CONSELHO REGIONAL DE
QUÍMICA - IV REGIÃO (SP)
facebook.com/crqiv
twitter.com/crqiv
Princípios e Aplicações da Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Ministrante: Guilherme Julião Zocolo
Doutor em Química Analítica - Unesp/Araraquara
Contatos: [email protected]
Apoio
Araraquara, 15 de setembro de 2012
Observação: A versão original desta apresentação, com slides coloridos, no formato
PDF, está disponível na seção downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Princípios e Aplicações da Cromatografia
Líquida
de Alta Eficiência (HPLC)
Dr. Guilherme Julião Zocolo
E mail: gjzocolo1@gmail
E-mail:
[email protected]
com
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Aplicações da Cromatografia Líquida de Alta
Efi iê i (HPLC)
Eficiência
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Toxicologia
Cosméticos
Fármacos
HPLC
P ti id
Pesticidas
Alimentos
Pré-requisito:
Pré
requisito: a amostra deve ser solúvel
na fase móvel
Proteínas
Aminoácidos
Corantes
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Sistema de HPLC
Solvente
Coluna
Sistema
de dados
Injetor
Bomba
Detector
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Descarte
Histórico
Mikhael Semenovich Tswett (1906)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Mikhael Semenovich Tswett (1906)
“Cromatografia”
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
“Cromatograma”
“Método cromatográfico”
B i ht der
Berichte
d Deutschen
D t h Botanischen
B t i h Gesellschaft
G ll h ft
Método
componentes
distribuição
físico-químico
q
de
uma
diferencial
de
mistura,
destes
separação
p ç
que
em
envolve
um
de
a
sistema
heterogêneo bifásico:
1 - FASE ESTACIONÁRIA;
2 - FASE MÓVEL.
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Evolução
ç
das Técnicas Cromatográficas
g
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1906
Tswett – CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) ( )
extratos vegetais; coluna c/ CaCO3; éter de petróleo
1938
Izmailov e Shraiber – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD, TLC) extratos vegetais; placa de vidro c/ alumina
ERA da “Cromatografia Moderna”: Prêmios Nobel – 1937, 1938, 1939.
1941
Martin e Synge – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)
1952
Martin e James CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)
Martin e James –
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG GC)
Décadas de 1960/1970
Karr, Jentoft, Gouwn, Huber, Hulsman, Snyder e Kirkiland –
Karr
Jentoft Gouwn Huber Hulsman Snyder e Kirkiland
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE, HPLC)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Mecanismo de separação cromatográfica
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
A separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciadas
entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase
móvel
móvel.
FM
FE
FASE MÓVEL
amostra
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
AMOSTRA
FASE
ESTACIONÁRIA
CROMATOGRAFIA: CLASSIFICAÇÃO PELA POLARIDADE DA FASE ESTACIONÁRIA
FASE ESTACIONÁRIA
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionária polar.
Ex.: sílica gel
OR
RO Si OH
OR
Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionária de baixa
polaridade.
Ex. sílica de fase ligada C18
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE NORMAL: fase estacionária polar
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
OR
RO Si OH
OR
Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE NORMAL: fase estacionária polar
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
X=Cl
R’ = CN, Diol, Fenila, NH2
→Quando se utiliza
silica-gel
derivatizada
com
grupos
polares (fenila, ciano, amino,
diol), tais fases estacionárias
podem ser utilizadas tanto
para cromatografia em modo
normal (fase estacionária polar
à eluente apolar) ou em fase
reversa
(fase
estacionária
apolar à eluente polar).
Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE NORMAL: fase estacionária polar
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Eluem primeiro as substâncias
apolares que possuem uma menor
interação com a fase estacionária
polar.
p
a análise de substâncias insolúveis em água:
g
óleos,,
Aplicável
gorduras, lipídios. Destaca-se na separação de isômeros.
Fonte: Waters corporation
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Mecanismo de separação cromatográfica
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Fonte: Adaptado de Waters corporation
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Características das FASES NORMAIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Vantagens
Desvantagens
1. Versatilidade na mudança de
seletividade alterando as fases móveis e
estacionárias
1. Amostras iônicas são de difícil separação
e são mais viáveis de se separar por fase
reversa
2. Colunas estáveis quando se utiliza
solventes não aquosos
2. Controle da força de eluição menos
previsível e mais demorado que em fase
reversa
3. Uma grande variedade de substâncias
orgânicas são mais solúveis nos solventes
usados em fase normal (útil em LC
preparativa)
3 Pior resolução
3.
