RICARDO BARROS MARIUTTI
Expressão, purificação e caracterização de proteínas dos fitovírus
SBMV e RSPaV
São José do Rio Preto
2014
RICARDO BARROS MARIUTTI
Expressão, purificação e caracterização de proteínas dos fitovírus
SBMV e RSPaV
Tese apresentada para obtençãodo título de
Doutor
em
Bioquímica
e
Microbiologia,área
Biologia
Molecular
de
de
Microrganismos, junto aoPrograma de Pósgraduação emMicrobiologia do Instituto
deBiociências, Letras e Ciências Exatasda
Universidade Estadual Paulista“Júlio de
Mesquita Filho”, Câmpus deSão José do Rio
Preto.
Orientador: Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni
São José do Rio Preto
2014
RICARDO BARROS MARIUTTI
Expressão, purificação e caracterização de proteínas dos fitovírus
SBMV e RSPaV
Tese apresentada para obtençãodo título de
Doutor em Microbiologia,área de Bioquímica
e Biologia Molecular de Microrganismos,
junto
aoPrograma
de
Pós-graduação
emMicrobiologia do Instituto deBiociências,
Letras e Ciências Exatasda Universidade
Estadual Paulista“Júlio de Mesquita Filho”,
Câmpus deSão José do Rio Preto.
Comissão Examinadora
Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni
UNESP-São José do Rio Preto
Orientador
Prof. Dr. Anwar Ullah
UNESP-São José do Rio Preto
Profa. Dr. Fátima Pereira de Souza
UNESP-São José do Rio Preto
Profa. Dra. Priscila Belintani
Centro Universitário do Norte Paulista- UNORP
Prof. Dr. Patrick Jack Spencer
IPEN/CNEN, do BUTANTAN
São José do Rio Preto
2014
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Dr. R. K. Arni, que nunca poupou esforços para me ajudar durante
esses anos de pesquisa, sempre me motivou e acreditou no meu potencial, mais do que eu
mesmo acreditei. Sempre serei grato pela orientação impecável que recebi, nenhum livro
poderia me ensinar tudo que ele me ensinou sobre proteínas.
A minha namorada, pelo incentivo, companheirismo e pela compreensão da minha
escolha em fazer do laboratório a minha casa. Ela me faz sentir uma pessoa de sorte.
“Diante da vastidão do tempo e da imensidão do universo, é um imenso prazer para mim,
dividir um planeta e uma época com a Luana”.
Aos meus pais que são as pessoas mais importantes da minha vida.
Ao Dr. Vinícius pela amizade de muitos anos, ensinamentos e paciência.
Ao Dr. Anwar pela disposição em me ajudar nos experimentos, tanto tarde da noite como
nos feriados.
Aos meus amigos do laboratório, Rehana, Eliana, Hévila, Carol Wilson.
Ao professor Dr. Betzel que me recebeu em seu laboratório com total atenção.
A toda banca examinadora pela disposição, em especial à Dra. Priscila, que durante minha
iniciação científica me ensinou conceitos que uso diariamente em meus experimentos.
Ao Dr. Osmar que me orientou no mestrado.
À FAPESP pelo apoio financeiro
Ao PPG em Microbiologia.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
1) INTRODUÇÃO
8
14
16
16
1.1) Os Vírus
1.1.2) Vírus vegetais .................................................................................................................... 16
1.2) A videira
17
1.2.1) Viroses da videira .............................................................................................................. 18
1.3) O Feijão
22
1.4) Sobemovirus
23
1.4.1) Organização do genoma .................................................................................................... 23
1.5) Produtos gênicos e suas possíveis funções
24
1.5.1) ORF1 ................................................................................................................................. 25
1.5.1.1) Proteína do Movimento
26
1.5.2 ) ORF 2 ............................................................................................................................... 29
1.5.2.1) VPg
29
1.5.2.2) Serino protease
30
2) REPLICAÇÃO VIRAL
33
3) EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM BACTÉRIA
33
4) JUSTIFICATIVA
35
5) MATERIAIS E MÉTODOS
36
5.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV
usando o pacote de ferramentas EXPASY
36
5.2) Linhagem de bactéria utilizada para expressão
36
5.3) Plasmídeo Utilizado
37
5.4) Tranformação bacteriana
37
5.5) Testes de expressão da proteína da capa proteica do RSPaV recombinante sob diferentes
condições.
38
5.6 ) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
38
5.7 ) Western blot
39
5.8) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 37 °C
39
5.9) Purificação por cromatografia de afinidade (Ni-NTA)
40
5.9.1) Sob condições desnaturantes ............................................................................................. 40
5.9.2) Sob condições nativas........................................................................................................ 40
5.10 ) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 25 °C
5.11 ) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 17 ºC
5.12) Teste de expressão em meio auto-indutivo
5.13) Expressão utilizando estresse osmótico e choque térmico
5.14) Expressão a 13 ºC utilizando cepas de Arctic Express
5.15) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC
5.16) Refolding
5.17) Concentração das amostras purificadas
5.18) Determinação da concentração das proteínas
5.19) Dicroísmo Circular
41
42
43
43
44
44
45
46
46
46
5.20) Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
5.21) Ensaios de cristalização
47
49
5.21.1) Microseeding e Streak seeding ........................................................................................ 49
5.21.2) Counter-diffusion ............................................................................................................ 50
5.21.3) Hanging drop ................................................................................................................... 51
5.21.4) Microbacth....................................................................................................................... 51
5.22) Inserção de sítio de clivagem nos plasmídeos recombinantes
52
5.22.1) Construção de oligonucleotídeos com adição de sítio de clivagem. ............................... 53
5.22.2) Amplificação dos genes das proteínas utilizando primers com sítio para TEV protease 54
5.23) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a.
54
5.23.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a ............................. 56
5.23.2) Ligação do DNA em vetor de expressão (pET28a) ......................................................... 56
5.23.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão (pMAL) ............................ 56
5.24) Transformação em célula competente (TOP 10)
57
5.25) Purificação do plasmídeo recombinante
57
5.26). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5)
58
5.27) Sequenciamento dos vetores contendo as sequências dos genes CP do RSPaV, após
inserção do sítio de clivagem para TEV protease
58
5.28) Expressão e Purificação da Proteína Capisidial com Sítio de Clivagem para Tev Protease
58
5.28.1) Expressão da CP utilizando pET28a ............................................................................... 58
5.28.2) Purificação da CP utilizando pET28a .............................................................................. 59
5.29) Digestão Enzimática utilizando TEV Protease.
5.30) Expressão e Purificação da CP utilizando pMAL
59
59
5.30.1) Expressão da CP recombinante utilizando pMAL........................................................... 60
5.30.2) Purificação da CP recombinante utilizando pMAL através de resina à base de amilose 60
5.31) Purificação da proteína digerida utilizando TEV protease
60
5.32) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease.
61
6) VIRAL PROTEIN GENOME-LINKED (VPg)
61
6.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína VPg recombinate do SBMV usando o
pacote de ferramentas expasy
61
6.2) Testes de expressão da VPg
61
6.3) Purificação da proteína VPg e Espalhamento Dinâmico de Luz
61
6.4). Ensaios de cristalização VPg
62
6.5) Inserção do sítio de clivagem para TEV protease
62
6.5.1) Amplificação dos genes das proteínas VPg utilizando primers com sítio para TEV
protease ........................................................................................................................................ 63
6.5.2)Purificação das partículas virais ......................................................................................... 63
6.5.3) Obtenção de RNA viral ..................................................................................................... 64
6.5.4) Produção de cDNA ............................................................................................................ 64
6.6) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a
65
6.6.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a ............................... 65
6.6.2) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a ............................................................. 65
6.6.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pMAL ................................ 65
6.6.4) Ligação do DNA em vetor de expressão pMAL ............................................................... 65
6.7) Transformação em célula competente (TOP 10)
6.8) Purificação do plasmídeo recombinante
6.9). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5)
65
66
66
6.10) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da VPg do SBMV após
inserção do sítio de clivagem para TEV protease
66
6.11) Expressão e purificação da VPg clonada em pMAL-c2x
66
6.11.1) Expressão da proteína VPg recombinante utilizando pMAL-c2x ................................... 66
6.11.2) Purificação da VPg clonada em pMAL-c2x .................................................................... 67
6.12) Digestão enzimática utilizando TEV protease
6.13) Purificação da proteína após digestão pela TEV protease
6.14) Expressão e purificação da proteína VPg clonada em pET28a
67
67
67
6.14.1) Expressão da VPg clonada em pET28a ........................................................................... 67
6.14.2) Purificação da VPg clonada em pET28a ......................................................................... 68
6.15) Efeito do TFE e dATP no raio hidrodinâmico das amostras proteicas
68
6.16) Verificação do efeito do TFE na estrutura secundária da VPg através de dicroísmo
circular
69
6.17) Ligação da sonda de sulfonato de naftaleno-1-8-anilina (ANS)
69
6.18) Análise da interação entre VPg e possíveis ligantes
70
7) SERINO PROTEASE DOSBMV
70
7.1) Amplificação da sequência codificadora da serino protease do SBMV para posterior
clonagem em pET28a
70
7.2) Clonagem da sequencia codificadora da Serino protease com sítio para TEV protease em
vetor pET28a
71
7.2.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a ............................... 71
7.2.2) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a ............................................................. 71
7.3) Transformação em célula competente (TOP 10)
7.4) Purificação do plasmídeo recombinante
7.5). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5)
7.6) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da Serino protease do
SBMV após inserção do sítio de clivagem para TEV protease
7.7) Expressão e purificação da Serino protease do SBMV utilizando pET28a
71
71
72
72
72
7.7.1) Expressão da Serino protease utilizando pET28a.............................................................. 72
7.8) Amplificação da sequencia codificadora da serino protease do SBMV utilizando primer
Serine_NoTransmembrane
73
7.9) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a
73
7.10) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a
73
7.11) Transformação em célula competente (TOP 10)
73
7.12) Purificação do plasmídeo recombinante
74
7.13) Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5)
74
7.14) Testes de expressão e purificação
74
8. PROTEÍNA DO MOVIMENTO DO SBMV
74
8.1) Expressão e purificação sob condições desnaturantes utilizando pET28a
75
8.2) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 15 %
75
8.3) Reenovelamento proteína do movimento do SBMV
75
8.4) Concentração das amostras purificadas
76
8.5) Dicroísmo Circular
76
9) RESULTADOS: CAPA PROTEICA DO RSPaV
76
9.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica do RSPaV
usando o pacote de ferramentas EXPASY
76
9.2) Expressão da proteína a 37 ºC
79
9.3) Western blot
79
9.4) Expressão a 17 ºC e 25 ºC
81
9.5) Expressão utilizando extresse osmótico e choque térmico e expressão utilizando o meio
auto-indutivo
83
9.6) Arctic Express
84
9.7) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC
86
9.8) Dicroísmo Circular
88
9.9) Ensaios de Cristalização
89
9.10) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
90
9.10.1) . Resultados DLS CP RSPaV. ......................................................................................... 92
9.11) Amplificaçao usando primers com sítio para TEV protease
94
9.12) Clonagem do fragmento da cp em vetor pMAL.
94
9.13) Sequenciamento do gene da capa preteica do RSPaV, confirmando sucesso na inserção
do sítio de clivagem para TEV protease
95
9.14) Purificação da TEV protease
97
9.15) Digestão enzimática das proteínas expressas clonadas em vetor pET28a (his-tag) e vetor
pMAL (MBP) utilizando TEV protease
97
9.16) purificação da proteína digerida utilizando TEV protease.
