Nanotecnologia
Mestrandos: Amanda Lima
Daniele Aimi
Denise Baldissera
Ricardo Lorenzoni
Professoras: Dra. Marta Palma Alves
Dra. Renata Raffin
Dra. Solange Fagan
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Fator de Impacto: 5,42
Introdução
• Antígeno Prostático Específico (PSA):
Glicoproteína – composta de 93% de peptídeo e 7 % de açúcar.
Produzido exclusivamente pelo tecido prostático.
Melhor marcador sérico que esta disponível para o diagnóstico e tratamento do
câncer de próstata.
Não existe tratamento curativo para o câncer de próstata, portanto, a melhor maneira
de tentar diminuir as taxas de mortalidade desta doença é detectá-la o mais cedo
possível - enquanto a patologia esta confinada a prostata.
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Introdução
PSA
(no organismo)
COMPLEXADO
com inibidores da
protease
LIVRE
α1- Antiquimiotripsina e α2-macroglobulina
Forma complexa predominante
e imunoreativo.
Não é
imunoreativo.
Podem ser determinados para
auxiliar no diagnóstico do câncer de
próstata.
Homens normais: < 4 ng/ml
Câncer: > 20 ng/ml
Quando os valores apresentam-se entre 4 e 20 ng/ml exames complementares devem
ser realizados.
Por isso, os ensaios de PSA são recomendados para auxiliar no diagnóstico ou
monitorar o tratamendo do câncer de próstata.
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Introdução
Ensaios para detecção do PSA:
Envolvem anticorpo de PSA monoclonal ou policlonal marcados com uma
enzima, fluorocromo ou isótopo radioativo.
Embora esses métodos sejam sensíveis e específicos, apresentam algumas
desvantagens:
Complexidade intrínseca;
Necessidade de reagentes;
Vários passos para execução;
Amplificação do sinal;
Tamanho de amostra relativamente grande;
Análise de dados complexos e de alto custo;
Portanto é altamente desejável que se desenvolva métodos de alta sensibilidade e
especificidade, detecção em tempo real, rápido, flexível, portátil, descartável e de
baixo custo.
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Introdução
Os Biosensores de NTC-FET podem satisfazer todos os quesitos referidos.
A superfície dos NTC pode ser funcionalizada com moléculas de receptores
específicos, que se ligam as biomoléculas desejadas.
Quando as moléculas alvo se ligam as moléculas receptoras que estão em
solução, as cargas das moléculas alvo alteram a condutância dos NTC-FET.
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Introdução
•
As biomoléculas alvo (PSA) devem estar dentro da faixa de comprimento de
Debye em torno do NTC-FET.
•
No entanto, a dimensão dos anticorpos utilizados como receptores, normalmente
é muito maior que o comprimento de Debye, o que implica que as moléculas alvo
não podem se aproximar do NTC-FET provocando alteração na condutância do
biosensor.
• A estratégia para superar esse problema é utilizar
receptores pequenos, como aptâmeros, peptídeos e
fragmentos de anticorpos de ligação, intercalados com
espaçadores, melhorando a ligação e interação entre a
molécula alvo e o biosensor.
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Introdução
No trabalho, os autores relataram a primeira demonstração bem sucedida de um um
biosensor de NTC-FET usando o 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester como
ligador e o 1-pyrenbutanol como espaçador. Os NTC foram funcionalizados contendo
diferentes relações ligador e espaçador.
a)
b)
c)
d)
e)
Ligador
Ligador: espaçador 1:1
Ligador: espaçador 1:3
Ligador: espaçador 1:9
Somente espaçador
A resposta foi monitorada em tempo real, apóos a introdução do complexo
antígeno prostático específico conjugado com α1- Antiquimiotripsina, em diferentes
concentrações (0,1 – 500ng/ml)
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MATERIAIS E MÉTODOS:
MATERIAIS:
•SWNTs – Carbon Nanotechnologies (USA)
•1-pyrenebutanoic acid succinimidyl – Molecular Probes (USA)
•HS(CH2)11(OCH2CH2)6OCH2NH2 (HS-OEG6-NH2) e
•HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH(HS-OEG3-OH) – Cos-Biotech (Korea)
•PSA-ACT complex and PSA-ACT complex monoclonal antibody (PSA-ACT mAb) –
Fitzgerald Industries International Inc. (USA).
