Virologia
Ano Lectivo 2010/11
Técnicas Diagnóstico
Virologia – Parte I
Testes imunológicos
 Baseiam-se em reacções antígeno-anticorpo:
 Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante
a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar
especificamente a um epítopo de um antígeno.
 Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de
induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar
através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.
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2
Anticorpo

Cadeias de glicoproteícas :
 Cadeias leves
 Cadeias pesadas

Região constante – local de activação
de outros elementos dos S. Imune;

Região variável – local de ligação ao
antigénio
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3
Anticorpo
Tipos de anticorpos

Policlonais
Obtidos a partir de diferentes
clones de células;

Monoclonais
Obtidos a partir de um único
clone de plasmócitos
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Classes de anticorpos no Homem
Imunoglobulinas
Características
IgG
Principal Ig sérica
Envolvida na activação do complemento e na opsonisação
IgM
Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)
Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados
IgA
Presente no soro, secreções e mucosas
Tem funções de opsonização.
IgD
Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como
receptor de antigénios.
Funções pouco definidas.
IgE
Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e
eosinófilos.
Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.
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Antígeno
Epítopo

Região do antígeno que reage com o anticorpo

Possibilidade de reacções cruzadas

Pequenas alterações na estrutura do antígeno,
entre
outras
factores,
podem
afetar
profundamente a ligação com o anticorpo
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Aplicabilidade

Papel importante:
Diagnóstico
Monitorização
Tratamento

Tipo de amostra varia conforme o
que queremos pesquisar
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Técnicas de Imunologia

Reacções Imunoenzimáticas

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)

Imunofluorescência

Imunocromatografia

ImunoHisto/Citoquímica

Análise Proteínas: Western Blot
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Reacções Imunoenzimáticas
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ELISA
Baseia-se numa reação imunoenzimática com detecção final por
espectrofotometria

Permite determinar a concentração
do analito

Calcular curva de calibração –
interpolar a concentração da
molécula a quantificar
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Tipos de ELISA
Sandwich
1. Poços revestidos com anticorpo especifico
2. Formação de complexos
3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria
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Tipos de ELISA
Indireto
1. Poços revestidos com antígeno específico
2. Formação de complexos
3. Ac conjugado com enzima
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria
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Tipos de ELISA
Competitivo
1. Ac específicos incubados com a amostra
2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag
3. Ac secundário
4. Adição do substrato
Quanto
maior
a
concentraçã
o de analito
menor
a
absorbância
5. Medição por espectrofotometria
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ELISA
Método automatizado
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ELFA
Reação imunoenzimática com detecção final por fluorescência.

Permite fazer um análise quantitativa
 Curva de calibração
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ELFA

Teste, geralmente, automatizado onde é
necessário:

Um cone sensibilizado com Ag,
serve, tanto de fase sólida como
sistema de pipetagem

Uma
barrete
reagentes
que
contem
necessários
para
os
a
realização da técnica
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Imunofluorescência
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Imunoflurescência

Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos

O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência


A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência
Fluorocromos mais usados

Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)

Rodamina
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Imunoflurescência

Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semiquantitativa

Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.

Tipos de Imunoflourecênca

Directa

Indirecta

Anti-complemento
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Imunofluorescência Indireta
 Etapas
▫ Fixação
(quando
queremos
pesquisar Ac as laminas vêm
revestidas com o respectivo Ag);
▫ Ac primário
▫ Ac Secundário (marcado com um
fluorocromo);
▫ Reagente de contraste
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Imunofluorescência anti-complemento
 Etapas
▫ Inactivação do complemento endógeno
▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo
▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado
▫ Ac conjugado que se liga ao complemento
▫ Detecção por microscopia de fluorescência
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Imunofluorescência
 Resultados
Permite localizar o
analito
EX: Membrana celular
Análise com o corante de
contraste
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Imunofluorescência
 Resultados
Pesquisa de anticorpos:
resultado positivo
(fluorescência verde)
Pesquisa de anticorpos:
resultado negativo
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Imunocromatografia
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Imunocromatografia

Teste qualitativo

Detecção antigénios virais ou anticorpos

Rápido e simples

Fase móvel: amostra diluida

Fase sólida: membrana revestida
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Imunocromatografia

Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C

Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex

Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis
devido às partículas de látex
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ImunoHisto/Citoquímica
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ImunoHisto/Citoquímica

Imunologia e citologia ou histologia

Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais,
proteínas)

Diferenças de expressão de proteínas

Localização celular do antigénio

Método qualitativo (maior parte dos casos)

Quantificação relativa
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ImunoHisto/Citoquímica

Método directo
 Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente
com o antigénio

Método Indirecto
 Ac primário que se liga ao antigénio
 Ac secundário marcado enzimaticamente

Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)
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ImunoHisto/Citoquímica

Principio do método
PO+ H2O2+ Dador de electrões  PO+ H2O2+ precipitado
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ImunoHisto/Citoquímica

Passos importantes

Fixação (sol. Alcoólica)

Permeabilizar (detergente)

Ac primário

Ac secundário conjugado

Substrato com agente cromogénio

Corante de contraste
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Imunohistoquímica

Imunohistoquímica
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Imunocitoquímica

Imunocitoquímica
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Análise Proteínas
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Western Blot

SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
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Western Blot

Blotting
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Western Blot

Detecção
1. Bloqueio da
membrana
2. Ac primário
3. Ac secundário
conjugado
4. Detecção
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Western Blot

Aplicação
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Fonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-1&user_login=HugoSousa1
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