98
9.17) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease
100
10) RESULTADOS E DISCUSSÃO: VPg DO SBMV
100
10.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinante VPg do SBMV usando o
pacote de ferramentas EXPASY
100
10.2) Expressão, purificação e concentração das proteínas VPg
101
10.3) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
102
10.3.1) Resultados DLS VPg ..................................................................................................... 102
10.4) Amplificação da sequência codificador da VPg usando primers com sítio para TEV
protease
10.5) Purificação das partículas virais
10.6) Extração do RNA viral do SBMV
10.7) Amplificação da sequ6encia codificadora da VPg a partir do cDNA
10.8) Sequenciamentro e alinhamento VPg
106
107
108
109
111
10.8.1) Refinamento do alinhamento utilizando BioEdit .......................................................... 112
10.9) Expressão e purificação da proteína do movimento
113
10.9.1) Expressão e purificação da VPg utilizando pMAL-c2x ................................................ 113
10.9.2) Expressão, purificação e concentração da VPg utilizando pET28a .............................. 115
10.10) Ensaios de cristalização
117
10.11) Efeito do TFE na estrutura secundária da VPg do SBMV monitorado atravé de
dicroísmo circular
118
10.12) Interação da sonda ANS
119
10.13) Efeito do dATP e TFE no raio hidrodinâmico da VPg
120
10.14) NMR
122
11) RESULTADOS: SERINO PROTEASE
124
11.1) Sequenciamento da região codificadora da serino protease do SBMV
124
11.2) Teste de solubilidade da Serino protease do SBMV
125
11.3) Predição da porção N-terminal da serinon protease do SBMV
126
11.4) Amplificação da sequência codificadora da serino protease utilizando primer a fim de
reduzir a proteína em 64 aminoácidos
126
11.5) Sequenciamento da região codificadora da serino protease após remoção da porção Nterminal
127
11.6) Teste solubilidade da Serino protease do SBMV após remoção da porção N-terminal 128
11.7) Expressão e purificação serino (-64)
129
12) RESULTADOS: PROTEÍNA DO MOVIMENTO
130
12.1) Expressão da provável MP em vetor pET28a
130
12.2) Dicroísmo circular após reenovelamento
131
12.3) Avaliação da interação entre MP do SBMV reenovelada e outras proteínas virais. 132
12.4) Dot blot utilizando proteínas que não interagiram com a MP
133
12.5) Amplificação usando primers com sítio para TEV protease
134
12.6) Amplificação dos gene da MP utilizando primes com sítio para TEV protease
134
12.7) Sequenciamento e alinhamento MP
136
13) CONCLUSÕES
137
14) EXPERIMENTOS REALIZADOS PARALELAMENTE AOS EXPERIMENTOS
VINCULADOS AO PROJETO DE PESQUISA
138
15) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
141
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Organização do genoma do RSPaV. ORF1: .................................................................. 21
Figura 2. Organização genômica dos sobemovírus. ...................................................................... 24
Figura 3. Movimento célula a célula do Tobacco mosaic virus (TMV)........................................ 27
Figura 4. Movimento viral célula a célula. .................................................................................... 28
Figura 5. Sítio ativo da protease de SeMV. ................................................................................... 32
Figura 6. (1) Capilar. (2) Solução contendo agente precipitante. .................................................. 50
Figura 7. Método hanging drop: .................................................................................................... 51
Figura 8. Modelo representativo da técnica de microbatch: .......................................................... 52
Figura 9. Mapa do vetor pET-28a-c(+) ......................................................................................... 53
Figura 10. Modelo esquemático de oligonucleotídeoutilizado para clonagem visando remoção da
cauda de histidina após purificação. .............................................................................................. 54
Figura 11. Região polylinker do vetor pMAL-c2x destacando os sítios de restrição ................... 57
Figura 12. Sequência de aminoácidos da proteína da capa proteica recombinante do RSPaV
clonada emvetor pET28a. .............................................................................................................. 77
Figura 13. Quantidade e porcentagem de cada aminoácido presente na CP do RSPaV. .............. 77
Figura 14. Predição da estrutura secundária a partir da sequência de aminoácidos da capa proteica
do RSPaV utilizando o programa PSIPRED. ................................................................................ 78
Figura 15. SDS-PAGE 10% evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína
capsidial do RSPaV usando resina à base de Níquel.. ................................................................. 79
9
Figura 16. "Western blot" utilizando evidenciando reação imunológica com anti-soro monoclonal
anti – histidina ............................................................................................................................... 80
Figura 17. SDS-PAGE 12 % evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína
capsidial doRSPaV a 37 ºC. .......................................................................................................... 81
Figura 18. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial
doRSPaV expressa a 17 ºC ............................................................................................................ 83
Figura 19. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial
doRSPaV expressa a 25 ºC ............................................................................................................ 83
Figura 20. SDS-PAGE 12% evidenciando resultados referentes às estratégias de solubilização. 84
Figura 21. SDS-PAGE 12% evidenciando resultados referentes às estratégias de solubilização . 86
Figura 22. SDS-PAGE 12 % etapas da eluiçãoda CP-RSPaV recombinante ............................... 87
Figura 23. SDS-PAGE 12 % evidenciando sobrenadante dos testes de reenovelamento 88
Figura 24. Espectro do dicroísmo circular da capa proteica do RSPaV. ....................................... 89
Figura 25. SDS-PAGE 12% evidenciando a proteína CP-RSPaV purificada. 90
Figura 26. Serie de Hofmeister ...................................................................................................... 91
Figura 27. Ilustração das medidas de DLS da proteína da capa proteica do RSPaV. ................... 92
Figura 28. Plotagem de 10 aquisições de 10 segundos cada referentes à proteína da Capa Proteica
do RSPaV. ..................................................................................................................................... 93
Figura 29. Gel de agarose 1% evidenciando a amplificação da sequência relativa a CP do
RSPaV. 94
Figura 30. Gel de agarose 1,5% evidenciando a liberação do fragmento de aproximadamente
referente à sequência codificadora da CP do RSPaV clonada em vetor de expressão pMAL. ..... 95
Figura 31. Alinhamento das sequências referentes ao gene da capa proteica do RSPaV. ............ 96
10
Figura 32. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostrasda TEV purificada utilizando resina à base de
Níquel. ........................................................................................................................................... 97
Figura 33. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação e e digestão com
TEV protease. ................................................................................................................................ 98
Figura 34. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação,e digestão com
TEV protease e posterior isolamento do fragmento de interesse .................................................. 99
Figura 35. Sequência de aminoácidos da proteína VPg clonada emvetor pET28a. .................... 100
Figura 36. SDS-PAGE 15% corado com comassie evidenciando pureza da VPg do SBMV. 101
Figura 37. Ilustração das medidas de DLS da proteína VPg em tampão Tris 10 mM e 150 mM
KCl. ............................................................................................................................................. 102
Figura 38. Ilustração das medidas de DLS da proteína VPg em tampão Tris 10 mM e 150 mM
NaCl. ............................................................................................................................................ 102
Figura 39. Plotagem de 20 aquisições de 20 segundos cada, referentes à proteína daVPg do
SBMV. ......................................................................................................................................... 103
Figura 40. Algumas condições em que a proteína VPg apresentou cristais. ............................... 104
Figura 41.Cristais de VPg fluorescendo quando iluminados por UV ......................................... 105
Figura 42.Cristal de VPg ............................................................................................................. 105
Figura 43. Gel nativo de agarose 1 %.evidenciando reações de PCR do gene da VPg .............. 107
Figura 44. SDS-PAGE 12% evidenciando a proteína capsidial das partículas virais purificadas.
..................................................................................................................................................... 108
Figura 45. Análise do RNA viral extraído de partículas purificadas de SBMV em gel de agarose
..................................................................................................................................................... 109
11
Figura 46. Gel de agarose 1%evidenciandodiferentes reações de PCR utilizando cDNA como
template. ...................................................................................................................................... 110
Figura 47. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dosvetores recombinates
pET28a e pMAL-c2x. .................................................................................................................. 111
Figura 48. Alinhamento de uma única sequência obtida utilizando primer reverse comparada com
a sequência original do gene da VPg. .......................................................................................... 112
Figura 49. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína VPg do SBMV.
113
Figura 50. SDS-PAGE 15 % evidenciando amostrasda VPg-MBPpurificada utilizando resina à
base de Amilose. .......................................................................................................................... 114
Figura 51. SDS-PAGE 15 % . amostras digeridas pela TEV protease evidenciando bandas
referentes à MBP ......................................................................................................................... 115
Figura 52. SDS-PAGE 15 % VPg-his6 digerida com TEV protease.
116
Figura 53. SDS-PAGE 15 % comparando o precipitado de amostras contendo Histag e amostras
com a Histag removida. ............................................................................................................... 117
Figura 54. Espectros de UV-CD da VPg na ausência (linha preta), presença de TFE 10 % (linha
vermelha), 20 % (linha laranja) e 30 % (linha amarela). ............................................................. 119
Figura 55. Espectro da emissão da fluorescência da sonda ANS ligada à VPg
120
Figura 56. Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão
contendo 1 mM dATP e 30 % TFE. ............................................................................................ 121
Figura 57. Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão
contendo 10 % de TFE. ............................................................................................................... 121
Figura 58.Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão
contendo 1 mM d ATP. ............................................................................................................... 121
12
Figura 59. Ilustração das medidas de DLS da proteína da VPg do SBMV na presença de tampão
contendo 30 % de TFE. ............................................................................................................... 121
Figura 60. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e os ligantes: (a)
dATP; (b) dCTP; (c) dGTP; (d) dTTP. ....................................................................................... 123
Figura 61. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e adenina. .......... 123
Figura 62. Alinhameto das sequências codificadoras da serino protease do SBMV. ................. 124
Figura 63. Sequenciameto mostrandosucesso na inserção do sítio de clivagem para TEV protease.
..................................................................................................................................................... 125
Figura 64. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão
proteica seguida de lise celular. ................................................................................................... 125
Figura 65. Predição da estrutura secundária da serino protease do SBMV. ................................ 126
Figura 66. Gel de agarose 1 % evidenciando a amplificação da sequencia codificadora da serino
protease do SBMV ...................................................................................................................... 127
Figura 67. Gel de agarose 1% evidenciando a amplificação da sequência codificadora da serino
protease utilizando colônias bacterianas transformadas como fonte de DNA
127
Figura 68. Resultado do sequenciamento da serino protease indicando sucesso nas etapas de
clonagem. ..................................................................................................................................... 128
Figura 69. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão
proteicaseguida de lise celular. .................................................................................................... 129
Figura 70. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão
proteica seguida de lise celular.: .................................................................................................. 129
Figura 71 Células de E. coli após centrifugação do meio de cultura após indução por 10 horas.130
13
Figura 72. Gel de poliacrilamida 12% mostrando a expressão da proteína de aproximadamente 22
kDa (MP-His). (17 kDa referente à MP + 5 kDA referente à cauda de histidina e região
polilinker). ................................................................................................................................... 131
Figura 73. Espectro do dicroísmo circular da MP reenovelada. .................................................. 132
Figura 74. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot.
133
Figura 75. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de dot blot.
134
Figura 76. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando o fragmento de 500 pares de bases
amplificado por PCR. .................................................................................................................. 135
Figura 77. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dos vetores recombinates
pET28a e pMAL-c2x. .................................................................................................................. 136
Figura 78. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína do movimento (MP) do
SBMV. ......................................................................................................................................... 137
Figura 79. SDS-PAGE 12 % evidenciando purificações parciais de 3 proteínas envolvidas neste
projeto. (MM) Marcador molecular; (PknG): Proteína quinase PknG; (M1) Proteína DNA
glicosilase mutM1. (M2) Proteína DNA glicosilase mutM2. ...................................................... 139
Figura 80. SDS-PAGE 12 % evidenciando purificações da PLD e PknG. (M) Marcador
molecular; (1): PLD. (2, 3, 4 e 5): Proteína quinase PknG.......................................................... 139
Figura 81. Cristais iniciais de PknG, PLD e mutM2 de C. pseudotuberculosis.......................... 140
14
RESUMO
A videira é a frutífera economicamente mais importante no mundo e é cultivada para que
seus frutos produzam uvas de mesa, suco, e uvas passas. As bagas da videira são também a
base para o alto valor agregado dos vinhos e outras bebidas alcoólicas. O Rupestris stem
pitting associated virus – RSPaV foi identificado como o agente causador da doença do
lenho estriado ou cascudo (“Rupestris stem pitting” - RSP), um dos componentes do
complexo do lenho rugoso da videira (“Rugose wood” - RW). Esta doença é transmitida
por enxertia e constitui uma das viroses de videira mais disseminadas no mundo, sendo
descrita no Brasil no final dos anos 60. Devido à dificuldade de purificação das partículas
virais a partir da videira infectada, a expressão em larga escala da proteína capisidial do
RSPaV em bactérias é uma estratégia promissora para o entendimento de suas
propriedades. A cultura do feijão também tem produtividade grandemente afetada pela
ocorrência de doenças que diminuem a produção e, conseqüentemente, reduzem a sua
oferta, provocando um aumento nos preços de mercado. No Brasil, foram descritas mais de
dez viroses em feijoeiro, citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus
(SBMV) do gênero Sobemovirus. Este vírus tem uma restrita gama de hospedeiras,
confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de
interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. As proteínas do movimento (MP),
serino protease e VPg, são produzidas em baixas concentrações, impossibilitando a
purificação em larga escala a partir de plantas infectadas. A expressão e purificação em
larga escala das proteínas VPg, serino protease e proteína do movimento do SBMV e
proteína capisidial do RSPaV, foram realizadas utlizando os vetores pET28a e pMAL.
Análises das proteínas, através de espalhamento dinâmico de luz mostraram que foi
possível obter soluções proteicas monomodais. Através de dicroísmo circular foi possível
observar que as proteínas estavam estruturadas e a investigação de interações proteínaligante foi realizada utilizando técinicas de ressonância magnética nuclear. Estes resultados
contribuiram para o aumento do conhecimento das propriedades bioquímicas dessas
proteínas e podem auxiliar no entendimento do mecanismo de replicação viral.
Palavras-chave: Expressão, purificação, fitovírus, SBMV, RSPaV.
15
ABSTRACT
The grapevine culture is the most economically important fruit plant in the world. The
grapevine is the basic source of high valued wines and other alcoholic beverages. The
Rupestris stem pitting associated virus-RSPaV was identified as the causative agent of the
"rupestris stem pitting" (RSP) disease, a component ofthe the rugose wood (RW) complex,
one of the major disease complexes affecting grapevines. This disease is transmitted by
grafting and is one of the most widespread viruses of grapevine in the world. In brazil this
disease was reported for the first time in late 1960s. As it is difficult to seperate the viral
particles from the infected plant, the expression of large-scale of coat protein of RSPaV in
bacteria is a promising strategy for understanding their properties. The bean crop
productivity has also greatly affected by the occurrence of diseases that reduce the
production and consequently reduce their supply, causing an increasein the prices. This
virus has a narrow host range, confined almost exclusively to species of leguminous
species, some of the species has a very high economical value such as the common bean
and soybean. The movement protein (MP), serine protease and VPg, are produced in low
concentrations, making impossible the large-scale purification from infected plants. In
Brazil, more than ten virus were reported in beans, among them, Southern bean mosaic
virus (SBMV) from the genus Sobemovirus. The large scale expression and purification of
proteins VPg, serine protease and movement protein of SBMV and capisidial protein of
RSPaV were performed using pMAL pET28a vectors. Analysis of the proteins by dynamic
light scattering showed that was possible to obtain monomodal protein solutions. By
circular dichroism was observed that the proteins were structured and the investigation of
protein-ligand interactions was performed using nuclear magnetic resonance. These results
contributed to increase the knowledge of biochemical properties of this proteins and may
help in understanding the mechanism of viral replication.
Keywords: Expression, purification, phytovirus, SBMV, RSPaV.
16
1) INTRODUÇÃO
1.1) Os Vírus
Os vírus infectam praticamente todas as formas de vida celular, desde procariotos
(bactérias e archaea) até eucariotos (animais vertebrados e invertebrados, plantas e fungos). A
presença de vírus pode ser nitidamente visível em organismos hospedeiros, mostrando sintomas
da doença, no entanto, muitos organismos saudáveis podem ser hospedeiros de vírus não
patogênicos, sejam eles ativos ou inertes.
Os vírus mais simples são compostos por um pequeno ácido nucleico protegido por uma
camada de proteína. Todos os vírus são parasitas obrigatórios que dependem da maquinaria
celular do hospedeiro para se reproduzir. Os vírus não são ativos fora de seus hospedeiros, e isso
sugere que eles não são seres vivos. A maioria dos vírus infecta um único tipo de hospedeiro.
1.1.2) Vírus vegetais
Apesar das paredes celulares das plantas serem extremamente espessas e resistentes,
existem diversos vírus capazes de infectar plantas, e disseminam-se a partir da célula infectada,
atingindo células vizinhas. A maioria dos vírus de plantas conhecidos corresponde a vírus de
RNA de fita positiva, foi postulado que estes pequenos genomas facilitam a transferência entre as
células da planta.
Os vírus causam muitas doenças em plantas importantes e são responsáveis por perdas na
qualidade e produtividade de diferentes culturas vegetais em todas as partes do mundo. Vírus de
plantas têm sido estudados há mais de 100 anos, mas a maior parte da pesquisa foi restrita
àqueles que causam doenças em plantas cultivadas. Provavelmente, esta restrição não favorece
uma visão precisa da verdadeira natureza dos vírus de plantas (WREN et al., 2006).
17
O advento de novas tecnologias embiologia molecular esta nos dando uma visão muito diferente
do mundo da virologia vegetal. Os estudos até agora são preliminares, mas prometem nos mostrar
uma nova imagem da diversidade dos vírus de plantas que é muito além de nossa compreensão
atual. Este novos conhecimentos abrangem uma série de questões importantes na agricultura,
incluindo a fonte de infecções por vírus emergentes, o papel dos vírus em ecologia vegetal,
incluindo potenciais efeitos benéficos (ROOSSINCK et al., 2010), o papel da biodiversidade, a
função dos hospedeiros na emergência de doenças (KEESING et al., 2011) e, finalmente, a
proposta de estratégias para combater a infecção viral.
1.2) A videira
A videira é uma planta pertencente à família Vitaceae, cujas principais cultivares são do
gênero Vitis (CRONQUIST, 1981). Estima-se existirem cerca de 6000 variedades de V. Vinifera
L. (ALLEWELDT; DETTWEILER, 1994), das quais menos de 400 são de importância
comercial. Atualmente, a maioria dos recursos genéticos de Vitis vinifera L. é mantida em
coleções de germoplasma (GALET, 2000). Sua importância econômica é devido ao fato de a uva
ser uma das frutas mais consumidas no mundo, tanto in natura como em suco, possuindo também
um extenso mercado na indústria de vinhos e outros fermentos alcoólicos (CHOUDHURY et al.,
2001), ocupando mundialmente nove milhões de hectares plantados, o que faz com que a uva só
perca em importância em área para citrus e banana (POMMER, 2002).
