Controle de Qualidade Físico-Químico
Continuação : Métodos Instrumentais de Identificação
- Espectrometria de Massa
- Métodos Cromatográficos
ESPECTROMETRIA DE MASSA : Princípio
A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão
característico da espécie química.
1) Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons
ABCDE + e-  ABCDE.+ + 2 e2) O íon formado se fragmenta:
ABCDE.+  AB. + CDE+
ABCDE.+  AB+ + CDE.
ABCDE.+  A+ + BCDE.
3) Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de
acordo com suas massas moleculares e contados:
ESPECTROMETRIA DE MASSA : Princípio
ABUNDÂNCIA
O gráfico do número de íons
formados em função da razão
Massa / Carga dos íons é o
ESPECTRO DE MASSAS do analito
MASSA / CARGA
Massa molecular de cada fragmento = formação dos picos =
descoberta / identificação da amostra
A massa e a carga dos íons podem ser medidas por sua posição no
espectro.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
Ilustração das quatro etapas básicas na análise por Espectrometria de Massas.
No espectrômetro de massas as
moléculas são bombardeadas
com um feixe de elétrons de alta
energia. As moléculas ionizamse e dissociam em muitos
fragmentos. Cada espécie de
íons possui determinado valor
da razão da massa pelo número
de carga, ou o valor m/z.
http://em.iqm.unicamp.br/
Finalidade: Os espectros de massas são utilizados em geral para
identificar um composto.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
- Método bastante
equipamento.
caro:
aquisição
e
manutenção
do
- Extremamente útil na caracterização de uma molécula.
- Devido ao seu alto custo, a espectrometria de massa não é
utilizada rotineiramente no Controle de Qualidade.
CROMATOGRAFIA
Método físico-químico de separação de componentes de uma
mistura, realizada através da distribuição desses componentes
entre duas fases (sistema heterogêneo bifásico) estão em
contato íntimo:
1) Fase Estacionária (FE)
2) Fase Móvel (FM)
APLICAÇÃO:
- Identificação de compostos (análise qualitativa)
- Quantificação de compostos
Cromatografia
analítica
- Separação (isolamento/purificação) Cromatografia de purificação
CROMATOGRAFIA: Principio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (fixa,
colocada em uma coluna ou numa superfície sólida) e
uma FASE MÓVEL.
- As fases móvel e estacionária são IMISCÍVEIS.
CROMATOGRAFIA: Principio Básico
FE : Líquida ou sólida
FM: Líquida ou gasosa
Separação dos
componentes da
amostra
Componentes da
amostra separados
Princípios do Mecanismo de separação em Cromatografia
Para desenvolvimento de uma análise cromatográfica:
1) A amostra é introduzida como uma única alíquota numa das
extremidades do sistema cromatográfico.
2) Um solvente (eluente – Fase Móvel) é adicionado para fluir
através do sistema. As moléculas se alternam entre FM e FE.
3) Os componentes da amostra são distribuídos entre as duas
fases, onde uma fase permanece estacionária (FE) enquanto a
outra elui / caminha (FM) entre os interstícios ou superfície da
Fase estacionária (FE). O movimento da Fase Móvel resulta
numa migração diferenciada dos componentes da amostra.
4) Os componentes da mistura são “arrastados” em velocidades
diferentes, dependendo da afinidade relativa pelas duas fases.
Substâncias que se movimentam vagarosamente são aquelas que
ficam mais fortemente presas a FE, enquanto que as que se
movem rapidamente gastam uma menor fração de tempo na FE,
devido a uma menor solubilidade ou afinidade por esta fase.
5) Componentes são totalmente ou parcialmente separados, de
acordo com a eficiência do sistema cromatográfico.
