Bacilos Gram Negativos
Fermentadores - Enterobactérias
Enterobactérias
• As enterobactérias possuem características em comum
que definem a família Enterobacteriaceae:
São bacilos Gram-negativos;
Fermentam a glicose com ou sem produção de gás;
São aeróbios e anaeróbios facultativos;
A maioria reduz nitrato a nitrito;
A maioria é oxidase negativa e catalase positiva;
Podem ser móveis por flagelos peritríqueos ou imóveis;
Crescem bem em meios comuns de cultura, como ágar
MacConkey.
Importância clínica
• As enterobactérias são universalmente distribuídas no solo, plantas,
na água e no trato gastrointestinal de humanos e dos animais
• As Enterobacteriaceae podem ser isoladas de vários sítios
infecciosos e são responsáveis por:
- Abscessos;
- Pneumonia;
- Meningites;
- Septicemias;
- Infecções de feridas, trato urinário e trato gastrintestinal.
• Alguns também são considerados enteropatógenos por causarem
preferencialmente infecções gastrintestinais, como a Salmonella
typhi, outras Salmonellas, Shigella spp., Yersinia enterocolitica e
vários sorotipos de Escherichia coli, embora possam também causar
infecção em outros sítios.
Importância clínica
• As principais enterobactérias isoladas, constituindo cerca de 99% dos
isolamentos de enterobactérias de importância clínica, são:
• Escherichia coli; Klebsiella spp.; Enterobacter spp.; Proteus spp.;
Providencia spp.; Morganella spp.; Citrobacter spp.; Salmonella spp.;
Shigella spp.; Serratia spp.
•
•
•
•
As enterobactérias que atualmente predominam são:
Escherichia coli;
Klebsiella spp.;
Enterobacter spp.
•
•
•
•
As isoladas com menor freqüência são:
Edwardsiella spp.;
Hafnia spp.;
Yersinia spp.
Isolamento
• A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao laboratório
clínico após a coleta.
• Em casos onde não é possível o envio ao laboratório em no máximo
até 2 horas, manter a amostra refrigerada.
• Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em meio de
transporte tipo Cary-Blair e/ou meio de Amies.
• Amostras de sangue devem ser imediatamente inoculadas em
frascos apropriados para hemocultura.
• As enterobactérias crescem bem em meios comuns de cultura e
meios seletivos utilizados para o isolamento de bacilos Gramnegativos.
• A maioria delas apresenta colônias maiores de 1 mm de diâmetro,
após incubação de 18 a 24 horas a 35±2ºC, com aspecto opaco,
brilhante, transparente ou mucóide.
Identificação
• Baseia-se principalmente na presença ou não de
diferentes enzimas codificadas pelo material
genético dos cromossomos bacterianos.
• Estas enzimas participam do metabolismo
bacteriano em diversas vias, que podem ser
detectadas por meios especiais utilizados em
técnicas de cultivo in vitro.
Identificação
• A caracterização definitiva dos membros das
Enterobacteriaceae pode requerer uma
bateria de provas bioquímicas.
• Primeiramnete confirmar se é enterobactéria:
*Fermentação da glicose;
*Citocromo oxidase negativa;
*Redução de nitrato a nitrito.
Identificação
• Os passos importantes a serem avaliados para a
identificação das enterobactérias são:
Exame macroscópico e microscópico da cultura
• O exame macroscópico e microscópico da cultura
constitui a primeira etapa da identificação das
enterobactérias.
• O exame macroscópico da cultura permite uma análise
do tamanho, aspecto morfológico e coloração da
colônia em meios simples e seletivos.
• O exame microscópico se faz através da coloração de
Gram
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Identificação bioquímica
Após o exame macroscópico e a confirmação da pureza da cultura, uma colônia pode
ser identificada com a ajuda de meios presuntivos de identificação, tais como o meio
de Triple Sugar Iron (TSI), EPM Mili e/ou Rugai modificado por Pessoa e Silva (Meio de
IAL).
No meio de IAL, nove reações bioquímicas são observadas em um único tubo:
Fermentação da glicose;
Produção de gás;
Fermentação da sacarose;
Desaminação do L-triptofano;
Produção de indol;
Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S);
Hidrólise da uréia;
Descarboxilação da lisina (LDC);
Motilidade.
O exame presuntivo acompanhado de provas complementares auxilia na confirmação
de um gênero ou espécie.
As provas complementares geralmente necessárias são a descarboxilação da ornitina
(ODC), arginina de-hidrolase (ADH), utilização do citrato (Simmons), prova da DNase e
prova de Voges Proskauer (reação de VP), e, quando necessário, a fermentação de
alguns açúcares.
VP
• A reação de VP divide as enterobactérias em dois
grandes grupos: espécies VP positivas e espécies
VP negativas
• Em geral, entre os membros mais comuns da
família, as espécies VP positivas pertencem aos
gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia.
