Implementação de melhores soluções para
o controle microbiano em processos petrolíferos
Geert M. van der Kraan 1, Diana Jocksch 2, Monica Canalizo-Hernandez1, Bei Yin1,
Terry Williams 1 & Philip A. Keene 3
Este artigo técnico foi preparado para apresentação na Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, realizada entre 17-20 de setembro
de 2012, no Rio de Janeiro. Este artigo técnico foi selecionado para apresentação pelo Comitê Técnico do evento, de acordo com as
informações contidas no documento final submetido pelo(s) autor(es). Os organizadores não devem traduzir ou corrigir os trabalhos
submetidos. O material, como é apresentado, não representa necessariamente a opinião do Instituto Brasileiro de Petróleo, Gás e
Biocombustíveis, ou a de seus Membros ou Representantes. Os autores consentem com a publicação deste Artigo Técnico nos Anais
da Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012.
Resumo
Novas soluções para o controle microbiano, como parte do gerenciamento do ciclo de água industrial na indústria
petrolífera, são propostas através de 2 estudos de caso. Cada estudo de caso aborda as diferentes fases do
desenvolvimento de melhores soluções para o controle microbiano dentro desta gestão da água. Abordada no primeiro
estudo de caso é a aplicação de métodos microbiológicos tradicionais e técnicas de biologia molecular (isto é, qPCR e
piro-sequenciamento do 16S rDNA). Foi realizada uma inspeção de uma unidade de produção de petróleo e de uma
instalação de separação de óleo-água e, posteriormente, um mapa detalhado foi produzido mostrando os problemas
microbiológicos detectados no sistema. Foi demonstrado que as principais unidades das instalações encontram-se
severamente contaminadas por redutores de sulfato, compreendendo, em vários locais testados, até 60% da população
total. Foram identificados locais de elevada preocupação, contendo, por exemplo, números de células 1000x maiores do
que a água produzida nos poços. Com base nessas análises, foi proposto um regime de dosagem otimizada de biocidas.
O segundo estudo de caso aborda o desenvolvimento de uma mistura de biocidas feita sob medida, especificamente
desenvolvida para áreas de exploração de gás de folhelho nos EUA. Os primeiros organismos foram enriquecidos a
partir de áreas de exploração específicas. Novas misturas de THPS foram formuladas e otimizadas com base na sua
eficácia contra essas cepas isoladas. As misturas também foram otimizadas para garantir uma boa estabilidade térmica e
uma boa compatibilidade com outras substâncias usadas pelo cliente. As novas misturas mostraram uma melhor eficácia
de ingredientes ativos em concentrações inferiores, tornando esta solução feita sob medida mais sustentável do ponto de
vista ambiental.
1. Introdução
Nossa sociedade atual, por sua própria essência, é fortemente dependente de combustíveis fósseis. Como exemplo, 40%
da demanda energética global é derivada de petróleo somente e 90% de todos os produtos químicos produzidos são
derivados de recursos fósseis (Bakas & Creemers, 2007). Como se torna cada vez mais difícil obter recursos fósseis do
subsolo, a indústria petrolífera está aplicando as técnicas artificial e terciária de recuperação de petróleo,
predominantemente inundação de água (do mar) para forçar mais óleo para o reservatório (em média 10 -15% a mais de
óleo). Com a introdução de água, problemas substanciais com o crescimento indesejado de microorganismos são
introduzidos (Pedersen, 2000). São frequentemente encontrados os microorganismos redutores de sulfato e seus efeitos
prejudiciais, como a acidificação do reservatório e a corrosão influenciada por microorganismos (MIC) (Papa et al,
1991), causada por sua produção de H2S como produto final de seu metabolismo (Muzyer & Stams, 2008) (Nilsen et al,
1996). Mas efeitos adversos, como a obstrução de filtros e o entupimento do reservatório, podem ser causados pelo
acúmulo indesejável de microorganismos que crescem nas superfícies (biofilmes) (Steward & Fogler, 2002) (Khazipov
et al., 1993). Todos estes processos são abordados sob o termo 'incrustação biológica.' Os campos petrolíferos
inundados de água e os ecossistemas artificiais associados fornecem ambientes adequados para os redutores de sulfato
prosperarem; são ambientes redutores (pobres em oxigênio) com muito sulfato introduzido através da água do mar, e
uma fonte abundante de carbono orgânico na forma de hidrocarbonetos. Os problemas com o crescimento indesejado na
______________________________
1
Especialista Sr. em P&D, - The Dow Chemical Company
2
Técnico de P&D, - The Dow Chemical Company
3
Líder de Aplicação do Cliente, -The Dow Chemical Company
água não estão limitados aos campos de petróleo, mas ocorrem também na recuperação de gás de folhelho, onde vastas
quantidades de água são aplicadas, especialmente no fraturamento efetivo de um poço (Kerr, 2010). Problemas com o
crescimento de microorganismos nestes sistemas também são frequentemente relatados. Com o boom do gás de
folhelho acontecendo quase que da noite para o dia nos EUA, a aplicação crescente de inundação de água para a
recuperação artificial de petróleo e a regulamentação mais rigorosa no uso e descarte de água industrial, há uma
necessidade crescente na indústria petrolífera de uma gestão do ciclo de água e de um controle microbiano aprimorados.
A incrustação biológica da água industrial é um elemento-chave que precisa ser abordado na gestão do ciclo de água.