4. Decréscimo de p
pressão menor devido à
baixa viscosidade dos solventes
4. Ponto de ebulição
ç reduzido p
pode gerar
g
bolhas
5. Útil para amostras que possam se
decompor em soluções aquosas.
aquosas
5. Alto custo dos solventes orgânicos
Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANÇAS, FERNANDO MAURO
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Ganhos e Perdas em
FASE NORMAL
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Fases móveis em Fase Normal
Força de Eluição
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Baixa (solvente A)
Média
Hexano
Clorofórmio, acetonitrila, tetrahidrofurano
Forte (solvente B)
Isopropanol, metanol
Retenção aumenta com aumento da polaridade dos solutos.
Agentes de supressão iônica melhoram a resolução cromatográfica
Ácido acético ou fórmico para ácidos.
Picos assimétricos
Amônia ou trietilamina para bases.
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
EFEITOS DA FASE MÓVEL EM FASE NORMAL
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
► Solvente fraco (A): não-polar
0 5 < k < 20
0,5
► Solvente forte (B): polar
► Seletividade (α) é fortemente influenciada pela proporção do
solvente B utilizado na fase móvel.
► Seletividade (α) é ainda mais fortemente influenciada pelo tipo do
solvente
l
t B utilizado
tili d na fase
f
móvel.
ó l
► F.E.s
F E s (poder de retenção): sílica > amino > diol > ciano
► F.E.s
F E s (poder de separação): ciano > sílica > diol > amino
Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANÇAS, FERNANDO MAURO
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Efeitos da variação de solvente POLAR na separação
cromatográfica
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Condições
cromatográficas
B: Acetato de etila
A Ciclohexano
Coluna de silica
150x4,6 mmx5 µm
Vazão de 2 mL min-1
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Desenvolvimento de método em FASE NORMAL
Estratégias
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
A. Coluna Ciano (solvente A:
hexano;; solvente B:
propanol).
B. Verifique a presença de
cauda
d nos picos.
i
C. Mudar a proporção do
solvente B; substituindo
o tipo de solvente B
(diclorometano, ACN) e
sua proporção.Em último
caso substitua o tipo de
caso,
coluna (diol, amino,
sílica).
D Oti
D.
Otimize
i as condições
di õ da
d
coluna (L; diametro da
particula e vazão da fase
móvel.))
Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANÇAS, FERNANDO MAURO
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Fase ligada amino (NH2)
Análise de esteróides em sangue
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Fase ligada amino (NH2)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Amostra de suco de frutas:
uva, tomate laranja...
l
j
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE REVERSA
Fase estacionária de baixa polaridade – C2, C4, C8, C18.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Mecanismo de Interação em Fase Reversa
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Interações ANALITO X FE e FM X FM
(em ordem decrescente de intensidade):
Van der Waals
Dipolo – dipolo
Dipolo – dipolo induzido
Dipolo induzido – dipolo induzido
Interações residuais: pte. H
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE REVERSA:
Fase estacionária de baixa polaridade – C2, C4, C8, C18
R’ = C2, C4, C8 E C18
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
C2=
C4=
X=Cl
C8=
C18=
Modo de HPLC mais utilizado (~80%): compostos não iônicos,
compostos polares a mediamente apolares.
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Cromatografia de Fase Reversa (FR)*
FE menos polar que FM.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
C l
Coluna
F
Fase R
Reversa C18
C18:
Aplicação quase universal
((~ 70% das aplicações
p
ç
na literatura))
Permite análise desde substâncias hidrossolúveis
e/ou iônicas até substâncias lipofílicas.
*Vantagens:
Vantagens:
- Equilíbrio mais rápido
- Menor adsorção irreversível
-Água
g não influi na reprodutibilidade
p
-Sítios de adsorção mais homogêneos
-Eluição em gradiente facilitada
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Cromatografia de Fase Reversa (FR)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
ODS, RP-18, C-18
Si O Si
RP-8,
RP
8, C
C-8
8
Si O Si
Fenil
Si O Si
TMS C
TMS,
C-1
1
Si O Si
SOLVENTES MAIS COMUNS:
- Água
- Acetonitrila (ACN)
- MeOH
- Tetraidrofurano (THF)
ORDEM DE ELUIÇÃO
(crescente)
POLAR  APOLAR
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Cromatografia de Fase Reversa (FR)
FE menos polar que FM
FM.
