitória de células cancerígenas humanas (HSU et al., 2004; CÁRDENAS et al., 2004; MA et
al., 2005; ZAPRUTKO et al., 2004).
1.3- Atividade Antifúngica de Extratos vegetais.
Os fungos são microrganismos de organização simples que podem ser encontrados como
mutualistas, comensais ou parasitos, provocando este último, prejuízo ao hospedeiro. No
homem, os fungos podem desempenhar o papel de parasitos obrigatórios, facultativos ou
ocasionais e, conforme seu poder invasor e virulência, determinam processos mórbidos de
intensidade e gravidade variáveis (MORAES et al., 2000).
As infeções fúngicas são conhecidas como micoses e elas são classificadas de acordo
com a localização dos tecidos acometidos. As micoses cutâneas, também denominadas de
dermatofitoses, são causadas por fungos que infectam o tecido queratinizado superficial, como
pele, unhas e cabelos e degradam a queratina presente nestes locais (TORTORA et al., 2002;
MURRAY et al., 1998; BROOKS et al., 1998).
As dermatofitoses são as patologias dermatológicas mais freqüentes em todo o mundo,
sendo considerada a “doença da civilização”, devido às mudanças de hábitos de vida que
favorecem a sua disseminação em grandes aglomerados (MÜGGE et al., 2006).
Atualmente, o tratamento das dermatofitoses é baseado no uso de medicamentos
antifúngicos tópicos e sistêmicos (HAMDAM e SANTOS; 2005). Fármacos como terbinafina,
cetaconazol e griseofulvina são comumente usados na terapia antifúngica, entretanto, há relatos
de resistência de vários dermatófitos a estas substâncias (HASIMOTO et al; 2004). Além disso,
a maioria das drogas empregada na terapia antifúngica, de administração sistêmica, provocam
efeitos colaterais em pacientes ocasionando distúrbios gastrintestinais, reações cutâneas,
leucopenia e hepatotoxidade. As complicações menos lesivas ao paciente desaparecem após a
interrupção do tratamento, entretanto, as mais graves provocam lesões hepáticas que em geral
são irreversíveis (SOARES e CURY; 2001; SONG e DERESINSKI; 2005; PERVEZE et al;
2007).
As internações relacionadas às enfermidades iatrogênicas devido a medicamentos
antifúngicos têm motivado a indústria de medicamentos a buscar novas substâncias com
potencial farmacológico sobre microorganismos patogênicos ao homem, e nesse sentido tem
crescido o número de pesquisas com produtos naturais, extratos vegetais e substâncias puras
isoladas de planta com atividade antimicrobiana, especialmente contra fungos (DUARTE et al..,
2005; PORTILLO et al., 2001; SARTORATTO et al., 2004; ALVES et al., 2005).
Levantamento etnofarmacológico relacionados com espécies vegetais utilizadas em
tratamento de enfermidades relacionadas às infecções fúngicas são amplos e os estudos
farmacológicos que comprovem essas atividades são reduzidos. FENNER et al (2006) relacionou
409 espécies, distribuídas em 98 famílias, com indicações populares de ação anti fúngicas,
entretanto, a grande maioria dessas espécies não foi avaliada cientificamente.
Vários trabalhos realizados com extratos vegetais como Ziziphus joazeiro,
Caesalpinea pyramidalis, Thymus pulegioides Celastrus paniculatus, Eriodendron
anfractuosum, Ficus glomerata, Azardirachta indica, Scutellaria baicalensis Baccharis
grisebachii e Oxalis. erythrorhiza mostraram atividade antifúngica sobre linhagens de
dermatófitos, (MUSCHIETTI et al., 2005; BOER, 2005; CRUZ et al., 2007; PINTO et al.,
2006; VONSHAK et al., 2003; NATAJAJAN et al., 2002; YANG, 2000; FERESIN et al.,
2001). Além disso, produtos naturais como a própolis também têm se mostrado
promissores como fungicida contra T. rubrum e T. mentagrophytes. A suscetibilidade
destes fungos ao extrato de própolis foi semelhante aos fármacos prescritos para o
tratamento das dermatofitoses, como itraconazol e terbinafina (KOC et al., 2005).
Considerando os estudos mencionados anteriormente constata-se que o potencial
antimicrobiano das substâncias extraídas ou derivadas de espécies vegetais é relevante e deve ser
intensivamente investigado, para que no futuro novas drogas mais eficazes e menos tóxicas
possam compor um arsenal terapêutico de medicamentos anti-fúngicos mais seguros.
1.3.1-Trichophyton rubrum mutante (∆ TruMDR2) e a múltipla resistência à drogas
Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso que em geral causa infecções
superficiais em pele e unhas humanas. É um organismo reconhecidamente cosmopolita e entre os
dermatófitos, é o mais freqüente, representando cerca de 70 % de todas as infecções (FACHIN et
al., 1996; ANSTEY et al., 1996; COLOE & BAIRD, 1999; SENTAMIL et al, 1999; COSTA et
al., 1999; SCHER, 1999; SANTOS, 2005). Entretanto, este dermatófito vem causando infecções
em regiões não usuais do corpo, como região glútea e peniana (GROSMAN et al., 1995;
SENTAMENVI et al., 1998; HSU, 1999; SENTAMIL et al., 1999; PILEOP & ROSEN, 2001).
Além disso, há relatos da invasão do T. rubrum em tecidos mais profundos, como descrito por
SMITH et al (2001), onde foram observadas a colonização deste fungo em tecido dérmico e sua
disseminação sistêmica em três pacientes imunodeprimidos.
Apesar da importância clínica de T. rubrum, muito pouco é conhecido sobre sua
biologia, devido principalmente ao fato deste patógeno não apresentar ciclos sexual e
parassexual descritos, o que dificulta o seu estudo do ponto de vista genético. Desta forma, genes
clonados em organismos modelos como S. cerevisae, Neurospora crassa e A. nidulans são
geralmente usados para identificar e isolar genes cognatos em fungos de interesse clínico, com
base na conservação de seqüência e/ou função (AGNAM et Al., 1997). FACHIN et al., 1996
descreveram a obtenção in vitro de um mutante de T. rubrum (gri1) por irradiação ultravioleta
que apresentou hiper-resistência à griseofulvina e ao tioconazol.
A dupla resistência deste mutante poderia ser explicada pela possível existência de
um mecanismo de múltipla-resistência a drogas em T. rubrum. O fenômeno de múltiplaresistência ocorre em células de mamíferos quando expostas a um único agente tóxico, que
passam a apresentar resistência a uma ampla variedade de drogas quimicamente e
funcionalmente não relacionadas. O desenvolvimento do fenótipo MDR está associado com a
super-expressão de uma glicoproteína de membrana que atua como uma bomba de efluxo de
droga dependente de ATP que transporta uma ampla variedade de drogas aparentemente não
relacionadas. Como a griseofulvina atua nos microtúbulos (GULL & TRINCI, 1973) e o
tioconazol, como os outros azoles, atuam na inibição da biossíntese do ergosterol (GUPTA et al.,
1994) estas duas drogas atuam diferentemente na célula do fungo e podem, portanto, ser
substratos para MDR.
FACHIN et al (2006) clonaram e sequenciaram o gene TruMDR2 que codifica um
transportador do tipo ABC. A análise por Northern blot demonstrou um aumento no nível de
transcrição do gene TruMDR2 quando o micélio foi exposto à acriflavina, benomil, brometo de
etídio, cetoconazol, cloranfenicol, griseofulvina, fluconazol, imazalil, itraconazol, metotrexato,
tioconazol
e
4-nitroquinoline-N-oxide (4NQO). A ruptura gênica do gene TruMDR2
demonstrou que o mutante tornou-se mais sensível a terbinafina, 4NQO e ao brometo de etídio,
sugerindo que este transportador desempenha uma função na modulação de susceptibilidade á
drogas em T. rubrum. Tal mutante (∆ TruMDR2) tornou-se um importante modelo de estudo
para o estudo de resistência a drogas in vitro, o que pode auxiliar no desenvolvimento de um
fitoterápico que possa ser eficaz quando a terapia usual não for efetiva devido à múltipla
resistência.
1.4-Atividade antioxidante dos compostos vegetais
Os antioxidantes são definidos como qualquer substância, que em condições normais,
possuem uma afinidade maior que qualquer outra molécula para realizar interações com os
radicais livres (BACALLAO et al., 2001). O sistema antioxidante consiste de uma rede de
antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. Dentre os enzimáticos, encontram-se a glutationa
peroxidase, catalase e superóxido dismutase (SOD). Entre os não enzimáticos, pode-se citar o
alfa tocoferol, ubiquiona, beta-caroteno, ascorbato e glutationa (BOKOV et al., 2004; PICARDO
& BRIGANTI, 2003).
Os radicais livres constituem espécies químicas que contém um elétron desemparelhado
na sua última órbita, o que os tornam altamente reativos e são formados em grande parte durante
o metabolismo mitocondrial (SOARES, 2002; BIESALSKI, 2002). Aproximadamente 0,4% a
4% de todo O2 metabolizado pela mitocôndria é convertido em radicais livres.
Conseqüentemente maiores danos são observados nesta organela (GOLDEN et al., 2002). Os
radicais livres são representados em maior parte pelo oxigênio simples (O2), radical superóxido
(O2 -), peróxido de hidrogênio (H2O2) e pelo radical hidroxil (OH) (YAMAMOTO., 2001 e
GUIRRO & GUIRRO., 2004). Embora uma pequena quantidade de radicais livres seja
necessária para a manutenção da vida, sua produção excessiva, maior que a sua velocidade de
remoção, pode conduzir a diversas formas de dano celular (SHAMI et al., 2004).