É prática comum na indústria do petróleo realizar testes de rotina em várias fontes de água, como a água produzida, a
água de injeção, a água derivada de tanques de armazenamento, etc. Isso geralmente ocorre por meio de métodos
baseados em cultura (MBC) tradicionais, indicando que uma pequena quantidade de água é adicionada a um caldo rico
em nutrientes, específico para o grupo de microorganismos de interesse. O crescimento observado é uma indicação da
presença de microorganismos. Durante esses testes tradicionais, também chamados de 'incubações', séries de diluições e
contagens de placas são feitas com frequência, fornecendo um certo nível de quantificação do número de
microorganismos presentes. Em muitos casos, esta também é a maneira como as soluções de controle microbiano são
testadas. Existem dois protocolos principais que são reconhecidos e aplicados internacionalmente (Padrão NACE
TM0194-2004-21224). A eficácia dos tratamentos com biocidas é avaliada em diferentes intervalos de concentração dos
ativos e através de diluições em série e contagens das placas. Tipicamente, os tratamentos são testados em uma
combinação padronizada predefinida de organismos, geralmente cepas de laboratório. Os métodos baseados em cultura,
embora forneçam informações sobre o quão severamente um ecossistema projetado encontra-se incrustado
biologicamente, possui limitações. Apenas uma fração dos microorganismos (0,1-1%) pode ser cultivada em ambientes
de laboratório (Staley & Konopka, 1985) e, frequentemente, o caldo de enriquecimento aplicado nas culturas seleciona
quais microorganismos irão se desenvolver; assim, os resultados dos testes baseados em cultura de laboratório podem
não prever com precisão o desempenho dos tratamentos no ecossistema de campo. Com o surgimento de ferramentas de
biologia molecular na indústria do petróleo (técnicas para caracterizar o conteúdo genético de células, isto é, DNA &
RNA), uma nova caixa de ferramentas está à nossa disposição para sermos capazes de determinar melhor quais
microorganismos estão crescendo em sistemas industriais e para melhor avaliarmos os efeitos prejudiciais destes
micróbios (Singh et al, 2009). Essa compreensão mais profunda também auxilia no desenvolvimento de novos
tratamentos de controle microbiano, uma vez que eles podem ser testados em espécies relevantes no ecossistema ou
contra equivalentes laboratoriais mais importantes. Esses métodos também permitem uma avaliação de campo de novas
soluções para o controle microbiano, quando são aplicadas em sistemas industriais reais.
Ter o monitoramento de processos biológicos ('biomonitoramento') incluído na análise tradicional de um sistema
industrial como um primeiro passo, permite uma melhor compreensão do sucesso dos microorganismos no sistema e
identifica as áreas do sistema com alta prioridade para os tratamentos de controle microbiano. Isto permite,
posteriormente, a aplicação de um tratamento e de uma dosagem melhores. O desenvolvimento da melhor solução para
o controle microbiano, feita sob medida para as condições do local e necessidades do usuário final, é a segunda etapa.
Isso inclui o teste e o desenvolvimento de vários tratamentos com biocidas, incluindo combinações de biocidas,
relevantes para o ecossistema. Geralmente, isto requer programas ampliados de triagem de biocidas. Este artigo discute
através de 2 métodos de estudo de caso que visam melhorar as soluções utilizadas para o controle microbiano. O estudo
de caso 1 discute um estudo completo de todos os fluxos de água diferentes, pertencentes a um campo de petróleo
costeiro e sua respectiva instalação de separação de água/óleo. Incluiu uma análise geoquímica e a utilização de
ferramentas tradicionais e de biologia molecular. O estudo de caso 2 discute o desenvolvimento de uma nova patente
pendente de misturas de THPS para uma área de exploração de gás de folhelho nos Estados Unidos. Observou-se um
crescimento indesejado de micróbios. Um exame completo foi realizado para preparar uma solução feita sob medida.
Além disso, microorganismos de vários fluxos de água foram isolados. A eficácia das misturas feitas sob medida foi,
em seguida, testada nestas cepas isoladas do tipo selvagem. Foi feita uma análise semelhante da 'diversidade', como no
estudo de caso 1, mas não será discutida neste artigo.
2. Estudo de caso 1 - Materiais & Métodos
Unidades de
produção-S1
Linhas de entradaS2
Poços de
injeção
-S6
Separador de água/óleoS4
Tanque de
armazenamento de
óleo
Oleoduto de
retroalimenta
ção-S3
Tanque de
armazenamento
de água
Bacia-S5
Figura 1: Impressão do artista - Visão geral do local no estudo de caso 1.
2.1 Descrição das unidades de produção e da instalação de injeção & separação de óleo/água.
O petróleo é produzido em diferentes locais a várias distâncias de uma unidade de separação. Poços de produção e
injeção são colocados ao longo dos locais. Nenhuma acidificação foi observada nos poços produzidos. A emulsão óleo
produzido-água tem um corte de água alto (90%) e é transportada para uma unidade de separação óleo-água através de
oleodutos. Aqui, a maior parte da fase óleo é separada em um separador e o óleo é transportado para um tanque de
armazenamento de óleo. A fase água é bombeada para um tanque de armazenamento de água que, a partir daí, fornece
água para as bombas injetoras. Existe um ciclo de retroalimentação entre o tanque de armazenamento de água e uma
bacia de água. Um pouco de água restante é bombeada do tanque de armazenamento de óleo de volta para o separador.
Esta quantidade de água é baixa e este oleoduto está em operação por 2 horas por dia. Detalhes podem ser encontrados
na Figura 1.