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Fraco (solvente A)
Água
Forte (solvente B)
Metanol, Acetonitrila,
Tetrahidrofurano
Nomograma
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Agentes de supressão iônica melhoram a resolução cromatográfica
R-COO- + H+ pKa 4-5
R-COOH
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
-OH
-O- + H+
Ácido acético ou fórmico para ácidos.
trietilamina para bases.
Picos assimétricos
Amostras de ácidos carboxílicos fenólicos
Coluna: 
BONDAPAK C18
30 cm X 3,9 mm
FM: Água, com 5% HOAc
Detecção: UV 254nm
Tempo: 30 min.
pKa 10-12
O
OH
9. Ác. ferúlico
O
OH
OH
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
8. Ác. o-coumárico
OH
4. d-Catequina
OH
OMe
10. Ác. cinâmico
O
1. Ácido gálico 2. Ác. protocatecuico 3. Ác. p-OH-benzóico
O
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
6. Ác. salicílico
5. Ác. cafeico
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
OH
7. Ác. p-coumárico
Aplicação: antidepressivos tricíclicos
FASE REVERSA ((C18))
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Coluna: Zorbax ODS 5m, 150 x 0,46 mm
FM: ACN/Tampão 30:70 + 0,2% TEA e
0,2% TFA
Tampão Fosfato 25 mM pH 2,5
Fluxo: 1,0 mL/min
Detector: UV
O
N
1
N
CH3
2
NH
H3C
H3C
CH4
N
CH3
3
N
CH3
H3C
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
4
N
H3C
CH3
Aplicação: análise de tocoferóis –
FASE REVERSA (C18)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm
FM: MeOH a 1,0 mL/min
Detector: UV (e: 295 nm)
HO
CH3
CH3
CH3
O
CH3
  tocoferol
-tocoferol
CH3
CH3
CH3
HO
CH3
CH3
CH3
O
CH3
-tocoferol
CH3
CH3
CH3
HO
CH3
H3C
CH3
CH3
O
CH3
CH3
CH3
-tocoferol (vitamina E)
CH3
H3C
O
CH3
CH3
O
H3C
CH3
O
CH3
CH3
 Vitamina E - acetato
Vitamina
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
CH3
Aplicações das Principais Fases Estacionárias
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE ESTACIONÁRIA (Normais e Reversas)
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
‐ tubo: aço inoxidável 316 tratado; contém FE
* colunas capilares e nano: tubos de sílica fundida
Coluna guarda (pré-coluna): C18 (5 µm)
Coluna analítica:
C-18 250 x 4,6mm x 5µm
Coluna semi-preparativa:
C-18 250 x 21,2mm x 10µm
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
1/37
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cavalheiro, A. J. IQ‐UNESP
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Cavalheiro, A. J. IQ‐UNESP
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Otimização dos parâmetros envolvidos na
separação
p ç cromatográfica
g
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
CÁLCULO DO FATOR DE RETENÇÃO
Ç
((k))
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Equação de Purnell:
A Equação Fundamental da Resolução em HPLC
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Resolução (Rs)
N (  1) k '2
Rs 
.
.
4
 (k '2 1)
EFICIÊNCIA
Depende da
configuração
do sistema
FATORES FÍSICOS
SELETIVIDADE
RETENÇÃO
Dependem das características da
FM e FE do sistema
FATORES QUÍMICOS
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
1/37
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Efeito da concentração de metanol no tempo de retenção de
compostos analisados
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Efeito da Seletividade (α) sobre Rs
2. Mudanças na FE
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
‐ geralmente acompanhada por mudanças na FM
Ex. FEinicial = Metil; FEalternativas = C8, C18
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Efeito da Seletividade (α) sobre Rs
3 Mudanças na temperatura
3.
↑ 1 °C  ↓ k de 1-2%  ↑ α
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Journal of Chromatography A Volume 814, Issues 1–2, 24 July 1998, Pages 97–104
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Volume de Injeção x Máxima Resolução
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Para evitar a saturação dos sítios de interação da coluna, o que pode
causar uma piora na resolução cromatográfica , não se deve injetar um
volume
l
maior
i que 1% d
do volume
l
d
da coluna
l
vazia.
i
Cálculo do volume máximo
dxL, onde d=diâmetro em mm e L=comprimento da
coluna
l
em cm
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Otimização Cromatográfica
Modos de eluição em Cromatografia Líquida
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
%B
Isocrático
%B
Gradiente
Teq.
tempo
k’ = (tR – tm)/tm
 %B   k’
 k’   tR
 tR  W e  Int.