Alguns agentes promotores internos ou externos podem influenciar na geração destas
moléculas que quando em desequilíbrio, atuam como agentes tóxicos celulares provocando ação
de oxido-redução para capturar o elétron de outros componentes químicos. Este mecanismo
provoca uma reação em cadeia, capaz de gerar mais radicais livres com potencial para infligir
mais danos oxidativos em membranas celulares, moléculas de DNA, proteínas entre outros
compostos biológicos (WICKENS, 2001; GUIRRO & GUIRRO, 2004; HARMAN, 1981).
Os efeitos tóxicos relacionados ao oxigênio já são conhecidos desde o final do século
XIX. Entretanto, a identificação dos radicais livres causadores desta toxicidade foi somente
possível há cerca de 50 anos, quando Denham Harmam lançou a teoria sobre o envolvimento
destes radicais livresem processos de mutagênese, câncer e envelhecimento celular
(BIESALSKI, 2002; HARMAN, 1981).
Como a produção dos radicais livres é um processo contínuo, o organismo dispõe de
mecanismos protetores antioxidantes que detoxificam esses radicais potencialmente prejudiciais,
promovendo assim a homeostase no organismo (GUIRRO & GUIRRO, 2004).
Substâncias antioxidantes também funcionam como inibidores da promoção, propagação
e transformação de estágios tumorais. Elas atuam como potentes sequestradores de radicais livres
e servem como inibidores de processos neoplásicos desde que o stress oxidativo esteja
intimamente associado à promoção do tumor (MACKEEN et al., 2000). Este mecanismo é
favorecido porque a molécula de DNA é altamente susceptível ao ataque dos radicais livres e a
interação destes pode causar danos à estrutura desta molécula com potencial para produzir um
evento prejudicial ou letal (PICARDO & BRIGANTI., 2003).
Vários trabalhos têm mostrado que o stress oxidativo é responsável pela causa de doenças
degenerativa, neurodegenerativas e processo de envelhecimento (FERREIRA & MATSUBARA,
1997; WLASCHECHEK et al., 2001; WEISHAUPT et al., 2006). Atualmente as substâncias mais
utilizadas no combate ao stress oxidativo são os antioxidantes naturais, como α-tocoferol, βcaroteno e compostos fenólicos presentes em plantas (HALLIWEL, 2005; DROGE, 2002;
MENDEL & YOUDIM., 2004; CASAGRANDE et al., 2006; CARINI et al., 2002). A finalidade
principal destes compostos é reduzir a concentração excessiva dos radicais livres, devido
interação com essas moléculas, prevenindo conseqüentemente o dano celular (FLORA, 2007).
A atividade antioxidante de compostos derivados de plantas medicinais têm sido
comprovada em centenas de espécies vegetais, alguns exemplos importantes são: Hypericum sp,
Melothria heterophylla, Pothomorphe umbellat e Camellia sinensi (COULADIS et al., 2002;
WANG et al., 2006; CHO et al., 2006; CALABRESE et al., 1999; ROPKE et al., 2006;
HIGDON & FREI., 2003).
Entre as substâncias derivadas de plantas medicinais que expressam maior poder
antioxidante, os compostos fenólicos representam a maior classe retentora desta capacidade e
entre eles, os flavonóides são talvez, as substâncias mais importantes (MOON et al., 2006). Os
flavonóides têm sido referidos recentemente como substâncias quimioprotetoras eficazes para o
tratamento de diversos tipos de patologias de origem degenerativa. MILTERSTEINER et al
(2003) avaliaram a atividade da quercetina, importante flavonóide, em casos de fibrose em
modelos animais de cirrose biliar secundária à ligadura do ducto biliar, de cirrose por álcool ou
por administração de tetracloreto de carbono (CCl4), todas relacionadas ao acúmulo de espécies
reativas de oxigênio. O estudo in vitro pode observar que a administração de quercetina em ratos,
cujo estado clínico indicava obstrução do ducto biliar provocou melhora tanto nos testes
laboratoriais quanto no estudo histológico do fígado desses animais.
Segundo SOARES et al (2005), a atividade antioxidante de certos flavonóides, como a
hesperidina, naringina, naringenina, quercetina, rutina e sakuranetina, foi comprovada durante a
avaliação do stress oxitativo sobre células eucarióticas de leveduras de Saccharomyces
cerevisiae. Esses autores demonstraram que a capacidade antioxidante dos flavonóides foi
superior à apresentada pelo ácido L-ascórbico e vitamina E em células eucarióticas da levedura
S. cerevisiae tratadas com a pomorfina.
Além da atividade antioxidante dos compostos fenólicos, os triterpenos também podem
atuar como agentes seqüestradores dos radicais livres, inserindo-se nessa classe, compostos
como o ácido úrsólico e oleanólico. Esta atividade foi comprovada em extrato acetato de etil,
produzido a partir de folhas de Olea europaea, cuja análise fitoquímica comprovou elevada
concentração dos acidos ursólico e oleanólico, (SOMOVA et al., 2002). O potencial antioxidante
desse triterpenos foi confirmado através do efeito protetor sobre a molécula de DNA quando esta
foi induzida à ação de H2O2 (OVESNA et al., 2006) e também em estudo in vivo utilizando ratos
wistar como modelo experimental, os quais foram submetidos a dieta enriquecida como os
triterpenos
em conjunto com um agente oxidante; os animais que receberam essa dieta
mantiveram a peroxidação lipídica em níveis normais (SENTHIL et al., 2006).
1.5-Atividade citotóxica de compostos vegetais
Os ensaios citotóxicos baseiam-se em testes de rotina quando se pretende selecionar
novas drogas com atividade anticâncer. Através destes ensaios, pode-se verificar a capacidade da
nova droga em lesar células tumorais e principalmente como ela se comporta sobre as linhagens
normais, devendo sobre estas últimas, não ter atividade tóxica ou em menor proporção
(UGARTONDO et al., 2006). A atividade citotóxica pode ser avaliada por diversas
metodologias, entre elas encontra-se o método colorimétrico MTT, que avalia a viabilidade
celular através do dano induzido no metabolismo da célula (MACIEL et al., 2001). A utilização
de ensaios citotóxicos é fundamental para seleção de novas drogas, principalmente antitumorais,
visto o numero crescente de processos neoplasicos entre a população mundial.
Segundo GOLDMAN et al. (2001), “ O câncer descreve uma classe de doenças
caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células aberrantes¨. A formação destas células
ocorre após uma transformação genética maligna que converte uma célula normal em outra com
característica destrutiva, que se reproduz sem o mecanismo de feedback celular, responsável pelo
controle ou inibição do processo de divisão das células (BOYER, 2000; GOLDMAN et al.,
2001). Além disso, o crescimento das células neoplásicas compete com as células e tecidos
normais quanto ao suprimento de energia e substrato nutricional podendo ainda disseminar-se
para locais distantes através do sangue, linfa ou superfícies serosas (COTRAN, 2000;
GOLDMAN et al., 2001).
Estima-se que o câncer atinja a cada ano mais de um milhão de indivíduos nos
Estados Unidos, sendo responsável por 23% de causa de morte neste país (COTRAN, 2000). No
Brasil, num estudo realizado pelo Instituto Nacional do Câncer em 2001, mostrou que esta
patologia representa, na maioria dos estados, a segunda causa de morte, ficando abaixo apenas
das moléstias cardiovasculares. Estima-se que no meio do século 21 o câncer já seja a principal
causa de morte no Brasil.
Os motivos que levam ao crescimento da incidência do câncer são o aumento da
expectativa de vida da população em geral, associada a maior exposição a fatores de risco
(SAMANO et al., 2005; COLLECCHI et al., 1998).
Diversos fatores podem funcionar como promotores para a transformação de uma
célula normal em maligna que podem ser de natureza externa, como carcinogênicos químicos,
radioativos, por ação dos raios ultravioletas, ou de origem interna como: os fatores genéticos,
agentes virais ou por algum distúrbio na imunocompetência do organismo (PRADO et al., 2003).
Entre os agentes desencadeadores das neoplasias, os radicais livres têm sido considerados
elementos importantes no desenvolvimento da fisiopatologia desta enfermidade. Os radicais
livres, produzidos por diversos mecanismos, como, por exemplo, por hábitos inadequados como
o fumo ou mesmo pela atuação dos raios ultravioletas na pele, são capazes de lesar o DNA
mitocondrial, provocando alteração em suas bases ou até mesmo quebra da molécula, sendo
fontes potenciais para mutação celular (LEITE et al., 2005; JUNIOR, 2005).
Com relação ao tratamento das neoplasias, o sucesso da obtenção do melhor
resultado depende tanto da avaliação física acurada e da prescrição adequada de medicamentos
quanto da boa orientação ao paciente (BOYER, 2000). Diversos recursos podem ser empregados
com o objetivo da erradicação das células tumorais. Entre eles, pode-se apontar o tratamento
cirúrgico que é o recurso mais antigo contra o câncer (ABBATUCCI, 1987 ); a quimioterapia, a
radioterapia e a imunoterapia (BOYER, 2000).
Os extratos produzidos de plantas têm sido amplamente estudados devido à atividade
quimiopreventiva, imunoregulatória e quimioterápica (DIWANAY et al., 2004). O Taxol está
inserido nesta última categoria por agir clinicamente como um importante agente antitumoral
(GANESH et al., 2004). Seu efeito terapêutico se deve a habilidade em reunir a tubulina dentro
dos microtúbulos, bloqueando a mitose celular (BAJER et al., 1982). Recentemente têm-se
descoberto outras drogas de origem vegetal com o mecanismo de ação similar ao taxol. Entre
elas estão a epilona e a discodermolida, a noscapina, alcalóide derivado do ópium, também tem
sido estudada como inibidor da divisão celular, possuindo mecanismo semelhante ao da
colchicina, além de promover a apoptose celular (GANESH et al., 2004; YE et al., 1998).