A Vitivinícola mundial apresenta grande concentração. A União Européia se destaca,
representando cerca de: 45 % da superfície vitícola mundial; 65 % da produção mundial de uvas;
60 % do consumo mundial e cerca de 70 % das exportações mundiais. O Brasil, no cenário
internacional, é o 21° país em área cultivada, 14° em produção de uvas, 24° em exportação de
uva (MELLO, 2006). A viticultura é uma atividade econômica recente no Brasil, quando
comparada aos tradicionais países produtores da Europa.
A videira foi introduzida no Brasil em 1532 adquirindo importância comercial,
principalmente nos Estados do Rio Grande do Sul e de São Paulo (SOUSA; MARTINS, 2002). A
área de uvas no Brasil em 2002, segundo IBGE, foi de 65.381 ha. O Rio Grande do Sul figura
18
como o principal produtor com área de 36.668 há, ou seja, 56,08 % da área total do país, seguido
pelo Estado de São Paulo com 12.152 há (MELLO, 2006).
1.2.1) Viroses da videira
A cultura da videira está sujeita a um grande número de doenças que pode causar perdas
significativas na produção de uva. As doenças causadas por vírus representam um dos mais
importantes problemas fitossanitários da viticultura mundial, ocorrendo em praticamente todas as
regiões onde a videira é cultivada (AMORIM; KUNIYUKI, 1997). Doenças causadas por vírus
na cultura da videira têm sido mencionadas nos países de tradição vitícola há mais de um século,
porém o estudo desses patógenos evoluiu nos últimos 40 anos. Até 1960, eram mencionadas na
literatura, apenas oito anomalias consideradas de origem viral. Dentre essas, estavam as doenças
denominadas de ‘Pierce's disease’ e ‘Flavescence dorée’, as quais, sabe-se hoje, são causadas por
uma bactéria e um fitoplasma, respectivamente.
Dois fatos marcaram decisivamente o avanço na pesquisa das viroses da videira,
inicialmente a descoberta de que o vírus responsável pela degenerescência da videira (fanleaf ou
court-noué) era transmitido através do solo pelo nematóide Xiphinema index e, posteriormente a
transmissão mecânica de diversos vírus da videira para plantas herbáceas. Atualmente, com o
aperfeiçoamento das técnicas utilizadas em virologia vegetal para a transmissão, purificação,
caracterização e diagnose de vírus, são conhecidas na videira cerca de cinquenta doenças (55
vírus distribuídos em 20 gêneros) consideradas de origem viral (MARTELLI, 2003; KUHN;
FAJARDO, 2006). Muitas destas doenças estão bem identificadas e caracterizadas. Outras,
embora consideradas viroses, não têm ainda uma definição exata da natureza do patógeno, se
vírus, fitoplasma, viróide, etc., sabe-se apenas que são perpetuadas pelo material vegetativo e por
enxertia, condição mínima para que uma doença seja incluída no grupo das viroses. Muitos vírus
conhecidos na videira não apresentam importância econômica. Outros, embora causem prejuízos
com reflexos econômicos importantes, estão restritos a determinadas regiões ou países,
possivelmente condicionados a certas tendências regionais, como o plantio de cultivares sensíveis
ou devido às condições climáticas regionais que favoreçam a ocorrência de vetores. Entretanto,
19
existe um grupo dessas doenças de grande relevância econômica para a viticultura, razão pela
qual é objeto de constante atenção nos programas de seleção sanitária dos diversos países
vitícolas. Dessas viroses já foram identificadas no Brasil quatro das mais importantes "enrolamento da folha" (leafroll), "intumescimento dos ramos" (corky bark), "caneluras do
tronco" (stem grooving, stem pitting) e "degenerescência da videira" (fanleaf). Outras duas
possuem menor relevância econômica e ocorrem de forma latente na maioria das cultivares
comerciais, a "necrose das nervuras" (vein necrosis) e "manchas das nervuras" (fleck) (KUHN;
FAJARDO, 2006).
No Brasil, o primeiro relato de virose em videira foi em 1972 no Estado de São Paulo
(KUNIYUKI, 1972a) e, atualmente, as principais doenças descritas em outros países já foram
constatadas no território nacional. A disseminação desses patógenos pode ser potencializada
quando se considera que a videira é, comercialmente, multiplicada por propagação vegetativa, o
que propicia a possibilidade da ocorrência de infecção latente, na qual plantas infectadas não
apresentam sintomas aparentes. Outros fatores que contribuem para o agravamento do problema
são: presença de diferentes espécies de vírus infectando uma mesma planta; suscetibilidade de
cultivares a estes agentes; combinação copa/porta-enxerto e presença de vetores desses vírus na
área do parreiral, entre outros.
Lenho estriado ou cascudo (“Rupestris stem pitting” - RSP)
O lenho estriado é uma doença transmitida por enxertia que se caracteriza por induzir na
indicadora Vitis rupestris ‘St. George’ (‘Rupestris du Lot’) faixa ou banda de pequenas caneluras
no lenho, que se desenvolve a partir do ponto de enxertia para a base da planta. Os sintomas
característicos do cascudo ou lenho estriado são apresentados pelas variedades Itália, Rubi e
Benitaka. As folhas apresentam-se menores, ligeiramente assimétricas e com mosaico difuso. A
casca do tronco torna-se espessa, quebradiça e fendilhada e não se destaca com facilidade do
lenho (AMORIN; KUNIYUKI, 1997). A etiologia do RSP não é totalmente conhecida, um vírus
denominado Rupestris stem pitting associated virus – RSPaV foi identificado como o agente
causador da doença do lenho estriado (MENG et al., 1997; MENG et al., 1998; MENG et al.,
1999a), sendo classificado como membro do gênero Foveavirus (MARTELLI; JELKMANN,
1998), família Flexiviridae(ADAMS et al., 2004).
O RSPaV sozinho geralmente não produz sintomas e não tem grande impacto sobre
20
crescimento e produtividade da videira (BONFIGLIOLI et al., 1998; REYNOLDS et al., 1997).
A presença de um outro vírus, como Grapevinevirus A (GVA), Grapevine fleck virus, ou
Grapevine leafroll associated virus-1, associado ao RSPaV, é requerida para sintomas de Rugose
wood-typeocorrerem (BONFIGLIOLI et al., 1998). Estes vírus podem ser transmitidos através de
enxertia de videiras infectadas pelo RSPaV (BONFIGLIOLI et al., 1998; MARTELLI, 1993) ou
no caso do GVA por cochonilha Planococcus ficus (ENGELBRECHT; KASDORF, 1990;
MINAFRA; HADIDI, 1994). Cultivares de videiras sem sintomas, mas infectados pelo RSPaV
são um risco para o desenvolvimento do RSP, portanto é importante saber se uma videira contém
o RSPaV. A presença do RSPaV pode ser determinada por RT-PCR usando oligonucleotídeo
baseado na sua sequência genômica (MENG et al., 1999; ZHANG et al., 1998) com
aparentemente maior confiabilidade do que indexação biológica em St. George (MENG et al.,
1999). O vírus foi reportado em pólen (ROWHANI et al., 2000) e sementes (STEWART;
NASSUTH, 2001), mas essas fontes não originam mudas infectadas (MENG et al., 2003).
O desenvolvimento de técnicas moleculares para a detecção do RSPaV mostrou que este
vírus encontra-se distribuído mundialmente (MINAFRA; BOSCIA, 2003). No entanto, a
detecção de infecções causadas pelo RSPaV ainda é problemática. Anticorpos produzidos para a
detecção da proteína capsidial (MENG et al., 2003; MINAFRA et al., 2000) ainda não foram
comercializados para o uso em testes de larga escala, como o ELISA.
O genoma completo deste vírus apresenta 8.726 nucleotídeos com extremidade 3’
poliadenilada (MENG et al., 1998; ZHANG et al., 1998) e similaridade com o Apple stem pitting
virus – ASPV) (MENG et al., 1998; ZHANG et al., 1998). O genoma do RSPaV apresenta cinco
cadeias abertas de leitura (“Open reading frame” - ORFs) que codificam proteínas envolvidas na
replicação (ORF1), movimento (ORF2-4) e formação do capsídeo viral (ORF5) (MARTELLI;
JELKMANN, 1998; MENG; GONSALVES, 2003). Uma outra cadeia aberta de leitura (ORF 6),
parcialmente sobreposta a ORF5, que codifica uma possível proteína com função ainda
desconhecida foi identificada (ZHANG et al.1998).
21
Figura 1. Organização do genoma do RSPaV. ORF1: gene da replicase que inclui os motivos metil
transferase, cisteíno protease, helicase e RNA polimerase. ORF 2, 3 e 4: bloco triplo de genes,
codificadores de proteínas envolvidas no movimento célula a célula. OFR5:gene daproteína capsidial.
ORF6: gene de proteína com função desconhecida. Extremidade 3` poliadenilada (A)n. Adaptado de
MENG et al., 2006.
A presença de uma ORF adicional sobrepondo o gene da proteína capsidial também foi
encontrada em outra espécie do gênero Foveavirus, o Apricot latent virus - APLV (GENTIT et
al., 2001). A existência desta ORF tem sido proposta baseando-se na ocorrência ‘in frame’ de
códon de iniciação e finalização. O códon de iniciação da ORF6 está localizado na região central
(nt 458) do gene da capa proteica (ZHANG et al.,1998) que mostra-se conservada entre as
variantes analisadas por Nolasco et al. (2006). Entretanto, estes autores não localizaram este
códon de iniciação em um dos grupos de variantes do RSPaV por eles analisado. Para este grupo
(grupo 3), o códon de iniciação mais próximo foi localizado 72 nt após o códon de iniciação
citado por ZHANG et al. (1998), ou seja, no nucleotídeo 530 da ORF5, o que codificaria uma
proteína de menor massa molecular (10.7 kDa). Foi observado que o RSPaV encontrado no
Estado de São Paulo (Acesso GenBank: DQ443732) apresenta o códon ‘in frame’ de iniciação
somente na posição 530 da ORF5. Além disso, o alinhamento de sequências de nucleotídeos do
RSPaV mostrou que algumas sequências variantes possuem o códon de iniciação nas duas
posições, ou seja, no nucleotídeo 458 e 530 (PEREIRA; GASPAR. Dados não publicados). Estas
variações levam ao questionamento quanto à existência da ORF6 no genoma do RSPaV, uma vez
que evidências diretas da existência desta ORF ainda não foram apresentadas. Além disso,
estudos que visam o melhor entendimento das características moleculares do RSPaV poderão ser
realizados.
Nos últimos anos, vários trabalhos que descrevem a variabilidade genômica do RSPaV
22
têm sido publicados (MENG et al., 1999b; ROWHANI et al., 1999; ROWHANI et al., 2000;
SOARES et al., 2000; SANTOS et al., 2003; CASATI et al., 2003; TERLIZZI et al., 2003;
LIMA et al., 2003; MENG et al., 2005; NOLASCO et al., 2006).
1.3) O Feijão
O feijão (Phaseolus vulgaris L.), leguminosa comum da família das Fabáceas
(Leguminoseae) (CRONQUIST, 1981), constitui uma das culturas mais importantes existentes,
sendo consumida por todo o mundo, devido principalmente ao seu valor nutritivo. A cultura do
feijão no Brasil assume um grande valor social, pois constitui a base da alimentação da
população, sendo fonte de proteína vegetal de baixo custo. A dupla feijão com arroz é o prato
principal na alimentação da maioria da população brasileira (CULTURA, 2000). Dados das
safras (2008) mostram que o Brasil produziu cerca de 3,52 milhões de toneladas de feijão, sendo
a região sudeste a maior produtora (CONAB, 2009). A produtividade da cultura é grandemente
afetada
pela
ocorrência
de
doenças
que
diminuem
sensivelmente
a
produção
e,
conseqüentemente, reduzem a sua oferta, provocando um aumento nos preços de mercado
(CULTURA, 2000). Estas doenças têm exercido um papel relevante na baixa produtividade de
feijoeiros no Brasil e outros países latino-americanos (JAYASINGHE, 1982; COSTA; COSTA,
1983). As mais numerosas são ocasionadas por fungos seguindo-se as de etiologia viral, várias
com expressiva importância econômica (GAMEZ, 1977).
No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro (COSTA et al.,1972;
BIANCHINI et al.,1997), citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV),
do gênero Sobemovirus (HULL; FARGETTE, 2005). Este vírus tem uma restrita gama de
hospedeiras, confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo
algumas de interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. Embora o SBMV não seja no
momento um problema fitossanitário, observações de campo no Estado do Paraná têm indicado a
sua presença em infecções mistas principalmente com o Bean golden mosaic virus (Gênero
Begomovirus, Família Geminiviridae), levando à possibilidade de problemas futuros para a
cultura do feijoeiro (Bianchini, A. Comunicação pessoal).
23
1.4) Sobemovirus
O nome Sobemovirus é originado das iniciais da espécie tipo do gênero Southern bean
mosaic virus e o gênero compreende 13 espécies definitivas.
A maioria das espécies dos sobemovírus apresenta distribuição geográfica limitada, mas
algumas espécies são encontradas em várias partes do mundo (HULL, 1988). Os sobemovírus
infectam plantas tanto mono como dicotiledôneas, mas a gama de hospedeiras de cada espécie é
relativamente restrita. Os sintomas induzidos são, principalmente, mosaico e mosqueado e, em
geral, causam infecção sistêmica invadindo quase todos os diferentes tipos de tecidos das plantas
hospedeiras (HULL, 1988). São transmitidos mecanicamente, por vetores e por sementes. Para a
maioria das espécies (CoMV, RYMV, SNMoV, SBMV, SCPMV, TRoV) a transmissão é feita
por besouros coleópteros enquanto o BSSV é transmitido por afídeos, o VTMoV por mirídios e o
SoMV por dípteros, homópteros e hemípteros (HULL, 1988; TAMM; TRUVE, 2000).
1.4.1) Organização do genoma
Os sobemovírus possuem partículas virais isométricas com cerca de 30 nm de diâmetro,
com uma única camada proteica formada por 180 subunidades com massamolecular igual a 2634 kDa. O RNA genômico é uma molécula de fita única e polaridade positiva com tamanho de
aproximadamente 4 a 4,5 kb. A região 5’ terminal do RNA possui uma proteína ligada ao
genoma (VPg) e na região 3’ terminal falta uma cauda poliadenilada. O genoma dos sobemovírus
possui quatro cadeias abertas de leitura (“Open reading frame”, ORF) (Figura 1). Todos os
sobemovírus sequenciados contêm uma pequena ORF1 na extremidade 5’-terminal do genoma,
que codifica a possível proteína do movimento célula a célula, e uma ORF4 na extremidade 3’terminal que codifica a proteína capsidial. Com base nas diferenças de organização na parte
central do genoma (que codifica uma poliproteína), os sobemovírus podem ser divididos em dois
24
grupos: aqueles semelhantes ao SCPMV e aqueles semelhantes ao CoMV. A poliproteína do
SCPMV é codificada por uma longa e contínua ORF2, contendo também uma região
codificadora interna, ORF3. Organização semelhante do genoma já foi descrita para o isolado
Arkansas do SBMV (SBMV-Ark) (LEE; ANDERSON, 1998), isolado “Ivory Coast” do Rice
yellow mottle virus- RYMV-CI (YASSIet al., 1994) e Lucerne transient streak virus - LTSV
(FEFFRIES et al., 1995).