As espécies dos gêneros Salmonella, Shigella,
Proteus, Morganella, Citrobacter, Kluyvera,
Providencia e a Escherichia coli apresentam
reação de VP negativa.
Características para o diagnóstico presuntivo e triagem dos
gêneros e espécies de enterobactérias mais comuns em
material clínico.
• As cepas de E.coli apresentam distintos perfis em
meio presuntivo de identificação. Isto se deve à
grande variabilidade bioquímica que existe entre
as cepas, especialmente em relação à produção
de gás a partir da fermentação da glicose,
fermentação da sacarose, LDC e motilidade.
• No entanto, fermentam a lactose e produzem
indol, características que praticamente definem a
espécie.
• Cepas de Salmonella produzem pouco gás a
partir da fermentação da glicose, são em geral
lactose negativas, sacarose negativas e
possuem como uma das principais
características a produção de H2S .
• As cepas com suspeita de Shigella apresentam
um perfil bioquímico muito homogêneo e
característico nos meios presuntivos de
identificação:
• Raramente produzem gás;
• São LDC negativas e imóveis.
• O gênero Citrobacter possui 11 espécies.
Todas as espécies são LDC negativas, citrato
positivas e a maioria fermenta a sacarose, a
lactose e o glicerol, características que
diferenciam as espécies de Citrobacter de
Salmonella.
As espécies de Citrobacter diferenciam-se
entre si pela produção de H2S (6 das espécies
são H2S positivas), produção de indol, ODC,
utilização do malonato e a fermentação de
vários açúcares.
• Cepas de Klebsiella possuem um metabolismo
muito ativo.
• São VP positivas, fermentam a maioria dos
carboidratos e colônias mucóides, lactose positiva,
são extremamente comuns, são imóveis e a maioria
das espécies é LDC positiva. A produção de urease é
característica das espécies K. pneumoniae e K.
oxytoca, as mais comuns em material clínico
• Enterobacter é um dos gêneros que possui o
maior número de espécies.
• São VP positivas, a maioria das cepas de todas
as espécies são móveis e extremamente
variáveis bioquimicamente.
• As principais características diferenciais entre
E. aerogenes, espécie LDC positiva, e K.
pneumoniae são a motilidade e a produção de
urease.
• LDC, ODC e ADH são excelentes testes para
triagem inicial das espécies de Enterobacter.
• Outro gênero VP positivo, as culturas de Serratia
em meio presuntivo de identificação são muito
semelhantes as cepas de Salmonella sem H2S.
• A maioria é LDC positiva, lactose negativa e
produz pouquíssimo gás a partir da fermentação
da glicose.
• A DNase é um teste fundamental para a
identificação de Serratia, e recomenda-se a
utilização rotineiramente.
• As cepas de Serratia são DNase, lipase e
gelatinase positivas. A ausência da fermentação
da arabinose e melibiose distingue a S.
marcescens, espécie mais comum, das outras
espécies de Serratia
• Os gêneros Proteus, Morganella e Providencia
caracterizam-se pela desaminação do
triptofano. Diferente dos outros dois gêneros,
o gênero Proteus invade a superfície de meios
sólidos (swarming), é gelatinase e H2S
positiva.
• A urease é positiva para os gêneros Proteus,
Morganella e Providencia rettgeri. O Proteus
mirabilis é indol e maltose negativo e ODC
positivo, enquanto que o Proteus vulgaris é
indol e maltose positivo e ODC negativo.
Kits de identificação
LTD LAC H2S
4
2
1
7
GLI GÁS ORN
4
2
1
7
IND LIS MOT
4
2
1
CIT RAM
2
1
7
3
Resistência
• Os microbiologistas devem estar alerta à
possibilidade do aparecimento de
Enterobacteriaceae resistentes a múltiplos
antibióticos.
Os mecanismos de resistência bacterianos
podem ser intrínsecos (já presentes em todas
as amostras de determinada espécie) ou
adquiridos (devido à presença de mutações,
aquisição de plasmídeos etc).
Resistência
• Dentre os mecanismos de resistência adquiridos
mais freqüentes entre as enterobactérias,
destacam-se os associados à resistência aos βlactâmicos, pela hiperexpressão de β-lactamases
cromossômicas ou presença de β-lactamases de
espectro ampliado (ESBL), às fluoroquinolonas,
pelas mutações nos genes gyrA e parC, presença
do gene qnr, e aos aminoglicosídeos, pela
produção de enzimas que modificam estes
agentes.
Beta-lactamases
• A resistência a alguns antimicrobianos, especialmente βlactâmicos, é freqüentemente encontrada em
enterobactérias de infecções em pacientes hospitalizados.
Amostras clínicas de enterobactérias, especialmente K.
pneumoniae e E. coli, podem produzir uma enzima
mediada por plasmídeos denominada ESBL, a qual hidrolisa
penicilinas, cefalosporinas e monobactans.