Os ácidos ursólico e oleanóico também são substâncias com ação antitumoral
(CARDENAS et al., 2004). Testes citótoxicos utilizando estes compostos isolados de extratos de
Origanum dictamnus comprovam esta atividade sobre células leucêmicas murinas (P388) e sobre
carcinoma bronquial epidermóide (NSCLC- N6) (CHINOU et al., 2007). Linhagens tumorais
obtidas de carcinoma de colo de útero (HeLa), cancer gástrico (BGC- 823) e de hepatoma
humano (7402) foram susceptíveis ao ácido ursólico e sues derivados (MA, 2005). Estes
compostos atuam também inibindo a produção do óxido nítrico, radical livre responsável pela
destruição de tecidos normais, assim como pelo bloqueio da progressão do ciclo celular na fase
G1, além de provocarem apoptose, resultando na fragmentação do DNA da célula cancerígena
(MA; 2004). Outra propriedade bastante relevante de ambos se deve pela inibição da
angiogênese patológica que ocorre diante do processo neoplásico. Este processo é favorecido
pela repressão da migração e invasão de células endoteliais, resultando na inibição da formação
do tubo capilar (CARDENAS et al; 2004).
Os compostos fenólicos, particularmente flavonóides como quercetina e tiliroside,
desempenham importante papel nos ensaios citotóxicos como mostra estudo realizado com
dezesseis plantas medicinais sobre linhagens tumorais de câncer de próstata (PC-3), câncer de
fígado (HepG2) e adenocarcinoma de colon retal (Colon 205) (RAO et al., 2007). Estudos
recentes comprovaram a habilidade dos flavonóides oriundos de extratos de Scutellaria
baicalensis em deter o ciclo celular de linhagens tumorais resistentes a várias drogas
quimioterapias (SCHECK et al., 2006). Os efeitos anticancerígenos de certos tipos de
flavonóides foram demonstrados em várias linhagens de células neoplásicas oriundas de tecidos
mamários, hepáticos, pancreático, estomacal e epitelial (SILBERBERG et al., 2006).
A indústria farmacêutica já desenvolveu diversos quimioterápicos a partir de substâncias
isoladas de plantas como a vinblastina (Velban) e vincristina (Oncovin) de Catharanthus
roseus, o etoposídeo (Vepeside) e teniposídeo (Vumon) derivados semisintéticos de
Podophyllum peltatum (L), taxol (Plaxitaxel) extraído de Taxus brevifolia, topotecan
semisintetico derivado de Camptotheca acuminata e homoharringtonina de Cephalolaxus
harringtonia entre outros, confirmando que espécies vegetais são importantes fontes potenciais
para o descobrimento de novas drogas anti-câncer (CRAGG et al., 1993; BOYOD & PAUL,
1995; NEWMAN et al., 2003 ).
2 . OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o potencial antifúngico, antioxidante e citotóxico de extratos de J.decurrrens
2.2 Objetivos específicos:
•
Avaliar a atividade antifúngica de extrato bruto de J.decurrrens sobre o isolado clínico
ATCC MYA-3108 (selvagem) e uma linhagem mutante com o gene TruMDR2 deletado.
•
Avaliar a atividade citotóxica do extrato bruto de J.decurrrens sobre linhagem celular de
melanoma murino, melan A e HeLa.
•
Fracionar, por técnicas cromatográficas, os extratos brutos de J.decurrrens e avaliar o
potencial antioxidante, antifúngico e citotóxico das frações e compostos puros obtidos.
•
Correlacionar
compostos
químicos
responsáveis
pelas
atividades
antifúngica,
antioxidante e citotóxica.
3 - JUSTIFICATIVA
O Brasil, país da megabiodiversidade, detém em seu território um patrimônio inestimável
de recursos genéticos, entretanto, muito pouco se conhece sobre essa diversidade. Estudos de
bioprospecção de drogas a partir da flora brasileira, como os apresentados nesse trabalho, como
J. decurrens, representam possibilidades concretas de descobertas de novas drogas, para as
graves enfermidades que assolam a humanidade. Além disso, no futuro, podem ser aproveitados
pela industria nacional de medicamentos fitoterápicos que ainda no momento é incipiente no
país.
4 . MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- Metodologia de coleta de acessos e produção de extratos.
Folhas, raízes e entrecascas de raízes de J. decurrens foram coletadas em outubro de
2005 no Estado São Paulo, no município de Altinópolis, no Estados de Mato Grosso do Sul, no
município de Dourados (J. decurrens symentrifoliata). Estes materiais foram secos em estufa
com ar circulante a 50°C, por 48 h, moídos em moinho de facas até a pulverização de 40 mesh.
4.2.1- Preparação e análise dos extratos.
Os extratos de partes aéreas e sistema radicular foram produzidos com solventes
hexânico, hidroalcoólico e diclorometano. Após 15 dias de maceração estática, foi realizada a
primeira filtração. Sobre o resíduo foi adicionado novamente a mesma quantidade de solvente
para uma segunda extração. Após 30 dias de maceração, o solvente dos extratos hexânico e
diclorometano foram totalmente rotaevaporados e os resíduos levados a capela de secagem, onde
permaneceram por um período de uma semana até a obtenção do extrato seco. O extrato
hidroalcoólico foi rotaevaporado até a retirada total do etanol e posteriormente liofilisado no
liofilizador Flexi-Dry para obtenção do extrato seco. Os rotaevaporadores utilizados foram da
marca Tecnal-TE -058. Os extratos brutos final foram acondicionados em recipientes
previamente pesados em balança analítica de pressão (SCINTECH AS 210, 210 x 0,001g), os
rendimentos dos extratos são mostrados na Tabela 1.
Os extratos hidroalcoólicos foram analisados através de CLAE (Cromatografia Liquida
de Alta Eficiência), para a quantificação dos triterpenos presentes. Este trabalho foi realizado em
colaboração com a Profa. Dra Miriam V. Lourenço.
4.3 - Quantificação dos triterpenos nos extratos hidroalcoolicos por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
Análises por CLAE foram feitas usando como fase móvel MeOH-H2O (ácido acético
0.1%) 85:15, a um fluxo de 1.0 mL/min. As análises foram monitoradas a 210 nm, sendo injetado
um volume de 20 µL de cada amostra em triplicata.
A quantificação dos triterpenos foi realizada através do método de padronização externa
utilizando curvas de calibração obtidas com a injeção de diferentes concentrações dos ácidos
ursólico e oleanólico (0,1-1,0 mg/ mL).
As soluções padrões foram pesadas, em balança analítica, exatamente 10 mg de cada
padrão dos ácidos ursólico (AU) e oleanólico (AO) e foram dissolvidos, separadamente, em 10
mL MeOH grau (CLAE). Foram feitas diluições da solução estoque de forma a obter soluções
nas seguintes concentrações: 0,5; 0,25; 0,125; 0,062 mg/mL. Para o traçado da curva de
calibração as injeções foram realizadas em triplicata.
A quantificação dos triterpenos foi realizada a partir dos extratos hidroalcoólicos,
produzidos a partir das raízes, cascas das raízes e folhas de Jacaranda decurrens coletadas no
município de Altinópolis-SP (J. decurrens - Jd ) e Dourados – MS (J. decurrens ssp.
symmetrifoliolata - Jds). As soluções foram preparadas a partir de 50 mg de cada extrato seco e
posteriormente diluídas em 1mL as soluções foram filtradas em filtros de 0,46 µm e em seguida
injetadas no CLAE. As análises foram realizadas em triplicada.
4.4- Fracionamento do extrato hidroalcoólico.
Cinco gramas do extrato hidroalcoólico/ folha/ Altinópolis foram fracionados em coluna
cromatográfica com sephadex (LH-20) e fase móvel utilizada foi o MeOH. As frações coletadas
contendo 5 mL, após análise por CCDC (cromatografia em camada delgada comparativa) foram
reunidas a partir da semelhança apresentada quando os compostos secundários. Para as análises
em CCDC foram utilizadas placas de sílica gel MACHEREY-Nagel (10x10); CHCl3:MeOH
(8:2) como fase móvel e revelador vanilina sulfúrica. Posteriormente as frações reunidas
resultando quatro novas frações: Jd-1, Jd-2, Jd-3 e Jd-4 (Figura 2). Devido à semelhança do
perfil químico entre as frações Jd-3 e Jd-4 elas foram reunidas e denominadas Jd-4.
As frações acima mencionadas foram analisadas por CLAE a fim de se verificar o perfil
químico das mesmas. Para isso foram utilizadas duas metodologias, sendo uma para triterpenos
e outra para flavonóides, visto que através do CCDC verificou-se a presença de flavonóides em
uma das frações. Para as análises de triterpenos utilizou-se como fase móvel MeOH:H2O (ácido
acético 0.1%) 85:15, a um fluxo de 1.0 mL/min. As análises foram monitoradas a 210 nm, sendo
injetado um volume de 20 µL de cada amostra. Quanto as análises dos flavonóides, foram usados
com fase móvel um sistema eluente em gradiente de MeOH: H2O de 10 à 66% ( 30 min) e 66 à
10% (5min) e de 10% de MeOH por 5 min, com fluxo de 1mL/min. As análises foram
monitoradas à 210, 280 e 340 nm.
Material vegetal de J. decurrens
Extrato hidroalcoólico
Extrato hexano
Extrato diclorometano
Ensaio antifúngico
Seleção dos Extratos hidroalcoolicos
Quantificação dos triterpenos dos
extratos hidroalcoolicos por CLAE
Seleção do Extrato hidroalcoolico
Folha/Altinópolis
Fracionamento do extrato hidroalcoólico
Ensaios antioxidante, antifúngico e citotóxico
Figura 2. Fluxograma representativo do fracionamento de extratos de J. decurrens e os
Fração Jd-1
Fração Jd-2
Fração Jd-4
ensaios biológicos realizados. Material vegetal representado por Folhas, raízes e cascas de raízes.