2.2 Procedimento de amostragem & preparação (descrição dos pontos de amostra).
A água produzida foi primeiramente coletada de vários locais em um recipiente para combustível de 10 litros. Para a
análise baseada em cultura tradicional, uma quantidades de 1 ml de água foi adicionada a três diferentes tipos de meio
(9 ml). Dois tipos de meio selecionados para o enriquecimento de Bactérias Redutoras de Sulfato, um tipo de meio
selecionado para Bactérias Produtoras de Ácido (APB). Para a análise de biologia molecular, a água foi filtrada em
filtros estéreis que capturam as células de diferentes ambientes. Após a filtração da água, os filtros retendo as células
foram colocados em tubos e transportados a 0 ˚C para o laboratório, onde foram submetidos à extração de DNA e
análise posterior.
2.3 Análise Geoquímica
As temperaturas das águas foram determinadas através de um termômetro digital. O pH foi determinado por meio de
tiras de teste padrão. Kits de teste padrão foram usados para determinar os níveis de sulfeto e íons ferrosos livres (Fe 2+)
nas diferentes águas, de acordo com as instruções do fabricante.
2.4 Métodos Baseados em Cultura (MBC).
Os frascos anaeróbicos inoculados com os diferentes meios foram enviados em gelo para o laboratório. Os frascos
foram incubados anaerobicamente por 5 dias a 25 ˚C. Foi realizada uma observação ao longo do tempo sobre a turbidez
(como uma verificação de presença/ausência).
2.5 Extração de DNA & verificação da qualidade do DNA extraído das células.
O DNA das células foi obtido aplicando-se o kit PowerWater ™ de isolamento Pro DNA (Laboratórios MO BIO), de
acordo com as instruções do fabricante. (Filtração – seção 2.2). Para verificar a presença e a quantidade de DNA
genômico, aplicaram-se 2 métodos: eletroforese em gel de agarose e quantificação usando espectroscopia de absorção
(através de um espectrômetro NanoDrop). Foram colocados 5 µl das soluções que contêm o DNA genômico purificado
em um gel de agarose a 1,5% (p/v) e foram corridos por 30 minutos a 90 Volts. O gel foi colocado em um tampão TAE
1X durante a corrida e posteriormente corado com corante de DNA. Colocou-se 1 µl do DNA genômico em um
espectrofotômetro Nanodrop. A absorção foi verificada a 230, 260 e 280 nm. As relações dos comprimentos de onda
indicam a quantidade e a qualidade do DNA.
2.6. Programa de quantificação relativa por qPCR & sequenciamento por piro tag do 16S rDNA
Para verificar se o DNA poderia ser usado para o sequenciamento por piro tag do 16S rDNA e para obter-se uma
estimativa aproximada das quantidades relativas de células nas diferentes águas, foram realizados ensaios de
quantificação relativa por qPCR. O par de primer usado para esta amplificação foi o 341f/907rM e teve como alvo o
gene 16S rDNA de bactérias. A amplificação foi feita em uma máquina da Biorad, modelo Icycler IQ5 para rt-PCR. A
mistura continha 10,0 µl da mistura IQ Sybrgreen Supermix (BIO-RAD), 9,1 μl de água livre de DNA-RNA (Qiagen),
0,16 μl de BSA, 0,15 μl de cada primer (Bac341F, 50 μM / Bac907rM(rA+rC) (Schäfer & Muyzer, 2001), concentração
estoque de 50 μM e 0,4 μl de template. Após esta verificação, o DNA genômico foi enviado para os Laboratórios de
Testes & Pesquisa (Texas, EUA), para o sequenciamento por piro tag do 16S rDNA. O gene 16S rDNA é amplamente
utilizado em ecologia microbiana para caracterizar a dinâmica e as estruturas das comunidades. Três mil sequências
foram analisadas por ambiente aplicando-se o pacote de software PyroTagger (Kunin & Hugenholtz, 2010). Todos os
resultados de sequenciamento obtidos foram cortados em um comprimento utilizável de alta qualidade de 250 pares de
bases. Esta triagem não incluiu Archaea neste momento.
3 Estudo de caso 2 - Materiais & Métodos
3.1 Amostragem & métodos baseados em cultura
Águas de diversas fontes foram tiradas de uma área de exploração de gás de folhelho norte-americana usando-se frascos
estéreis de 1 L. Para a análise baseada em cultura tradicional, foi adicionada uma quantidade de 1 ml de água a dois
tipos de meios diferentes (9 ml) para o enriquecimento de Bactérias Redutoras de Sulfato e Bactérias Produtoras de
Ácido (APB). A amostra de água do lago foi tomada logo abaixo da superfície, a cerca de meio metro da borda. A lama
de perfuração foi amostrada a partir dos dispositivos de abertura para os fluxos laterais, coletando-se amostras em
frascos semelhantes. Os detalhes são encontrados na tabela 1. Foi realizada uma avaliação do conteúdo microbiológico
em todas as amostras de água. Estas incubações foram aplicadas para se estimar o número de células. Além disso, foi
realizada uma análise de ATP de todas as amostras. Frascos de incubação comerciais de 12 ml (contendo 9 ml de meio)
foram comprados de fornecedores padrão locais. Após a inoculação com 1 ml de água, os frascos foram incubados a 30
˚C. As contagens de células (log10 ml-1) foram registradas para as SRBs e para as APBs após 28 dias de incubação. Este
longo período de 28 dias foi devido a problemas logísticos no transporte da amostra.
Tabela 1: Locais das amostras e as respectivas temperaturas da água.
