Avanços da
Nanotecnologia
Farmacêutica-1
aula-2 (15/08/07)
Prof. Dr. Nelson Durán
MSc. Priscyla D. Marcato
MSc. Zaine Teixeira
IQ-UNICAMP
NANO (anão)
1 nm = 10-9 m
ALGUMAS DICAS
• Rede de Nanobiotecnologia:
(www.nanobiotec.iqm.unicamp.br)
• Google: MIT OpenCourseWare
(vários cursos completos)
• MIT OpenCourseWare BE.4625
(curso: Molecular Principles of Biomaterials)
Conferencia(http://www.ranf.com/pdf/discursos/numero/vila.p
df)
Rawat et al. Nanocarriers... Biol. Pharm. Bull. 29, 1790 (2006).
Kayser et al. The Impact of nanobiotechnology... Current
Pharm. Biotechnol. 6, 3 (2005).
3,5 bilhões de anos atrás - Células possuem
biomáquinas nanométricas que têm funções
como manipulação de material genético e
suprimento de energia.
Os químicos: Sintetizam polímeros (grandes
cadeias de moléculas feitas de minúsculas
unidades nanoescalares- monômeros) há muitas
décadas
NANO X MACRO
Abaixo de 100 nm as propriedades físicas e
químicas mudam
• Aumento da área superficial = maior
reatividade, maior penetração em células
• Novas propriedades
magnéticas
óticas,
elétricas
e
NANO X MACRO
NANO X MACRO
NANOBIOTECNOLOGIA É MULTIDISCIPLINAR
Medicina
Física
Nanotecnologia
Nanobiotecnologia
Química
Engenharias
Informática
Ciências
dos
Materiais
Biologia
Rotas de administração de ativos
• Oral
• Nasal
• Parenteral (intravenosa,
intramuscular, subcutânea)
• Dérmica
• Oftálmica
QUAL É A FUNÇÃO DOS
ATIVO (FÁRMACO OU
COSMÉTICO) NA
ÁREA ESPECIFICA DE
ATUAÇÃO?
O FÁRMACO DEVE ATINGIR
UM ALVO DEFINIDO COM
EXATIDÃO
CONTROLAR O MECANISMO
DE PENETRAÇÃO DO FARMACO
CÉLULAS OU TECIDOS
“MAGIC BULLET”
(Paul Ehrlich)
OS ATIVOS ESTÃO LONGE
DESTE DESENHO
O ATIVO É LOCALIZADO DE
FORMA PRECISA NO ALVO E NO
EXATO LOCAL DA AÇÃO
NANOTECNOLOGIA
NanoBioTecnologia
• Encapsulamento de ativos (drug delivery)
• Biosensores
• Máquinas e dispositivos Moleculares
• Implantes médicos
•Engenharia de tecidos
•Descoberta de novos medicamentos
SISTEMA DE LIBERAÇÃO
SUSTENTADA
 O princípio ativo é encapsulado em espécies
coloidais
como
lipossomas,
nano
e
micropartículas poliméricas ou lipídicas sólidas
 O princípio ativo pode estar associado a
nanopatrículas metálicas e nanotubos de
carbono
Nanopartículas: diâmetro  1m
Micropartículas: diâmetro > 1 m
Vantagens
• Melhora a estabilidade física e química de ativos
• Melhorar a biodisponibilidade
• Mantém o efeito do fármaco no tecido alvo
• Solubilizar ativos lipofílicos
• Minimiza os efeitos colaterais
• Reduz a toxicidade
• Diminui o número de doses/aplicações
Níveis Plasmáticos
LIBERAÇÃO SUSTENTADA
Convencional
Liberação ordem
zero
Efeitos adversos
Níveis tóxicos
Faixa terapéutic
Concentração
Min. efetiva
Sem efeito
Tempo/dosagem administrada
Dendrímeros
Nanoemulsões
Ciclodextrina
Lipossoma
Nanopartículas
Lipídicas Sólidas
Nanopartículas
Metálicas
Fulerenos
Nanopartículas
Poliméricas
Nanotubo de Carbono
Preparação e Caracterização de
Nanopartículas no Encapsulamento de
Ativos/Fármacos
Top-Down X Bottom-Up
http://www.barrettresearch.ca/teaching/nanotechnology/nano06.htm