4.4.1.Fracionamento da Fração Jd-4
A fração Jd-4 (1.295 g) foi purificado em coluna cromatográfica com sephadex e as
amostras foram coletadas (5mL) em frasco tipo cubeta. Estas amostras foram analisadas em
CCDC, com o eluente CHCl3:MeOH (8:2) e foi utilizado o revelador vanilina sulfúrica. Após
análise das placas cromatográficas foi realizada a reunião das frações que resultaram em 10
novas amostras. Todas estas amostras foram encaminhadas para teste de sensibilidade com o T.
rubrum. As frações que apresentaram melhor atividade antifúngica foram novamente purificadas
em coluna cromatográfica seguindo a mesma metodologia descrita acima (Figura 3).
4.4.2. Purificação em CLAE da fração FR-3 – Preparativa
A fração FR-3 (20,8 mg) foi dissolvida em 1 mL de água. Em seguida, esta amostra foi
filtrada para análise em CLAE (Shimadzu LC 10) e purificada nas seguintes condições: coluna
de fase reversa (10 X 250 mm); fase móvel MeOH : H2O 0:100 à 75:25 gradiente linear por 80
minutos; fluxo de 2,0 mL / minuto e a detecção de 210 e 340 nm. A purificação forneceu 38
tubos com 4 mL de amostras coletadas as quais foram analisadas por CCDC e reunidas,
fornecendo quatro novas frações: Fra-1 (6,6 mg), Fra-2 (7,5 gm), Fra-3 (1,3) e Fra-4 ( 0,7). A
fração Fra-2 foi encaminhada para a determinação estrutural da substância por métodos
espectroscópicos como RMN 1H e espectrometria de massa, confrontando-se os dados obtidos
com aqueles existentes na literatura (Anexo 1).
Fracionamento da fração Jd-4
Fr-1
Fr-2
Fr-3
Fr-4
Fr-5
Fr-6
Fr-7
Fr-8
Fr-9
Fr-10
Ensaio antifúngico
Seleção e fracionamento
da fração Fr-10
por
FR-1
FR-2
FR-3
Analise da fração FR-3 por
HPLC Preparativa
Fra-1
Fra-2
Fra-3
Fra-4
Determinação estrutural
Figura 3. Fluxograma representativo do fracionamento das sub-frações de extratos de J.
decurrens e isolamento de substância pura.
4.4.3. Identificação estrutural do Flavonóide
As análises de RMN de 1H em aparelho Brucker Advance DPX-500 foram
realizadas na
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP,
Departamento de Física e Química , e a interpretação dos espectros foi realizada pela
Profa. Dra. Hosana Maria Debonsi Navickiene.
5- Avaliação da atividade antioxidante pelo DPPH:
A atividade antioxidante foi avaliada pela redução do radical DPPH (2,2-difenil-1picrilidrazila) em espectrofotômetro. O método (KOLEVA et al, 2002) é baseado na redução das
soluções alcoólicas de DPPH a 517 nanômetros (nm) na presença de um antioxidante (AH)
doador de um próton (H+) para a forma não radicalar (DPPH-H) através da reação:
DPPH• + AH DPPH-H + A•
As
medidas
de
potencial
antioxidante
foram
realizadas
através
de
leitura
espectrofotométrica sendo utilizada, como controle, uma solução de rutina (1mg/mL). O preparo
da amostra em solução metanólica foi feito em diferentes concentrações (10, 5, 2,5, 1, 0,62,
0,32). Em seguida, preparou-se uma solução estoque de DPPH a 10-4 em metanol ou 0,0004 %
sendo que esta solução de DPPH foi mantida em frasco coberto com papel alumínio e estocada à
4 ºC entre as medições. Sempre antes de começar os ensaios verificou se a solução de DPPH
encontrava-se em uma absorbância de 517nm. Em um eppendorf de plástico foi colocado 950µL
da solução metanólica de DPPH e 50uL da amostra em diferentes concentrações. Para o preparo
do branco colocou-se no lugar da amostra metanol.
Usou-se como controle positivo a rutina em uma concentração de 1mg/ml, colocando 950
µL da solução metanólica de DPPH e 50 µL da rutina. Todas as amostras, inclusive o branco e a
rutina foram incubados por 15 minutos no escuro a 30 ºC. As medidas de potencial antioxidante
foram realizadas através de leitura espectrofotométrica sendo utilizado como controle positivo
uma solução de rutina a partir de 1 mg/ml. O ensaio colorimétrico com DPPH fornece uma
variação percentual da absorbância da solução de DPPH para cada amostra a ser testada.
Posteriormente, transferiu-se as soluções dos eppendorfs para cubetas e realizou-se a leitura das
absorbâncias das amostras, controle positivo e do branco a 517 nm em um espectrofotômetro
previamente calibrado com solução metanólica PA.
6. Metodologia de análise antifúngica: ensaio de sensibilidade aos extratos de
Jacaranda decurrens nas linhagens de dermatófitos.
6.1. Linhagens de T. rubrum
O isolado clínico ATCC MYA-3108 (H6) e uma linhagem mutante ∆TruMDR2
foram utilizados neste trabalho e o cultivo foi realizado segundo os métodos previamente
descritos (FACHIN et al., 1996; 2001b).
A linhagem ATCC MYA-3108 foi isolada de um paciente do sexo masculino com
dermatofitose (tinea pedis) atendido no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (SP). Esta
linhagem foi denominada H6 e a seguir depositada no ATCC como MYA-3108 e apresenta as
seguintes características: colônia branca de aspecto cotonoso, incorpado e o reverso da colônia
não apresenta pigmentação após 15 dias de crescimento.
A linhagem ∆TruMDR2 é um transformante da linhagem H6 com o gene TruMDR2
rompido, este gene codifica um transportador do tipo ABC, envolvido na múltipla resistência à
drogas. O gene marcador da transformação é o gene de resistência à higromicina (hygBr ). A
metodologia de ruptura gênica foi descrita e comprovada por Fachin et al., (2006).
As linhagens H6 e TruMDR2 foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Nilce
Martinez-Rossi do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.
6.2- Manutenção da linhagem de T. rubrum
A preservação do isolado de T. rubrum, por período de seis meses, foi realizado em
meio ágar Sabouraud, utilizando tubos de ensaio inclinados, com adição de água estéril sobre o
fungo.
Os repiques periódicos da linhagem selvagem foi realizada em placas de Petri
contendo meio Sabouraud e a
linhagem mutante foi repicada em
meio ágar Sabouraud
acrescido de 400µg/ml de higromicina. As duas linhagens foram inoculadas nos meios descritos
acima com o auxílio de palitos de madeira estéreis e mantidas em estufa a 28°C por um período
de 15 dias.
6.3. Ensaios de sensibilidade a extratos de plantas nas linhagens de dermatófitos
Soluções estoque das linhagens foram preparadas como descrito pelo National
Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002 (NCCLS) protocolo M-38-P com pequenas
modificações para adaptar o protocolo a fim de avaliar os extratos vegetais. A formação de
conídios foi induzida pelo crescimento das linhagens em placas de meio Sabouraud a 28°C por
cerca de 15 dias. As colônias foram cobertas com aproximadamente 1 ml de solução salina
contendo 1% Tween 80 e, o material foi colhido com o auxilio de uma espátula estéril e filtrado
em lã de vidro. A mistura resultante foi transferida para um tubo estéril e ajustado numa faixa de
70 a 72 % de transmitância num comprimento de onda de 530nm no espectrofotômetro. Esta
suspensão foi diluída 1:50 em meio RPMI 1640 (LGC) tamponado com MOPS, pH 7,2 que
corresponde a duas vezes a densidade necessária para testar aproximadamente 3x 10 4 a 5x 10 4
UFC/ml.
Os testes foram realizados em placas de microdiluição contendo 96 poços, cada poço
contendo 100µL das concentrações dos extratos ou frações (2 vezes concentrado) foram
inoculados com 100µL das suspensões de conídios. O volume final de cada poço foi de 200 µL.
As concentrações variaram de 5mg a 32µg do extrato e frações de J. decurrens. O extrato vegetal
foi diluído através de diluições seriadas na qual foi adicionado previamente 100 µL de meio
RPMI nos poços. Posteriormente, sobre o primeiro poço foi colocado 100 uL da primeira
concentração do extrato vegetal e homogeneizado, em seguida foi retirado 100 µL do primeiro
posso e transferido para o segundo, depois 100 µL do segundo foi transferido para o terceiro e
assim sucessivamente, sendo que no último poço foram retirados 100 µL e descartados.
Controles de crescimento e esterilidade do meio de cultura e do extrato foram incluídos para
cada linhagem testada e os experimentos foram incubados a 28°C por sete dias. O CIM 100
corresponde a menor concentração inibitória do extrato ou fração onde não há crescimento
macroscópico do fungo, determinado no 7º dia de crescimento comparado com o crescimento do
controle. Os resultados foram obtidos de três experimentos independentes realizados em
triplicata.
7- Manutenção das linhagens tumorais e Ensaios de citotoxicidade.
Linhagens utilizadas
As linhagens tumorais de carcinoma de colo de útero HeLa, melanoma murino B-16 e a
linhagem normal melan-A foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Cláudio Miguel da Costa
Neto, do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto-SP (FMRP-USP)
7.1- Cultura e estoque da linhagem HeLa
A linhagem foi cultivada em garrafas de cultivo de 25cm2 na concentração inicial de
3x104células/cm2 em meio de cultura HAM F10 + DMEM, suplementado com soro fetal bovino
(SFB) a 15% em uma estufa a 37 °C contendo 5% de CO2 por 3 a 5 dias.
Para o subcultivo (repique), o meio de cultura foi retirado, sendo acrescentados 10ml de
solução de Hanks por 5 minutos. A solução de Hanks foi retirada e acrescentou-se a solução de
PBS e EDTA 0,01mol por 1 ou 2 minutos, as células foram tripsinizadas e em seguida, a solução
foi inativada acrescentando-se o mesmo meio de cultura.
