Anomalias cromossômicas no início
do desenvolvimento de embriões
zebuínos produzidos in vitro
RITA MARIA LADEIRA PIRES2, RAFAEL HERRERA ALVAREZ2, ANA CRISTINA
LIGORI2, LIA DE ALENCAR COELHO,2,3,
ANTÔNIO CAMPANHA MARTINEZ2
Discente: Carolina de Souza Stuchi
Docente: Dra. M. Tercília V. de A. Oliveira
INTRODUÇÃO
• Atualmente o Brasil ocupa um lugar de destaque no emprego de
tecnologias relacionadas à transferência de embrião (TE).
Líder Mundial: 25 mil transferências
de embriões FIV por ano (Sociedade
Internacional de Transferência de
Embriões)
• Finalidade principal: multiplicação de animais que apresentam
características genéticas de alto valor de mercado.
Introdução
Melhora no processo de produção
Uso de embriões FIV
Problemas
• Mortalidade embrionária precoce
(abortos espontâneos);
• produção de bezerros “gigantes”;
• desvio da taxa de sexo (machos);
• problemas de saúde dos bezerros
nascidos.
Esses problemas têm sido atribuídos, entre outros, às alterações
celulares de ordem genética e estrutural dos embriões.
Existem evidências de que manipulações e/ou os métodos de
cultivo in vitro provocam alterações estruturais e funcionais nos
embriões.
Introdução
≠
• Estudos mostram a existência de anomalias cromossômicas em
embriões FIV e PIV bovinos de raças européias, mas não existem
informações para as raças zebuínas.
• Considerando que as raças zebuínas representam a grande maioria
da população bovina do Brasil e constituem o principal mercado das
empresas de FIV no País, informações são importantes.
Objetivo: caracterizar a incidência de alterações
cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de
desenvolvimento.
MATERIAL E MÉTODOS
Embriões FIV
1. Ovários de fêmeas zebuínas (Nelore) foram coletados em um
frigorífico  colocados em solução salina (NaCl a 0,9 %) +
estreptomicina (100 μg mL-1) + penicilina (100 UI mL-1) 
transportados ao laboratório em uma caixa térmica (30 a 35⁰C).
2. Os oócitos foram aspirados dos folículos ovarianos no período de 4
h após o abate  lavados em meio H-199, constituído de TCM
suplementado com Hepes (25 mM) + piruvato (2,73 mM) + sulfato
gentamicina (50 μg mL-1) + soro fetal bovino (5%)  avaliados por
critérios morfológicos (somente foram utilizados os que
apresentaram um cumulus oophorus intacto).


Material e Métodos
3.
Os oócitos selecionados foram colocados em meio B-199,
constituído de meio TCM 199 suplementado com Hepes (16,79
mM) + bicarbonato de sódio (28,57 mM) + piruvato de sódio (2,73
mM) + sulfato de gentamicina (50 μg mL-1) + albumina sérica
bovina-BSA (4 mg mL-1).
4.
Maturação dos oócitos:
Colocados em meio B-199 + estradiol 17β (1 μg mL-1) +
PMSG (20 UI mL-1) + hCG (10 UI mL-1)  incubação durante 24h
em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2).
5.
Fertilização in vitro:
Após maturados, os oócitos foram lavados em meio H-199 +
TALP-FIV e distribuídos em gotas sob óleo mineral. Cada gota
formada de 70 μL de meio TALP-FIV-PHE + 10 μL de suspensão de
espermatozóides à concentração de 10X106 mL-1 + 20 μL de
suspensão contendo 10-12 oócitos  colocados por 18 a 21h em
estufa (38,5⁰C e 5% de CO2) para a fecundação.
Material e Métodos
6. Os
oócitos
(presumivelmente
fecundados) foram lavados 
transferidos
para
gotas
de
desenvolvimento, constituídas de
78 μL meio B-199-CEOB + 2 μL de
fragmentos de células epiteliais de
oviduto bovino + 20 μL de
suspensão contendo 10 oócitos 
foram cultivados em estufa nas
mesmas condições.