Encapsulamento e liberação de
ativos: Método Botton-Up através
de moléculas auto-organização
de moléculas em solução aquosa
Moléculas anfifílicas
Reúnem dois grupos com polaridades
ou solubilidades opostas
lipídeos, surfactantes, proteínas
Estruturas de algumas moléculas anfifílicas típicas
(Surfactantes não-iônicos)
Alquilssulfato
(surfactante aniônico)
Sal de amina graxa
(surfactante catiônico)
Betaína (surfactante anfotérico)
Polimeros em bloco
fosfatidilcolina
(fosfolipídios)
EMULSÕES
Aula 2
Emulsão
É uma dispersão, na qual as fases são líquidos imiscíveis ou
parcialmente miscíveis. Neste sistema tem-se uma fase finamente
dividida (dispersa ou interna) em uma outra fase (contínua ou
externa), na presença de surfatante (agente emulsificante).
Classificação (tamanho das partículas da fase dispersa):




MACROEMULSÕES - >400 nm;
MINIEMULSÕES – 100 a 400 nm;
MICROEMULSÕES - transparentes, < 100 nm;
MÚLTIPLAS – a partícula dispersa já é uma emulsão
De Azevedo, 2004
Exemplos de tipos de emulsões
A
O
O
A
A
A/O
A/O
De Azevedo, 2004
Emulsão
múltipla A/O/A
H2O / óleo de parafina /
emulsificador (copoliol
cetildimeticona, lipofílico),
A/O
Gota a gota, rpm
H2O /emulsificador (SDS,
hidrofílico), espessante (poli
ácido acrílico),A
De Azevedo, 2004
Emulsão
A/C
H2O / CO2 (l ou supercrítico)
/ emulsificante
Neste caso não
é qualquer
emulsificante, tem que ter boa
solubilidade em CO2 com fracas
forças de dispersãodas cadeias
(perfluoropoliéter)
CF3 – (O-CF2- CF (CF3)n- (O-CF2)COO- NH4+

Conceito de tensão interfacial:
Forças de dispersão (as chamadas forças de London):flutuações
Presença de momentos de dipolo instantâneos inerentes às
moléculas, que se reorientam o tempo todo
Os momentos de dipolo de moléculas vizinhas são
correlacionados e em decorrência,moléculas vizinhas sempre se
atraem
Existe uma energia superficial decorrente da existência destas
forças intermoleculares, particularmente de dispersão
De Azevedo, 2004

Conceito de tensão interfacial:
Em conseqüência das forças intermoleculares, moléculas
sempre se atraem e a tendência é a minimização da área
superficial espontaneamente (variação da energia livre
superficial ou interfacial com a variação de área)
G
A
=

T,P ,n
A é a área de contato entre as fases
(Processo de aumento da superfície de um líquido)
De Azevedo, 2004

INSTABILIDADE:
 2 líquidos imiscíveis puros não podem formar uma emulsão:
A tensão interfacial de valor alto representa uma energia livre
interfacial alta, decorrente do aumento na área de contato entre
as fases
O sistema é instável termodinamicamente, se comparado à área
mínima que se conseguiria entre as duas fases quando
separadas.
De Azevedo, 2004.
A maior parte dos sistemas que interessam são metaestáveis ( A energia livre do
sistema tende a diminuir, mas este sistema é mantido no mesmo estado por uma
barreira de ativação)
Esta metaestabilidade está intimamente relacionada à presença de
moléculas anfifílicas (surfatantes) na interface.