Local
Temperatura
1) Água do lago
(T < 40 ˚C)
2) Água do fosso
(T = 40 ˚C)
3) Água Misturada (contém água do lago/ água do fosso & água produzida)
(T = 40 ˚C)
4) Água misturada tratada*
(T = 40 ˚C)
5) Água de refluxo (retorna após injeção inicial)
(T = 70 ˚C)
6) Água produzida (T = 70 ˚C)
7) Lama de perfuração
(T = 60 ˚C)
8) Lama de perfuração à base de óleo
* Esta água foi tratada durante testes de laboratório e, portanto, analisada como tal.
Análise de ATP de todos os fluxos de água
Uma análise de ATP foi realizada nas águas listadas aplicando-se o método e o kit utilizados da LuminUltra
Technologies, Ltd., usando-se os chamados kits Quench-Gone™ Aqueous, de acordo com as instruções dos fabricantes.
Em resumo, amostras de 10 ml foram passadas por um filtro e os organismos capturados sofreram lise para liberar o
ATP celular. Os níveis de ATP presente foram medidos usando-se um ensaio de luciferina-luciferase com um
luminômetro Kikkoman C-110 Lumitester™. Os níveis de ATP foram determinados a partir de uma curva de doseresposta calibrada internamente com um padrão de ATP recente. Os valores foram registrados como picogramas de
ATP por ml de amostra. (A quantidade de ATP presente pode ser usada para comparar os ambientes relativos)
Verificação da quantificação relativa de endósporos
Um protocolo de coloração de esporos por verde de malaquita foi aplicado em combinação com contagens
microscópicas para verificar a presença de Endósporos nas águas. O Kit de Coloração de Esporos Schaeffer and Fulton
(Fluka) foi usado para coloração de esporos, seguindo-se as instruções do fabricante. Um microscópio Olympus BX51
com capacidade de fluorescência foi utilizado para observação visual dos esporos e avaliação relativa da presença de
esporos.
Programa de teste de eficácia de biocidas
Os enriquecimentos das amostras ambientais foram feitos a fim de se testar diferentes programas de controle
microbiano. Uma redução nas contagens de células para menos de 102 células ml -1 foi definida como critério para um
bom controle microbiano. A eficácia do biocida foi testada em ambos os grupos. Uma concentração total de biocida
ativo de 150 ppm. p/v foi aplicada em todos os casos. Os biocidas foram testados isoladamente e em combinações
sinérgicas. Nos testes de biocida em separado, foram aplicadas 200 ppm. p/v de ativo e utilizou-se um critério de
aprovação 'mais suave', indicando que níveis mais elevados de células eram aceitáveis. Os biocidas testados incluíam
glutaraldeído, compostos de amônio quaternário, dazomet e THPS (Sulfato Tetrakis Hidroximetil fosfônico).
4. Estudo de caso 1 -Resultados
4.1 Composição química das diferentes águas
A água produzida difere por poço quanto à salinidade, mas de maneira geral, é qualificada como salobra. A temperatura
média da água no fundo do poço varia entre 65 e 85 ˚C. Nas várias unidades de produção, foram medidos os níveis de
ferro e sulfeto nas águas, bem como os pHs das mesmas. A água que chega na unidade de separação de óleo-água exibe
diferenças quanto à água produzida. Ambas as linhas têm diferentes temperaturas (quentes e frias) de 41 ˚C e 10 ˚C.
Esta diferença é causada pela distância variada a partir da unidade de separação. A linha de entrada 'fria' passa por um
permutador de calor para aumentar a temperatura um pouco acima de 40 ˚C. O pH ainda estava neutro, mas havia uma
assinatura distinta de sulfeto na água, em torno de 3 mg L -1. A água no separador de óleo-água encontra-se a cerca de
43 ˚C, mas ligeiramente mais ácida do que a água de entrada, mantendo um pH de cerca de 6 a 6,5; não houve detecção
de sulfeto. Ao contrário das águas de entrada e produzida, foi detectado um pouco de Fe2+ livre. A água do fundo do
tanque de armazenamento de óleo e do oleoduto de retroalimentação tem outra assinatura, mantendo uma temperatura
de 37 ˚C e um nível de ferro livre de cerca de 10 mg L -1; o pH voltou para neutro. A água aeróbica na bacia manteve
uma temperatura de 32 ˚C e um pH ligeiramente ácido de 5,8. Nenhum sulfeto ou ferro livre foram detectados. A água
de injeção manteve uma temperatura de 24,8 ˚C e um pH de 6,5; foi detectado um nível de sulfeto de mais de 10 g L -1.
Para uma visão geral detalhada, consulte a Tabela 2.
4.2 Resultados dos métodos baseados em cultura tradicionais
As incubações de SRB & APB (MBC) foram feitas a partir das diferentes fontes de água no sistema. Foi demonstrado
que a água de muitos dos locais mostrou crescimento de microorganismos (turbidez). indicando que o número de
células na água é elevado (Tabela 2). Mostra-se claramente que, em todos os ambientes testados, os microorganismos
estão prosperando, algumas diferenças entre os resultados indicam o quão sensíveis são esses métodos em relação à
composição dos meios e detecção dos microorganismos.
Tabela 2: Resultados dos métodos baseados em cultura e das análises geoquímicas realizadas
Descrição da localização
nr∧
SRB (i)
SRB (com.)
APB (com.)
