Nanotecnologia
Mestrandos: Amanda Lima
Daniele Aimi
Denise Baldissera
Ricardo Lorenzoni
Professoras: Dra. Marta Palma Alves
Dra. Renata Raffin
Dra. Solange Fagan
Fator de Impacto: 5.44
ADMINISTRAÇÃO TRANSDÉRMICA DE UM
AGENTE ANTI-HIV ATRAVÉS DE LIPOSSOMAS
ETANÓLICO
SINDROME DE IMUNODEFICIÊNCIA
ADQUIRIDA (AIDS)

O vírus é mais frequentemente transmitido
pelo contacto sexual (característica que faz da
AIDS uma doença ou infecção sexualmente
transmissível), pelo sangue (inclusive em
transfusões), durante o parto (mãe para o
filho), durante a gravidez ou no aleitamento.
AIDS

O HIV age no interior das principais células do
sistema imunológico, os linfócitos. Ao entrar
nessa célula, o HIV se integra ao seu código
genético para poder se multiplicar. Entre os
linfócitos, o tipo mais atingido pelo vírus é o
chamado linfócito TCD4, usado pelo HIV para
gerar cópias de si mesmo.



Uma vez que o HIV está ligado ao linfócito T CD4+, uma
estrutura viral conhecida como GP41 penetra na
membrana celular e o RNA do HIV e várias enzimas,
incluindo (mas não limitada) à transcriptase reversa,
integrase e protease são injetadas na célula.
Uma vez que a célula T hospedeira não processa o RNA em
proteínas, o próximo passo é gerar um DNA a partir do RNA
do HIV usando a enzima transcritase reversa para que
ocorra a transcripção reversa.
Se bem sucedida, o DNA pró-viral deve ser então integrado
ao DNA da célula hospedeira usando a enzima integrase.
Se o DNA pró-viral é integrado ao DNA da célula
hospedeira, a célula torna-se altamente infectada, mas não
produzindo ativamente proteínas do HIV.
HIV protease é a responsável pelo
processamento das poliproteínas levando à
formação das proteínas estruturais e
funcionais do vírus.
 O vírus pode ficar escondido na medula
óssea, onde fica protegido do efeito de
medicamentos e dormente. Descobrir onde
o vírus latente se esconde é o primeiro
passo para eliminá-lo.

Vírus do HIV-1 na superfície de um macrófago infectado
INIBIDORES DA PROTEASE

A inativação da protease, demonstrou a
incapacidade das partículas virais formadas
de se replicar, produzindo, após a etapa de
“brotamento”, apenas vírions não infectivos.
Estudos sustentam a hipótese de que
inibidores específicos de HIV PR podem
prevenir a formação de vírions infectivos a
partir de linfócitos T infectados, o que
resulta em um efeito terapêutico anti-viral
significante.
INIBIDORES DA PROTEASE
Saquinavir
 Indinavir
 Ritonavir
 Nelfinavir
 Amprenavir
 Lopinavir

INIBIDORES DA PROTEASE

O presente trabalho tem como objetivo
formular e caracterizar o encapsulamento do
Indinavir dentro de lipossomas etanólicos
(Ethosomes), e verificar seu potencial em uma
aplicação transdérmica.
INDINAVIR


Sua meia vida curta (em torno de 1,8h), absorção
dependente do pH oral, o extenso metabolismo de
primeira passagem, os intensos efeitos colaterais
gastrointestinais apresentam um desafio sobre o seu
potencial terapêutico através da via oral.
Uma formulação liquida do indinavir também é
rejeitada pela maioria dos pacientes devido aos seus
fatores organolépticos.
Estrutura química do indinavir
Sendo assim, o referido trabalho
desenvolveu estudos utilizando lipossomas
etanólicos (Ethossomas) onde o Indinavir foi
encapsulado e aplicado pela via
transdérmica;
 Caracteriza-se como alternativa que poderia
manter os níveis da droga por um período
maior de tempo,diminuição dos efeitos
grastrointestinais e consequentemente
aumentando a adesão do paciente ao
tratamento;

LIPOSSOMAS

A importância de lipossomas como modelo de
membranas biológicas deriva do fato de que eles são
constituídos por elementos capazes de formar
bicamada idêntica à membrana natural. A
similaridade entre lipossomas e membranas
biológicas pode ser aumentada por modificações
químicas na membrana dos lipossomas,
possibilitando sua exploração em áreas como
direcionamento de fármacos (GREGORIADIS, 1973;
CHONN e CULLIS, 1998) ou modulação imune in vivo
e in vitro (MEYENBURG et al., 2000).
LIPOSSOMAS