A separação ocorre em função das diferenças de afinidade
que as diferentes substâncias tem por uma fase móvel ou pela
fase estacionária. Essas afinidades diferenciadas podem ser
exploradas para fins analíticos e de identificação
CROMATOGRAFIA: Classificação
Cromatografia
Líquida
FM = Líquido
Fase
Móvel
Cromatografia
Gasosa
FM = Gás
Sólida
Em CG a FE
pode ser:
Líquida
Cromatografia
Gás-Sólido (CGS)
Cromatografia
Gás-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFIA: Classificação
Considera-se em geral, pela forma física:
- Forma física do sistema:
a) FE em coluna: Cromatografia líquida de Clássica (CLC)*
Cromatografia Líquida de alta eficiência (HPLC)*, Cromatografia
gasosa (CG).
b) FE sobre superfície planar: Cromatografia em papel (CP) e
Cromatografia em camada delgada (CCD)*
- Estado Físico da Fase Móvel empregada:
a) Gás: Cromatografia gasosa (CG ou GC), CSC
b) Líquido : HPLC e CLC
- Estado Físico da Fase Estacionária:
Sólido, Líquido ou quimicamente ligada.
CROMATOGRAFIA: Classificação
a) FE Líquida: simplesmente espalhado sobre suporte sólido
ou imobilizado por meio de ligações.
b) FE quimicamente ligada: suportes modificados são
considerados separadamente,, por diferirem dos demais por
outros mecanismos de separação.
CROMATOGRAFIA
- Classificação pelo modo de separação
a) Separação por adsorção
b) Separação por partição
c) Troca iônica
d) Mistura desses mecanismos
Os dois sistemas mais simples e utilizados de cromatografia
são a Cromatografia Planar (CP ou CCD) e a
Cromatografia Líquida Clássica. Estas duas técnicas são
normalmente empregadas de forma manual e ou semi
automatizadas (não constituem verdadeiramente técnicas
instrumentais)
- CP e CLC são as versões mais simples e baratas de
cromatografia.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
- Geralmente são placas de vidro (Existem placas / lâminas
prontas de alumínio ou plástico)
- FE: Sólida (Sílica gel - mais utilizada, alumina, terra diatomácea
ou celulose).
- FM: Líquida (dentro da cuba)
Placa
Cuba
1) Aplicação da amostra (aprox 1,0 cm da base inferior da placa)
2) Ds1: Distância percorrida pela subst.1
3) Ds2: Distância percorrida pela subst. 2
4) Dm: Distância percorrida pela FM
Rf: Fator de retenção. Seus valores ideais são 0,4 – 0,6
Rf : Ds
Dm
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Rf : É constante para uma dada substância, e corresponde a
uma propriedade física daquele composto. O valor de Rf pode,
então, ser usado para identificar um composto desconhecido,
mas como muitas substâncias podem ter o mesmo valor de Rf,
assim com podem ter o mesmo ponto de fusão, métodos
adicionais devem ser utilizados para identificação inequívoca do
composto.
-Utiliza-se, ao mesmo tempo, padrão da substância para
comparação de resultado
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
- Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, após a
separação das substâncias, é necessário um processo de
revelação para analisar o resultado.
- As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores
de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio,
fluorescências, etc.
- É um método simples, rápido, visual e econômico.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
- O CLC foi o primeiro
cromatografia que surgiu.
modo
de
- Colunas
de
vidro,
sob
pressão
atmosférica, com fluxo de fase móvel
devido à força da gravidade.
- FE: Sílica ou alumina são as mais
utilizadas.
- A FM que passa pela coluna pode ser
captada na saída por um becker ou
erlenmeyer.
- Já as frações de interesse são coletadas
em frascos ou tubos de ensaio
Introdução da
amostra
Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
- Para análise das amostras obtidas, pode-se utilizar análises
químicas auxiliares, CCD ou análise espectrofotométrica.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATGRAPHY ( HPLC)
- Técnica analítica mais utilizada no Controle de Qualidade pelas
Indústrias Farmacêuticas
- É utilizado como ensaios de doseamento, identificação de
compostos e ensaios de impurezas orgânicas
- Otimização da coluna clássica: emprego da pressão torna a
separação mais eficiente.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Modelo Esquemático
Reservatório de FM
Válvula p/ amostra
Sistema de
Bombeamento
Cromatogramas
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula
de injeção; d) coluna; e) detector , f) registrador.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Fase Móvel:
- Alto grau de pureza – livre de gases dissolvidos e O2.