•1-Pyrenbutanol (PB), human serum, bovine serum albumin (BSA) and other chemical
reagents - Sigma–Aldrich (USA).
•Platinum wire - Tae Won Scientific Corporation (Korea).
•Silicon Isolators - Sigma–Aldrich.
•Deionized water – Human Corporation (Korea)
FABRICAÇÃO DOS DISPOSITIVOS CNT-FET
Monocamadas auto-montadas de metil-termined octadecyltrichlorosilane em
pastilhas de óxido de silício foram gerados por padronização fotoresistente através
de fotolitografia
Mergulha a pastilha em solução OTS por 3 minutos
Remoção da PR com acetona
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Os SWNT foi preparados pela dispersão de nanotubos de carbono
purificado em 1,2-diclorobenzeno com ultra-som por 1 hora
A pastilha de óxido de silício
Mergulhada na solução SWNT (10s)
Esta etapa permitiu os SWNTs
serem adsorvidos em regiões
descoberta de SiO2
Lavadas com 1,2-diclorobenzeno
Secas com gás nitrogênio
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Após a montagem do CNT os eletrodos foram confeccionados e o
processo de fotolitografia foi realizado.
Para fazer a câmara de reação, um isolador de silicone foi anexado
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PREPARAÇÃO DA SUPERFÍCIE DO CNT PARA A DETECÇÃO EM SOLUÇÃO
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•Para a funcionalização da superfície não covalente do CNT, os dispositivos
CNT-FET foram incubados com soluções preparadas por 2h em temperatura
ambiente, seguido por lavagem com metanol para lavar qualquer reagente
em excesso.
•Para a imobilização covalente de proteínas do receptor na superfície da
CNT, cada dispositivo CNT-FET foram expostos a 20µg/ml de PSA-ACT
mAb em 10 mM de tampão PBS (pH 7,4) durante a noite em temperatura
ambiente.
•A não-reação dos grupos funcionais foram bloqueados por 100 mM de
etanolamina e cuidadosamente lavados com água deionizada por 6 h, e
depois secos com gás nitrogênio.
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PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE OURO
•As nanopartículas de ouro (AuNPs) foram sintetizados por redução de citrato
de sódio de uma solução aquosa HAuCl4
•Um volume de 0,5 ml de 50 mM HAuCl4 foi aquecido e 2,5 ml de solução de
citrato trissódico foi adicionado à solução em ebulição sob agitação vigorosa
•A solução foi fervida mais 15 min para completar a redução dos íons de ouro
e então agitada por mais 15 minutos e resfriadas à temperatura ambiente
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•Após a AuNPs foram tampadas com uma relação molar de 1:10 HS-OEG6NH2: HS-OEG3-OH- através da mistura de 9,0 ml da solução de ouro e 1,0 ml
de uma solução etanólica de HS-OEG6-NH2:HS-OEG3-OH para produzir uma
concentração efetiva de 0,5mM de HS-OEG6-NH2:HS-OEG3-OH
•Agitação por 6 horas à temperatura ambiente para a separação dos produtos
químicos desvinculados das AuNPs
•Em seguida, o sedimento foi ressuspandido em 10 mM de tampão PBS
•As AuNPs funcionalizadas foram armazenadas em 10 mM de tampão PBS a
4ºC para experimentos posteriores
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MEDIÇÃO ELÉTRICA
•As propriedades elétricas dos dispositivos CNT-FET durante a introdução das
proteínas-alvo foram medidos por um sistema de caracterização de
semicondutores conectado a uma estação de teste que faz o contato elétrico
com os eletrodos de fonte e dreno do CNT-FET .