T (˚C)
H 2S
Fe2
pH
+
Crescimento Detectado
Água produzida (5 anos) S1
Sim
44
0
3
7
Linha de entrada
S2
Sim
43,6
2
0
7
Tanque de
S3
Sim
Sim
Sim
37,5
0
10
7
armazenamento de óleo
Tanque separador de
S4
Sim
Sim
43
0
3
6,5
O/A
Água da bacia
S5
Sim
32,3
0
0
5,8
Água de injeção
S6
Sim
Sim
24,8
10
0
6,5-7
Linha de tanque de
*
Sim
Sim
47,7
0
0
7
decantação subsequente
Água produzida (35
*
Sim
24,3
/
/
/
anos)
^ = Número da amostra tomado para análise de biologia molecular; * = Nenhuma água foi filtrada – nenhuma análise de
biologia molecular
- Indica ausência de turbidez nas incubações; / indica dados não disponíveis. (com. = fonte comercial)
4.3 Qualidade do DNA & resultados da quantificação relativa por qPCR.
Para avaliar a qualidade e as quantidades de DNA extraído, foram aplicados 2 métodos diferentes. 1) O DNA de alta
massa molecular (HMW) foi colocado em um gel de agarose, 2) o DNA foi colocado em um espectrômetro NanoDrop.
Um qPCR foi realizado, fornecendo os números relativos de células. Nas reações de qPCR, diluições de 1/10 foram
usadas para avaliar se realmente não havia discrepâncias entre as diluições (dados não mostrados). Obteve-se um sinal
positivo de PCR de todos os ambientes, indicando que todas as amostras estavam aptas para o piro-sequenciamento. Foi
demonstrado que, entre os fatores de diluição de 1 a 10, encontrou-se uma diferença de 3 a 4 ciclos, indicando uma
qualidade aceitável de DNA e das condições de PCR. A partir dos resultados de quantificação relativa por q-PCR, pôdese fazer uma comparação relativa das quantidades de DNA, proporcionando uma estimativa aproximada da
multiplicidade de quantidades de células, tomando-se como ponto de referência a menor quantidade (S1-S6). Os
resultados encontram-se na Tabela 3. Diferenças entre as quantidades de água filtrada foram levadas em consideração
para o cálculo de comparação relativa. Pode-se ver claramente que o sistema enriquece o número de microorganismos
conforme a fase água migra através dos oleodutos. Especialmente o oleoduto de retroalimentação, onde os níveis de
células são elevados (S3), desde a fase água do tanque de armazenamento de óleo de volta para o separador de óleoágua. A água de entrada dos poços de produção e a água de saída que chega nos poços de injeção são semelhantes
quanto aos níveis de células. A água produzida do poço jovem e da bacia exibe níveis inferiores, quando comparada ao
sistema de separação óleo-água. A amostra S1 foi escolhida como ambiente comparativo, já que os números de células
aumentam a partir desse ponto, indicando que o sistema enriquece as bactérias, quando comparado à água produzida
que aflora.
Tabela 3: resultados da quantificação relativa por qPCR
Nome da amostra
S1
S2
S3
S4
S5
S6
Valores de Ct
(limiar do ciclo)
(1/10)
27/20
16/20
16/19
16/20
21/25
16/20
Ciclos com menos
de S1 (A
produzida)
11
11
11
6
11
Diferença de fator
Mais do que S1
Diferença de fator
Mais do que S2
1
102
103
102
1
102
0,01
1
10
1
0,1
1
4.4 Estruturas de comunidades (piro-sequenciamento do 16S rDNA)
Apresentar todos os resultados de piro-sequenciamento está além do escopo deste trabalho, já que mais de 17000
agrupamentos diferentes foram identificados nos 6 ambientes estudados. Em vez disso, um resumo dos ambientes
importantes é fornecido na Tabela 4, que mostra a distribuição das espécies mais dominantes e as principais
descobertas. Os dados são apresentados em porcentagem da população total. Um resumo das descobertas mais
importantes encontra-se listado abaixo. A partir da Tabela 4, podem ser feitas observações interessantes. A água de
produção, que aflora do poço de produção jovem, é dominada por espécies que não podem ser encontradas em qualquer
lugar no resto do sistema, e parecem desempenhar um papel insignificante (coluna cinza claro de S1). As linhas de
entrada quentes enriquecem uma espécie específica de Desulfocaldus (Duncan et al, 2010) que também é enriquecida
no oleoduto de injeção; no tanque, esta espécie também está presente, mas em um nível inferior em relação à
comunidade total (linha cinzenta-Desulfocaldus). A água na bacia exibe proteobactérias gama, o que não é incomum
para águas aeróbicas ligeiramente salinas. Nas seções a seguir, serão dados mais detalhes para os diferentes ambientes.
Como um exemplo do nível de detalhe que o piro-sequenciamento pode proporcionar, os resultados da água de entrada
são fornecidos na Figura 2.
Tabela 4: Sequências mais abundantes (% das sequências totais) presentes nas amostras.