Teq.
tempo
k* = (20.F)/(Vm.%/min)
 %/min   k*
 k*   tR
 tR  W e  Int.
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Otimização Cromatográfica
M d Isocrático
Modo
I
áti ou Gradiente?
G di t ?
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Gradiente exploratório utilizado para testes iniciais:
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 mm
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN,
ACN 60
60’
Fluxo: 2,0 mL/min.
Amostra: < 50 uL; 50-100 mg
(0 5 - 1 mg/mL)
(0,5
Modo Isocrático possível
∆tr/tg < 0,25
0 25
1 < k’ < 10
Modo gradiente será
necessário
á i se:
∆tr/tg < 0,40
∆ tr/tg > 0,40
0,5 < k’ < 20
Onde ∆ tr = tr do último pico - tr do primeiro pico
/tg = tempo total de gradiente exploratóro
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
FASE REVERSA C-18 - AVALIAÇÃO DA AMOSTRA
GRADIENTE EXPLORATÓRIO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Modo Isocrático possível
tr/tg < 0,25
1 < k’ < 10
tr/tg < 0,40 0,5 < k’ < 20
Amostra muito retina, muito apolar
Usar THF ou fase reversa não
não-aquosa
aquosa (NARP).
(NARP)
Usar coluna menos lipofílica.
Modo gradiente será necessário
tr/tg > 0,40
Amostra muito polar.
Ácidos/Bases/Açucares
Controlar pH, força iônica.
Íon-par. Troca îônica.
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60’
Fluxo: 2,0 mL/min.
Detetor: DAD ou 254 nm
Amostra: < 50 L; 50-100
50 100 g
(0,5 - 1 mg/mL)
Amostra complexa
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Amostra fácil – modo isocrático possível
tR/tG = (24 – 19)/60 = 0,083  < 0,25
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tRp = 19 min.
i
tRu = 24 min.
i
Gradiente Exploratório
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60’
2 0 mL/min
2,0
mL/min.
Eluição isocrática possível
1 < k’ < 10
k’u = 7  % ACN = 1,7.t
k
1 7 tRu
1 7 24 = 40,8
40 8 %
R = 1,7.24
k’u = 20  % ACN = 1,7.t
k
1 7 tRu
30 8 %
R - 10 = 30,8
ACN/Água 40:60
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
ACN/Água 30:70
Resolução satisfatória
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Amostra mais difícil – modo isocrático possível - I
tR/tG = (24 – 9,5)/60 = 0,24  < 0,25
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tRp = 9,5
9 5 min.
min
tRu = 24 min.
min
Gradiente Exploratório
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60’
2,0 mL/min.
El i ã iisocrática
Eluição
áti possível
í l
1 < k’ < 10
k’u = 7  % ACN = 1,7.tRu = 1,7.24 = 40,8 %
k’u = 20  % ACN = 1,7.tRu - 10 = 30,8 %
ACN/Água 40:60
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
ACN/Água 30:70
Resolução insatisfatória
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Amostra mais difícil – modo isocrático possível - II
Otimização da FM
1
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1 Gradiente Exploratório
k’u= 7
ACN
2
k’u= 20
8
2
3
ACN/Água 30:70
3
6
ACN/MeOH
ACN/Água 40:60
6
9
7
MeOH 4
10
5
4
ACN/MeOHÁgua
20:25:55
MeOHÁgua
Á
50:50
7
5
ACN/MeOHÁgua
15:20:65
MeOHÁgua
Á
40:60
ACN/MeOHÁgua
23:30:47
%MeOH = 1,22 + 1,37(%ACN) - 0,004(%ACN)2
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
J. Chromatogr. A, 721:15 – 1996.
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Amostra mais difícil – modo gradiente - I
tR/tG = (23 – 2)/60 = 0,35  < 0,40
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
tRp = 2 min.
tRu = 23 min.
Gradiente Exploratório
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60’
2,0 mL/min.