7.2. Cultura e estoque da linhagem Melan A e B16:
A linhagem tumoral de melanoma murino B16 e a linhagem normal Melan-A foram
cultivadas em garrafas de cultivo de 25cm2 na concentração inicial de 3x104células/cm2 em meio
de cultura HAM F10 , suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 15% em uma estufa a 37 °C
contendo 5% de CO2 por 3 a 5 dias.
Para o subcultivo (repique), o meio de cultura foi retirado, sendo acrescentados 10ml de
solução de Hanks por 5 minutos. A solução de Hanks foi retirada e acrescentou-se a solução de
PBS e EDTA 0,01mol por 1 ou 2 minutos, as células foram tripsinizadas e em seguida, a solução
foi inativada acrescentando-se o mesmo meio de cultura.
Estoque das linhagens
As linhagens foram cultivadas em meio de cultura apropriado, descrito acima, por 72
horas, a seguir as células foram destacadas, transferidas para um tubo Falcon de 15mL estéril
(Corning) e centrifugadas a 2400 rpm por 1 min. O sobrenadante foi retirado a as células
ressuspendidas em 3mL de meio de cultura sem SFB.
Foram transferidos, com uma micropipeta, 600µl da suspensão das células, 200µl de SFB
e 200µl de dimetil-sulfóxido (DMSO-Acros) para um “vial” criogênico (Corning) que foi
mantido em nitrogênio líquido.
7.3- Ensaio com MTT
A proliferação das células foi determinada pelo teste MTT, baseado na redução do sal
amarelo solúvel MTT 3- (4,5 dimetilazol- 2yl)- 2-5- difenil- 2H tetrazolato de bromo) no produto
insolúvel azul de formazan pela dehidrogenase sucinica mitocondrial
A linhagem HeLa foi cultivada em meio HAM F10 + DMEM (Dulbeccos modified Eagle’s
media) suplementado com glutamina (2mM), penicilina (400 U/ml), streptomicina (50 mg/l), e
15% de soro bovino fetal em uma atmosfera contendo 5% de CO2 a 37 °C por uma semana. A
linhagem tumoral de melanoma murino B16 e a linhagem normal Melan-A foram cultivadas ,por
3 a 5 dias, em meio de cultura HAM F10 suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 15%, em
uma estufa a 37 °C contendo 5% de CO2.
O cultivo foi realizado até que as linhagens atingiram 90% de confluência, sendo então
foram subcultivadas em placas de 48 poços (1x104 células / poço), por 24h a 37°C no meio de
cultura apropriado sem antibiótico.
As células foram incubadas por 24h a 37 °C com várias concentrações do extrato bruto e
frações previamente dissolvidas em DMSO a 10 %. Posteriormente, 100 µL de solução do MTT
(5 mg/mL) foram adicionados e novamente as células foram encubadas por um período de três
horas. Ao término deste período, as células foram lavadas duas vezes com PBS e, adicionados
200 µL of isopropanol com o objetivo de determinar a viabilidade das células pela medida da
absorbância a 570nm em um leitor ELISA (Biotek ELx 800, Singapura).
O controle (concentração zero dos extratos) consistiu do mesmo número de células
cultivadas com meio de cultura acrescido de 10% DMSO (reagente utilizado para dissolver os
extratos e frações).
Estes ensaios foram realizados com diferentes concentrações do extrato (2, 20 e 200
µg/ml), realizados em duplacatas em dois eventos independentes.
8- RESULTADOS E DISCUSSÃO
8.1-Produção dos extratos brutos e purificados de J.decurrens
O rendimento dos extratos obtidos a partir de partes aéreas e de raízes de J. decurrrens
foram diferentes sendo o que os rendimentos dos extratos hidroalcoólicos, foram maiores quando
comparados aos extratos preparados com hexâno e diclorometano (tabela 1).
Tabela 1: Dados da produção dos extratos brutos de Jacaranda decurrens
Solvente
Hexano
Município (GPS)
Peso seco
(pó em g)
Altinópolis/SP SP 285
(47º29’11,5’’
932,5
635
21º03’19,3”
Volume do
solvente
1140
3730
2540
Parte utilizada / rendimento
%
Folha
0,8
Raiz
0,09
Casca
0,21
957,5
1320
790
3902
5000
3160
Folha
Raiz
Casca
1,22
0,06
0,145
Altinópolis/SP
143
932
645
600
3800
2540
Folha
Raiz
Casca
25
5,4
5,7
Dourados/MS
957,5
320
645
3600
5000
2580
Folha
Raiz
Casca
7,8
8,62
12,7
Altinópolis/SP
100
100
400
400
Raiz
Casca
0,38
0,72
Dourados/MS
100
100
400
400
Raiz
Caca
1,3
0,87
alt 761
Dourados/MS
22 º03’ 07,6’’
55º 07’ 57,9’’
alt 782
Hidroalcoólico 70%
Diclorometano
* Peso seco = material vegetal inicial. Rendimento = Rendimento do extrato.
8.2- Quantificação dos triterpenos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) dos extratos hidroalcoolicos de J. decurrens
Através das análises por CLAE, verificou-se que os extratos de entre-casca de raízes
coletadas em Altinópolis não apresentaram triterpenos, enquanto que estes foram detectados nos
extratos da entre-casca de plantas originárias de Dourados-MS. Dois fatores podem estar
relacionados à presença e ausência desses metabólitos nessas plantas. É possível que a subespécie J. decurrens ssp. symmetrifoliolata tenha adquirido a capacidade de produzir
os
triterpenos nas raízes a partir de alguma alteração genética ou ainda por se encontrar sob
condições edáficas e ambientais propícias a produção desses metabólitos em suas raízes.
Segundo D’ANDREA et al (1995) variações qualitativas e quantitativas de metabólitos
secundários originam-se principalmente por meio de alterações genéticas e influência ambiental,
sendo que as interações desses fatores geram diversidade biológica que podem constituir os
chamados quimiotipos. Os dados obtidos com a quantificação de triterpenos em J. decurrens e
J. decurrens ssp. Symmetrifoliolata comprovam que essas matérias formam quimiotipos
quantitativos e qualitativos.
Os extratos produzidos a partir de folhas, também apresentaram diferenças quantitativas
em relação ao material coletado nas duas diferentes localidades. Acessos coletados em
Altinópolis-SP apresentaram os maiores valores, ou seja: 7,87 mg/g PS e 3,4 mg/ gPS
respectivamente (Tabela 2). Por este motivo o extrato hidroalcóolico de folhas/Altinópolis de
J.decurrens foi escolhido para ser fracionado em camada delgada (CCDC) e análise por CLAE
para verificação dos triterpenos e flavonóides presentes nas frações.
Tabela 2: Concentração dos ácidos ursólico e oleanólico nos extratos hidroalcoólicos de J.
decurrens.
Extrato
Raiz/ /Dourados/
Jd-Jds/
Ácido ursólico
(mg/gPS)
1,37 (± 0,019)
Ácido oleanólico
(mg/gPS)
0,94 (± 0,009)
Raiz/ Altinópolis/ Jd
0
0
Casca/ Altinópolis/ Jd
0
0
Casca/ Dourados/
Jd-Jds/
0
0
Folha/ Dourados/
Jd-Jds
Folha/Altinópolis/Jd
0,95 (± 0,005)
0,68 (± 0,035)
7,87 (± 0,079)
3,54 (± 0,057)
8.3 – Fracionamento do extrato hidroalcoólico de folhas de J. decurrens
No fracionamento por coluna de Sephadex foram coletadas 120 frações de
aproximadamente 10 mL. As frações, após análise por CCDC foram reunidas, obtendo-se: Jd-1
(0,1418 g), Jd-2 (0,040 g), Jd-3 (0,5138 g) e Jd-4 (0,7812 g). Através da análise de CCDC,
verificou-se a presença de triterpenos nas quatro frações (coloração azul) e a provável presença
de flavonóides na fração Jd-3 e Jd-4, observadas através da coloração amarela (Figura 4).
Também foi observada a semelhança no perfil fitoquímico das amostras Jd-3 e Jd-4, sendo as
mesmas reunidas e transformadas em uma única amostra.
Triterpeno
Flavonóides
1
2
3
4
Figura 4. Cromatografia em camada delgada (CCDC) do extrato hidroalcoólico de folhas
de J. decurrens 1: fração Jd-1-, 2: fração Jd-2 ,3: fração Jd-3 , 4: fração Jd-4.
Para a verificação dos triterpenos e flavonóides presentes nessas frações, as mesmas foram
analisadas por CLAE, cujo resultado evidenciou a presença dos ácidos úrsólico e oleanólico na
fração Jd-1 (figura 5) e flavonóides na fração Jd-4 (figura 6).
20
10
-10
2
4
6
8
10
12
14
17.472
0
16.725
0
mAU
10
A
4.598
1.920
De te ctor A-210 n m
P a d rã o Au e Ao
cr01t
Retention Tim e
3.326
mAU
20
16
18
-10
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
M inutes
FiJd-2 (C) e Jd-3 (D).
0
B
2000
16.662
1000
17.435
14.813
12.949
13.696
11.716
9.152
9.823
10.152
10.783
mAU
2
7.934
3.163
3.233
3.320
3.395
5.281
1000
6.104
mAU
2000
3000
De te ctor A-210 n m
ja ca ra nd a - Ex tra to Bruto
cr02t
Retention Tim e
2.086
2.201
3000
0
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
M inutes
0
2
C
m AU
2000
24.654
16.668
17.562
15.923
12.802
9.116
9.770
10.141
3.172
3.255
1000
6.871
7.367
7.839
8.413
5.030
5.680
6.043
m AU
2000
3000
De te cto r A-210 n m
ja ca ra n da - Jd 01 (1-14)
cr03t
Retention Tim e
2.232
3000
1000
0
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
M inutes
2000
mAU
2.116
3.737
D
mAU
2000
De te cto r A-210 n m
ja ca ra n d a - Jd .02(15-35)
cr04t
Retention Tim e
0
2
39.319
26.108
16.657
1000
17.422
14.803
15.272
13.733
12.927
11.781
9.156
9.834
10.157
10.794
6.074
3.206
4.744
4.908
5.245
1000
0
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
M inutes
3000
De te cto r A-210 n m
ja ca ra n d a - Jd .03
cr05t
Retention Tim e
3000
E
mA U
2000
mA U
2000
2
37.836
38.216
3.037
3.152
3.224
3.325
3.395
2.195
0
1000
5.434
1000
0
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
M inutes
Figura 5. Cromatogramas mostrando o perfil químico de triterpenos à 210 nm, dos
padrões (A),
extrato bruto
(B) e
frações Jd-1 (C), Jd-2 (D) e Jd-4 (E).