(O/A,
interface)
Adsorve
na interface L-L como
um filme interfacial orientado
água
Provoca
abaixamento da tensão
interfacial, o que leva à
diminuição na energia livre
interfacial

óleo
óleo

óleo interface
Isto
permite uma maior área de
contato entre as fases
De Azevedo, 2004
Instabilidade física das emulsões
Mecanismos
Floculação
, sedimentação
(“creaming”)
irreversível
Coalescência
Envelhecimento
reversível
de
Ostwald,
separação de fases
Mecanismos
Irreversível
“quebra”
De Azevedo, 2004
Instabilidade Física das emulsões
Dispersão:
Movimento Browniano,
Difusão
Colisão efetiva
Forças atrativas entre as gotas,
formam-se agregados (floculação)
Rompimento do filme interfacial e coalescência
Paralelamente
a estes fenômenos, as gotas podem flotar
 ou sedimentar (tamanho)
“Ostwald Ripening”
De Azevedo, 2004
Mecanismos de estabilização
das gotas
Abaixamento
da tensão interfacial: A formação da emulsão
é mais fácil, mas existem outros fatores de estabilidade
Estérica:
força repulsiva
entre as cadeias (tamanho e
solvente);La Mer: floculação x
coagulação
Eletrostática: carga do
surfactante, adsorção de
contra-íons.Repulsão
governada pelo “overlap”
entre as camadas difusas
(potencial de Stern).
Drenagem
De Azevedo, 2004
gera
gradientes de
[surfatante] mas há cura
do filme
Outros: natureza do
filme interfacial,
viscosidade da fase
contínua
Estabilidade pela presença de partículas
sólidas
A
partícula
irá
permanecer no líquido
que
molha
melhor
(ângulo de contato)
Para
deslocar
a
partícula da interface é
necessário
realizar
trabalho
Partículas
de látex de
poliestireno estabilizando uma
gota de água
na interface água/octano
De Azevedo, 2004
Ordenamento das partículas de látex de
poliestireno ( 2,6 m )
na interface água/octano
Organizadas em
monocamada
com empacotamento
hexagonal
A mesma
monocamada, após
compressão: dobras e
filme pregueado.
Forças repulsivas laterais (originadas da carga superficial das partículas)
dá origem à monocamada altamente organizada.
De Azevedo, 2004
Seleção do surfatante como
agente emulsificante
Método do HLB (balanço
hidrofílico-lipofílico, Griffin, 1949).
O tamanho relativo dos
grupos determina a
curvatura preferida da
interface, o que
determina a fase dispersa
Selecionar o surfatante
ou uma combinação de
surfatantes
De Azevedo, 2004
hidrofilicidade
Jacob Israelachvili (University of
California) First World Congress
in Emulsions, Paris, 1993
O/A x A/O
Hierarquia de forças e o tipo de estrutura autoorganizada que estabiliza: emulsões e
micremulsões ocupam um lugar especial,
energia da ordem de kT.
Parâmetro de agregação crítica, CPP = Vap/ L A
HLB
é indicativo apenas do tipo de emulsão que pode ser esperada
,mas não é indicativo de sua eficiência (concentração requerida) ou de
sua contribuição à estabilidade da emulsão;
Muitas
maneiras de se calcular, ex: HLB= 20 * M
hidrofílico/
M
hidrofílico
+M
lipofílico
(não-iônicos)
O SONHO:
Relacionar estrutura
molecular do
surfatante com HLB
Exemplo:
Etoxilados, HLB=13
mas acima de 80 0C
forma emulsão A/O
De Azevedo, 2004
O PROBLEMA:
Não acompanha
mudanças nas
condições
(temperatura, cosurfatantes)
Método de PIT
Shinoda
e Saito (1969) definiram PIT como a temperatura na qual uma
emulsão O/A torna-se A/O;
Nesta temperatura as tendências hidrofílica e lipofílica do surfatante
são perfeitamente balanceáveis.