Por outro lado, na organização genômica do CoMV falta a ORF2 contínua e uma região
codificadora similar à ORF3 do SCPMV. Em vez disso, CoMV possui duas ORFs sobrepostas,
ORF2a e ORF2b, e a poliproteína é expressa através de um mecanismo de mudança de fase
(“frameshift”) ribossomal -1 (MÄKINENet al., 1995a; RYABOVet al., 1996).
Figura 2. Organização genômica dos sobemovírus Southern cowpea mosaic virus (SCPMV) e Cocksfoot
mottle virus (CoMV). Figura obtida de Hull; Fargette (2005).
1.5) Produtos gênicos e suas possíveis funções
Os RNA de vários sobemovírus já foram traduzidos in vitro em sistemas de “lisado de
reticulócitos de coelho” e de “extrato de germe de trigo”. Os RNA do SBMV e SCPMV
codificam a tradução de 4 proteínas nesses sistemas: 105 kDa, 75 kDa, 29 kDa e 14 kDa para o
SBMV e 100 kDa, 70 kDa, 30 kDa e 20 kDa para o SCPMV (MANG et al., 1982; SALERNORIFE et al., 1980). Quatro polipeptídeos foram também traduzidos a partir dos RNA do CoMV
25
(MÄKINEN et al., 1995), LTSV (MORRIS-KRSINICK; FORSTER, 1983), SNMoV
(KIBERSTIS; ZIMMERN, 1984) e TRoV (MORRIS-KRSINICK; HULL, 1981), apresentando
somente ligeiras diferenças na massa molecular. Estudos têm demonstrado que as proteínas de
100 e 70 kDa do SCPMV são relacionadas e traduzidas a partir do RNA genômico enquanto a
proteína de 20 kDa é presumivelmente codificada pela ORF1 (MANG et al., 1982; WU et al.,
1987). Já a poliproteína codificada pela ORF2 do SCPMV é processada por clivagem proteolítica
para originar o produto de tradução de 70 kDa (WU et al., 1987). A proteína de 30 kDa (proteína
capsidial) é traduzida a partir de um pequeno RNA subgenômico (sgRNA) que já foi encontrado
em tecidos infectados por sobemovírus bem como em partículas virais (RUTGERS et al., 1980;
WEBER; SEHGAL, 1982; RYABOV et al., 1996; TAMM et al., 1999). Estudos com o CoMV,
utilizando a síntese de proteínas in vitro e imunoprecipitação com anticorpos específicos,
mostraram que as proteínas de 12 kDa, 71 kDa e 100 kDa são sintetizadas a partir do RNA
genômico do vírus. A proteína 12 kDa é produzida a partir da ORF1, a proteína 71 kDa a partir
da ORF2a e a 100 kDa é a poliproteína produzida a partir das ORFs 2a e 2b. A proteína de 34
kDa (proteína capsidial) é produzida a partir de um sgRNA.
1.5.1) ORF1
Todos os sobemovírus caracterizados codificam uma pequena proteína a partir da ORF1,
mas estas apresentam sequências e massas moleculares diferentes (11,7 a 24,3 kDa) e não são
relacionadas com qualquer outra proteína conhecida. Análises de mutantes incapazes de produzir
P1 ou mutantes produtores de proteínas truncadas indicaram que as proteínas P1 do RYMV ou do
SCPMV não são necessárias para a replicação viral, porém são necessárias para o movimento
célula a célula e movimento sistêmico (BONNEAU et al., 1998; SIVAKUMARANet al., 1998).
Proteína P1 recombinante do CoMV foi capaz de interagir com RNA de fita única (ssRNA) numa
maneira independente da seqüência mas não com dsDNA (TAMM; TRUVE, 2000). Assim,
levando-se em conta que nenhum outro produto gênico dos sobemovírus estaria relacionado com
o movimento célula a célula ou movimento sistêmico do vírus, é proposto que a proteína P1
representa a proteína do movimento dos sobemovírus. Entretanto, a localização da proteína P1 in
26
vivo ainda não foi possível para nenhum sobemovírus. Foi também descrito que a proteína P1 do
RYMV funciona como supressora do mecanismo de silenciamento gênico (“posttranscriptional
gene silencing”, PTGS) (VOINNET et al., 1999).
1.5.1.1) Proteína do Movimento
Para realizar uma infecção sistêmica na planta hospedeira, os fitovírus precisam superar
diversas barreiras. Eles devem entrar na célula através de um ferimento ou inoculação por
vetores, iniciar a multiplicação, translocar para as células vizinhas (movimento célula a célula) e
finalmente para as outras partes da planta (movimento a longa distância). Os fitovírus empregam
comunicações intercelulares para se movimentarem pela planta. No movimento célula a célula os
vírus utilizam os plasmodesmos para atravessar a parede celular. Os plasmodesmos são canais
estreitos revestidos pela membrana plasmática e atravessados por um túbulo de retículo
endoplasmático modificado, conhecido como desmotúbulo. Esses canais permitem a
continuidade do citoplasma e do sistema de endomembranas entre as células (RAVEN et al.,
2001). Em células vegetais sadias, apenas moléculas com massa molecular inferior a 1 kDa são
capazes de atravessar passivamente esses canais, que possuem limite de exclusão muito inferior à
massa molecular dos menores fitovírus, ou mesmo de seus RNAs ou DNAs genômicos (WOLF
et al., 1987). Para suprir essa restrição física, os fitovírus codificam proteínas especializadas,
denominadas Proteínas do Movimento (MPs), capazes de dilatar os plasmodesmos permitindo a
passagem de complexos formados por proteínas mais ácidos nucléicos virais ou mesmo de
vírions inteiros (DEOM et al., 1992).
27
Figura 3. Movimento célula a célula do Tobacco mosaic virus (TMV). Neste modelo a proteína do
movimento (MP) se liga ao RNA viral.[1] Proteínas da hospedeira podem se ligar ao complexo MP.[2] O
complexo MP atravessando o plasmodesmo.[3,4 e 5] As proteínas se desligam do RNA viral permitindo
que as replicases iniciem a replicação.
Para o transporte a longa distância, além dos plasmodesmos, foi proposta a utilização do
sistema vascular da planta (floema) (CARRINGTON et al., 1996). Durante todo esse processo de
transporte, uma ou mais proteínas virais exercem papel fundamental. A maior parte dos vírus de
plantas estudados parece expressar uma proteína especificamente relacionada com o movimento,
denominada “Proteína do Movimento” (“Movement Protein”- MP), que está envolvida no
transporte dos vírus através dos plasmodesmos (LAZAROWITZ; BEACHY, 1999). O papel da
MP no movimento a longa distância ainda é mal compreendido, no entanto, alguns autores
sugerem que a MP realize funções específicas no espalhamento dos vírus sistemicamente (HILF;
DAWSON, 1993). Os fitovírus são classificados em três grupos principais com base na
necessidade ou não da proteína capsidial (CP) para atravessarem os plasmodesmos. O grupo I
compreende os vírus que não necessitam da CP para realizarem o movimento. Nos vírus do grupo
II a CP age auxiliando a MP no movimento e protegendo o genoma viral. Os vírus do grupo III
também requerem a CP, porém, são transportados como partículas inteiras (SCHOLTHOF,
2005). O movimento envolvendo CP pode ocorrer através de túbulos (movimento “túbuloguiado”) e é utilizado por uma grande variedade de vírus de planta, dentre eles: tospovírus,
comovírus, caulimovírus, bromovírus, alfamovírus (LAZAROWITZ E BEACHY, 1999;
28
CARRINGTON et al., 1996). Nesses casos, os plasmodesmos das células infectadas são
drasticamente modificados, os desmotúbulos são removidos e um túbulo formado por MP é
inserido no poro plasmodesmal (Figura 3). É por esse túbulo que as partículas virais são
transportadas, sendo que neste tipo de transporte a proteína capsidial é também requerida
(LAZAROWITZ E BEACHY, 1999; CARVALHO et al., 2004).
Figura 4. Movimento viral célula a célula. Na parte inferior da figura, movimento é denominado túbulo
guiado.
As MPs virais podem ser agrupadas em quatro superfamílias: I) MPs codificadas pelo
bloco triplo de genes dos potexvírus e vírus relacionados; II) MPs dos tymovírus; III) uma série
de pequenos polipeptídeos menores que 10 kDa, codificados pelos carmovírus e alguns
geminivírus; IV) a superfamília ‘30 K’, relacionada com a MP de 30 kDa do TMV. Para a
superfamíla ‘30 K’ foram propostos dois modelos de movimento, o primeiro é exemplificado
pelo Tobacco mosaic virus (TMV) e está relacionado com o aumento do limite de exclusão dos
plasmodesmos e o segundo, típico dos comovírus, ocorre através de túbulos (Figura 4).
29
MELCHER (2000) após alinhar a seqüência de aminoácidos das MPs de 30 kDa de vários
gêneros de fitovírus mostrou que os agrupamentos formados estão relacionados com o tipo de
movimento realizado pelo vírus. Um grupo reúne os vírus formadores de túbulos e outro, aqueles
vírus que não se movimentam por túbulos.
1.5.2) ORF 2
A ORF 2 codifica uma poliproteína que por clivagem origina três produtos funcionais:
uma serino protease; uma proteína ligadora do genoma viral (VPg) e uma polimerase com
atividade relacionada à replicação do RNA viral, a RNA polimerase RNA-dependente.
(GORBALENYA et al., 1988; LEE; ANDERSON, 1998; MÄKINEN et al., 1995; OTHMAN;
HULL, 1995; RYABOV et al., 1996; WU et al., 1987; YASSI et al., 1994). Não é ainda
conhecido se estas são as únicas funções da poliproteína. Dentro da ORF 2 encontra-se a ORF 3;
que codifica uma proteína de função desconhecida. Os sobemovírus caracterizados codificam
uma proteína com massa molecular de cerca de 100 kDa.A tradução da poliproteína dos
sobemovírus não é iniciada a partir de RNA subgenômico (nunca detectado em tecidos
infectados), mas sim a partir do próprio RNA genômico. Assim, as ORFs 1 e 2 são traduzidas
apartir de seus respectivos códons de iniciação AUG. Produtos de tamanho esperado de ambas as
ORFs foram observados após tradução dos RNAs genômicos do SCPMV (SIVAKUMARAN et
al., 1998) e do CoMV (TAMM et al., 1999).
1.5.2.1) VPg
A VPg encontra-se ligada covalentemente à extremidade5' terminaldo RNA de uma
variedade de vírus vegetais e animais. Estudos bioquímicos mostraram que a VPg não é apenas
ligada ao RNA viral de fita simples e polaridade positiva, mas também em RNA de fita negativa
e fitas nascentes do estágio replicativo. Com base nestes estudos foi sugerido que a VPg pode
30
estar envolvida na replicação genômica, possivelmente na iniciação da síntese do RNA. Foi
sugerido ainda que a clivagem da ligação entre a VPg e o RNA pode ter um uma função
regulatória; é possível que apenas RNAs ligados à VPg sejam encapsidados, enquanto RNA sem
a proteína sirva como mRNA ou como templates (LEE et al. 1977; NOMOTO et al. 1977).
Trabalhos atuais indicam uma versatilidade da VPg, tendo participação nos processos de
replicação do RNA, movimentação viral célula a célula e longa distância, tradução, supressão de
silenciamento gênico, além de outras funções (BORGSTROM et al., 2001; KELLER et al., 1998;
LELLIS et al., 2002; RAJAMAKI et al., 2002; SCHAAD et al., 1996; SCHAAD et al., 1997).
Algumas proteínas VPg podem ainda ser encontradas associadas à membrana de plantas
infectadas (HAFREN; MAKINEN, 2008) e possuir a capacidade de ligar-se anionicamente a
fosfolipídios in vitro, evidenciando alterações estruturais associadas à ligação (RANTALAINEN
et al., 2009). Estudos recentes têm sugerido que uma flexibilidade estrutural permite essa
variedade functional das proteínas VPg (GRZELA et al., 2008; HEBRARD et al., 2009;
RANTALAINEN et al., 2008; SATHESHKUMAR, 2005), no entanto nenhuma estrutura foi
obtida através da difração de raio-X para que pudesse permitir avanços nessa linha de pesquisa.
Várias proteínas VPg de vírus vegetais podem ser classificadas como proteínas intrinsecamente
desordenadas (IDPs), incluindo VPgs do rice yellow mottle virus (RYMV), lettuce mosaic virus
(LMV), potato virus A (PVA), potato virus Y (PVY) e sesbania mosaic virus (SeMV) (GRZELA
et al., 2008; HEBRARD et al., 2009; RANTALAINEN et al., 2008; SATHESHKUMAR et al.,
2005). IDPs em seu estado nativo não tem estruturas fixas, necessitando de uma associassociação
com um ligante para permanecerem com suas estruturas estáveis. Esta é a característica mais
vantajosa de proteínas multifuncionais, permitindo assim uma adaptação estrutural (KIMMO et
al., 2009).
1.5.2.2) Serino protease
O processamento de poliproteínas é uma das principais estratégias utilizadas por vírus de
animais e de plantas para gerar mais do que uma proteína funcional a partir da mesma cadeia de
polipeptídeo (WELLINK E VANKAMMEN, 1988) e é realizado por uma serino protease,
31
semelhante às proteases celulares, como tripsina e quimotripsina (GORBALENYA et al., 1988).
Esta protease é similar às cisteínas proteases encontradas nos picornavírus (Família
Picornaviridae) e é característica de todos os sobemovírus, polerovírus (Família Luteoviridae),
Pea enation mosaic virus (PEMV, Gênero Enamovirus) e Mushroom bacilliform virus (MBV,
Gênero Barnavirus). O motivo serino protease está localizado no terço N-terminal da
poliproteína codificada pela ORF2 do SBMV, SBMV-Ark, SCPMV, RYMV e LTSV e é
codificada pela ORF2a no caso do CoMV (GORBALENYA et al., 1988). O sítio catalítico H-DS (Histidina, posição 181-Ácido Aspártico, posição 216-Serina, posição 284) encontrado no
SCPMV é também conservado no SeMV e outros sobemovírus (LOKESH et al., 2001). Em
SeMV, esta protease, cliva a poliproteína codificada pela ORF2 em três posições diferentes, em
E325-T326, T403-E402 eE498-S499, para liberar três domínios de proteases diferentes, sendo
elas VPg, p10 e RDRP (RNA polimerase dependente de RNA) (SATHESHKUMAR et al.,
2004). Na maioria dos outros vírus que têm VPg na extremidade 5' do seu genoma, o arranjo de
domínio é VPg-protease, ao passo que, em sobemovírus, é protease VPg.
O resíduo H181 do sítio ativo forma ligações de hidrogênio com ambos S284 e D216, os
outros dois resíduos da tríade catalítica. O sítio ativo e as ligações de hidrogênio envolvidas estão
mostradas na figura 5.