A prevalência da produção desta enzima em
enterobactérias varia de acordo com a espécie e a região
geográfica estudada; entretanto, em determinados centros
médicos brasileiros as taxas de ESBL em E. coli e K.
pneumoniae coletadas de bacteremias de pacientes
hospitalizados podem alcançar aproximadamente 7% e
50%, respectivamente
Beta-lactamases
• As amostras bacterianas pertencentes aos gêneros
Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Morganella e
isolados de Proteus vulgaris são reconhecidamente
produtores de β-lactamases AmpC. Estas enzimas são
codificadas pelo gene AmpC, e sua produção pode ser
induzida quando estes isolados clínicos são expostos a
agentes β-lactâmicos. A hiperprodução desta enzima
pode acarretar hidrólise de cefalosporinas, como
ceftazidima e ceftriaxona, ocasionando falência
terapêutica durante tratamento com estes agentes. As
cefalosporinas de quarta geração e os carbapenens são
mais estáveis à hidrólise pela AmpC.
Carbapenes
• Isolados clínicos de enterobactérias resistentes à carbapenens já
foram identificados no Brasil. Os mecanismos de resistência
associados a alguns destes fenótipos foram caracterizados por
laboratórios de referência em microbiologia, incluindo:
• Enterobacter spp. resistentes a ertapenem: hiperprodução de AmpC
e/ou produção de ESBLs; K. pneumoniae com susceptibilidade
reduzida a imipenem e meropenem: produção de ESBLs associado a
perda de proteína de membrana externa (porinas);
• K. pneumoniae com resistência a imipenem e meropenem:
produção de enzimas que degradam os carbapenens
(carbapenemases), denominadas KPC;
• K. pneumoniae com resistência a imipenem e meropenem:
produção de enzimas que degradam os carbapenens, denominadas
metalo-β-lactamases.
ESBL
•
•
•
•
•
Os testes fenotípicos para ESBL devem ser utilizados para:
Todos os isolados de K. oxytoca, K. pneumoniae e E. coli, independente do sítio de infecção;
Isolados de Proteus mirabilis provenientes de sítios estéreis de infecção, como sangue e líquor;
A partir da identificação destas espécies pelo laboratório de microbiologia, o perfil de sensibilidade (antibiograma)
já contempla automaticamente testes para a possível presença destas enzimas. Estes testes, realizados pelos
laboratórios de rotina, dividem-se em duas fases: testes de triagem e testes confirmatórios para ESBL.
O CLSI preconiza que o teste de triagem seja realizado pelos métodos de disco difusão (ágar Müeller-Hinton-MHA)
ou microdiluição em caldo (Müeller-Hinton caldo cátion ajustado-CAMHB).
Teste de triagem para detecção de ESBL pelo método de disco difusão:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Suspeita-se de cepa produtora de ESBL, quando são encontradas zonas de diâmetro referentes a:
Para K. pneumoniae, K. oxytoca e E. coli:
Cefpodoxima ≤ 17 mm;
Ceftazidima ≤ 22 mm;
Aztreonam ≤ 27 mm;
Cefotaxima ≤ 27 mm;
Ceftriaxona ≤ 25 mm.
Para P. mirabilis:
Cefpodoxima ≤ 22 mm;
Ceftazidima ≤ 22 mm;
Cefotaxima ≤ 27 mm.
• Teste confirmatório para detecção de ESBL pelo método de disco
difusão:
• Todas as cepas produtoras de ESBL, apresentam aumento na zona
de diâmetro na presença do ácido clavulânico. Confirma-se como
ESBL o microrganismo que apresentar um aumento ≥ 5 mm na zona
de diâmetro para um dos dois agentes antimicrobianos testados em
combinação com o ácido clavulânico versus a zona de diâmetro de
quando testado sozinho.
Exemplo: Ceftazidima com zona de diâmetro igual a 16 mm e
ceftazidima/ácido clavulânico com zona de diâmetro igual a 21 mm.
Resultado: ESBL positivo ou cefotaxima com zona de diâmetro igual
a 20 mm e cefotaxima/ácido clavulânico com zona de diâmetro
igual a 26 mm. Resultado: ESBL positivo.
Teste confirmatório recomendado pelo CLSI
Teste de adição de Ác. Clavulânico
Ácido Clavulânico
•
Preparar 1000 l de solução estoque (1 g/l) fresca ou congelada a –70°C
•
Adicionar 10 l desta solução sobre os discos de CAZ e CTX uma hora antes
do teste
•
Comparar os resultados obtidos entre cefalosporinas sozinhas e com adição de
ácido clavulânico
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação
Jarlier, 1988
CPM
AMX/AC
CRO/
CTX
CAZ
ATM
Distância de
20 - 30 mm