Staphylococcus Dra. Elsa Masae Mamizuka USP Dr. Antônio Carlos Pignatari Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia LEMC Introdução a cocos Gram-positivos Características do Gênero Staphylococcus Staphylococcus aureus Enzimas Extracelulares Testes de aglutinação rápida para coagulase Padrões de Hemólise Regulação de Fatores de Virulência Staphylococcus epidermidis Outras espécies de Staphylococcus Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina Resistência aos Antibióticos Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina) Resistência à Vancomicina Detecção da VISA/VRSA Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma índice Introdução a cocos Gram-positivos Os cocos Gram positivos (CG+) compõem um grupo de grande importância clínica. São responsáveis por inúmeras e variadas afecções e síndromes. Os CG+ anaeróbios facultativos de importância clínica pertencem a uma de duas famílias: Micrococcaceae ou Streptococcaceae Pesquisa de catalase na bactéria Introdução a cocos Gram-positivos A partir da caracterização da amostra como CG+ através da coloração de Gram, a determinação da família é feita pela prova da catalase. A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio. catalase 2H2O2 2H2O + O2 Introdução a cocos Gram-positivos + Micrococcaceae As bactérias desta família são catalase POSITIVAS Streptococcaceae As bactérias desta família são catalase NEGATIVAS Características do Gênero Staphylococcus Esta estrutura característica lembra cachos de uva. Características do Gênero Staphylococcus As sp mais importantes na clínica S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis S. schleiferi S. simulans S. capitis S. sciuri S. cohnii S. warnei S. lentus S. xylosus S. caseolyticus S. hyicus S. saprophyticus S. caprae S. gallinarium S. hominis S. chromogenes S. kloosii S. intermedius S. equorum S. arlettae S. delphini S.saccharolyt. S. haemolyticus S. auricularis S. aureus Características do Gênero Staphylococcus As mais importantes no laboratório clínico são: S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis S. schleiferi S. simulans S. capitis S. sciuri S. cohnii S. warnei S. lentus S. xylosus S.saccharolyt. S. caseolyticus S. saprophyticus S. hyicus S. chromogenes S. gallinarium S. intermedius S. equorum S. auricularis S. arlettae S. aureus S. delphini S. kloosii S. caprae S. hominis S. haemolyticus Staphylococcus aureus De todas as espécies do gênero, o S. aureus é o mais importante. É responsável pelo segundo maior número de infecções em seres humanos. O S.aureus está presente no trato respiratório superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da população em geral, e assim permanece sem causar doença em condições normais. Características do Gênero Staphylococcus O gênero Staphylococcus é composto por várias espécies: S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis S. schleiferi S. simulans S. capitis S. sciuri S. cohnii S. warnei S. lentus S. xylosus S. caseolyticus S. hyicus S. saprophyticus S. gallinarium S.saccharolyt. S. caprae S. hominis S. haemolyticus S. chromogenes S. kloosii S. intermedius S. equorum S. delphini S. arlettae S. auricularis S. aureus Staphylococcus aureus O nome “aureus” significa “dourado” em latim, qualidade atribuída ao pigmento amarelado característico produzido pela bactéria. Enzimas Extracelulares A enzima extracelular mais importante é a coagulase. A produção de coagulase é exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critério para a identificação de uma amostra como pertencente à espécie. coagulase Fibrinogênio Fibrina protrombina Estafilotrombina Causa coagulação Fatores de Virulência do Staphylos Staphylos não é o único que produz coagulase Staphylococcus aureus No laboratório clínico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactéria em questão é inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espécie é S. aureus. Se não coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente Staphylococcus aureus Proteína A (SpA) Tem a habilidade de se ligar à porção FC de IgG, impedindo, portanto que ela sirva de fator de opsonização na fagocitose. F ab IgG S. aureus Fab Fc SpA (Atn) Testes de aglutinação rápida para coagulase • • • • • • • • • • Testa a presença de proteina A e fator de coagulação (clamping factor) Fornece resultado + em 5 a 20 seg. Mostra correlação de 80% com mét.classico preço e mbalagem com 150un. U$116.00 Teste de aglutinação do latex azul para detecção do clumping factor e protein A associado à Staphylococcus aureus Resultado