Nome do parente mais
próximo
Bacillus sp. cepa LAMI 010
Desulfocaldus sp. cepa Hobo
Desulfovibrio desulfuricans
cepa G20
Similar à Proteobactéria Gama
Desulfotomaculum
S1
44,56
S2
S3
S4
S5
S6
42,08
2,68
64,2
0,53
0,01
46,73
0,04
0,06
0,1
52,86
0,14
0,05
Identidade
100%
100%
100%
100%
100%
solfataricum cepa V21
Similar á Clostridium
Desulfovibrio sp. cepa M1
Desulfacinum subterraneum
cepa 101
Similar à Desulfotomaculum
Similar à
Carboxydibranchium
Bacteroides sp. cepa SA-7
Cepa isolada 52651
Pseudomonas balearica
cepa101
4,7
33,99
0,01
0,09
0,07
0,22
8,86
0,15
12,88
18,6
0,14
0,12
0,07
99,56%
100%
0,17
100%
100%
100%
0,01
0,74
11,59
0,01
0,08
0,05
0,66
0,09
0,05
10,7
100%
100%
98,23%
0,07
4.5. Uma descrição detalhada das comunidades encontradas nas diferentes fontes de água.
Na água produzida (S1) de um dos poços foi encontrado que 2 espécies compreendem quase que 80% da comunidade,
Desulfotomaculum solfataricum e uma espécie não cultivada. A primeira espécie é descrita na literatura como um
microorganismo em forma de bastão que pode formar esporos, os quais podem usar uma grande variedade de fontes de
carbono. Ela usa sulfato, tiossulfato e sulfito como aceitadores de elétrons (Goorissen et al, 2003). O crescimento ideal
do organismo é 60 ˚C, com um limite superior de 65 ˚C. A faixa de pH deste organismo é de 6,4-7,9. Ele pode crescer
em água com uma salinidade máxima de 1,5 g L -1. Isso se encaixa com a descrição do ecossistema (Tabela 2). A água
de entrada (S2) das linhas de produção na unidade de separação atingiu, até então, uma temperatura de 41 ˚C, e mostra
uma modificação na comunidade bacteriana, quando comparada à comunidade da água de produção. A água que chega
na unidade de separação agora é dominada por um membro de Desulfocaldus que perfaz mais de 40% da comunidade.
A quantidade de células subiu aproximadamente 10 vezes, quando comparada à água produzida no poço. Além disso,
traços de sulfeto foram detectados, indicando uma população que produz H 2S ativamente. Está claro que a espécie de
Desulfocaldus está desempenhando um papel dominante na acidificação do sistema. Esta espécie de Desulfocaldus
também foi detectada em separadores das instalações petrolíferas da Encosta Norte do Alasca (Alaskan North Slope) (T
= 50 ˚C).
O oleoduto de retroalimentação (S3) encontra-se em operação somente por 2 horas por dia e serve para bombear de
volta o restante da água da fase óleo separada de volta para o tanque separador. Ele mantém uma temperatura de 37,5
˚C. Da comparação relativa das quantidades de células em amostras ambientais diretas, ele apresentou a maior
quantidade de células. Também verificou-se que a comunidade do fundo do tanque de armazenamento de óleo é mais
diversa, indicando uma alta atividade microbiana. O pH é de cerca de 7 e foi detectada uma quantidade substancial de
Fe2+ livre, indicando um processo de CIM que potencialmente também explica a baixa quantidade de H 2S.
Curiosamente, a espécie de Desulfocaldus, que é detectada na água de entrada em níveis baixos, prevalece aqui. Está
claro que muitas sequências detectadas têm os parentes mais próximos associados à degradação do óleo e às águas
associadas ao enxofre. A água extraída do tanque separador de água-óleo (S4) é uma combinação de todas as águas de
vários locais de produção. A temperatura média é de 43 ˚C. A água é semelhante à água da linha de entrada quente, com
relação às espécies. Encontra-se uma grande dominância da mesma espécie de Desulfocaldus, compreendendo quase
65% da comunidade. Surpreendentemente nenhum sulfeto foi detectado na água; no entanto, a presença de Fe2+ livre
pode explicar esta ausência. A água na bacia (S5) encontra-se totalmente exposta ao ar exterior e, portanto, é
completamente aeróbica e representa um ecossistema diferente. A temperatura da bacia é menor do que no sistema (32
˚C quando medida), mas isso pode ser propenso a mudanças sazonais. A comunidade possui espécies típicas de água
salobra aeróbica e é menos relevante. A água que chega aos poços injetores (S6) exibe muita semelhança com a água
que chega das linhas de entrada. Sob uma perspectiva de ecossistema, são de fato semelhantes. No final do oleoduto, a
temperatura caiu para 25 ˚C e cai gradualmente ao se afastar cada vez mais do tanque de água. A água de injeção
enriquece novamente a espécie de Desulfocaldus encontrada, a qual compreende cerca de 50% da comunidade. Os
níveis de sulfeto detectados foram elevados, como os que foram encontrados na linha de entrada fria, com valores
superiores a 10 mg L-1. A presença de níveis tão elevados de sulfeto na água injetada pode ser um problema para o
reservatório.
Figura 2: Resultados do piro-sequenciamento da água de entrada (estrutura da comunidade)
5. Estudo de caso 2 –Resultados
5.1 Análise de microbiologia das fontes de água (Incubação e observações de SRB/APB)
Todas as águas apresentaram uma contaminação significativa em todos os enriquecimentos. As contagens de células
foram de 104 a 107 células ml-1, tanto para bactérias SRB como para APB. Foi também demonstrado que as águas do
lago e do fosso continham níveis significativos de leveduras e fungos (dados não mostrados). As contagens de
endósporos, especialmente na água de refluxo e na água produzida foram elevadas, quando comparadas às outras fontes
de água. A água de refluxo e a água produzida mostraram a mais alta tolerância à temperatura pelos microorganismos
nas vários amostras testadas. Isso é esperado, já que esses ambientes de fundo de poço estão sujeitos a maiores
variações de temperatura in situ. Detalhes são encontrados na Tabela 5.
5.2 Análise de ATP de todas as fontes de água
A partir da análise de ATP, ficou claro que a água de fosso exibiu a maior quantidade de ATP, de 7000 pg ml -1, seguida
do lago e das águas misturadas e de refluxo (cada uma com cerca de 2000-2500 pg ml-1). Uma observação clara foi a de
que o conteúdo de ATP da água tratada (laboratório) foi significativamente menor, por exemplo, aproximadamente 70
pg ml-1, após 6 horas de tratamento. A análise de ATP das lamas de perfuração não pôde ser obtida devido à
interferência da lama com a medição de ATP. Isto pode ser visto na Tabela 5 .