Eluição isocrática possível
0,5 < k’ < 20
Modo gradiente
%IACN = 1,65.tRp – 9 = 1,65.2 – 9 = -5,7  0%
%FACN = 1,65.tRp + 10,3 = 1,65.23 +10 = 48%
%ACN/min
/ i = 48/10 = 44,8
8  k*  20.F/(V
20 F/(Vm.%min)
% i )  8,3
83
%ACN/min
/ i = 48/30 = 1,6
1 6  k*  20.F/(V
20 F/(Vm.%min)
% i )  12,5
12 5
0 a 47 % de ACN, 10’
2,0 mL/min. - 30o C
0 a 47 % de ACN, 30’
2,0 mL/min. - 60o C
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Resolução insatisfatória
Amostra mais difícil – modo gradiente - II
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1 Gradiente Exploratório
Ajustar % I e % F
k* = 5
5 %/min
35o C 2
6
65o C 4
8
9
10
k*= 17
1,6 %/min
3
0 a 47 % de ACN, 10’
2,0 mL/min. - 30o C
0 a 47 % de ACN, 30’
2,0 mL/min. - 60o C
0 a 47 % de ACN, 10’
2,0
, mL/min. - 60o C
0 a 47 % de ACN, 36’
2 0 mL/min.
2,0
mL/min - 60o C
7
5
0 a 47 % de ACN, 72’
2,0 mL/min. - 60o C
Col. 30 cm - 3,5 m
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Gradiente - Otimização
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1.
1
2.
3.
4.
5.
6
6.
Ajustar % Inicial
Aj
i i e % Final
i
de B
Otimizar k* (considerar tG)
Verificar influência do solvente B
Avaliar influência da temperatura
Ajustar configuração da coluna
O t
Outras
variáveis
iá i
Ajustar % Inicial e % Final de B
Mistura de Herbicidas: 9 feniluréias e 6
s-triazinas (J. Chromat. , 261:329 – 1983)
0-100% MeOH
50 min. (2%/min.)
40-100% MeOH
30 min. (2%/min.)
60-100% MeOH
20 min. (2%/min.)
50-100% MeOH
25 min. (2%/min.)
50-70% MeOH
10 min. (2%/min.)
50-80% MeOH
15 min. (2%/min.)
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Gradiente - Otimização
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1.
2
2.
3.
4.
5.
6.
Ajustar % Inicial e % Final de B
Oti i
Otimizar
k* ((considerar
id
tG )
Verificar influência do solvente B
Avaliar influência da temperatura
Ajustar configuração da coluna
Outras variáveis
Verificar influência do solvente B
Col.: C18 - 10 m
30 x 0,42 cm
1 mL/min - t.a.
Mistura de fenóis (J. Chromatogr., 214:35 – 1981)
% ACN
100
% MeOH
100
10
% MeOH
20
% ACN
60 min.
 tempo
0
60 min.
 tempo
0
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
60 min.
 tempo
0
Gradiente - Otimização
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1.
2.
3.
4.
5.
Ajustar % Inicial e % Final de B
Otimizar k* (considerar tG)
Verificar influência do solvente B
Avaliar influência da temperatura
Ajustar configuração da coluna
Aj t configuração
Ajustar
fi
ã d
da coluna:
l
comprimento, partícula, fluxo
Rs = 1,1
25 cm - 10 m
2 mL/min - 1040 psi
Rs = 1,3
25 cm - 10 m
1 mL/min - 520 psi
Rs = 1,5
50 cm - 10 m
2 mL/min - 2080 psi
Coluna C18 d.i. 0,46 cm
FM: 40 a 77% MeOH a 0,7%/min
Rs = 2
Mistura de Herbicidas:
9 feniluréias e 6 ss-triazinas
triazinas
(J. Chromat. , 261:329 – 1983)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
25 cm - 5 m
1 mL/min - 2080 psi
BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
‐
Permitem vencer a resistência à passagem da FM exercida pelas partículas da FE.
‐
u ção p p
p
Função: proporcionar fluxo constante e reprodutível de FM a todo o sistema.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS: ‐ composição da FM e fluxo precisos e exatos
‐ vazão contínua e livre de pulsações
‐ resposta rápida a alterações no fluxo e composição da FM – gradiente de eluição!!