em 60 seg Sensibilidade/especificidade: 99/92% Inclui partícula de latex , cartão p/teste, haste, e controles positivo e negativo Preço: embalagem de 105 um. U$ 105.62 Validade 18 meses Padrões de Hemólise esverdeado Regulação de Fatores de Virulência Os fatores de virulência produzidos por S. aureus não são expressados a toda hora, são dependentes da fase de crescimento da bactéria. no de células Proteína A adesinas coagulase hemolisinas Toxinas Alimento em abundância alimento Taxa estacionária Proteína A adesinas coagulase hemolisinas toxinas tempo Staphylococcus epidermidis A segunda espécie mais importante do gênero Staphylococcus é o Staphylococcus epidermidis. O Staphylococcus epidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores. Importante na infecção hospitalar Staphylococcus epidermidis O Staphylococcus epidermidis é uma espécie bem menos virulenta do que S. aureus. Não apresentam a produção de coagulase e algumas cepas apresentam a produção muito tímida de certas enzimas proteolíticas. Todavia, isto não significa que S. epidermidis não possa ser patogênico. Esta espécie tem muitos fatores de adesão e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses, stents, etc.). Staphylococcus epidermidis O Staphylococcus epidermidis é um risco para pacientes imunocomprometidos e para usuários de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infecções generalizadas não-piogênicas. Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infecções em locais com prótese. Outras espécies de Staphylococcus No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina. Outras espécies de Staphylococcus No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina. Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica Gênero Catal. Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio Tétrade Estrito Staphylococcus + neg + neg não não Planococcus + + + neg + variável Micrococcus + neg + + variável variável Enterococcus neg variável + neg não não Streptococcus neg neg variável neg não não Aerococcus neg neg + neg não + Stomatococcus * variável neg neg neg não variável * aderente ao meio Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus Coco GRAM + Streptococcaceae Sensível à novobiocina? - - catalase + Micrococcaceae DNAse + Staphylococcus sp. + Staphylococcus não saprophyticus Coagulase - Staphylococcus grupo saprophyticus + Staphylococcus aureus Outras espécies de Staphylococcus No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua sensibilidade à novobiocina. Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus Espécies de Staphylococcus do gruponão saprophyticus (Grupo epidermidis) S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. capitis S. warneri Espécies de Staphylococcus do grupo saprophyticus S. saprophyticus S. cohnii S. xylosus Staphylococcus saprophyticus O Staphylococcus saprophyticus é de interesse clínico pois frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia. As outras espécies de Staphylococcus de interesse clínico causam infecções parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento é igual. Logo, o mais importante é discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa. Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina Resistência aos Antibióticos A primeira vez que um antibiótico foi usado, clinicamente, foi contra uma infecção por Staphylococcus aureus. Sir Alexander Fleming Resistência aos Antibióticos A penicilina funcionou bem contra infecções estafilocócicas até os anos 60, quando rapidamente começaram a surgir cepas resistentes à penicilina. Resistência aos Antibióticos Para contornar o problema, foi criado o beta-lactâmico sintético meticilina, que era resistente à ação das betalactamases. Anel b-lactâmico meticilina Resistência aos Antibióticos A meticilina funcionou bem até os anos 70, quando começaram a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA). meticilina Resistência aos Antibióticos Todo antibióticos beta-lactâmico se liga a enzimas que participam da síntese da parede celular chamadas PBPs (Proteínas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP é plenamente funcional mas não tem afinidade por beta-lactâmicos. penicilina PBP2a (PVN) ligadora de penicilina = enzima Resistência aos Antibióticos Devido a este mecanismo de resistência, as cepas MRSA/ORSA são resistentes não só à penicilina, mas a todos os antibióticos betalactâmicos! No laboratório clínico, deve-se reportar num antibiograma resistência a todos os beta lactâmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas às vezes são suscetíveis = ocorre apenas “in vitro”) quando a amostra for MRSA mesmo quando são sensíveis a alguns beta lactâmicos in vitro. A PBP2a é codificada pelo gene mecA. Este gene é carreado num elemento genético móvel chamado de Cassete Cromossômico Estafilocócico mec (SCCmec). Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA CIM meticilina Nivel de expressão mecA PBP2a bla Maioria Subp-R Freq de Subp-R BorderlineBORSA Baixo - - +++ 8 - - MOD-SA Baxo - PBP 1,3,4 + 8 - - Heterogênea Baixo + + + 1,5-3 200 107 Heterogênea Medio + + + 6-12 400 10-5 Heterogênea Alto + + + 10-200 800 103 Homogênea Alto + + +/- 800 800 1 Modalidade b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulação resistente. Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina) Para detectar a resistência a oxacilina no laboratório clínico, pode-se utilizar a técnica de disco difusão em ágar (Kirby-Bauer). Também pode-se detectar cepas MRSA através de um ágar screening de oxacilina que é ágar Müller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentração de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colônias indica resistência a oxacilina. Para a determinação da concentração inibitória mínima de oxacilina, o método de macrodiluição em caldo deve ser feito com caldo Müller-Hinton com uma concentração final de 4% de NaCl. Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxacilina ( meticilina) O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina é uma alternativa válida em casos de dúvida, com uma eficácia diagnóstica praticamente similar ao do método de referência de dilução em ágar hiper salino, a concentração crítica de 6 µg/ml de oxacilina (NCCLS,1997). Sistemas automatizados de micro diluição nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficácia suficientes para a detecção deste tipo de cepas, quando comparado aos métodos de referência (Sánchez, 1998), Um método alternativo, rápido e eficaz, embora nem sempre aplicável em rotina, é a detecção do gene mecA, por métodos de amplificação por PCR (Murakami et al., 1991). Este método teria a vantagem de não estar sujeito às condições do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande número de isolados, empregado em casos de dúvida com valores de CIM próximo do limite. Resistência à Vancomicina O mecanismo de resistência à vancomicina em Staphylococcus aureus ainda não foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes. Em S. aureus, ocorrem fenômenos bizarros e pouco ortodoxos em relação à resistência à vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colônias de VRSA é heterogênea, dando a impressão de contaminação. VSSA VRSA VRSA VSSA VRSA VRSA Resistência aos Antibióticos Em 1997, foi relatada no Japão, a primeira cepa clínica de Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tóquio. Resistência aos Antibióticos Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus resistentes à vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referência de queimados. Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001. ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu) Resistência à Vancomicina Outro fenômeno comum à oxacilina e a vancomincina é a ocorrência da resistência heterogênea (hetero-resistência) de S. aureus a estes antibióticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo consideradas sensíveis por métodos tradicionais de avaliação sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas podem conter subpopulações de células que apresentam um MIC 8g/mL, numa freqüência de 1:106 células. Estas células não são detectadas por métodos tradicionais (antibiograma e MIC). A única forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA é através de uma análise de populações, onde se inocula diferentes diluições de uma suspensão bacteriana em meio de cultura sóilido adicionado de concentrações crescentes de vancomicina. Resistência à Vancomicina Quando o resultado é plotado num gráfico obtém-se três possibilidades distintas de curva: VRSA heteroVRSA VSSA Sensível à Vancomicina Resistência à Vancomicina Observou-se também, por morfometria, que enquanto as cepas sensíveis à vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e VSSA Resistência à Vancomicina Parece portanto, que a resistência à vancomicina está ligada a uma exacerbação da síntese da parede celular, em que inúmeros genes regulatórios estariam envolvidos. Até agora, todavia, ninguém parece saber por certo quais genes estão envolvidos e até que ponto. Uma das grandes limitações no