32
Figura 5. Sítio ativo da protease de SeMV.Glicerol =GOL. As ligações de hidrogênio estão representadas
por linhas pontilhadas.
Foi demonstrado que a serino protease do SeMV possui atividade proteolítica atuando em
cis e trans, além de possuir possíveis hélices que estariam associadas à ligação com membranas
(SATHESHKUMAR et al., 2004). Com exceção do LTSV, todos os produtos da ORF2 dos
sobemovírus mostraram a presença de tais hélices sugerindo uma possível função de ligação às
membranas. Em muitos vírus de RNA de polaridade positiva, foi observado que a replicação e
montagem das partículas virais ocorrem em associação com membranas (CARETTE et al., 2002;
DEN BOON et al., 2001).
33
2) REPLICAÇÃO VIRAL
Muitas proteínas codificadas pelos RNAs virais, sejam elas capsidiais ou proteínas não
estruturais, acumulam-se na célula como "corpos de inclusão" ou “viroplasmas” tanto no
citoplasma como no núcleo. A agregação desses produtos gênicos virais pode constituir um
método de remoção de proteínas que, em grandes quantidades, poderiam ter influência no
funcionamento da célula. Entretanto, os corpos de inclusão poderiam estar também associados
com a replicação e/ou montagem das partículas virais (MATTHEWS, 2001). Na maioria dos
casos, entretanto, a síntese das proteínas virais não estruturais ocorre de maneira transitória de
modo que a quantidade produzida é extremamente baixa.
Quando as proteínas virais acumulam nas células como corpos de inclusão, há a
possibilidade de as mesmas serem purificadas por métodos bioquímicos, a partir de extratos das
folhas das plantas infectadas como ocorre, por exemplo, com os potyvírus (URCUQUIINCHIMA et al., 2001). Por outro lado, quando as proteínas não estruturais (e mesmo as
partículas virais) são sintetizadas em tecidos específicos da hospedeira (floema, por exemplo) e
em baixas concentrações, tais métodos mostram-se ineficientes e alternativas devem ser
buscadas. Uma estratégia alternativa que vem sendo utilizada ultimamente para estes casos é a
expressão de tais proteínas, sejam estruturais ou não, em Escherichia coli.
3) EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM BACTÉRIA
Devido à dificuldade de purificação das partículas virais a partir da videira infectada, no
caso da CP do RSPaV a expressão em larga escala de proteínas virais em bactérias, purificação e
subsequente renovelamento, podem auxiliar no entendimento da estrutura e função destas no
ciclo de replicação viral. A estrutura dessas proteínas pode ser determinada através de duas
etapas principais: a cristalização da proteína e depois o recolhimento de dados de difração de
raios X pelos cristais. No caso de proteínas não estruturais, como VPg, serino protease e MP do
SBMV, a expressào em larga escala também é requerida, pois estas proteínas são encontradas em
34
baixa concentração nas hospedeiras.
A expressão de proteínas heterólogas em bactéria muitas vezes leva à formação de
agregados insolúveis ou corpos de inclusão (IBs). Estes agregados consistem basicamente de
proteínas recombinantes e podem ser facilmente isoladas dos demais componentes bacterianos
por centrifugação após o rompimento celular, proporcionando assim um meio simples de
recuperar a proteína de interesse. No entanto, solubilização dos corpos de inclusão e subsequente
renovelamento da proteína, a fim de obter corretamente a reforma das pontes dissulfeto ainda é
uma questão central no campo da biotecnologia com importantes implicações teóricas e práticas.
Durante a última década, vários estudos têm revelado uma caracterísca peculiar dos IBs, que é a
existência de estruturas secundárias residuais das proteínas recombinantes (OBERG et al., 1994;
PRZYBYCIEN et al., 1994; FINK, 1998; UMETSU et al., 2004; AMI et al., 2005; UMETSU et
al., 2005). Para obter a proteína nativa, os IBs primeiro devem ser liberados, solubilizados e
posteriormente renovelados para recuperar sua atividade biológica. Eles são sujeitos a repetidas
lavagens por centrifugação e posteriormente solubilizados. Algumas proteínas podem ser
solubilizadas com agente não desnaturante (por exemplo, L-arginina, N-Lauril Sarcosina,
Sulfobetaína, Tampão Tris pH 12,5 com ou sem uréia 2M). No entanto, os corpos de inclusão são
em geral solubilizados pelo uso de altas concentrações de agentes desnaturantes tais como uréia e
cloridrato de guanidina, juntos com um agente redutor como β-mercaptoetanol (CLARCK, 1998;
LILIE et al., 1998). As proteínas solubilizadas dessa forma podem ser renaturadas pela lenta
remoção do agente desnaturante na presença de agentes oxidantes (FISCHER et al., 1993)
através de diferentes métodos conhecidos. Muitos procedimentos cromatográficos têm sido
descritos no passado e revisados recentemente (JUNGBAUERet al., 2004). No entanto, a
maneira mais simples de iniciar o refolding é diluir a proteína desnaturada em tampão de
‘refolding’. Tanto as concentrações do agente caotrópico como de proteínas, são reduzidos em
uma única etapa, permitindo interações intramoleculares, porém evitando interações
intermoleculares. Uma concentração final de proteína entre 10-100µg/ml é geralmente aplicada
em rápidos processos de diluição (JUNGBAUER; KAAR, 2007).
35
4) JUSTIFICATIVA
Devido à importância econômica mundial, a videira ocupa nove milhões de hectares
plantados, o que faz com que a uva só perca em importância em área para citrus e banana
(POMMER, 2002). Ocultivo da videira representa uma parcela econômica e social importante na
fruticultura brasileira, movimentando cerca de R$ 2,5 bilhões/ano e gerando 5 empregos/ha, um
dos maiores índices do setor (EMBRAPA, 2008). O melhor conhecimento a respeito dos vírus
que infectam videiras poderiam evitar perdas significativas na produção de uva. Devido à
dificuldade de purificação dos vírus a partir de videiras infectadas, pouca informação é conhecida
a respeito das proteínas do RSPaV. A cultura do feijão também temprodutividade grandemente
afetada pela ocorrência de doenças que diminuem a produção e, conseqüentemente, reduzem a
sua oferta, provocando um aumento nos preços de mercado. As proteínas do movimento(MP),
serino proteasee VPg, são produzidas em baixas concentrações, impossibilitando a purificação
em larga escala partir de plantas infectadas.Sobre a proteína do movimento, não há nenhuma
evidência direta sobre sua possível função ou localização na planta. Informações sobre a estrutura
tridimensional de proteínas virais, podem auxiliar no entendimento de sua função no ciclo de
multiplicação viral e na sua interação com biomoléculas do hospedeiro. Com relação à VPg,
estudos recentes têm sugerido uma variedade funtional dessasproteínas, no entanto nenhuma
estrutura foi obtida através da difração de raios X para que pudesse permitir avanços nessa linha
de pesquisa. O conhecimento sobre a estrutura das proteínas VPg pode fornecer informações para
a elaboração de inibidores para que ela não exerça suas funções durante a infecção viral, como
por exemplo processos de replicação do RNA, movimentação viral célula a célulae longa
distância, tradução, supressão de silenciamento gênico, além de outras funções. Particularmente,
nos casos onde ela atua como primer, se sua função for inibida, nenhuma outra proteína viral
poderá ser codificada, impedindo assim, a replicação viral já nos primeiros estágios da infeção,
diferentemente de outras estratégias onde o combate visa à inibição da infecção quando a
maquinaria celular do hospedeiro já codificou todas as proteínas virais. Informações sobre a
estrutura tridimensional das proteínas virais deste projeto, podem auxiliar no entendimento de sua
função no ciclo de multiplicação viral e na sua interação com biomoléculas do hospedeiro. Além
disso, estudos de cristalização e análise por raios X, que fornecem dados sobre a estrutura das
36
partículas virais, são escassos.
5) MATERIAIS E MÉTODOS
5.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica
do RSPaV usando o pacote de ferramentas EXPASY
O ExPASy (Expert Protein Analysis System, http://ca.expasy.org/) é um servidor de
biologia molecular que possui “links” para o acesso a “sites” dedicados às análises de
identificação e caracterização da proteína, predição de estrutura primária, secundária, topologia,
etc. A sequência de aminoácidos foi traduzida a partir da sequencia de nucleotídeos obtidos pelo
sequenciamento do cDNA e analisada in silico no através do pacote ExPASy.
Estrutura primária no programa ProtParam, que é uma ferramenta que permite a análise
computacional de vários parâmetros físicos e químicos para uma dada proteína depositada no
Swiss-Prot ou TrEMBL ou para uma sequência de aminoácidos enviada ao ProtParam.
Disponível em http://expasy.org/tools/protparam.html.
Estrutura secundária foi analisada no programa PSIPRED, que é um método de predição
de estrutura secundária baseado em rede neural e em análises obtidas de PSI-BLAST (Position
Specific Iterated- BLAST) (McGUFFIN, BRYSON; JONES, 2000). A predição de estrutura
secundária foi baseada na sequência primária de aminoácidos da proteína capsidial do RSPaV.
Disponível em http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/.
5.2) Linhagem de bactéria utilizada para expressão
E. coli BL21-CodonPlus-RIL (Novagen), possui cópias extras de genes de tRNA de argU,
ileY, leuW. Esses genes codificam tRNAs que reconhecem códons para arginina AGA e AGG,
37
isoleucina AUA e para leuceina CUA, respectivamente. Essa linhagem tem tRNAs que mais
frequentemente restringem a tradução heteróloga de proteínas de organismos que possuem
genomas ricos em AT, e permitem alto nível de expressão de proteínas que são fracamente
expressas em linhagens convencionais de BL21.
5.3) Plasmídeo Utilizado
Foi utilizado o plasmídeo pET28a (Novagen) contendo o gene da proteína capsidial do
RSPaV cedido pelo Prof. Dr. José Osmar Gaspar, previamente sequenciado proveniente de
estudos anteriores.
5.4) Tranformação bacteriana
Plasmídeos recombinantes contendo as sequências de interesse foram transformados em
linhagem BL21-RIL de E. coli competente. Utilizando-se 50 µL de células competentes e 1 µL
de amostra de plasmídeo, essa mistura permaneceu no gelo durante 1 h e, então, foi submetida ao
choque de temperatura a 42 ºC por 1 min e 2 min no gelo. Em seguida foram adicionados 250 µL
de meio líquido SOC (meio SOB + 200 mM de glicose) e as bactérias foram submetidas à
regeneração (1 h a 37 ºC com agitação a 250 rpm). Posteriormente, as bactérias foram plaqueadas
em meio sólido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). As
colônias foram testadas por PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para cada uma das
sequências das proteínas em questão, sendo que uma das colônias positivas foi utilizada para o
pré-inóculo nos testes de expressão.
38
5.5) Testes de expressãoda proteína da capa proteica do RSPaV recombinante sob
diferentes condições.
Inicialmente 5mL do pré inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 100 mL
de meio líquido seletivo (LB + kanamicina e cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). A
amostra foi mantida sob agitação e aeração até atingir a densidade (OD550nm ) entre 0,4 e 0,6 para
indução da expressão com IPTG. A leitura da amostrafoi feita em espectrofotômetro - Spectronic
Genesys 2. A indução da expressão foi feita com IPTG em diferentes concentrações (0,1 mM; 0,2
mM; 0,3 mM e 0,4 mM) e sob diferentes temperaturas (17 °C, 25 °C,e 37 °C) a fim de obter
proteínas na fração solúvel após a sonicação. Após 4 h e 16h de indução, amostras coletadas
foram analisadas através de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)
segundo Laemmli (1970).
Após a constatação da expressão nos testes iniciais, a expressão foi realizada em maior
escala visando à obtenção de proteínas para purificação. Inicialmente 5 mL de pré-inóculo foram
transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio líquido seletivo (LB + kanamicina e
cloranfenicol, 30 e 34 µg/mL rspectivamente). A cultura foi mantida sob as mesmas condições
citadas acima. A purificação foi feita utilizando resina de níquel (ProBond) conforme instruções
do fabricante (Invitrogen).
5.6) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As amostras coletadas durante o teste de expressão foram analisadas através de
eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970). As
proteínas foram desnaturadas por fervura (3 minutos a 100 °C) em tampão de amostra (Tris-HCl
0,125 M, pH 6,8, contendo SDS 4 %, glicerol 20 %, 2-ME 10 % e azul de bromofenol 1,0 mM).
As amostras foram centrifugadas por 5 min a 16.000 x g e 10 L do sobrenadante de cada
amostra aplicado no gel. A eletroforese foi feita em aparelho Hoefer mini VE Amersham
Biosciences GE. Os géis foram fixados e corados em mistura contendo metanol, água, ácido
39
acético (50:50:10) e Comassie Blue 0,25 % por 1 h e descorados com metanol e água (1:1) por 1
h.
5.7) Western blot
Alíquotas contendo proteína recombinante foram misturadas com tampão de amostra (1:1)
e aplicadas em gel SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose
em um eletrotransferidor (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad) operando sob
voltagem constante (100V) por 1 hora.
O tampão de transferência utilizado foi o Tris-Glicina (Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M)
contendo metanol 20 %. A membrana foi incubada com antissoro monoclonal Anti-polihistidina
(produzido em camundongo; Sigma) e antissoro anti-IgG de camundongo conjugado com
fosfatase alcalina (Sigma) diluído 1:30.000 e a detecção da reação antígeno/anti-corpo foi feita
com mistura de BCIP/NBT (“5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate/nitro-blue tetrazolium”) até o
aparecimento do resultado da reação (cor azul púrpura).
5.8) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 37°C
Após a expressão da proteína recombinante a 37 ºC utilizando 500 mL de meio LB
induzidos com 0,5 mM de IPTG, a cultura foi centrifugada por 20 min a 8.000 x g a 10 °C. O
“pellet” foi ressuspendido em 30 mL de tampão de lise (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20
mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5). A solução foi submetida a
pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a
20.000 x g a 4 °C. O sobrenadante foi coletado e utilizado para a purificação da proteína de
interesse sob condição nativa em coluna de afinidade utilizando resina de níquel (Ni Sepharose
High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare). O mesmo experimento
também foi realizado utilizando tampão de lise (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β-
40
mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5) a fim de obter maior quantidade de proteína na fração
solúvel.
A fração insolúvel do experimento, o corpo de inclusão, foi lavado com o tampão de lise,
deoxicolato de sódio 2 % e água. A cada lavagem, a amostra foi submetida a pulsos em sonicador
e centrifugada a 10.000 x g por 20 min e, após a última centrifugação, a amostra foi então
utilizada para a purificação da proteína de interesse sob condição desnaturante.
5.9) Purificação por cromatografia de afinidade (Ni-NTA)
5.9.1) Sob condições desnaturantes
A purificação do corpo de inclusão foi feita em condições desnaturantes, em coluna de
afinidade utilizando resina de matriz de níquel conforme instruções do fabricante (GE
Healthcare). Após a lavagem, o corpo de inclusão foi ressuspendido em tampão desnaturante
(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris.HCl e 6 M guanidina pH 8,0).A suspensão foi sonicada e
centrifugada a 10.000 x g por 20 minutos. O sobrenadante foi filtrado e aplicado a coluna de
afinidade. Após a ligação, a matriz foi lavada com tampões 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 6 M
guanidina e pH, respectivamente, 6,3 e 5,9. A eluição da proteína foi feita em tampão 100 mM
NaCl, 10 mM Tris, 6 M guanidina, pH 4,5.