A habilidade de imitar a conduta das membranas biológicas
pelo mesmo caminho torna os lipossomas seguros e eficazes
como veículos para aplicação terapêutica (FORSSEN e WILLIS,
1998). O maior interesse de lipossomas como carreadores de
medicamentos ou substâncias biologicamente ativas, consiste
na capacidade de incorporação tanto de agentes lipofílicos, na
membrana fosfolipídica (IWAMOTO e SUNAMOTO, 1982),
quanto compostos hidrofílicos, na cavidade aquosa (BRANDL e
gREGORIADIS, 1994) ou espaços interlamelares.
LIPOSSOMAS
O encapsulamento de substâncias em
lipossomas se constitui em uma técnica
poderosa e apresenta potencial terapêutico
com relação à entrega seletiva de agentes
bioativos por causa da baixa
 toxidez e/ou do aumento da eficácia do
medicamento. Isto tem ocorrido com agentes
antineoplásicos, antibióticos, antivirais e
antiparasitários.

LIPOSSOMAS


Não são conhecidas as razões pela qual a toxicidade
é reduzida, mas presume-se que seja por causa de
alterações na farmacocinética ou na biodistribuição
dessas drogas.
De modo geral o encapsulamento de substâncias
medicamentosas em lipossomas depende de três
fatores principais: o tipo de lipossoma, a técnica
utilizada para carregar o lipossoma com um dado
composto e a estabilidade do produto final.
Lipossomas Etanólicos

O Etanol tem uma boa penetração na pele,
levando isso em consideração no trabalho foi
usado lipossomas etanólicos como carreadores
do fármaco Indinavir um antiretroviral, inibidor
de protease que permitiu uma maior
penetração no estrato córneo (SC) em
comparação com os lipossomas convencionais.
LIPOSSOMAS ETANÓLICOS

a)
b)
A melhor penetração dos lipossomas etanólicos no
estrato córneo pode ser atribuída a dois efeitos:
Aumento da atividade termodinâmica devido à
evaporação do etanol, conhecido como efeito de
repulsão;
Um efeito de atração nos quais a penetração da
molécula do fármaco é aumentada através de uma
redução de etanol da propriedade de barreira da SC.
MATERIAIS E MÉTODOS
MÉTODOS
Materiais:
•Soja fosfatidilcomina (99% pureza)
•Ácido fosfotúngstico
•Sulfato de indinavir
•Água destilada
PREPARAÇÃO DE INDINAVIR CARREGADO EM
LIPOSSOMAS ETANÓLICO
•PC de soja 1,0% para 3,0 wt/vol
•Etanol 25% a 45% vol/vol
Dissolvidas em etanol
•Indinavir 1,0% wt/vol
Salina tamponada com fosfato PBS, pH 7,4
•Água 100% vol/vol
700 rpm
30ºC (durante)
25ºC (esfriar)
5 minutos
Lipossomas convencionais
Método da película
PC de soja 3% wt/vol
Indinavir 1,0% wt/vol
Filmes hidratados com PBS (pH 7,4)
60 rpm por 1 hora a 55ºC
Passados em filtro de polibicarbonato
(antes da caracterização)
FORMA VESICULAR E MORFOLOGIA DA
SUPERFÍCIE DAS VESÍCULAS ETHOSOMAL
•Visualizadas com MET
•As amostras foram desidratadas e coradas com uma solução de
ácido fosfotúngstico
Após secagem
Microscópio de 10.000 para 100.000 vezes
MEV
TAMANHO VESICULAR E
TAMANHO DE DISTRIBUIÇÃO
Tamanho de distribuição
2 conjuntos de 3 exemplares por espalhamento de luz dinâmico (DLS)
Tamanho vesicular
A suspensão foi misturada com PBS (pH 7,4) em triplicata
ESTABILIDADE DO ARMAZENAMENTO
FÍSICO DOS LIPOSSOMAS ETANÓICO
Droga retentiva
120 dias em diferentes temperaturas
4ºC e 25ºC
Frascos fechados
EFICIÊNCIA DE APRISIONAMENTO
Lipossomas separadas do medicamento
Técnica de centrifugação
Quantidade de aprisionamento
Utilizando HPLC
Percentagem foi calculada
A = Q / Qt x 100
A = aprisionamento da droga
Q = quantidade de droga encapsulada
Qt = quantidade total de droga adicionada
ESTUDOS CALORIMÉTRICOS
Temperatura de transição
Medida em triplicata
Calorimetria exploratória diferencial modulada (DSC TA)
Sob um fluxo constante de nitrogênio dentro de um
intervalo de -50ºC a 50ºC
ESTUDOS IN VITRO DE PERMEAÇÃO NA
PELE
Péle de cadáver das áreas abdominais
Armazenadas a -20ºC – Controladas através de uma lupa
Experimentos realizados durante 24 horas
•Temperatura 32ºC com 100 μL de
a) Indinavir ethosomal
b) Indivanir lipossomal
c) Solução etanólica indinavir
d) Solução de indivanir
•A pele foi lavada 10 vezes com um pano de algodão imerso em metanol
•Uma amostra de pele foi pesada, cortada com uma tesoura, posicionado em
um homogeneizador de vidro contendo 1 ml de metanol e homogeneizado
durante 5 minutos com um agitador elétrico
•A solução resultante foi centrifugado por 10 minutos a 7000 rpm
•O sobrenadante foi analisado por HPLC
•Determinação quantitativa do Indinavir foi realizada por HPLC utilizando
65:15 (vol / vol) dihidrogenofosfato de amônio (10 mM) com o ácido 1heptanesulfonic (1 mM) em pH 4,8 misturada com acetonitrila como fase
móvel a uma vazão de 1,0 mL / min
•As concentrações de indinavir foram comparadas com uma curva de
concentração padrão de indinavir em fase móvel.
•Para análise estatística foi usado ANOVA e seguido pelo teste Tukey de
comparação múltipla.
RESULTADOS