De Azevedo, 2004
Diagramas de fase para o sistema
surfatante/óleo/água
Winsor tipo
I
Winsor tipo
II
Winsor tipo
III
1
1
2
2
2
Região bifásica: tensoativo-água
predomina
1
tensoativo-óleo
predomina
3
2
2
microemulsão
3
diferentes tipos de diagramas de fase, dependendo dos valores relativos
de energia de interação do surfatante com óleo ou água; “tie line” seria
horizontal para afinidades totalmente balanceadas
De Azevedo, 2004
Preparação de emulsões
A
formação e estabilidade de uma emulsão é afetada pela seqüência e
metodologia de mistura ( ex: emulsificador adicionado em separado,
mistura de todos os componetes);
a energia introduzida influi no diâmetro das gotas;
forte tensão de cisalhamento pode levar a
coalescência e
polidispersidade (margarina O/W : componente de aroma na fase
dispersa)
Métodos
de micronização – energia mecânica ao sistema, promovendo
agitação dos 2 fluidos e do emulsificador (agitador)
ultra-som: produção repentina e subseqüente colapso das cavidades em
um líquido; crescimento da pressão local, subdivisão da gota (problemas
de reprodutibilidade, controle dos núcleos de cavitação
oMétodos
Preparação de emulsões
Métodos
Inversão
de fase: O/A
preparada
de
uma
emulsão A/O (menor
gasto energético)
PIT:
pequenas gotas
podem ser obtidas em T
um pouco abaixo do PIT;
consegue-se uma menor
tensão interfacial
Aplicação : preparação de microesferas
SEM, elétrons
secundários
(topografia)
A=5000x
(clorofórmio)
De Azevedo, 2004
Emulsão múltipla na
obtenção
de
microesferas
para
vacinas de DNA
De Azevedo, 2004
Bibliografia-M.M.M.DE ACEVEDO(2004)
[1] Rosen, M. J. Surfactants and Interfacial Phenomena, John Wiley & Sons: New Yok,
1989, 304-336.
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Emulsions: Formation and Stability., Langmuir 15, 6781-6791.
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[13] Lim, F. Bomedical Application of Microencapsulation, CRC Press, Inc. : Boca Raton,
USA, 1985.
FORMAÇÃO DE AGREGADOS POR
MOLÉCULAS ANFIFÍLICAS
Surfactantes
Tensoativos ou
agentes de superfície
“head” hidrofílica
“tail” hidrofóbica
Surfactantes em solução
cmc – concentração
micelar crítica – faixa
estreita de
concentração
Aparecimento de
agregados (micelas)
Myers, 1999; Fendler, 1982
Tipos de Micelas
Jönsson e col., 1998
Número de Agregação
 Número de monômeros de surfactantes em
cada micela no sistema aquoso
 constante em uma ampla faixa (~100 vezes cmc)
 da concentração
Formação de diferentes tipos de agregados
organizados: mesofases liotrópicas
Cristais Líquidos Liotrópicos
Efeito da temperatura
sobre os tipos de
agregados formados
por surfactantes nãoiônicos
(mesofases
termotrópicas)
Cristais Líquidos Termotrópicos
Vesículas ou lipossomas
multivesículas
Fendler e col. 1982
Parâmetro de crítico de empacotamento, p
Dependente da natureza do grupo polar e cadeia
hidrofóbica, concencentração, temperatura, pH etc.
Rodríguez-Hernández e col., 2005
MICELAS
Preparação de Micelas
Diálise
Equilíbrio
simples
Emulsão
o/a
‘casting’
liofilização
Gaucher e col., 2005
Modelos de Solubilização
Rangel-Yagui e col., 2005
 A introdução de moléculas ativas
não muda significativamente o
tamanho micelar.
 O método de preparação exerce
influência sobre a quantidade
encapsulada.
Lukyanov e Torchilin, 2004
Eficiências de Encapsulamento
 Métodos convencionais como
HPCL, absorbância no UV/VIS,
fluorescência.
 Comumente variam de 1,550%.