5.3 Triagem e combinações de biocidas para um desempenho otimizado
A fim de fornecer uma solução sustentável para o problema de bioincrustação, diferentes triagens e combinações de
biocidas foram testadas em cepas ambientais enriquecidas, isoladas da área de exploração de gás de folhelho. De
particular interesse são as avaliações de tratamento da água de refluxo e da água produzida. Como mostrado na Tabela
6, pode-se constatar que as combinações de biocidas recentemente propostas forneceram um melhor controle do que os
biocidas usados tradicionalmente, durante um período mais longo de tempo. Neste caso, o critério de aprovação foi
definido como uma redução das contagens viáveis para menos de 102 células ml-1. Na triagem, o nível combinado de
ativos aplicado foi de 150 ppm. p/v. Em comparação com as combinações testadas, a aplicação de biocidas em
separado, mesmo quando administrados em altas concentrações, isto é, 200 p.p.m. de ativos e com um critério de
aprovação mais tolerante (redução de 3 log por ml nas contagens de células) não forneceu um controle tão bom.
Detalhes podem ser encontrados na Tabela 7.
Tabela 5: Número de células e análise de ATP das diferentes fontes de água
Fonte
Água do lago
Água do fosso
Água misturada
Água misturada
(tratada)
Água de refluxo
Água produzida
Lama de
perfuração
Lama de
perfuração à base
de óleo
Contagem de células (a potência de 10)
ATP médio
picograma ml-1
Endósporos
baixo
baixo
baixo
baixo
*
SRB
3
6,5
5,5
3
APB
5
6,5
7
3,5
4
3,5
4
5
3
7
2200
7000
2600
(70 (6 horas) – 15
(24 horas)
2300
200
*
5
7
*
alto
alto
*
Tabela 6 *: Exame de combinação de biocidas realizado nos enriquecimentos de isolados de água de refluxo
Combinações aplicadas
Glutaraldeído/
Sal de amônio
quaternário**
Dazomet/
Sal de amônio
quaternário**
Glutaraldeido/Ativo novo
1
THPS/ Ativo novo 1
Glutaraldeído/Ativo novo
2
THPS /Ativo novo 2
24 horas de eficácia
SRB
APB
48 horas de eficácia
SRB
APB
7 dias de eficácia
SRB
APB
×



×
×
×
×

×
×
×
×
×





×

×














* Um × indica: não passou os critérios definidos de contagens de células abaixo de 102 células ml-1, um  indica:
passou este critério.
** O quat aplicado neste caso é de propriedade do operador da área de exploração e, portanto, não pode ser divulgado.
Tabela 7 *: Triagem de biocidas (em separado) realizada nos enriquecimentos de isolados de água de refluxo.
Biocidas
aplicados
Glutaraldeído
Dazomet
THPS
24 horas de
eficácia
SRB
APB
48 horas de
eficácia
SRB
APB
7 dias de eficácia
SRB
APB
×
×

×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×

×
×
×
* Um × indica: não passou os critérios definidos de redução de 3 log de células ml -1, um  indica: passou este critério.
6. Discussão
A realização de um estudo detalhado de biologia molecular além de um teste tradicional baseado em cultura,
proporcionou informações que são fundamentais na aplicação do conceito de 'biomonitoramento'. As informações
adquiridas não poderiam ter sido obtidas usando-se somente os testes tradicionais. Uma observação científica
interessante é que, de fato, as espécie se relacionam às propriedades do ecossistema obtidas por uma simples análise
geoquímica (salinidade, T, pH, níveis de ferro ferroso e sulfeto). A água de produção que aflora contém espécies
associadas com o ecossistema do poço e verificou-se que elas não desempenham nenhum papel significativo no restante
do sistema. Posteriormente (para o Estudo de caso 1), a espécie para a qual o oleoduto quente enriquece é uma cepa de
Desulfocaldus que parece ser dominante em todo o sistema. A linha de entrada quente e a tubulação da água de injeção
são semelhantes a esse ponto; especialmente porque a água de injeção exibe níveis elevados de sulfeto, indicando uma
alta atividade microbiana. O maior ponto de preocupação é a água de refluxo do oleoduto, entre o separador de óleoágua e o tanque de armazenamento de óleo; esta água continha o mais alto nível microbiano e diversidade. A análise
biológica molecular mostrou que esta área é a provável fonte de infecção para todo o sistema industrial. A Figura 3
resume os resultados de biologia molecular. Com base na análise, um nível de preocupação foi atribuído a cada um dos
ambientes testados. As recomendações foram elaboradas para melhorar a gestão do ciclo de água. Um novo ponto de
adição de biocidas no tanque de água foi proposto, uma vez que a água de injeção representava uma preocupação
significativa devido aos níveis elevados de H2S. Propôs-se um destino alternativo para a água do fundo do tanque de
armazenamento de óleo. A situação atual é que, em uma condição rotineira (diariamente), a água do fundo é transferida
do tanque de óleo para o tanque de decantação. Os dados gerados a partir das análises mostram que esta água não
tratada contém tanto as SRBs como as APBs. O tanque de óleo pode ser considerado uma fonte contínua de infecção
para o sistema e o tanque de decantação. A água transferida e/ou a água do fundo do tanque precisam ser tratadas para
eliminar esta importante fonte de contaminação não tratada no sistema. Alternativamente, foi proposto alimentar a água
diretamente para a água da bacia, onde condições aeróbicas dominam, assim os níveis de SRBs e APBs seriam muito
reduzidos no sistema. Com essas mudanças, podemos ajustar o tratamento e monitorar a água de injeção para reduzir os
níveis presumidos de H2S biótico e de SRB/APB. A eficácia destas medidas pode ser determinada através do
monitorando rotineiro do sistema, aplicando-se as mesmas metodologias de triagem.