MET
vesículas com uma forma
esférica (Figura 1, A)

MEV
superfície lisa
características vesicular (Figura 1, B).
Na otimização formulações
para aplicação transdérmica
tamanho e eficiência do armazenamento
são os principais parâmetros,
desempenhando um papel decisivo na
determinação do fluxo.
Variando os fosfolipídios
(1,0% para 3,0% wt / vol)
e concentração de etanol
(25% a 45% vol / vol)
obteve-se uma mudança no tamanho
vesicular variando de 112 nm e 242 nm
e eficiência no encapsulamento de 83% para
97%.
O eixo x representa as diferentes formulações contendo concentrações variadas de
etanol (25% a 45% vol /) e fosfolipídios (1% a 3% em peso / volume), e o eixo y
representam tamanho vesicular (nm) e eficiência percentuais do encapsulamento
obtidos a partir de várias formulações ethosomal, respectivamente.
A formulação lipossomal etanólica selecionada
para estudos de permeação cutanea
com 3,0% (wt / vol) PC de soja, 45% (vol / vol) de
etanol foi selecionada para estudos de permeação
cutânea.
Essa formulação apresentou a melhor eficiência de
encapsulamento (96,71% ± 1,4%).
Tamanho (147 ± 4,5 nm).
Um ótimo índice de polidispersão (0,12 ± 0,03) da formulação potenciada para
utilização, na medida em que, indicou a homogeneidade na formulação
As temperaturas de fusão de fosfolipídios nos
sistemas ethosomal (Tm) foram avaliadas por DSC
com o objetivo de demonstrar a fluidez bicamadas
lipídicas.
Varreduras de DSC mostraram temperaturas de
transição de -9,16 ° C e 16,62 ° C para etosomas
sem fármacos e lipossomas respectivamente.
Ethosomes
carregados
com
fármacos
apresentaram temperaturas de -10,78 ° C, um valor
mais baixo em comparação aos etosomas sem
fármaco
Os estudos de estabilidade foram realizados em
lipossomas etanólicos armazenado a (4 ° C e 25 ° C) ±
1 ° C por 120 dias.
TEM
não revelaram nenhuma diferença significativa
na forma lamelar em qualquer temperatura.
DLS
revelou um aumento no tamanho dos lipossomas
etanólicos armazenadas a 25 °C, enquanto que as
formulações armazenadas a 4 °C não apresentou
variação de tamanho significativo.
O potencial de liberação transdérmica
lipossomas etanólico
através da determinação do fluxo através da
pele de cadáveres humanos
tempo de latência, a pele ea deposição da
droga
DISCUSSÕES
DISCUSSÕES
Avanços na compreensão dos processos fisiológicos levaram ao
desenvolvimento de novos transportadores de fármacos que são capazes de
controlar a liberação do fármaco, entregando os fármacos no local desejado
em uma taxa predeterminada.
MAIOR ADERÊNCIA AO TRATAMENTO E MELHORIA
DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO FÁRMACO.
No entanto, a maioria dos medicamentos são administrados via oral.
VIA QUE, ALGUMAS VEZES, LIMITA A BIODISPONIBILIDADE DE UMA
AMPLA VARIEDADE DE MEDICAMENTOS.
INDINAVIR - pH; extenso metabolismo de primeira passagem; meia vida curta;
DISCUSSÕES
• A AIDS é um dos maiores desafios enfrentados pela comunidade
médica.
• Tipos de HIV: HIV-1 (infecção mundial) HIV-2 (áfrica).
• Os medicamentos anti-HIV tentam bloquear a replicação viral,
inibindo a transcriptase reversa, a integrase e a protease.
• O tratamento bem sucedido à AIDS requer níveis sistemicos