5.9.2) Sob condições nativas
Primeiramente, a resina (Ni-NTA) foi equilibrada com o mesmo tampão utilizado para
lisar as células. Logo em seguida, o sobrenadante do lisado celular foi passado através da coluna
de purificação (coluna de gravidade, Bio-Rad) para que as proteínas (His-tag-RSPaV-CP) fossem
adsorvidas. Após a adsorção, a resina foi lavada utilizando tampão de lavagem (20mM NaH2PO4,
41
500mM NaCl, 40 mM imidazol, 2 % glicerol e 1 mM PMFS, pH 7.4) para remover
contaminantes adsorvidos inespecificamente na resína de níquel. Por fim, as proteínas foram
eluídas utilizando tampão de eluição (20 mM fosfato de sódio dibásico, 300 mM NaCl, 500 mM
imidazol e 1 mM PMFS, pH 7.4).
As proteínas foram dialisadas após a eluição para a remoção do imidazol utilizando
tampão (20 mM de fosfato de sódio dibásico, 300 mM de NaCl, pH 7.4). Foi realizada uma
diálise gradual trocando o tampão de diálise e reduzindo de 100 em 100 mM de NaCl a cada duas
horas até a concentração final de 100 mM de NaCl.
5.10) Expressão da proteína capsidial do RSPaVa 25 °C
O experimento referente ao item 4.8 foi repetido diminuindo a temperaturas de indução a
fim de diminuir a formação de agregados e obter a proteína de interesse na fração solúvel após a
etapa de sonicação. Sob as mesmas condições de aeração e agitação o experimento foi realizado
utilizando temperaturas de 25 ºC para a expressão. Para indução da expressão foi utilizado IPTG
na concentração de 0,3 mM por 16h. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 8.000 x g
e 4 °C. O precipitado foi dividido em três tubos e três diferentes tampões de lise foram utilizados
para sonicar cada amostra a fim de obter a proteína na fração solúvel após centrifugaçãopor 30
minitos a 20.000 x g a 10 ºC.
Os tampões utilizados foram:
Tampão A: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 %
Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 %
Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril
Sarcosina pH 7,5)
42
O sobrenadante de cada tubo foi utilizado para purificação da proteína sob condição
nativa utilizando resina à base níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme
instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.11) Expressão da proteína capsidial do RSPaV a 17 ºC
O experimento referente ao item 5.8 foi repetido diminuindo as temperaturas de indução a
fim de diminuir a formação de agregados e obter proteínas na fração solúvel após a etapa de
sonicação. Sob as mesmas condições de aeração e agitação o experimento foi realizado utilizando
a temperatura de 17 ºC para a expessão. Para indução da expressão foi utilizado IPTG na
concentração de 0,3 mM por 16h. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 8.000 x g e 4
°C. O precipitado foi dividido em três tubos e três diferentes tampões de lise foram utilizados
para sonicar cada tubo a fim de obter a proteína na fração solúvel após centrifugação por 30
minitos a 20.000 g a 10 ºC.
Os tampões utilizados foram:
Tampão A: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton
X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 %
Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (10 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril
Sarcosina pH 7,5)
O sobrenadante de cada tubo foi utilizado para purificação da proteína sob condição
nativa utilizando resina de níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do
fabricante (GE Healthcare).
43
5.12) Teste de expressão em meio auto-indutivo
Inicialmente 5 mL de pré inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL
de meio auto-indutivo (ZYM-5052), que consiste de meio LB + canamicina e cloranfenicol
34g/mL + meio M (Na2HPO4 25 mM, KH2PO4 25 mM, NH4Cl 50 mM, Na2SO4 5 mM, MgSO4
2mM) + meio 5052 (0,5 % glicerol, 0,05 % glicose, 0,2 %α-lactose), contendo 50 µg/mL, de
acordo com Studier, 2005. O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 18 °C por 48 horas. Em
seguida, o meio foi centrifugado por 30 min a 6.000 x g e 4°C. O “pellet” foi ressuspendido em
20 mL de tampão de lise (50 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução
foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi
centrifugada por 30 min a 20.000 x g a 10 °C. A fase aquosa foi coletada e utilizada para a
purificação da proteína de interesse.
A purificação foi feita utilizando resina à base de níquel (Ni Sepharose High
Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.13) Expressão utilizando estresse osmótico e choque térmico
Inicialmente 5 mL de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL
de meio líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 30 e 34g/mL respectivamente),
contendo 0,5M NaCl e 1 mM betaína. O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 37 °C até
atingir a densidade ótica ideal. Para o choque térmico, o tubo foi submetido à temperatura de 47
o
C por 20 minutos (contados a partir do momento em que o meio de cultura atingiu esta
temperatura). Posteriormente, a cultura foi transferida para outro shaker, a 18 oC, e a indução da
expressão foi feita com 0,4 mM IPTG “overnight”. Em seguida, o meio foi centrifugado por 30
min a 6.000 x g e 4 °C. O “pellet” foi ressuspendido em 20 ml de tampão de lise (50 mM tampão
fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução foi submetida a pulsos de 15 s a 300 W
em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 30 min a 20.000 g a 10 °C. A
44
fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da proteína de interesse utilizando resina de
níquel (Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.14) Expressão a 13 ºC utilizando cepas de Arctic Express
O vetor recombinante também foi utilizado para a transformação por choque térmico de
células competentes da cepa ArcticExpress. As células foram incubadas a temperatura de 30 °C,
200 rpm por 16 horas. Foram transferidos 5 mL do pré-inóculo para o erlenmeyer contendo
250mL de meio LB com 30g/mL de kanamicina 30°C, 250 rpm até atingir a densidade ótica
ideal. Após baixar a temperatura para 13 ºC a indução foi feita com IPTG 0,5 mM e a cultura foi
mantida sob mesma agitação e temperatura por 16h. O “pellet” foi ressuspendido em 20 ml de
tampão de lise (50 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 8). A solução foi
submetida a pulsos de 15 s a 300 W em sonicador para lise celular. Esta amostra foi centrifugada
por 30 min a 20.000 g a 10 °C. A fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da
proteína de interesse. A purificação foi feita em coluna de afinidade utilizando resina de níquel
(Ni Sepharose High Performance) conforme instruções do fabricante (GE Healthcare).
5.15) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC
A fração insolúvel obtida a partir do experimento citado no item 4.8, o corpo de inclusão,
foi lavado com o tampão de lise, deoxicolato de sódio 2% e água. A cada lavagem, a amostra foi
submetida a pulsos em sonicador e centrifugada a 10.000 x g por 20 min e, após a última
centrifugação, a amostra foi então utilizada para a purificação da proteína de interesse sob
condição desnaturante conforme o item 4.9.1. Após a confirmação da presença da proteína em
gel de poliacrilamida SDS-PAGE iniciaram-se os ensaios de reenovelamento utilizando
protocolos de diluição simples e de gradiente decrescente de uréia em resina de afinidade
contendo níquel.
45
5.16) Refolding
Diferentes métodos de renovelamento foram utilizados, basicamente foram utilizados
protocolos de diluição simples em tampão de renovelamento, no qual a solução com guanidina
6M contendo proteína de interesse (1 mg/mL) é diluída até a concentração 10–100 µg/ml. O
renovelamento também foi testado utilizando gradiente decrescente de uréia em resina de
afinidade contendo níquel. Neste método a resina é carregada com a proteína em tampão
contendo 8M uréia, e através de um gradiente, a solução final torna-se livre de uréia. Nos dois
casos a proteína renaturada foi purificada em condições nativas utilizando-se resina de níquel
conforme protocolo do fabricante (Qiagen) e sua concentração foi determinada. Baseando-se no
ponto isoelétrico teórico (9.04) Vários tampões de renovelamento foram testados, entre eles:
Tampão R1:50 mMTris-HClpH 7,5 contendo 200 m M NaCl, 1 mM DTT e 500 mM larginina.
Tampão R2: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM Glutationa Reduzida, 1
mMEDTA, 500 mM l-arginina, 20 % glicerol.
Tampão R3:50 mMTris-HClpH 7,5 contendo 200 mM NaCl, 1 mM DTT e 1 M NDSB201
[3(1-pyridinio)-1-propane sulfonate].
Tampão R4: 30 mM NaH2PO4 pH 7.5, 200 mM NaCl e 20% glicerol.
Tampão R5: 30mM Citrato de Sódio pH 6.2, 200mM NaCl, 1mM DTT.
Tampão R6: 30mM Citrato de SódiopH 6.2, 200mM NaCl, 500 mM l-arginina.
Tampão R7: 30mM Citrato de Sódio, 200mM NaCl, 1 M NDSB201 [3(1-pyridinio)-1propane sulfonate], pH 6.2
Tampão R8: 30 mM acetato de sódio pH 5.5,30 mMNaCl e 1% glicerol.
Após verificar o tampão mais eficiente a proteína foi dialisada contra tampão fosfato de
sódio pH 6.4 contendo 0,2 M NaCl, concentrada até 2 mg/mL por centrifugação utilizando-se
colunas Centricon-30 (Millipore), e utilizada para os ensaios de Dicroísmo Circular.
46
5.17) Concentração das amostras purificadas
Após a diálise as amostras contendo a proteína purificada foram concentradas em
dispositivos de ultrafiltração AMICON (3.000 Da) conforme instruções do fabricante (Millipore)
a uma rotação de 4.000 x g a 10 °C.
5.18) Determinação da concentração das proteínas
A quantificação das proteínas foi feita através de medidas de absorbância. Os espectros de
absorbância foram obtidos em espectrofotômetro – Espectronic Genesys 2, com varredura de
comprimento de onda de 340-200 nm. A concentração foi determinada a partir dos valores dos
coeficientes de extinção molar (ε) obtidos através do programa ProtParam (http://ca.expasy.org) e
dos valores de absorbância a 280 nm. A quantificação também foi feita através de leitura em
equipamento Quant-iTTM Assays, conforme instruções do fabricante (Invitrogen).
5.19) Dicroísmo Circular
O Dicroísmo circular (CD) foi obtido à temperatura ambiente no espectro polarímetro
Jasco710 para estimar a estrutura secundária e a qualidade da proteína. Os espectros de CD foram
medidos em um concentração de proteínas de aproximadamente 2 mg/ml em 20 mM de fosfato
de sódio, 100 mM de NaCl, pH6.4, usando uma cubeta com caminho ótico de um milímetro de
comprimento. Cada espectro representa uma média de 5 acumulações coletadas de 190 a 260nm,
com um passo de tamanho de 0,2 nm, a uma taxa de 20 nm/ min, e largura de banda de 1,0 nm. O
tempo de resposta foi de 0,5s. A linha de base foi corrigida subtraindo-se o espectro do tampão
de diálise, pois possui condições idênticas à amostra. Os resultados foram convertidos para
47
unidade de absorção molar per-resíduo, [θ] (Deg cm2 dg-1), e a estrutura secundária foi analisada
com o software CDPro. SELCON3, CDSSTR e CONTINL produziram resultados similares.
5.20) Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
O espalhamento dinâmico de luz é uma técnica capaz de analisar biomoléulas em solução.
Na prática as biomoléculas encontram-se hidratadas e o raio calculado a partir do coeficiente de
difusão oferece uma estimativa do tamanho aparente da partícula com sua camada de solvatação,
denominado assim raio hidrodinâmico, RH, a patir do qual também é possível estimar sua massa
molecular. O princípio da técnica se baseia na incidência de luz monocromática em solução de
partículas e monitoramento das flutuações da intensidade. Para cada proteína foram testadas 125
condições (Tabela 1) variando concentração proteica, valores de pH, concentração salina e
concentração de aditivos a fim de obter informação sobre a polidispersividade e a presença de
agregados nas amostras das proteínas que forampreviamente centrifugadas por 60 minutos a
16000 x g a 4°C. Em todas as análises foram realizadas 20 aquisições de 20 segundos a 20°C.
Somente as frações consideradas monomodais (1 população) foram utilizadas nos ensaios de
cristalização, pois há relatos na literatura mostrando que amostras monodispersas têm maior
chance de cristalização.
48
Agentes que podem alterar
solubilidade e estado de
CONCENTRAÇÃO
agregação de proteínas
SAIS
AMINOÁCIDOS
MATERIAL GENÉTICO
AÇÚCARES E ÁLCOOIS
DETERGENTES
AGENTES REDUTORES
NaCl
0 – 1M
KCl
0 – 1M
NaF
0 – 500 mM
NaCl + KCl
0 – 500 mM
CaCl2
0 – 200 mM
MgCl2
0 – 200 mM
MgSO4
0 – 400 mM
Uréia
0 – 500 mM
Glicina
0,5 – 2 %
L-Arginina
0 – 0,5 M
Solução de Primers
0,1 – 100 μM
Nucleotídeos (dNTPs)
0 –0,5 mM
β-Ciclodextrina
0 – 100 mM
Sucrose
0–1M
Glucose
0–1M
Sorbitol
0 – 40 %
Glicerol
5 – 40 %
Etanol
0-5%
Triton X-100
0 – 0,02%
Tween 20
0 – 0,1%
CHAPS
0 – 0,5%
NP-40
0 – 0,2%
DTT
0 – 20 mM
β-Mercaptoetanol
0 – 10 mM
Sulfobetaina(NDSB 195)
0 – 500 mM
TENSOATIVO NÃOTabela 1. Condições testadas a fim de desagragar as proteínas de interesse.
49
5.21) Ensaios de cristalização
Os “screenings” iniciais das condições de cristalização foramrealizados pelo método de
difusão de vapor por gota sentada utilizando o robô Honeybee 961 (Genomic Solutions Ltd). A
temperatura de incubação foi 20 C.
Os kits utilizados foram JSCG+ (Qiagen), Pact Suite 2 (Qiagen), Morpheus (Molecular
Dimensions) e para cada uma das 96 condições de cada Kit foram aplicadas solução de proteínas
concentradas e soluções de precipitante na proporção 1:1 e 1,5: 1, totalizando 192 condições por
Kit. Para cada Kit foram utilizadas proteínas concentradas nas seguintes condições:
a)CP a 5mg/mL em tampão Tris 10 mM 300 mM NaCl pH 7,0.
b) CP a 5mg/mL em tampão Tris 10 mM 150 mM NaF pH 7,0.
Totalizando 1152 condições
As melhores condições encontradas foram utilizadas como referência para o refinamento
do crescimento dos cristais fazendo pequenas alterações no pH, concentração da proteína,
concentração de sal e concentração do precipitante. Em algumas condições foram encontrados
pequenos cristais (menores que 100 micrômetros), os quais foram recolhidos e utilizados em
experimentos de Streak seeding e microseeding.
5.21.1) Microseeding e Streak seeding
O método seeding consiste na preparação de uma solução estoque (seed stock) que
contém cristais macerados e estas “sementes” são transferidas para soluções contendo tampão,
concentração de proteína e concentração de precipitante desejado. Para preparação da solução
estoque (seed stock), que contém os núcleos dos cristais, foram utlizados tubos de 1,5 mL
50
contendo esfera de vidro que sob vigorosa agitação permitiu a maceração dosmicro cristais. A
solução estoque foi também utilizada para fazer diluições.