‐ pressão máxima: 700 atm (10.000 psi)
‐ maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio, peek, teflon
‐ inércia química a solventes comuns
‐ manutenção simples
‐ reservatório de solvente ilimitado
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
BOMBAS DE VOLUME (FLUXO) CONSTANTE
Bombas mais utilizadas em CLAE
Vantagem: Capacidade de repetição dos volumes ou fluxos e, consequentemente, das áreas dos picos, mesmo com mudanças na viscosidade da FM ou bloqueio da coluna por partículas.
p p
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
BOMBAS DE VOLUME (FLUXO) CONSTANTE
BOMBA DO TIPO SERINGA
Collins; Braga; Bonato, 2006
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Lanças, 2009
BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
BOMBAS DE VOLUME (FLUXO) CONSTANTE
BOMBA DO TIPO PISTÃO RECIPROCANTE OU ALTERNANTE
BOMBA DO TIPO PISTÃO RECIPROCANTE OU ALTERNANTE
pistão conectado ao motor por meio de engrenagens e 1 EXCÊNTRICO
‐ escoam volumes constantes de forma não contínua ou pulsante
‐ bomba mais empregada em CLAE atualmente
bomba mais empregada em CLAE at almente
‐ adequada para pressões elevadas
‐ reservatório de FM: ilimitado
‐ movimentos do pistão na câmara geram PULSOS
‐ aplicações: CLAE analítica e preparativa
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Lanças, 2009
SISTEMAS DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRAS (INJETORES)
INJETORES MANUAIS
INJETORES MANUAIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
‐ amostra deve ser aplicada na coluna pressurizada na forma de uma banda estreita
‐ válvula de introdução de amostra mais comum: válvula de 6 pórticos (orifícios)
loop para escala analítica
‐ alça de amostragem ou loop: comprimento e diâmetro interno definem seu volume
(µL))
(µ
loop para escala preparativa
(mL)
http://www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
SISTEMAS DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRAS (INJETORES)
INJETORES MANUAIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
VISÃO ESQUEMÁTICA DO FUNCIONAMENTO DA VÁLVULA DE 6 PÓRTICOS
POSIÇÃO DE CARGA LOAD
saída da amostra
entrada da amostra
alça de amostragem (loop)
2
3
1
4
6
coluna
entrada do eluente
2
5
3
1
4
6
5
POSIÇÃO DE INJEÇÃO INJECT
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
1/37
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Função do detector: identificar a presença de substâncias de
interesse que estejam eluindo da coluna cromatográfica.
cromatográfica
Característica desejáveis:
- alta sensibilidade e baixo limite de detecção
- ampla faixa de linearidade
- confiável e reprodutível
-fácil de operar e manter
-informação
informação qualitativa e quantitativa
-não destruição do soluto
-insensibilidade a mudanças na FM e de T
- resposta
t rápida
á id e lilinear a alterações
lt
õ d
das concentrações
t õ d
dos solutos
l t
-baixo nível de ruído
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
CLASSIFICAÇÃO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
De acordo com as propriedades medidas:
Detectores de propriedades do eluente: medem a variação de
propriedades do eluente (ex. constante dielétrica)
Detectores de propriedades do analito: medem propriedade física ou
química do analito (ex
(ex. fluorescência)
De acordo com o tipo de resposta:
Detectores
etecto es se
sensíveis
s e s à co
concentração:
ce t ação resposta
esposta p
proporcional
opo c o a à
concentração de um componente no eluente (ex. UV, fluorescência).
Detectores sensíveis ao fluxo de massa: resposta proporcional à
quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector
por unidade de tempo (ex. eletroquímico, espalhamento de luz).
De acordo com a seletividade:
Detectores universais
Detectores seletivos
Detectores específicos
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES BASEADOS NA ABSORÇÃO DE LUZ C O S S
OS
SO Ç O
U
UV/VIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Faixas de λ utilizadas:
Ultravioleta: 190 - 400 nm
Visível: 400 - 800 nm
Espectro eletromagnético
1/37
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
1/37
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1ε
2
LEI DE LAMBERT-BEER
Leitura = Unidade de Absorbância (UA)
1 UA = Depreciação da luz incidente em 90 %
Comprimento de onda
λ máximo
S l
Solvente
t
ε máximo
pH
Temperatura
> Sensibilidade
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTOR NO UV/VIS DE COMPRIMENTO DE ONDA FIXO
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2







Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTOR NO UV/VIS DE COMPRIMENTO DE ONDA VARIÁVEL
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2




Lâmpadas: deutério – UV
tungstênio - visível
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTOR NO UV/VIS COM ARRANJO DE /
FOTODIODOS (DAD)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
‐ arranjo de diodos: série de fotodiodos posicionados lado a lado num cristal de
silício de modo que cada λ difratado pela grade atinja um diodo.
‐ a absorbância de uma amostra pode ser determinada em todos os λ de modo
simultâneo.