constantes do fármaco.
• A manutenção desses níveis constantes do fármaco pela via
transdermica usando lipossomas etanólicos pode ser uma
estratégia promissora na luta contra a AIDS.
DISCUSSÕES
Com base nisso, o INDINAVIR foi formulado, caracterizado e avaliado quanto a
absorção transdermica.
• ↑ [etanol]; ↓ tamanho da partícula.
Lasic et. al. Propuseram que o etanol provoca uma
alteração da carga líquida do sistema, conferindo um
certo grau de estabilização estérica que pode,
finalmente, levar a uma diminuição de partícula.
• A melhor formulação, dentre as preparadas, foi a
que continha maior concentração de etanol e de
fosfolipídeos, pois apresentou um ótimo tamanho e
maior encapsulamento de fármaco, o que
proporciona um modo de entrega seguro (Verma
D.D., 2003).
DISCUSSÕES
Estudosde
defluxo
permeação
in vitroobtido
(célulaatravés
de difusão
de Franz),
fornecem etanólicos,
A•eficácia
transdérmico
do sistema
de lipossomas
informações
importantíssimas
o comportamento
do produto
in vivo.
podem
ser justificada
com basesobre
na dupla
função realizada
pelo etanol
presente na
formulação etossomal. Maior fluidização das bicamadas lipídicas, tanto nas
• A quantidade
de fármaco
que lipídios
se difunde
pele, determina
a
vesículas
lipossomais
e nos
doatravés
estratodacórneo,
proporcionando
assim
quantidade
de fármaco disponível
para absorção.
uma
maior maleabilidade
às vesículas
e reforçando a permeabilidade da pele
(Touitou E., 2000.)
x
4,32
x
x
6,3
2,06
DISCUSSÕES
• O perfil de deposição de indinavir na pele também foi melhor no
lipossomos etanólicos quando comparada com outras formulações,
possivelmente como resultado de um efeito combinado do etanol e
fosfolipídios, apoiado à natureza lipofílica do fármaco, fornecendo assim
um modo sustentado para entrega do fármaco, durante um maior período de
tempo.
Estes resultados estão de acordo com observações anteriores sobre
lipossomas etanólicos carregado com melatonina(Dubey. V., 2007) e
metotrexato (Dubey V, 2007) que produziu uma acumulação considerável
desses compostos na pele.
DISCUSSÕES
• De acordo com Harrison et al, os lipídios do estrato córneo estão numa
fase sólida-gel a temperatura fisiológica.
• Conforme os resultados obtidos por Calorimetria Exploratória Diferencial,
os lipossomas etanólicos apresentam-se no estado líquido em temperaturas
acima de -10,78°C.
O que implica a capacidade dos lipossomas etanólicos de interagir com os
lípidios do estrato córneo (SC), levando possivelmente a interrupção,
extração e fluidização dos lipídios do SC.
• Outros grupos (Jacobs. M., 1988 e Honeywell. P.L., 2002), relataram
resultados semelhantes, de melhor interação das vesículas com a pele
humana.
DISCUSSÕES
• Houve um efeito sinérgico dos fosfolipídios e do etanol, confirmando a
perspectiva de entrega transdérmica do fármaco por esse sistema.
• Outros estudos, realizados anteriormente, não detectaram mudanças
específicas na histopatologia da pele quando da aplicação deste sistema.
•A natureza inerte e boa tolerância dos lipossomas etanólicos, apoiam o
desenvolvmento deste sistema como uma tecnologia inovadora para
administração transdérmica de fármacos.