- O solvente (FM) que se encontra no reservatório é bombeado
com auxilio da bomba até a coluna cromatográfica.
Bomba:
- Vazão contínua, sem pulsos, não interferindo na eluição da FM.
-Método mais eficiente que o a cromatografia líquida clássica
(CLC), pois o emprego da pressão torna a separação mais
eficiente.
Colunas:
- Geralmente de aço inoxidável, diâmetro interno de 0,45 cm para
separações analíticas e 2,2 para preparativas.
- Comprimento da coluna é variável (10 - 25 cm para colunas
analíticas e de 25 - 30 cm para colunas preparativas)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATGRAPHY ( HPLC)
- O “recheio” da coluna cromatográfica é a FE, a qual pode ser
sólida ou líquida. A FE sólida é a mais utilizada.
Detectores:
- O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector
de ultravioleta (Absorção da luz na faixa UV – visível), sendo
também empregados detectores de fluorescência, eletroquímico e
de massa.
Registro de dados:
- Pode ser feito através de um integrador, registrador ou
computador
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Bombeamento ISOCRÁTICO ou por GRADIENTE
- Composição da Fase Móvel Constante: HPLC ISOCRÁTICA
-Alteração da Fase Móvel durante a Análise: HPLC com
programação de Gradiente.
- A eluição com gradiente é muitas vezes usada quando os
componentes da amostra possuem polaridade muito diferentes.
Mecanismos das separações em CLAE
As separações em CLAE podem ser:
- Adsorção,
- Partição
- Ambos
- O suporte mais comumente utilizado é a sílica.
O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte
não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária.
O uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos
como conseqüência do problema acima, possibilita a produção
de uma imensa variedade de colunas com diferentes
propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas
são chamadas de quimicamente ligadas.
As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação
feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou
ambos.
Cromatografia na fase normal: a fase estacionária é mais
polar que a fase móvel.
Cromatografia em fase reversa: a fase móvel é mais polar.
Separações analíticas são predominantemente realizadas em
fase reversa.
HPLC
Equipamentos empregados para
efetuar a cromatografia a líquido
(HPLC) são chamados de
cromatógrafos a líquido.
Colunas cromatográficas
CROMATOGRAMA
A resposta do detector é traduzida em um gráfico,
denominado CROMATOGRAMA.
Cromatograma: demonstração gráfica da separação obtida
por alguma técnica cromatográfica, que permite utilizar os
dados para análise quantitativa e/ou qualitativa.
Cromatograma
CLAE - UV
Cromatograma
Cromatogramas
Cromatogramas
Tempo de retenção: Tempo necessário para eluir as
substâncias, desde o instante da injeção até o máximo
do pico.
Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC
Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida
Clássica
Cromatografia Líquida
Alta Eficiência
Cromatografia Líquida
Clássica
Cromatografia Líquida
Alta Eficiência
A FM é arrastada pela coluna
por ação da gravidade
A FM é submetida a uma
bomba de alta pressão para a
sua eluição pela coluna,
devido a baixa permeabilidade
pela coluna cromatográfica
Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC
Cromatografia Líquida
Clássica
O recheio da coluna é utilizado geralmente
uma só vez porque parte da amostra
usualmente se adsorve de forma
irreversível
Cromatografia Líquida
Alta Eficiência
Na CLAE emprega-se um coluna fechada,
reaproveitável.
Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC
Coluna Clássica
CLAE
Barata
Alto custo de operação e manutenção
Recheio descartado
Coluna cara, mas realiza muitas
análises
Precisa-se coletar frações
Rapidez e
contínua)
Detecção mais demorada (cada
fração)
Maior resolução,
repetibilidade
automação
(detecção
sensibilidade
Depende da experiência do analista Necessita de experiência do analista
para ter repetibilidade (técnica
manual)
e