5
10
15
20
25
30
54.957
A200
mAU
51.738
51.939
52.535 52.328
400
53.738
34.706
35.45735.737
35.177
0
0
36.114
36.544
36.960
37.397
37.649
38.094
38.485
38.771
38.946
39.368
39.716
40.246
41.008
33.032
33.750
12.876
10.020
3.598
200
22.138
22.379
2.345
mAU
400
29.326
De te ctor A-330 nm
ja ca ra nda - Ex tra to Bruto
cr02
Retention Tim e
0
35
40
45
50
55
60
M inutes
De te ctor A-330 nm
ja ca ra nda - Jd 01 (1-14)
cr03
Retention Tim e
0
mAU
54.042
B100
1.655
3.527
48.582
100
52.304
44.153
44.409
200
mAU
200
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
M inutes
De te ctor A-330 nm
ja ca ra nda - Jd .02(15-35)
cr04
Retention Tim e
300
52.537
5
10
15
20
25
30
35
40
45
54.989
51.733
51.958
0
0
200
52.325
49.137
34.975
33.002
29.335
100
22.048
3.592
9.752
m AU
200
50
C
m AU
300
100
0
55
60
0
5
10
15
20
25
30
35
54.294
55.033
52.335
52.539
D500
m AU
36.650
36.990
37.482
37.729
38.153
38.688
39.033
39.445
39.808
40.154
40.683
41.091
42.027
42.549
43.520
32.672
33.168
33.905
0
1000
34.804
35.274
35.829
12.728
12.931
9.806
6.037
6.332
8.135
8.426
3.584
3.704
2.370
500
26.286
22.218
22.470
m AU
1000
29.440
De te ctor A-330 nm
ja ca ra nda - Jd .03
cr05
Retention Tim e
35.559
M inutes
0
40
45
50
55
60
M inutes
Figura 6. Cromatogramas mostrando o perfil químico de flavonóides à 330 nm do
extrato bruto (A) e das frações Jd-1 (B), Jd-2 (C) e Jd-4 (D).
8.4 – Identificação do flavonóide ativo obtido do extrato hidroalcoólico de folhas de J.
decurrens.
O espectro de RMN de 1H (Anexo 1) apresentou sinais na região de δ 6,3 – 7,7 ppm,
referentes aos hidrogênios ligados a carbonos sp2 aromáticos, sinais na região de δ 5,0 –
5,1 ppm, característicos de hidrogênios anoméricos e sinais na região de δ 3,4 – 3,9 ppm,
caracterísitcos de hidrogênios de açúcares. Após a análise detalhada deste espectro foi
proposta a estrutura mostrada na figura 7 ( derivado glicosilado da luteolina).
Os espectros foram expandidos para serem observados os hidrogênios aromáticos,
onde também é possível observar a presença dos hidrogênios H-3 com δ 6,8 ppm, H-6 δ 6,6
ppm e H-8 δ 6,4 ppm, onde cada sinal está integrado para 1H.
Também foram observados os sinais em δ 7,8 ppm (1H), δ 7,7 ppm (1H, J= 7,6 Hz)
e δ 7,5 ppm (1H, J= 7,4 Hz), referentes aos hidrogênios H-2´, H-6´, H-5´, respectivamente,
confirmando a estrutura proposta.
A presença do açúcar na molécula foi proposta devido a presença de sinais de
hidrogenios anomericos, juntamente com os sinais na região de δ 3,4-3,9 ppm, sendo que o
espectro de massas (modo positivo) obtido desta amostra mostrou um pico da molécula em
301 m/z (correspondente a aglicona) com a liberação de resíduos referentes a duas unidades
de açucares, o que levaria ao PM da molécula glicosilada em 579. No momento ainda não
podemos propor quais os acúcares que estão presentes, uma vez que estamos aguardando os
espectros de RMN de 13C e bidimensionais (HMQC e HMBC). Com base nas constantes
de acoplamento dos hidrogênios anoméricos (J= 7,4 Hz), sugerimos a presença de glicose,
porém uma analise mais detalhada é necessária para confirmar a estrutura.
R=H
ou
Me
Figura 7. Estrutura proposta para o flavonóide isolado do extrato hidroalcoólico de
folha de J. decurrens.
8.5- Avaliação da atividade antioxidante das frações Jd-1, Jd-2 e Jd-4 obtidas a
partir do extrato hidroalcóolico das folhas de J.decurrens
Todas as frações demonstraram atividade antioxidante, como pode ser observado na
tabela 3. O extrato bruto e a fração Jd-2 na concentração de 10mg/L apresentaram a mesma
porcentagem de atividade antioxidante ( 92 e 90 %, respectivamente) que a substância referência
rutina na concentração de 1mg/L (Tabela 2). Esse flavonóide foi utilizado por ser um padrão de
referência de sustância antioxidante capaz de inibir o sistema de peroxidação lipídica,
dependente de ferro, e suprimir os estágios do processo de formação dos radicais livres como a
produção do radical hidroxila na reação de Fenton e de radical peróxido (Morel et al., 1993).
A fração Jd-1 também apresentou atividade antioxidante e as concentrações mais ativas
foram 10 mg (84, 41%) e 5 mg (86, 43%) sendo esses valores estatisticamente diferentes e
inferiores a rutina (92,56%).
A atividade antioxidante da fração Jd-4 foi a mais expressiva quando comparada com as
outras frações, embora esta atividade tenha sido menor do que o padrão de referência e que este
resultado tenha sido mais significativo em concentração mais baixa que a rutina (0,625mg/m/L 89%). Esta fração está enriquecida com os flavonóides glicosilados e estes compostos
apresentam grupos hidroxila fenólicos que lhes conferem uma ação antioxidante com potencial
terapêutico como inibidores da peroxidação de lipídeos nos microssomas (Rios et al.,1992).
Tabela 3. Atividade antioxidante (em %) de extrato e frações de Jacaranda decurrens
Conc. mg/mL Porcentagem de atividade antioxidante
Rutina - 1
92a
92a
92a
Extrato bruto
Fração Jd1
Fração Jd 2
a
b
10
91
84
90a
b
b
5
78
86
91a
2,5
62c
70c
62b
d
d
1
48
41
31c
0,625
20e
18e
15d
f
f
0,312
10
6,6
6,3e
g
g
0,156
1,2
2,7
2,8f
CV(%)
4,16
3,73
3,18
92a
Fração Jd 4
74d
83c
87b
89b
89b
81c
41e
1,63
Médias seguida das mesmas letras não diferem entre si na coluna pelo teste Scott-Knott ao
nível de 5%.( CV=Coeficiente de variação).
Provavelmente a atividade antioxidante do extrato bruto e das frações Jd-1 e Jd- 2
estejam relacionados à presença dos ácidos ursólico e oleanólico. Recentemente tem sido
comprovado que esses triterpenos apresentam atividade antioxidante não enzimática e que o
ácido úrsólico também atua como inibidor da apoptose celular causada por hiperglicemia.
(AGGARWAL; SHISHODIA, 2006; YIN et al., 2007; BAI et al., 2007; YANG et al., 2007; OH
et al., 2007).
A atividade antioxidante da fração Jd-4 foi a mais expressiva quando comparada com as
outras frações, embora esta atividade tenha sido menor do que o padrão de referência e que este
resultado tenha sido mais significativo em concentração mais baixa que a rutina (0,625mg/m/L 89%). Esta fração está enriquecida com os flavonóides glicosilados e estes compostos
apresentam grupos hidroxila fenólicos que lhes conferem uma ação antioxidante com potencial
terapêutico como inibidores da peroxidação de lipídeos nos microssomas (RIOS et al.,1992).
Os flavonóides têm despertado grande interesse em decorrência da sua excelente
capacidade antioxidante e as possíveis implicações para a saúde humana. Muitos estudos têm
evidenciado a habilidade dos flavonoídes oriundos de produtos naturais em interagir com
espécies reativas de oxigênio e a sua capacidade de interferir na inibição na oxidação celular
(SANCHEZ-PEREZ et al., 2005; CONFORTI et al., 2004; HU et al., 2003). Esta propriedade foi
observada em ensaio antioxidante utilizando como amostra a fração aquosa e de acetato de etila
produzidas a partir do extrato etanólico de flores de Taraxacum officinale em ensaio com DPPH
(HU et al., 2003).
As propriedades terapêuticas dos metabólitos bioativos derivados das plantas medicinais
são largamente conhecidas e muitas espécies possuem potencial biológico já documentado e são
rotineiramente empregadas como antitumoral, cicatrizante e antiinflamatório (ARAUJO & CAC,
2001). Plantas ricas em flavonóide como Hedyotis herbácea, Caesalpinia bonducella, entre
outras, são descritas na literatura como espécies que apresentam excelente atividade antioxidante
(AHMAD et al., 2005; GUPTA et al., 2004). Estudos realizados com extratos etanólicos
produzidos a partir de própolis corroboram com os trabalhos supracitados, evidenciando forte
atividade antioxidante em ensaio com DPPH, atividade provavelmente relacionada a presença de
flavonóides em sua composição química (CHEN et al., 2004).