•Os dispositivos foram estabilizados em solução tampão 10 mM PBS (pH 7,4),
e um fio de platina foi inserida como um eletrodo de porta (VG).
•Para o controle do sinal elétrico foi introduzida 5,0μl de solução tampão
•Uma substância com concentrações crescentes foi introduzida na câmara
usando volumes de amostra de 5,0 μl.
•Para analisar a sensibilidade, especificidade e seletividade do dispositivo CNTFET, o complexo PSA-ACT foi diluído com 10 mg/ml de soro humano para
produzir concentrações de 0,1, 1, 10, 50, 100 e 500 ng / ml.
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Resultados e discussão
Layout do dispositivo de e caracterização elétrica do CNT-FET
As imagens detalhadas de dispositivo CNT-FET são mostrados na fig. 1A
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Neste método, os padrões de rede CNT foram formados diretamente sobre uma
superfície de óxido de silício, sem moléculas ligantes e foram usadas como canal
para FETs.
A relação on-off foi baixa, porque a rede SWNT foi composta por dois
semicondutores e nanotubos de carbono metálico.
No entanto, o CNT-FET tem vantagens significativas para aplicações em sensores.
Em primeiro lugar, uma vez que o método de fabricação não usa todas as
moléculas vinculador, o possível sinal contaminação foi minimizado pelas
moléculas vinculador.
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Além disso, neste processo, como nanotubos de carbono foram adsorvidos sobre a
superfície de óxido de silício, a superfície tornou-se formadoras das camadas nãopolares de SWNT múltiplos.
As propriedades elétricas da CNT-FETs
foram medidos em tempo real na
temperatura ambiente.
A configuração experimental mostrado na
figura. 2 (a) indica que o campo elétrico
que foi aplicado aos CNT, através do
eletrodo de referência (gate), em relação à
fonte e dreno.
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As características da CNT-FET na solução tampão foram investigados, como mostrado na figura
2(b). A CNT-FET apresentou aumento na corrente dreno-fonte com tendencia ao gate negativo, mas
diminuia com o aumento da polarização de gate positivamente no sentido dreno-fonte de 50 mV. Este
resultado indicou que este aparelho apresentou características do tipo p no tampão PBS.
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Caracterização da superfície do nanotubo de carbono modificado com linkers
e espaçadores
No sistema biosensor geral, a sensibilidade do sinal específico está
intimamente relacionado com o padrão do ligante imobilizado na superfície do
sensor.
A sensibilidade do dispositivo CNT-FET pode ser reforçada através da
otimização da densidade superficial do ligante;
Para obter uma densidade de superfície ideal do ligante, o espaço entre
ligantes é importante para as proteínas alvo acessarem facilmente os
receptores imobilizados.
Assim, foi introduzido o design de superfície: espaçador (PASE: PB) na
superfície do CNT para melhorar a acessibilidade do alvo
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Para confirmar o padrão de imobilização dos receptores dependendo da relação molar
de vinculador e espaçador, cerca de 12 nm AuNPs modificadas com grupos amina e
hidroxila foram imobilizados na superfície CNT tratadas com produtos químicos, em
vez de receptores PSA-ACT mAb
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Figura. 3 mostra que AuNPs como receptores se ligam fortemente às linkers
imobilizadas na superfície do CNT, e que a distância entre os receptores, por área,
também é diferente, com uma razão molar de ligador ao receptor.
Quando o vinculador foi tratado sem espaçador na superfície do CNT,
nanopartículas compactas de Au foram imobilizadas (Surface A).
Além disso, ao aumentar a razão molar do espaçador, a distância entre AuNPs
aumentou (Surface B, C e D).
A imagem de MEV do experimento de controle sem qualquer tratamento
prévio, mostrou uma falta de AuNPs, como é o caso da superfície E, no qual a
superfície CNT foi tratado apenas com PB (Surface E na Fig. 3. ). Portanto, como
mostrado nos resultados acima, o controle da distância entre os receptores
usando o espaçador pode ser afirmado.