estudo do mecanismo de resistência à vancomicina em S. aureus é que a emergência da resistência é um fenômeno ainda raro. Existem ainda poucas cepas no Mundo atualmente Detecção da VISA/VRSA Detecção de VISA/VRSA Screening CIM Vancomicina 2 μg/mL Relatar como VSSA 4-16 μg/mL Difusão com disco + placa de BHI com vancomicina 6 μg/mL 32 μg/mL 14 mm, e/ou cresce Possível Possível Possível VISA VRSA VISA/VRSA > 14 mm, e não cresce Relatar como VSSA Checar Pureza da cepa e revisar resultados Notificar o médico e CCIH sobre possível identificação de VISA/VRSA, aguardar repetição dos testes Detecção da VISA/VRSA Detecção de VISA/VRSA Pelo laboratório de referência Confirmação CIM Vancomicina 2 μg/mL Relatar como VSSA 4-16 μg/mL Relatório Presuntivo VISA placa com vancomicina (BHI + vancomicina 6 μg/mL 32 μg/mL Relatório Presuntivo VRSA cresce Relatório Presuntivo VISA/VRSA Não cresce Relatar como VSSA Salvar o isolado Notificar o médico e CCIH sobre o resultado presuntivo de VISA/VRSA e enviar a cepa para Laboratório de Referência Resistência a Macrolídeos Os macrolídeos são antibióticos de primeira escolha só para Streptococcus pneumoniae, dentre os Gram positivos. Os macrolídeos utilizados na clínica são: •Eritromicina • Claritromicina • Azitromicina Único macrolídeo disponível por 40 anos!! O lançamento dos novos macrolídeos recentemente aumentou o uso destas drogas. Resistência a Macrolídeos Os macrolídeos são inibidores da síntese protéica bacteriana. Os ribossomos bacterianos têm duas subunidades: 30S e 50S. Resistência a Macrolídeos aa Os macrolídeos têm afinidade pela subunidade 50S do mRNA ribossoma bacteriano. tRNA ribossoma Os macrolídeos interferem na síntese de proteínas por bloquear o sítio ativo do ribossoma por impedimento estérico. Resistência a Macrolídeos A resistência aos macrolídeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A bactéria metilava o rRNA que perdia afinidade aos macrolídeos. A metilação é feita por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene é denominado erm [Erythomycin Ribosome Methilation]. Os genes erm geralmente estão localizados em elementos genéticos móveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns destes transposons residem em plasmídios. Os genes erm muitas vezes estão associados à presença de genes que conferem resistência à tetraciclina (genes tet). Resistência a Macrolídeos As lincosamidas (clindamicina) e as estreptograminas têm o mesmo alvo (50S rRNA) que é modificado pelos genes erm. Estes antibióticos são denominados como pertencentes ao grupo MLS Resistência a Macrolídeos Os genes erm conferem resistência tanto à eritromicina quanto à clindamicina. Mas a resistência à clindamicina só é detectada in vitro com a indução por eritromicina. Eritromicina (bom indutor) Clindamicina (mal indutor) erm- erm+ Achatamento do Halo Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma • Para Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, não testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso resultados sensíveis podem ocorrer. • S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e não precisam ser testados pois dificilmente apresentam resistência à SMXTMP, quinolonas e nitrofurantoína, (drogas de escolha). • Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensíveis à penicilina são sensíveis a todos os beta-lactâmicos. Testar pelo disco de penicilina e não de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimétrico, iodométrico ou da cefalosporina cromogênica(nitrocefin) considerar resistente a ampicilina e penicilina. • Staphylococcus resistente a penicilina é produtor de penicilinase e é resistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e ticarcilina. A associação de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato e tazobactam só terão atividade para os estafilococos oxacilina-sensíveis. Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma • Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4ª , Aztreonam( droga sem atividade contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e ertapenem) • Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem testes de aglutinação específicos para detectar este gene. • Staphylococcus spp podem desenvolver resistência durante a terapia com quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e não repetir o antibiograma anterior. • Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratório de referência. Prevalência de resistência Prevalência de resistência
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