8.6- Ensaios de sensibilidade a extratos vegetais de J. decurrens sobre as linhagens
de dermatófitos:
A concentração inibitória mínima dos extratos diclorometano e hexânico obtidos de
diferentes partes da espécie vegetal foi igual ou acima 5000µg/mL, quando a leitura visual pôde
ser realizada. A observação da inibição das linhagens de dermatófitos em alguns dos poços da
placa foi prejudicada pela precipitação de algumas substâncias presentes nos extratos.
O melhor resultado obtido com os extratos de baixa e média polaridade foi com a
linhagem mutante, que se mostrou mais sensível ao extrato hexânico produzido a partir das
folhas (Altinópolis), o CIM deste extrato foi de 1250 µg/mL entretanto essa eficiência não foi
observada na linhagem selvagem que apresentou um CIM de 5000µg/mL (Tabela 3).
Os extratos hidroalcóolicos apresentaram maior atividade antifúngica, sobre as duas
linhagens selecionadas, em relação aos extratos hexânico e dicloromentano. Os valores do CIM
variaram entre 312 µg/mL e 78 µg/mL (Tabela 3). Extrato hidroalcoólico de raiz e folha de J.
decurrens da subespécie
symmetrifoliolata (coletada em Dourados) foram mais eficientes
quanto a atividade antifúngica para a linhagem mutante com o gene TruMDR2 deletado.
Tabela
4.
Concentração
inibitória
mínima
(CIM)
em
µg/mL
dos extratos hexânico e diclorometano de J.decurrens sobre as linhagens de T.rubrum.
Parte da planta/ Local
Solvente
H6
∆TruMDR2
Raiz/Dourados
Raiz/Dourados
Entre-casca/Dourados
Entre-casca/Dourados
Folha/Dourados
hexano
dicloro
hexano
dicloro
hexano
>5000
Nd
5000
Nd
>5
>5000
Nd
Nd
Nd
>5
Raiz/Altinópolis
Raiz/Altinópolis
hexano
dicloro
>5000
5000
>5000
Nd
Entre-casca/Altinópolis
Entre-casca/Altinópolis
Folha/Altinópolis
hexano
dicloro
hexano
>5000
Nd
>5000
>5000
>5000
1250
Raiz/ Dourados/
Entre-casca/ Dourados
folha/ Dourados
hidroalcoólico
hidroalcoólico
hidroalcoólico
156
312
156
78
156
78
Raiz/Altinópolis
hidroalcoólico
156
Entre-casca/Altinópolis hidroalcoólico
312
Folha/Altinópolis
hidroalcoólico
312
Nd*: valor de CIM não determinado devido à precipitação do extrato.H6 (
156
156
156
linhagem selvagem);
∆TruMDR2( linhagem mutante).
O extrato hidroalcoólico de folhas de J. decurrens foi fracionado e a fração Jd-4 foi a
mais ativa tanto sobre a linhagem mutante (CIM=32) quanto para a linhagem selvagem (CIM=
125). Embora as frações Jd-1 e Jd-2 apresentem triterpenos, como foi evidenciado nos
experimentos descritos anteriormente, elas não foram eficientes quanto à atividade antifúngica
para as linhagens analisadas (tabela 4).
Tabela 5. Concentração inibitória mínima (CIM) de frações produzidas a partir do extrato
hidroalcoolicos de J.decurrens, frente as linhagens de T.rubrum.
Frações
H6 (µ
µg /mL )
Mutante (µ
µg /mL )
Fração Jd-1
Fração Jd-2
Fração Jd-4
Extrato bruto
1000
1000
125
312
250
250
32
156
Após a obtenção desses resultados a fração Jd-4 foi fracionada resultando em dez novas
frações que foram avaliadas novamente quanto à atividade antifúngica (Tabela 5). O ensaio
evidenciou maior atividade inibitória da fração 10 sobre o dermatófito. Este material foi
analisado em cromatografia de camada delgada e em CLAE ficando evidenciado que o
componente majoritário da fração era um flavonóide. A Fração Fr-10 após ser purificada em
CLAE e posteriormente em placa cromatográfica preparativa, resultou no isolamento de um
flavonóide que foi analisado quanto a sua fórmula estrutural e testado quanto a atividade
antifúngica (Tabela 5).
Tabela 6. Concentração inibitória mínima (CIM) em (µ
µg /mL )das frações Fr-1 a Fr-10 frente a
linhagem H6 de T.rubrum produzidas a partir do fracionamento da fração Jd-4
H6
Fr-1
Fr-2
Fr-3
Fr-4
Fr-5
Fr-6
Fr-7
Fr-8
Fr-9
Fr-10
500
500
> 1000
125
125
125
125
125
62
32
Tabela 7. Concentração inibitória mínima (CIM) do flavonóide isolado a partir do extrato
hidroalcoolicos de J.decurrens, e dos controles de referência frente às linhagens de T.rubrum..
Substâncias
Puras
H6 (µ
µg / mL )
Mutante (µ
µg / mL )
Flavonóide
Fluconazol*
Griseofulvina*
125
75
5
125
75
5
O flavonóide isolado mostrou a mesma atividade para ambas as linhagens, entretanto foi
menos ativo (CIM=125) para a linhagem mutante do que a fração Jd-4 (CIM=32) o que pode ser
explicado de duas maneiras: a fração foi mais efetiva devido a atividade estar relacionada a um
conjunto de sustâncias que compõem a fração ou pode ser que uma outra substância mais ativa
presente na fração tenha sido eliminada no processo de purificação. Essas hipóteses deverão ser
alvo de futuras investigações. Quanto à linhagem selvagem a fração Jd-4 foi tão eficiente quanto
o flavonóide, isso evidencia que esta substância é a responsável pela atividade antifúngica nessa
linhagem de T.rubrum.
Os resultados encontrados com a fração Jd-4 são consideravelmente próximos aos obtidos
em alguns trabalhos realizados in vitro com medicamentos prescritos na terapia antifúngica
convencional. Estudos realizados com dermatófitos isolados de pacientes portadores de Tinea
pedis, mostraram que o CIM do cetaconazol (Galena Química Farmacêutica Ltda) para o T.
rubrum esteve entre 1 a 32 µg/mL e a do ciclopirox olamine (Galena Química Farmacêutica
Ltda) variou de 8 a 32 µg/mL para o mesmo isolado clínico (SOARES & CURY, 2001).
Os dados apresentados nesse trabalho mostraram que a atividade antifúngica da fração
Jd-4 foi mais eficiente do que o fluconazol para a linhagem mutante e que para a linhagem
selvagem o CIM da fração Jd-4 e do flavonóide não foram tão discrepantes em relação ao
fluconazol. A substituição dos antifúngicos convencionais alopáticos por produtos naturais como
esses apresentados nesse trabalho dependerá de avaliações toxicológicas, considerando que os
medicamentos alopáticos empregados na terapia antifúngica são amplamente conhecidos por sua
atividade tóxica sobre as células do hospedeiro e pelos acentuados efeitos colaterais.
Constatou-se também que tanto para os extratos brutos quanto para as frações produzidas
a partir do extrato selecionado (Folha/Altinópolis), a linhagem mutante mostrou-se mais sensível
que a selvagem. Estes resultados evidenciam a maior sensibilidade desta linhagem, que pode ser
devida à ruptura do gene TruMDR2, envolvido no efluxo de substâncias tóxicas para a célula
como os triterpenos e flavonóides, presentes no extrato de J. decurrens.
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com estudos realizados por BINUT &
LABUBUTU (1994) que verificaram atividades antimicrobianas de algumas espécies
pertencentes à família Bignoniaceae. Eles comprovaram a atividade antifúngica dos extratos
metanólicos produzidos a partir de folhas e caule da Jacaranda mimosifolia. Dentro da família
Bignoniaceae e do gênero Jacaranda, os flavonóides têm sido considerados importantes
marcadores químicos, devido as diversas atividades biológicas que apresentam, tanto para as
plantas quanto para o homem, que vão desde proteção a irradiação utra-violeta, atração de
polinizadores, pigmentação de plantas até a proteção a microoganismos (BLATT et al., 1998;
SANTOS & BLATT, 1998).
O conhecimento das propriedades terapêuticas dos flavonóides nos mais variados tipos de
doenças humanas é antigo e a cada ano cresce o número de artigos demonstrando a diversidade
farmacológica desta classe de substâncias (CUSHNIE & LAMB, 2005).
A atividade antimicrobiana dos flavonóides é bastante conhecida e descrita em diversos
trabalhos com microorganismos, principalmente sobre algumas linhagens fúngicas, e em
particular sobre alguns dermatófitos (DAS & ROSAZZA, 2006; SATHIAMOORTHY et al.,
2007). Um exemplo de significativa atividade fungistática é o do extrato de própolis sobre
algumas linhagens de dermatófitos coletados em pacientes portadores de onicomicoses. O
extrato de própolis é bastante conhecido por conter expressiva quantidade de flavonóides em sua
composição (OLIVEIRA et al., 2006). Assim como o potencial antimicótico dos flavonóides foi
observado também durante o ensaio antifúngico com o extrato alcoólico de Cimaruba glauca
sobre M. gypseum, apresentando níveis de inibição de 41% das cepas (HIDALGO et al., 2002).
Além dos flavonóides, os triterpenos, em especial os ácidos ursólico e oleanólico,
são substâncias com significativa
atividade antifúngica. A atividade antifúngica do ácido
oleanólico foi demonstrada em estudo in vitro realizado sobre várias espécies de dermatófitos
(FAVEL et al., 1994) e estudo conduzido por CHATTOPADHYAY et al (2001) com extratos
metanólicos de folhas de Alstonia macrophylla, mostrou que essa espécie apresenta atividade
antifúgica contra Trichophyton rubrum; essa atividade foi atribuída a presença do ácido ursólico
e a alguns flavonóides.