7. Ao alcançar os estágios de 2; 4; 8;
16 células e mórula compacta os
embriões foram submetidos à
análise citogenética.
Material e Métodos
Embriões PIV
Utilizadas Mórulas Grau I e II produzidas in
vivo como controle da incidência de anomalias
cromossômicas.
•
Os embriões foram obtidos de vacas Nelore superovuladas com
FSH-LH.
1.
A lavagem dos cornos uterinos foi realizada por via cervical, no dia
7 após a inseminação (com sêmen do mesmo touro usado nos
embriões FIV).
2.
Os embriões foram avaliados morfologicamente e em seguida
foram submetidos ao processo de cariotipagem de forma
semelhante aos embriões FIV.
Material e Métodos
Análise cromossômica dos embriões
1.
Os embriões foram cultivados durante 8 a 12 horas em meio TCM
+ soro fetal bovino (10%) + colchicina (0,03 μg mL-1) 
transferidos para uma solução hipotônica de citrato de sódio 0,9%
(10 minutos a 20⁰C).
2.
Fixados sobre uma lâmina, com metanol:ácido acético (3:1) e
corados com Giemsa.
A análise cromossômica foi realizada em microscópio óptico.
Análise estatística de dados
Teste de Quiquadrado (χ2) com correção de Yates.
Coloração Usual com Giemsa
Permite a visualização e classificação
dos cromossomos por grupos de
acordo com o tamanho e a posição do
centrômero.
• Protocolo:
–
–
–
–
–
Envelhecer as lâminas em estufa a 60⁰C por um dia;
Hidrólise em HCl 1N a 60 ⁰ C por 7 minutos;
Mergulhar as lâminas em água deionizada gelada;
Lavar as lâminas em água destilada por 10 minutos;
Levá-las a um borel com solução de tampão Sorensen de 1 a 2
minutos;
– Mergulhar as lâminas em uma solução de Giemsa tamponada a 2%
por 5 minutos;
– Por fim, lavar as lâminas em água deionizada e colocá-las para secar.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
• 29,9% (32/107)dos embriões FIV analisados apresentaram
anomalias cromossômicas.
• Os embriões PIV (mórulas) apresentaram uma incidência de
13,0% (3/23).
não evidenciaram diferenças significativas entre os
diferentes estágios de desenvolvimento precoce do embrião
bovino (Figura 1).
Resultados e Discussão
39,1%
32,1%
26,7% 25%
24,1%
13%
Figura 1. Anomalias cromossômicas de embriões
zebuínos
FIV
em
diferentes
estágios
de
desenvolvimento (MoPIV = mórulas produzidas in vivo)
Resultados e Discussão
• Anomalias observadas: mixoploidia e poliploidia (para FIV e
PIV).
• A mixoploidia apresentou diferentes rearranjos:
– n/2n; 2n/3n; 2n/4n, 3n/4n;
– Em mais de 80% dos casos existiu uma linhagem celular normal
de 2n=60.
• A incidência de poliploidia (3n e 4n) dos embriões FIV:
– 0,9 % nos estágios de mórula;
– 10,3 % de 2 a 16 células.
Sugere que o desenvolvimento
de embriões poliplóides é menor
e aparentemente reprimido a
partir do terceiro ciclo celular.
Resultados e Discussão
• As poliploidias podem ser explicadas por erros na fertilização:
– penetração de mais de um espermatozóide no óvulo;
– não expulsão do segundo corpúsculo polar;
– fertilização de um óvulo diplóide por um espermatozóide.
• Dos 32 embriões FIV que apresentaram anomalias:
– 19 (59,4%) eram do sexo feminino;
– 13 (40,6%) do masculino (Figura 2).
Poderia eventualmente explicar o
maior número de nascimento de
bezerros machos oriundos de
embriões FIV.
Resultados e Discussão
59,4%
40,6%
Figura 2. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos
FIV conforme o sexo do embrião
CONCLUSÃO
Aproximadamente um terço dos embriões zebuínos FIV
apresentam anomalias cromossômicas e sua incidência
independe do estágio de desenvolvimento embrionário.
Obrigada!