Para a técnica de streack seeding, uma haste é utilizada para transferir as “sementes” da
solução estoque escolhida para gotas contendo diferentes concentrações de proteína e diferentes
concentrações do agente precipitante. Esta haste percorreu unidirecionalmente através de cada
gota.
5.21.2) Counter-diffusion:
Algumas condições foram testadasutilizandoo kit Granada Crystallization Box
®,
que
permite a cristalização de proteínas no interior de capilares, que são primeiramente preenchidos
com a solução contendo proteína concentrada, e posteriormente mergulhados em tampão
escolhido contendo agente precipitante como mostrado na figura 6. Os capilares foram estocados
a 5, 10, 15, 20 e 25 ºC.
Figura 6. (1) Capilar. (2) Solução contendo agente precipitante. (3) camada de agarose. As condições de
otimização do crescimento dos cristais foram também testadas utilizando o método de difusão de vapor de
gota pendente (hanging drop) e microbatch.
51
5.21.3) Hanging drop
Consiste em uma gota contendo a macromolécula biológica a ser cristalizada em tampão
com o agente de cristalização. A gota é equilibrada contra um reservatório contendo a solução do
agente de cristalização em uma concentração mais alta que na gota, como exemplificado na
figura 7 abaixo.
Figura 7. Método hanging drop: (A) gota contendo solução proteica misturada com tampão contendo
agente precipitante. (B) Lâmínula siliconizada. (C) Silicone utilizado como material de vedação. (D)
Solução contendo o agente de cristalização.
5.21.4) Microbacth
Este método foi utilizado misturando 1µL de solução contendo a proteína concentrada
com 1µL de solução contendo agente precipitante. A gota fica armazenada em um reservatório
que é coberto por óleo de parafina como mostrado na figura 8 abaixo:
52
Figura 8. Modelo representativo da técnica de microbatch: (A) placa contendo gotas submersas em óleo
(B) reservatório onde a gota contendo a proteína concentrada é misturada com a gota contendo agente
precipitante.
5.22) Inserção de sítio de clivagem nos plasmídeos recombinantes
Devido ao fato de não obtermos amostras contendo raio hidrodinâmico menor que 10 nm,
quando analisadas por DLS, mesmo utilizando diversas condições e aditivos, uma alternativa que
foi realizada a fim de evitar agregação, foi a remoção da cauda de histidina juntamente com a
sequência de aminoácidos codificada pelo pET28a (M G S S H H H H H H S S G L V P R G S
H M A S M T G G Q Q M G R G S), as quais não pertencem à estrutura da proteína de
interesse.
O processo de remoção dessa sequência composta por 34 aminoácidos tem a finalidadede
investigar se esta porção da proteína recombinante é responsável pela agregação.
53
Figura 9. Mapa do vetor pET-28a-c(+) mostrando os sítios de restrição e seus aminoácidos
correspondentes.
Embora o vetor pET28a tenha sítio de clivagem para trombina entre a proteína de
interesse e a His-tag (figura 8), um outro sítio de clivagem para a TEV (Tobacco etch virus)
protease foi adicionado por alguns motivos: (1) pelo fato de a trombina apresentar pouca
especificidade quando comparada à TEV protease, (2) a trombina é uma protease cara, enquanto
a TEV protease pode ser produzida em nosso laboratório uma vez que o professor Christian
Betzel doou plasmídeos recombinantes contendo sua sequência codificadora, (3) algumas
proteínas do nosso grupo de pesquisa possui o sítio da trombina em sua sequência codificadora,
como por exemplo a VPG do SBMV.
5.22.1) Construção de oligonucleotídeos com adição de sítio de clivagem
Os oligonucleotídeos senso para os genes das proteínas estudadas neste projeto foram
desenhados baseados nos primers utilizados anteriormente nos experimentos já citados. Cada
oligonucleotídeo senso contém o sítio de restrição para enzima Bam HI e foi também introduzido
um sítio de clivagem para a TEV protease (figura 10) para posterior remoção da His-tag
54
juntamente com a sequência codificada pelo pET28a que não faz parte da estrutura da proteína de
interesse .
Figura 10. Modelo esquemático de oligonucleotídeoutilizado para clonagem visando remoção da cauda
de histidina após purificação.
5.22.2) Amplificação dos genes das proteínas utilizando primers com sítio para TEV
protease
O volume da reação de PCR foi de 25 µL consistindo de tampão (20 mM Tris-HCl pH
9,5; 50 mM KCl); 5 mM de MgCl2; 0,2 mM cada dCTP, dGTP, dATP e dTTP; 10 µg/mL de
cada oligonucleotídeo (senso e antissenso); 1µL de cDNA e 3 unidades de Taq DNA-polimerase
(Invitrogen). O programa de PCR, realizado em um termociclador MJ Research, envolveu uma
desnaturação inicial de 94 °C por 4 minutos e 30 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94 ºC, 1
minuto de anelamento a 50 ºC e 1 minuto de extensão a 72 ºC, seguidos de extensão final por 10
minutos a 72 ºC. Os fragmentos de DNA amplificados foram submetidos à eletroforese em gel
nativo de agarose 1% em tampão TAE (40 mM Tris-HCl; 20 mM de acetato de sódio e 1 mM de
EDTA, pH 8,3) a uma voltagem de 80V, corado com brometo de etídio (0,05 µg/mL)
(SAMBROOKet al., 1989) e visualizados sob luz ultravioleta.
5.23) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a
Após verificação dos fragmentos de interesse amplificados por PCR em Gel de agarose,
iniciaram-se expermentos de digestão enzimática deste amplificado e posterior ligação em vetor
pET28a previamente digerido com as mesmas enzimas e defosforilado utilizando CIAP.
55
56
5.23.1) Digestãoenzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a
O vetor de expressão pET28a foi digerido a 37 °C por 2h utilizando as enzimas Bam HI e
Xho I. Em seguida, o vetor digerido foi defosforilado utilizando-se a enzima CIAP (Fosfatase
alcalina de intestino de bezerro) (Invitrogen) utilizando 5 unidades de enzima para cada 1g de
DNA. A mistura foi submetida a 37 °C por 30 min. e a 75 °C por 10 min.
5.23.2) Ligação do DNA em vetor de expressão (pET28a)
Para esta reação de ligação foram utilizados 50 ng de vetor pET28a previamente digerido
e defosforilado, 50 ng de DNA, 3 unidades de T4 DNA ligase (Promega) e tampão de ligação
(Promega). A mistura foi submetida a 18°C por 16h.
5.23.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão (pMAL)
O gene que codifica a proteína da capa proteica do RSPaV foi também clonado em vetor
pMAL inserindo o gene da capa proteica amplificado utilizando primers contendo sítios para
Bam HI (primer senso), Hind III (primer antisenso da CP) e Xho I (primer antisenso da VPg). O
vetor de expressão pMAL-2c do “pMAL Protein Fusion and Purification System” (Bio Labs)
foidigerido a 37 °C por 2h utilizando as enzimas Bam HI e Hind III. Em seguida, o vetor digerido
foi defosforilado de acordo com o item 5.23.1.
57
Figura 11. Região polylinker do vetor pMAL-c2x destacando os sítios de restrição
5.24) Transformação em célula competente (TOP 10)
Após a reação de ligação em pet28a e pMAL-c2x, os vetores recombinante foram
transformado em E. coli linhagem TOP 10, utilizando-se 50 L de solução contendo células
competentes e 5 L da reação de ligação. Essa mistura permaneceu no gelo durante 30 minutos, e
então, submetida ao choque de temperatura a 42 ºC por 1 minuto e 2 minutos no gelo. Em
seguida foram adicionados 450 L de meio líquido SOC e as bactérias foram submetidas a
regeneração (1 hora a 37 ºC com agitação a 250 rpm). Posteriormente, as bactérias foram
plaqueadas em meio sólido seletivo LB + ampicilina, 100 g/mL, quando transformada com
pMAL, e LB + Kanamicina, 34 g/mL, quando transformada com pET28a. As colônias obtidas
foram testadas para comprovar a existência do inserto através de PCR. As colônias que
apresentaram o inserto foram inoculadas em tubos individuais de 7 mL de meio líquido seletivo
sob agitação e aeração constantes a 37 ºC por 16 horas para posterior extração do DNA
plasmidial.
5.25) Purificação do plasmídeo recombinante
O DNA plasmidial foi purificado utilizando-se o “Pure Link Quick Plasmid Miniprep
Kit”, seguindo as orientações do fabricante (Invitrogen). O DNA plasmidial foi eluído em 50 l
de tampão TE (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0).
58
5.26) Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5
)
A transformação do vetor recombinante pMAL em E. coli linhagem DH5 foi feita
utilizando o método de heat-shock.
5.27) Sequenciamento dos vetores contendo as sequências dos genes CP do RSPaV,
após inserção do sítio de clivagem para TEV protease
O DNA plasmidial foi purificado a partir de E. coli linhagem TOP 10 (item 5.25) e
sequenciado pela técnica de reação de terminação em cadeia (SANGER et al., 1977), utilizandose o sequenciador automático “ABI 377 DNA Sequencer” (UNESP Jaboticabal-SP) e o “ABI
PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied Biosystems),
seguindo-se as instruções do fabricante. O sequenciamento foi realizado nos dois sentidos de
leitura (sense e antissense) com 3 repetições e o alinhamento das sequências consenso utilizandose o Multalin (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). Um refinamento das
sequências obtidas com baixa qualidade foi realizado utilizando o BioEdit Sequence Alignment
Editor.
5.28) Expressão e Purificação da Proteína Capisidial com Sítio de Clivagem para Tev
Protease.
5.28.1) Expressão da CP utilizando pET28a
A expressão foi realizada de acordo com o item 5.11.
59
5.28.2) Purificaçãoda CP utilizando pET28a
A purificação foi realizada utilizando tampao de lise celular consistindo de 50 mM
NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2% N-Lauril Sarcosina pH 7,5. A remoção de
contaminantes foi realizada utilizando tampão de lavagem contendo 50 mM NaH2PO4, 500 mM
NaCl, 1 mM PMSF, 0,2% N-Lauril Sarcosina, 40 mM de imidazol pH 7,5. A eluição foi
realizada utilizando tampao 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2% N-Lauril
Sarcosina, 200 mM de Imidazol pH 7,5.
Dez mL de solução contendo a proteína eluída foi dialisada contra tampão de diálise
contendo 50 mM NaH2PO4,200 mM NaCl por 16 h e posteriormente adicionou-se EDTA e DTT
alcançando as concentraçõesde 1mM e 0,5 mM respectivamente.
A proteína foi concentrada utilizando-se colunas Centricon-30 (Millipore) e
posteriormente submetida à digetão enzimática utilizando TEV protease recombinante produzida
neste laboratório.
5.29) Digestão Enzimática utilizando TEV Protease.
A TEV protease recombinante contendo his-tag foi expressa e purificada neste laboratório
utilizando coluna de afinidade contendo Níquel de acordo com TROPEA et al., 2009 e
posteriormente,utilizada para experimentos de digestão enzimática na proporção de 1 mg de
enzima para cada 10 mg de proteína alvo a 4° C por 16 h.
5.30) Expressão e Purificação da CP utilizando pMAL
60
5.30.1) Expressão da CP recombinante utilizando pMAL
A expressão da proteína foi utilizando vetor pMAL foi realizada de acordo com o item
5.10.
5.30.2) Purificação da CP recombinante utilizando pMAL através de resina à base de
amilose
A proteína CP expressa foi purificada por cromatografia de afinidade em colunas com
resina a base de amilose (BioLabs), conforme o protocolo do “pMAL Protein Fusion and
Purification System” (Bio Labs). Nesse sistema, a proteína expressa é fusionada à MaltoseBinding Protein de 43 kDa.A eluição foi feita em tampão fosfato 20 mM pH 7,2, NaCl 200mM,
contendo Maltose 100 mM.
A amostra proteica foi dialisada duas vezes contra tampão de diálise de acordo com o
item 5.28. e submetida a digestão enzimática pela TEV protease de acordo com o item 5.29.
5.31) Purificação da proteína digerida utilizando TEV protease
A fim de realizar estudos estruturais, após a digestão enzimática, a proteína deve ser
isolada da enzima TEV e também do fragmento contendo a his-tag. Para isso, a solução passou
novamente através da resina de Níquel, a qual retém a TEV protease recombinante contendo histag, e, posteriromente, através da resina de amilose, a qual retém a proteína de fusão maltosebinding protein, codififaca pelo pMAL.
61
5.32) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease
Após remoção da sequência de aminoácidos codificados pelo pET28a a amostra proteica
foi concentrada até 6mg/mL e utlizada em testes de cristalização utilizando o método “hangingdrop”.
6) VIRAL PROTEIN GENOME-LINKED(VPg)
6.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína VPg recombinate do SBMV
usando o pacote de ferramentas expasy.
As análises foram feitas de acordo com o item 5.1.
6.2) Testes de expressãoda VPg
A expressão da proteína VPg foi realizada utlizando BL21-RIL de E. coli transformadas
com o vetor pET28a contendo a sequência que codifica a VPg do SBMV. A indução das céluas
crescidas em meio líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 30 g/mL) foi realizada
utlizando IPTG 0,3 mM e a 18º C, como já mencionado 5.11.
6.3) Purificação da proteína VPg e Espalhamento Dinâmico de Luz
62
Para a realização dessa etapa, foi feito uso de FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography) pelos métodos tradicionais de afinidade utilizando resina à base de níquel e
cromatografia por exclusão molecular utilizando AKTA purifier. Os experimentos envolvendo
espalhamento de luz foram também conduzidos de acordo com o item 5.20.
6.4) Ensaios de cristalização VPg
Os “screenings” iniciais das condições de cristalização foramrealizados pelo método de
difusão de vapor por gota sentada utilizando o robô Honeybee 961 (Genomic Solutions Ltd). A
temperatura de incubação foi 20 C.
Os kits utilizados foram JSCG+ (Qiagen), Pact Suite 2 (Qiagen), Morpheus (Molecular
Dimensions) e para cada uma das 96 condições de cada Kit foram aplicadas solução de proteínas
concentradas e soluções de precipitante na proporção 1:1 e 1,5: 1, totalizando 192 condições por
Kit. Para cada Kit foram utilizadas proteínas concentradas nas seguintes condições:
a) VPg a 7 mg/mL em tampão Tris 10mM e 150 mM NaCl pH 7,0.
b) VPg a 10 mg/mL em tampão Tris 10mM e 300 mM NaCl pH 7,0.
c) VPg a 7 mg/mL em tampão Tris 10mM e 150 mM KCl pH 7,0.
Totalizando 2592 condições.
6.5) Inserção do sítio de clivagem para TEV protease
As etapas de clonagem envolvendo a inserção do sítio de clivagem para a TEV protease
foram também realizadas para as proteína VPg do SBMV, de acordo com o item 5.20. No caso da
VPg, particularmente, foi usado síto para Xho I no primer antisenso.Os primers utilizados estão
mencionados abaixo, com sítios para TEV protease em negrito e sítios para Bam HI e XhoI
grifados.