A vantagem de se utilizar substâncias provenientes de substratos naturais se deve, entre
outras razões, pela baixa capacidade toxicológica que os mesmos apresentam. Os triterpenos
citados, os ácidos ursólico e oleanólico, assim como os flavonóides de modo geral são referidos
como substâncias que apresentam muitas vantagens sobre o organismo, principalmente pelo
efeito hepatoprotetor e baixa toxicidade (OVESNÁ, 2006; UGARTONDO, 2006). O contrário
ocorre com as drogas antifúngicas alopáticas, que são em sua maioria são responsáveis pelo
aparecimento de efeitos colaterais diversos e particularmente pelo desenvolvimento
complicações com as lesões hepáticas (FISCHER et al., 2005).
8.7- Ensaio de atividade citotóxica de extratos de J.decurrens
A atividade citotóxica de J. decurrens no presente trabalho foi avaliada pelo teste de
quimio-sensibilidade MTT que baseia-se na redução do sal tetrazolato (MTT) pela enzima
hidrogenase succínica presente na mitocôndria da célula tumoral, o qual adquire uma coloração
violácea quando ocorre esta reação, indicando com isso a sobrevivência da célula. A mudança da
coloração foi avaliada por espectrofotometria, cuja absorbância foi medida a 570 nm
(MATSUZAKI et al., 2006).
Os ensaios realizados com a linhagem HeLa, demonstram que as fração Jd- 2 (F -2) e Jd4 (F-4), nas concentração de 200 µg/mL, reduziram para 30% a taxa de células sobreviventes,
enquanto que no controle negativo ( água + DMSO) 100% de células sobreviveram (figura 8). O
extrato bruto (Eb) e a fração Jd-1 (F-1) apresentaram menor atividade citotóxica para a mesma
concentração, sendo que as células foram mais sensíveis ao extrato bruto do que a Fração Jd-1
(F-1). Estatisticamente não houve diferença entre as concentrações de 20 µg/mL e 2 µg/mL para
todas as amostras testadas com a linhagem tumoral HeLa, evidenciando que essas concentrações
não apresentam uma atividade citotóxica expressiva.
Figura 8: Porcentagem de sobrevivência da linhagem tumoral HeLa cultivada em
meio de cultura suplementado com frações (Jd-1 (F-1), Jd-2 (F-2) e Jd-4 (F-4) ) e extrato
bruto (Eb) de Jacaranda decurrens .
Corroborando com os resultados anteriores, a atividade citotóxica das amostras frente à
linhagem tumoral B16 também foi mais intensa na maior concentração 200µg/mL (figura 9),
sendo que a taxa de sobrevivência foi menor que a apresentada pela HeLa, exceto para a fração
Jd-4 (F-4). Tal resultado evidencia maior sensibilidade desta linhagem, aos extratos de J.
decurrens, quando comparada a HeLa. Neste ensaio, foi testada a atividade do flavonóide
isolado da fração Jd-4 (F-4) e como resultado pode-se observar que este composto esteve entre
os que apresentaram maior atividade citotóxica. Tanto o flavonóide quanto o extrato bruto e a
fração Jd-2 (F-2), na concentração de 200 µg/mL, reduziram a taxa de sobrevivência das células
tumorais (B16) para a porcentagens menores que 5 %. A fração Jd-1 (F-1) produziu a segunda
menor taxa (40%).
Figura 9: Porcentagem de sobrevivência da linhagem tumoral B16 cultivada em
meio de cultura suplementado com frações (Jd-1 (F-1), Jd-2 (F-2) e Jd-4 (F-4)), extrato
bruto (Eb) e o flavonóide isolado de folhas de Jacaranda decurrens .
Nesse experimento foi observado um padrão entre a atividade citotóxica e a concentração
das substâncias, ou seja, as maiores concentrações promoveram sempre maior citotoxidade. O
extrato bruto (3,7 %) e a fração F-4 (4,1%) apresentaram expressiva atividade citotóxica e as
frações F-1 (1,2%), F-2 (1,8) e o Flavonóide (1,6%) foram ainda mais eficazes em inibir a
proliferação celular.
Figura 10: Porcentagem de sobrevivência da linhagem não tumoral Melan A
cultivada em meio de cultura suplementado com frações (Jd-1 (F-1), Jd-2 (F-2) e Jd-4 (F4)), extrato bruto (Eb) e o flavonóide isolado de folhas de Jacaranda decurrens .
Os dados obtidos em todos os experimentos com as diferentes linhagens celulares
monstraram que, de modo geral, as amostras testadas tiveram atividade citotóxica mais
pronunciada na concentração de 200 µg/mL.
A atividade citotóxica do flavonóide isolado, assim como do extrato bruto e das frações,
na concentração de 200 µg/mL, foram expressivas tanto para a linhagem de célula tumoral B16
quanto para as linhagem de célula normal (figura 10). Isso evidencia a toxicidade dessas
substâncias que apresentam o mesmo modelo de ação dos quimioterápicos alopáticos, ou seja,
não são seletivos para células neoplásicas.
A atividade citotóxica dos flavonóides é referenciada em muitos trabalhos na literatura
progressivamente mais substâncias químicas pertencentes a este grupo são descobertas como
promissores agentes anticancer (SUN et al., 2006). Estudos prévios também têm demonstrado a
atividade antiproliferativa de compostos derivados de flavonóides, como por exemplo, a
epicatequina, em células de melanoma (UGARTONDO, 2006). A mesma atividade também foi
atribuída a alguns flavonóides isolados de Lonchocarpus spp sobre a linhagem P-388 de células
tumorais leucêmicas, onde estes metabólitos foram responsáveis pelo bloqueio do ciclo celular
das células neoplásicas (ARGAEZ-BORGES et al., 2007).
A atividade citotóxica apresentada nas frações F1 e F2 certamente esta relacionada a
presença de triterpenos, principalmente os ácidos ursólico e oleanólico, substâncias identificada
nas análises em CLAE e também já anteriormente mencionadas por VARANDA et al (1992).
A atividade citotóxica dos triterpenos compõe uma das inúmeras propriedades
farmacológicas que estes constituintes detêm, sendo fontes promissoras para o desenvolvimento
fitofármacos antineoplásicos (SETZER e SETZER, 2003). Ensaios biológicos realizados com
triterpenos e seus derivados freqüentemente revelam a sua capacidade em inibir o crescimento
tumoral, além impedir o processo de metástase (CHINTHARLAPALLI et al., 2007;
SOROKINA et al., 2006). Entre os triterpenos largamente estudados encontram-se o ácido
ursólico e o oleanólico.
A atividade citotóxica dos ácidos ursólico e oleanólico sobre linhagens tumorais é
amplamente descrita em muitos trabalhos (MA, 2005). Esta propriedade já tinha sido referida
sobre células B16 em ensaio com MTT em 1997 por Es-SAADY et al., Neste estudo, foi
demonstrada a atividade inibitória do ácido ursólico sobre a proliferação desta linhagem, sendo a
inibição dose-dependente e o melhor resultado observado no IC
50
a 7,7 µg após 24 h de
tratamento (ES-SAADY, 1997). O mecanismo da atividade inibitória deste ácido está associado
ao bloqueio da progressão ciclo celular na fase G1 e na apoptose celular seguida de
fragmentação do DNA (MA, 2005).
9- CONCLUSÃO:
● Os estudos realizados no presente trabalho comprovaram o potencial antifúngico,
antioxidante e citotóxico do extrato hidroalcoólico de J.decurrrens.
●
Dentre os extratos produzidos, o hidroalcoolico foi o que apresentou melhor atividade
antifúngica sobre o isolado clinico ATCC MYA-3108 (selvagem) e sobre a linhagem mutante
com gene para TruMDR2 deletado, sendo este ultimo mais sensível para a maioria dos extratos
testados.
●
Extrato hidroalcoólico, frações desse extrato e o flavonóide isolado de J. decurrens
apresentaram atividade antifúngica sobre linhagens selvagens e mutantes de dermatófito T
.rubrum. Sendo que as frações purificadas com exceção da fração Jd-4 foram menos eficientes
como antifúngicos do que o extrato bruto.
●
Todas as frações obtidas do extrato hidroalcoólico apresentaram atividade antioxidante ,
sendo a fração Jd-4 a mais ativa. Esse resultado certamente esta relacionado à presença do
flavonóide que foi isolado dessa fração.
●
Os extratos brutos e frações de J. decurrens apresentaram pronunciada atividade citotóxica
principalmente sobre a linhagem tumoral B16 e sobre células normais. O extrato hidroalcoólico
produzido a partir de folhas coletadas no município de Altinópolis demonstrou atividade
citotóxica sobre as linhagens tumorais HeLa e melanoma murino B 16 e sobre a linhagem de
célula não tumoral Melan A, contudo esta atividade foi mais relevante sobre as duas últimas
linhagens.
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Anexo 1
Anexo 2
Gráfico 1: Curva de calibração do ácido oléanólico
Curva de calibração de Ácido Oleanólico 31/08/06
10000000
8000000
Área
6000000
4000000
Y=A+B*X
Parameter Value
Error
A
-94754,375
41993,03378
B
8,09077E6
81358,89597
R
SD
N
P
0,99934 107435,3386 15 <0.0001
2000000
0
-2000000
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
concentração (mg/mL)
0,8
1,0
1,2
Anexo 3
Gráfico 2: Curva de calibração do ácido ursólico
Curva de calibração de Ácido Ursólico - 31/08/06
12000000
10000000
8000000
Área
6000000
4000000
Y=A+B*X
Parameter Value
Error
A
-123157,90278
39820,34911
B
8,5339E6
77149,4543
R
SD N
P
0,99947 101876,72346 15 <0.0001
2000000
0
-2000000
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Concentração (mg/mL)
1,0
1,2
1,4
Anexo 4
Gráfico 3: Cromatograma do extrato bruto selecionado (Altinópolis/ Folha)
3000
3000
Detector A-200 nm
ALT/FOLHA
jac12
2000
mAU
m AU
2000
1000
1000
0
0
0
5
10
15
20
Minutes
25
30
35
40