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Fig. 4 mostra a corrente de dreno versus característica
gate de voltagem do aparelho CNT-FET fixa a 0,01 V,
antes e após as modificações químicas e anticorpos na
superfície do CNT puro. Observamos, também, a partir
da curva de CNT puro que o (IDS) foi suprimida com o
aumento positivo de VG, indicando uma caractiristica
FETs tipo-p.
Após PASE: PB solução mistura e solução espaçador
só foram tratados na superfície do CNT puro por 2 h,
a condutância do dispositivo CNT-FET foi alterado
em ambos os casos, indicando que o ligador
selecionado e o espaçador tiveram sucesso quando
imobilizado na superfície do CNT.
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Então, a superfície modificada CNT foi exposta a 20 mg/ml de PSA ACT-mAb
em tampão PBS durante a noite.
A condutância no caso do dispositivo CNT-FET modificada com PASE PB foi alterado.
No entanto, no caso de um dispositivo CNT-FET modificado só com o espaçador, a
mudança na condutância não foi observada, indicando que o vinculador PASE
selecionado efetivamente, imobiliza receptores para a detecção de proteínas-alvo.
Além disso, o spacer PB conseguiu bloquear a ligação não específica na
superfície CNT. Portanto, PASE e PB são de uteis para a estabilização da superfície do
CNT.
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Detecção do complexo PSA-ACT no
soro humano pelo NTC-FET modificado
com um ligante e um espaçador
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Detecção do PSA-ACT
• Resposta do NTC-FET modificado somente com ligantes.
•Não houve alteração da condutância mesmo com adição de 500ng do PSA-ACT,
isto pode ser explicado porque o complexo PSA-ACT não se aproxima da superfície
do NTC dentro da distância do comprimento de Debye.
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Detecção do PSA-ACT
Para resolver esse problema, introduziram um espaçador.
Na proporção 1:1 de ligante/espaçador a alteração da condutância ocorreu quando
o NTC-FET reagiu com 500ng/ml.
Como a distância entre os receptores aumentou devido a adição de espaçadores
na superfície do NTC, as proteínas carregadas negativamente podem aproximarse dentro da distância do comprimento de Debye, afetando a condutância com
maior facilidade.
Entretanto a concentração mínima detectável do biossensor era ainda muito
elevada.
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Detecção do PSA-ACT
Para obter melhor sensibilidade de detecção, a superfície do NTC foi
funcionalizada na razão 1:3 ligante/espaçador.
A condutância aumentou gradualmente após a exposição dos NTC-FET ao
complexo PSA-ACT em concentrações crescentes.
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Detecção do PSA-ACT
Modificando a superfície na concentração 1:9, a condutância aumentou
gradualmente após a exposição ao complexo PSA-ACT em concentrações
frequentes 1,0-50 ng/ml, exceto para concentração 0,1 – 50 ng/ml de PSA-ACT.
A concentração mínima detectada foi a mesma que foi para o NCT-FET
modificado 1:3 e o sistema 1:9.
Este resultado mostra que a relação do sistema detectado na proporção 1:9 foi
maior, indicando melhor sensibilidade deste biosenssor.
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Conclusões
•
Biosensores sensíveis e específicos.
•
Esta estratégia possibilitou a construção de sistemas de biossensor CNTFET baseado reações antígeno-anticorpo.
•
Foi realizada a modificação da superfície dos NTC-FET, com diferentes
razões molares de ligantes e espaçadores, o que melhorou a sensibilidade
dos biossensores.
•
O método foi capaz de reduzir o limite de detecção para uma concentração
de proteína de 1,0 ng/ml,.
•
A estratégia da modificação da superfície CNT usando um espaçador na
superfície dos biossensores pode servir como um grande avanço,
permitindo várias aplicações importantes em proteômica e diagnósticos
médicos.
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