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTOR -UV/VIS
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Qual o comprimento de onda ideal para a
análise quantitativa ?
mAU
OH
500
OH
O
O
215 nm
223 nm
252 nm
300
100
250
300
350
nm
max = > 
> sensibilidade
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
280 nm
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Detector Eletroquímico
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
Espectrômetros de massas (HPLC‐MS/MS)
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
DETECTORES
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Comparação da resposta de alguns detectores
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
TAMPÕES EM CLAE
Tampão
pKa
Faixa
UV limite
Ácido Trifuoracético (TFA)
H3PO4/KH2PO4 ou K2HPO4
>> 2
1,5-2,5
210 nm (0,1%)
2,1
7,2
12,3
< 3,1
6,2-8,2
11,3-13,3
< 200 nm (0,1 %)
Ácido cítrico/K3 citrato
3,1
4,7
5,4
2,1-6,4
230 nm (10 mM)
Ácido fórmico/Formiato de K
Ácido acético/Acetato de K
KHCO3 ou K2CO3/Ácido acético
3,8
2,8-4,8
210 nm (10 mM)
4,8
3,8-5,8
210 nm (10 mM)
6,4
6
4
10,3
5,4-7,4
5
474
9,3-11,3
< 200 nm (10 mM)
Bis-tris propano.HCl/Bis-tris propano
6,8
9,0
5,8-7,8
8,0-10,0
215 nm (10 mM)
225 nm (10 mM)
Tris.HCl/Tris
NH4Cl/NH3
1-Me-Piperidina.HCl/1-Me-Piperidina
Et3N.HCl/Et
N HCl/Et3N
8,3
7,3-9,3
205 nm (10 mM)
9,2
8,2-10,2
200 nm (10 mM)
10,1
9,1-11,1
215 nm (10 mM)
11 0
11,0
10 0-12 0
10,0-12,0
< 200 nm (10 mM)
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Algumas Dicas
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Gradiente otimizado
T
Tempo
(min)
( i )
% H2O
%M
MeOH
OH
0
70
30
15
35
65
17
0
100
20
70
30
25
70
30
Tempo de equilíbrio de 8 min
Tempo de equilíbrio de 3 min
Fique atento ao tempo
de equilíbrio da sua coluna
Ácido ácetico 0,1 % foi usado como
supressor iônico
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
O que você
ê não
ã deve
d
fazer
f
em HPLC
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
Agradecimentos
M
i
n
i
c
u
r
s
o
s
2
0
1
2
• Ao Conselho Regional
g
de Química - CRQ-IV
• Aos Participantes do Curso
Contato
Guilherme Julião Zocolo
E-mail: [email protected]
Quaisquer dúvidas estarei sempre a
disposição
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
MinicursosCRQ‐IV–PrincípiosdaHPLC
Princípios da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Dinâmica 1
1. O entendimento do processo cromatográfico e dos fatores de retenção (k’), seletividade () e
eficiência (N) é fundamental para o desenvolvimento racional de um método cromatográfico.
Assim sendo, explicar objetivamente:
a) O que é força de eluição e qual a sua influência na distribuição de cada componente
de uma mistura de substâncias orgânicas entre as fases estacionária (FE) e móvel
(FM);
b) O que é seletividade cromatográfica? Cite exemplos de solventes e adsorventes com
seletividades diferentes.
c) O que é eficiência cromatográfica?
2. Quais as vantagens e desvantagens do uso dos modos de eluição isocrático e gradiente?
3. Para avaliar a qualidade de uma coluna de CLAE, quais parâmetros (cite pelo menos três)
devem ser freqüentemente monitorados e o que eles podem indicar?
Apoio–CaixaEconômicaFederal
MinicursosCRQ‐IV–PrincípiosdaHPLC
Princípios da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Dinâmica 2
1. a. Qual a característica mais importante de um detetor em sistema de cromatografia
líquida? Por que? Quais detetores satisfazem essa característica?
b. Considerando sensibilidade e seletividade, que detetores seriam mais indicados
para analise quantitativa em CLAE das misturas abaixo:
I.
Álcoois e aminas saturados – industria de alimentos.
II. Antioxidantes polifenólicos – presente em medicamentos fitoterápicos.
III. Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos – presentes na fuligem resultante
da queima da cana-de-açúcar – amostra ambiental – concentrações
na ordem de ng mL-1 (ppb)
Apoio–CaixaEconômicaFederal