Lukyanov e Torchilin, 2004
Técnicas de Caracterização
 Espalhamento de luz dinâmico (DLS).
 Espalhamento de luz estático (SLS).
Espalhamento de nêutrons a baixos
ângulos (SANS).
 Espalhamento de raios X a baixos
ângulos (SAXS).
 Microscopia
eletrônica
transmissão (TEM).
de
Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
 Intensidade de luz espalhada por
partículas em suspensão em movimento
Browniano.
DT=kT/3d
cálculo do raio de hidratação, d (raio de
Stokes)
Edwards e Baeumner, 2006
Espalhamento de luz estático (SLS)
 Tempo médio de espalhamento
em função do ângulo.
Informações sobre raio médio,
massa molar e raio giratório.
Edwards e Baeumner, 2006
Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo
(SAXS) e Espalhamento de Nêutrons a
Baixo Ângulo (SANS)
Mede-se a intensidade de luz espalhada em
função do ângulo de espalhamento.
 Interferências
geradas
organizadas
(seguem
a
d=n/2(1/sen=n)
por
lei
Informações
sobre
tamanhos,
organizações de partículas.
estruturas
de
Bragg:
formas
e
Linder e Zamb, 1991
Small Angle X-ray Scattering
(SAXS)
http://srs.dl.ac.uk/arch/DALAI/SAXS.html
Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
 Feixe de elétrons incidentes que interagem com a
amostra de diferentes formas
Informações sobre tamanhos, formas e organizações
de partículas.
Aplicações de sistemas micelares
no carreamento de bioativos
 PEG-b-PDLLA no encapsulamento do anticancerígeno
Paclitaxel (formulação padrão com Cremofor EL, Taxol®)
Aumento da eficácia, diminuição de efeitos colaterais
Kim e col., 2004
 Micelas baseadas em PEG-PE foram modificadas com o
mAb 2C5, sendo reconhecidas por diversos tipos de
tumores, conforme estudos realizados no encapsulamento
de paclitaxel.
Lukyanov e Torchilin, 2004; Gao e col., 2003
Micelas de PEG-b-Phis foram relatados na forma micelar
quando em pH fisiológico. A acidificação do meio aquoso
provoca a ionização progressiva dos segmentos de
Polihistidina (Phis), expondo as moléculas encapsuladas.
Gaucher e col., 2005; Lee e col., 2005
NANOPARTICULAS MICELARES
COMERCIALIZADAS E EM
DESENVOLVIMENTO
FSD=female sexual dysfunction; PMH= post-menopausal hormone
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
CRISTAIS LÍQUIDOS
Técnicas de preparação similares aos de preparações
de micelas.
Sagalowicz e col. 2006
Modelos de Solubilização
Técnicas de Caracterização
 Medidas de viscosidade
Microscopia óptica com luz polarizada.
 Espalhamento de luz dinâmico (DLS).
 Espalhamento de luz estático (SLS).
 Espalhamento de nêutrons a baixos ângulos
(SANS).
 Espalhamento de raios X a baixos ângulos
(SAXS).
 Microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
Microscopia óptica
Identificação
das
fases
líquido cristalinos devido a
observação de diferentes
texturas.
Ex.
fase
hexagonal
apresenta textura do tipo
leque.
fase cúbica (isotrópica).
Microscopia óptica: exemplos de texturas
fase líquido cristalina lamelar
fase líquido cristalina hexagonal
Micrografias por cryo-TEM
de uma fase hexagonal
reversa (b); fase cúbica
hexagonal reversa de uma
dispersão de Dimodan U (c),
vesícula a partir de uma
fase lamelar a partir
de uma mistura de
Dimodan U e lactato de
sódio esteárico (d);
dispersão de micela de
solução de polissorbato
80 (e).
Sagalowicz e col. 2006
Aplicações
 Ciclosporina A, um peptídeo altamente lipofílico
empregado no tratamento de inflamações dérmicas, foi
encapsulado em fases cúbicas e hexagonais de
monoleína, sendo que foi observado um aumento da
permeação cutânea, além da diminuição da irritação.