Desulfocaldus, altos
níveis de H2S
(T = 24,8 ˚C, pH
6,5, H2S, 30 mg L1
)
Este oleoduto é de
elevada
preocupação.
Comunidade diversa &
altos níveis celulares.
Este oleoduto é uma
fonte de infecção
para o sistema e é de
grande preocupação.
(T = 37,5 ˚C, pH 7, 10
mg L -1 Fe2+)
Tanto a água produzida
quanto a água na bacia
são de pouca preocupação
em relação aos números
de espécies e de células.
A área em torno do
separador de O/A é de
certa preocupação (T = 43
˚C, pH 6,5-7; 3 mg L-1
Fe2+)
Figura 2: Mostrando as áreas de preocupação: o verde indica baixa, o vermelho indica alta
A seleção correta de biocidas para a área de exploração específica e para o fluxo de água é uma etapa fundamental, mas
representa um desafio em cada ambiente diferente. No estudo da área de exploração de gás de folhelho dos EUA,
verificou-se que as águas do fundo do poço também estavam fortemente contaminadas por microorganismos. As
combinações de biocida selecionadas têm um desempenho potencialmente melhor do que o atual programa de controle
microbiano utilizado. Verificou-se que estas águas contêm microorganismos termófilos, incluindo níveis elevados de
formadores de esporos. Tratamento aqui é essencial para reduzir e inibir a germinação de endósporos.
Esta pesquisa indica que o tratamento atual é ineficaz e que um tratamento eficaz de fluidos de perfuração com produtos
de controle microbiano alterados é necessário. Além disso, o baixo volume de fluidos minimiza o conservante
necessário. Para o fluido de injeção, as condições são diferentes. Neste caso, uma temperatura estável e a aplicação de
um controle microbiano duradouro devem ser aplicadas, já que a água irá permanecer na formação por um período
prolongado de tempo.
A partir dos dados de monitoramento de campo, que não incluem um programa de tratamento por biocidas, detectou-se
uma forte contaminação microbiana (níveis de SRB & APB significativamente acima dos critérios de 10 2 células ml-1).
Os estudos de laboratório forneceram várias soluções para manter o sistema sob controle novamente. Essas soluções
incluíram combinações de biocidas inovadoras e sustentáveis que oferecem um controle eficaz em concentrações mais
baixas de ativos. As combinações de biocidas propostas ainda podem ser otimizadas ainda mais com relação aos
regimes de dosagem e proporção. Uma análise de qPCR será realizada para se observar melhor o número total de
células, com relação ao grupo. Um teste de campo será realizado quando os parâmetros acima forem otimizados. Os
programas de biomonitoramento (não mostrados) indicaram quais das fontes de água necessitavam do tratamento mais
robusto.
7. Conclusões
Os resultados apresentados no estudo de caso 1 fornecem uma prova de conceito para como a caixa de ferramentas de
biologia molecular pode ser aplicada para o desenvolvimento do gestão do ciclo de água na indústria petrolífera. Ela
permite uma compreensão mais profunda da dinâmica da comunidade e dos processos metabólicos em sistemas
industriais e pode ajudar na identificação dos locais de elevada preocupação, e alterações podem ser feitas no local e no
tipo de adição de biocidas para melhorar o controle microbiano. Além disso, a biologia molecular também pode ajudar
na rápida identificação de problemas potenciais, permitindo uma estratégia proativa de solução para o controle
microbiano. Geralmente, quando os problemas estão em fase inicial, menos biocida é necessário para recuperar o
controle efetivo, possibilitando programas de tratamento ainda mais sustentáveis. Em ambos os cenários, as soluções
para o controle microbiano são aplicadas mais eficazmente. No segundo caso, é necessário um monitoramento rotineiro
do sistema.
Os resultados apresentados no estudo de caso 2 mostram que o desenvolvimento de combinações específicas de
biocidas sob medida para o ecossistema é um próximo passo valioso, o qual requer um protocolo de triagem extenso,
que leve em consideração vários parâmetros, que tenha uma eficácia e compatibilidade com a água e outros produtos
químicos adicionados àquela água como parâmetros-chave. No segundo estudo de caso, novas combinações de
biocidas, baseadas em THPS como o principal ativo, foram desenvolvidas especificamente para áreas de exploração de
gás de folhelho na área dos EUA. Este estudo de caso mostrou claramente que um programa integrado de gestão do
ciclo de vida da água deve incluir um programa de controle microbiano especializado, baseado em parâmetros
ambientais individuais da área de exploração de gás de folhelho. A triagem microbiológica requer um laboratório
especializado que possa reproduzir as condições ambientais específicas do cliente. Isto é essencial para desenvolver
uma solução sustentável e eficaz para o controle microbiano.
Os dois estudos de caso demonstram que um bom programa de monitoramento de unidades industriais em combinação
com o desenvolvimento de tratamentos com biocidas feitos sob medida, específicos para o local e as condições do
usuário final, pode, em um futuro próximo, levar ao desenvolvimento de um programa de controle microbiano mais
eficaz e sustentável.
8. Referências
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