Lopes e col., 2006
Aplicações
 Furosemida
como fármaco modelo em
sistema líquido cristalino para aplicação
oral. Foi obtida uma fase cúbica de
monoleína
que
aumentou
a
biodisponibilidade do medicamento, além
de promover uma liberação sustentada.
Sallam e col., 2002
LIPOSSOMAS
Preparação de lipossomas
Lipossomas: MLV, SUV, LUV
Preparação de lipossomas
Lipossomas: MUV, SUV, LUV
(http://www.avantipolarlipids.com/PreperationofLiposomes.html) jun/2006.
Modelos de Solubilização
Fendler, 1982
Caracterização de lipossomas
 Número de lamelas
 Distribuição de tamanhos
 Composição e concentração
lipídios,
além
da
eficiência
encapsulamento
de
de
Número de lamelas
31P
NMR (adição de Mn2+ que suprime o sinal P)
NMR dos fosfolipídeos da face externa dos
lipossomas.
 SAXS
 Cyo-TEM
Distribuição de Tamanhos
 DLS
 SLS
 HPLC-GEC-high-performance
chromatography
gel
exclusion
Conteúdo de fosfolipídios
 Métodos colorimétricos
 NMR
 HPLC
Outras caracterizações
 DSC na interação ativo/membrana
 NMR na organização das vesículas
Possibilidades de interações
Chorilli e col., 2004
Limitações da Primeira Geração
de Lipossomas
Segunda Geração de Lipossomas:
“Stealth”
Janof, 1999; Villanova e Consiglieri, 2000
Exemplo
injeção em tumores sólidos, de maneira a reduzir efeitos
colaterais e aumentar a citotoxicidade local. Após a
injeção tumoral aproximadamente 90% dos lipossomas
catiônicos permaneceram nos tumores.
Hashida e col., 2005
Geração Atual de Lipossomas
Exemplos
Os Lipossomas funcionalizados com transferina
aumentaram a eficiência de transporte para as células
endoteliais capilares cerebrais de uma droga modelo,
através de receptores de transferina, em comparação
com as formulações sem transferina.
Visser e col., 2006
Exemplos
Lipídios galactosilados em lipossomas no
encapsulamento da doxorubina promoveram
direcionamento da droga para hepatócitos.
Wang e col. 2006
EXEMPLOS DE LIPOSSOMAS APROVADO PELA FDA
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
PRODUTOS LIPOSSOMAIS EM FASE CLINICA I/II APROVADA PELA FDA
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
PRODUTOS LIPOSSOMAIS EM FASE CLINICA III E IV
APROVADA PELA FDA.
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
ALGUMAS VACINAS LIPOSSOMAIS EM DIFERENTES
FASES CLÍNICAS
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
OUTROS TIPOS DE AGREGADOS
ORGANIZADOS DE MOLÉCULAS
ANFIFÍLICAS
Complexos de poliíons (PIC) no
carreamento de bioativos.
Yamamoto e col., 2001
Nanotubos de peptídeos
Hidrólise parcial de -lactalbumina na presença de Ca2+
Condições mais severas de hidrólise do que na pasteurização
Graveland-Bikker and Kruif, 2006
THE EMERGING FIELD OF NANOTUBE BIOTECHNOLOGY
C. R. Martin and P. Kohli (NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY, 2,
29 (2003).
Yu et al. Bioconjugate Chem.
16, 1484-1487 (2005)
Nanofibras de Oligopeptídeo
Concentração
Globular e Filamentos  Fibras
Fung e col., 2003
Bibliografia
Chorilli, M.; Leonardi, G. R.; Oliveira, A. G.; Scarpa, M. V. Lipossomas em
formulações dermocosméticas. Infarma, 16 (2004), 75.
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AGRADECIMENTOS
REDE NANOTUB0S
DE CARBONO
CNPq/MCT
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