63
Primer Senso:
GGATCCGGTGAAAATTTATATTTTCAAGGTATGAGCTATCGTTTCCTA
Primer anti senso:
TGGACTTCAGCTCAGGAATGACTCGAG
6.5.1) Amplificação dos genes das proteínasVPg utilizando primers com sítio para
TEV protease
Para amplificação do gene de interesse, foram realizados experimentos de acordo com o
item 5.22. Particularmente, na reação de amplificação do gene da VPg utilizando o pET28a
recombinante (pET28a contendo a sequência que codificara da VPg do SBMV) como template, o
controle negativo da reação (pET28a sem inserto) apresentava amplificação defragmentos de
tamanhos próximos à ORF codificadora da VPg (200 e 300 pb), impossibiltando a continuidade
do experimento. Para superar este problema, parículas virais foram utilizadas como fonte de
RNA. Utilizando primer reverse, foi feito novo cDNA, o qual foi utilizado como template da
reação de PCR como descrito abaixo.
6.5.2)Purificação das partículas virais
Folhas de Feijoeiro Phaseolus vulgaris (L) ‘Jalo’ infectadas pelo SBMV-SP foram
trituradas em liquidificador com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2, contendo
0,5% 2-mercaptoetanol. A solução foi filtrada em gaze, clarificada com clorofórmio (0,5 ml/g de
folha) e centrifugada 20 minutos a 16.000 g e 4°C. O vírus foi precipitado pela adição de
polietilenoglicol (PEG 8000) a 10% e NaCl 1,0%, sob agitação por 2 h a 4°C, e então
centrifugado por 10 min a 16000 g e 4°C. O sedimento foi ressuspendido em 1/10 do volume
inicial de tampão fosfato 0,01 M pH 7,2 e submetido a um ciclo de baixa e alta rotação (16000
64
g/10 min e 100000g/90min). O “pellet” final foi ressuspendido em tampão fosfato e aplicado em
gradiente de sacarose (10-50%) em tampão fosfato 0,01 M pH 7,2. por 1:30 h a 100000 g. A
banda formada pelo vírus purificado foi coletada, diluída e ultracentrifugada por 1 h a 100000 g,
dissolvendo-se o sedimento final em 1 ml de tampão fosfato0,01 M pH 7,0. O vírus purificado foi
submetido à leitura em espectrofotômetro sob comprimento de onda de 260 e 280nm (luz
ultravioleta) para determinação da concentração viral, utilizando o coeficiente de extinção do
SBMV cujo valor é 6,0 em leitura a 260nm (SEHGAL, 1981).
6.5.3) Obtenção de RNA viral
O RNA foi obtido a partir de partículas purificadas do SBMV. A extração do RNA viral
foi feita utilizando-se o “RNeasy Plant Mini Kit” conforme especificações do fabricante
(QIAGEN). O extrato foi eluído em água DEPC e estocado a -20°C.
6.5.4) Produção de cDNA
Oligonucleotídeo antissenso baseado no modelo do item 4.2 e o RNA viral foram
desnaturados por aquecimento a 94°C por 10 min, imediatamente resfriados em gelo, e, em
seguida os demais componentes foram adicionados. A reação teve volume total de 20 µl,
consistindo de: 50 mM Tris.HCl pH 8,3; 75 mM KCl; 10 mM DTT; 0,1 mM cada dCTP, dGTP,
dATP, dTTP; 0,4 µM do oligonucleotídeo, 2 unidades de inibidor de RNAse; 1µg RNA viral e
40 unidades de Transcriptase Reversa “Superscript II” (Invitrogen). A reação permaneceu
incubada por 2 h a 42°C. Este cDNA foi utilizado como template de acordo com o item 4.3.
65
6.6) Clonagem do vetor com sítio para TEV protease em vetor pET28a
Idem itens 5.22.2 e 5.23.
6.6.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressãopET28a
Idem item 5.23.
6.6.2) Ligação do DNA em vetor de expressãopET28a
Idem item 5.23.2.
6.6.3) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pMAL
Idem item 5.23.3.
6.6.4) Ligação do DNA em vetor de expressãopMAL
Idem item 5.23.2.
6.7) Transformação em célula competente (TOP 10)
66
Idem item 5.26.
6.8) Purificação do plasmídeo recombinante
Idem item 5.25.
6.9). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5
)
Idem item 5.26.
6.10) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da VPg do
SBMV após inserção do sítio de clivagem para TEV protease
Idem item 5.27.
6.11) Expressão e purificação da VPg clonadaem pMAL-c2x
6.11.1) Expressão da proteínaVPg recombinante utilizando pMAL-c2x
67
A expressão das proteínas foi realizada utlizando BL21-RIL de E. coli como já descrito
no item 5.28.1. A indução das céluas crescidas em meio líquido seletivo foi realizada utlizando
IPTG 0,25 mM e a 18 ºC.
6.11.2) Purificação da VPg clonadaem pMAL-c2x
Idem item 5.30.2.
6.12) Digestão enzimática utilizando TEV protease
Idem item 5.29.
6.13) Purificação da proteína após digestão pelaTEV protease
Idem item 5.31.
6.14) Expressão e purificação daproteína VPg clonada em pET28a
6.14.1) Expressão da VPg clonada em pET28a
A expressão da proteína foi realizada utilizando vetor pMAL de acordo com o item 6.1.
68
6.14.2) Purificação da VPg clonada em pET28a
A purificação foi realizada utilizando tampão de lise celular consistindo de 30 mM
NaH2PO4, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, e 100 mM de Arginina, pH 7,5. Após 30 minutos de
rotação a 17.000 g, adicionou-se polietilenamina atingindo-se a concentração final de 0,1% e a
amostra foi submetida novamente a 17.000 x g por 30 min e 4 ºC. A remoção de contaminantes
foi realizada utilizando tampão de lavagem contendo 50 mM NaH2PO4, 500 mM KCl, 1 mM
PMSF,40 mM de imidazolpH 7,5 e. A eluição foi realizada utilizando tampao 30 mM Tris, 200
mM KCl, 1 mM PMSF, 250 mM de Imidazol pH 7,5.
Dez mL de solução, contendo a proteína eluída, foram dialisados contra tampão de diálise
contendo 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl por 16 h e posteriormente adicionou-se EDTA e DTT
alcançando as concentraçõesde 1 mM e 0,5 mM respectivamente.
A proteína foi concentrada utilizando-se Centricon-30 (Millipore) e posteriormente
submetida à digetão enzimática utilizando TEV.
Após remoção da sequência de aminoácidos codificados pelo pET28a a amostra proteica
foi concentrada e diferentes concentrações foram utlizadas em testes de cristalização utilizando o
método “hanging-drop”.
6.15) Efeito do TFE e dATP no raio hidrodinâmico das amostras proteicas.
Amostras contendo 10 mg/mL de VPg purificada, em tampão 10 mM tris e 50 mM de
NaCl foram analisadas após a adição de diferentes concentrações de dATP, e TFE (2,2,2trifluoroethanol). Foi realizado o cálculo do raio hidrodinâmico de amostras que ficaram 16 h na
presença dos reagentes e também imediatamente após a adição dos reagentes.
69
6.16) Verificação do efeito do TFE na estrutura secundária da VPg através de
dicroísmo circular.
Espectros UV foram registrados a temperatura ambiente em equipamento Jasco J-710
(Jasco, Tóquio, Japão), equipado com célulasde quartzo com caminho óptico de 0,5 milímetros.
Os espectros foram registrados na faixa de 190 a 260 nm, utilizando varredura de 50 nm/min,
tempo de resposta de 1,0 segundo, largura de banda espectral de 1,0 nm e resolução espectral de
0,1 nm. Para cada espectro foram realizados 7 acumulações. A concentração de 30 uM de VPg
foi mantida constante durante todo o experimento. A adição de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE,
Sigma) foi realizada na faixa 0 – 30%, com incrementos de 10% (vol: vol). Todos os espectros
foram corrigidos subtraindo dos respectivos espectros de tampão. Porcentagens de estrutura
secundária, para cada condição testada, foram calculados com o software do pacote CONTINLL
CDPro, usando o conjunto de referências de proteínas SMP56 (SREERAMA; WOODY, 2000).
6.17) Ligação da sonda de sulfonato de naftaleno-1-8-anilina (ANS)
As medidas de fluorescência de estado estacionário foram obtidas no espectrofluorímetro
ISS PC1 (Champaign, IL, USA) equipado com cubeta de quartzo com caminho ótico de 10
mm.Ambas as larguras de banda, de excitação e de emissão, foram fixados em 8,0 nm. O
comprimento de onda de excitação a 370 nm, foi escolhida uma vez que ela proporciona a
excitação só de ANS. O espectro de emissão foi recolhido na faixa de 390-700 nm, com o
incremento de 1 nm. Cada ponto no espectro de emissão é a média de 10 acumulações. A ligação
da sonda ANS (250 uM) - VPg (100 uM) foi monitorada na ausência e na presença de 30 % de
TFE (vol: vol). Como um espectro de referência, a emissão ANS também foi analisada em
solução tampão na ausência e na presença de 30 % de TFE.
70
6.18) Análise da interação entre VPg e possíveis ligantes
A técnica de RMN que analisa a diferença de transferência de saturação, STD (Saturation
Transfer Difference) (MAYER; MEYER, 1999) é uma das mais sensíveis para caracterizar
interações não covalentes entre ligante e proteína. À medida que o ligante interage com a
proteína, recebe desta uma transferência de magnetização e torna-se cada vez mais saturado de
acordo com o tempo de saturação usado. A saturação de cada ligante é medida antes e após a
transferência de magnetização, resultando na diminuição do sinal dos ligantes. Pela diferença
entre os espectros com e sem polarização, somente o ligante que interagir com a proteína
mostrará sinal no espectro STD. Possíveis interações entre VPg e ligantes foram análisadas
através da técnica de ressonância magnética nuclear de hidrogênio por diferença de transferência
de saturação (STD-RMN) foi utilizado para este fim. Os experimentos foram realizados em
espectrómetro Bruker de 600 MHz, equipado com uma crio-sonda. A amostra foi preparada em
50 mM de tampão de fosfato deuterado. A concentração de proteínas foi ajustada para 15 uM, e
cada possível ligante foi utilizado na concentração de 300 uM. A fim de obter a melhor saturação
de proteína, a sequência de pulsos stddiffesgp.3 foi utilizada com 4.096 escaneamentos, onressonância de 0,5 ppm, off- ressonância em 40 ppm, filtro spin lockde 30 ms, o tempo de
saturação de 2 segundos e o nível de potência de pulso de 35 dB. O experimento foi repetido na
presença de 30 % de TFE para verificar se as alterações conformacionais poderiam prejudicar a
ligação. Além disso, o experimento foi realizado sem a proteína, a fim de verificar a existência de
possíveis artefatos.
7) SERINO PROTEASE DOSBMV
7.1) Amplificação da sequência codificadora da serino protease do SBMV para
posterior clonagem em pET28a
71
7.2) Clonagem da sequencia codificadora da Serino protease com sítio para TEV
protease em vetor pET28a
Idem itens 5.22.2 e 5.23.
7.2.1) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a
Idem item 5.23.
7.2.2) Ligação do DNA em vetor de expressãopET28a
Idem item 5.23.2.
7.3) Transformação em célula competente (TOP 10)
Idem item 5.26.
7.4) Purificação do plasmídeo recombinante
Idem item 5.25.
72
7.5). Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5
)
Idem item 5.26.
7.6) Sequenciamento dos vetores contendo a sequência codificadora da Serino
protease do SBMV após inserção do sítio de clivagem para TEV protease
Idem item 5.27.
7.7) Expressão e purificação daSerino protease do SBMVutilizando pET28a
7.7.1) Expressão da Serino protease utilizando pET28a
Diversas estratégias foram utilizadas para obter a proteína nativa solúvel. Foram testadas
expressão a baixa temperatura (18 °C) seguida de sonicação contendo glicerol 5 e 10 %,
expressão utilizando estresse osmótico (utilizando betaína e sorbitol) e expressão utilizando meio
autoindutivo assim como nos itens 5.5, 5.12, e 5.13.
Devido à insolubilidade da proteína utilizando diferentes condições de expressão e
diferentes tampões de sonicação, foi desenhado primer senso a fim de remover uma possível
região transmembrânica. A região foi encontrada utilizando a ferramenta Serp Server
(http://services.mbi.ucla.edu/SER) que faz a predição a partir da sequência primária de
aminoácidos.
Uma nova clonagem foi realizada utilizando o vetor pET28a contendo a sequência
codificadora
da
serino
protease
como
template
e
primer
senso
73
(GGATCCGGTGAAAATTTATATTTTCAAGGTCTGCTGTGTTGGGAAGC) chamado de
Serine_NoTransmembrane), desenhado com a finalidade de remover a sequência codificadora da
região transmembrânica. Estão destacados o sítio para Bam HI grifado e o sítio para TEV
protease em negrito.
7.8) Amplificação da sequencia codificadora da serino protease do SBMV utilizando
primer Serine_NoTransmembrane.
Idem item 5.22.
7.9) Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão pET28a
Idem item 5.23.
7.10) Ligação do DNA em vetor de expressão pET28a
Idem item 5.23.2.
7.11) Transformação em célula competente (TOP 10)
Idem item 5.26.
74
7.12) Purificação do plasmídeo recombinante
Idem item 5.25.
7.13) Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5
)
Idem item 5.26.
7.14) Testes de expressão e purificação
Idem item 5.28.1.
8) PROTEÍNA DO MOVIMENTO DO SBMV
A partir do vetor pET28a contendo a ORF1 do SBMV, diversas estratégias de expressão
da proteína nativa solúvel foram testadas:
- a baixa temperatura (18 °C) seguida de sonicação contendo glicerol 5 e 10 % de
glicerol.
-estresse osmótico (utilizando betaína e sorbitol)
- expressão utilizando meio autoindutivo.
- utilizando screening de detergentes nos tampões de sonicação (triton X-100 0,5
%;tween 20 0,5 % e N-Lauril-sarcosina 0,2%).
75
8.1) Expressão e purificação sob condições desnaturantes utilizando pET28a
Foram transferidos 5 mL de pré inóculo para um novo tubo contendo 250 mL de meio
líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 100 g/mL). O tubo foi mantido sob agitação e
aeração a 37 °C por 2 h e em seguida foi feita uma leitura da amostra em espectrofotômetro. A
indução de expressão foi feita com IPTG 0,5 mM por 4 h. Em seguida, o meio foi centrifugado a
3.000 x g por 20 min. O “pellet” foi ressuspendido em 20 mL tampão de lise (20 mM fosfato de
potássio, 500 mM NaCl e 6 M Guanidina). A solução foi submetida a 6 pulsos de 15 s a 300 W
em sonicador (Marconi - MA 103) para lise celular. A purificação foi feita em coluna de
afinidade utilizando resina de níquel (ProBond) conforme instruções do fabricante (Invitrogen).
8.2) Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 15%
Idem item 5.6.
8.3) Reenovelamento proteína do movimento do SBMV:
Foram utilizados protocolos de diluição simples em tampão Tris.HClpH 7,5 contendo 0,2
M NaCl, 1 mM DTT e 1 M NDSB201 [3(1-pyridinio)-1-propane sulfonate], a 4 oC, no qual
solução com guanidina 6 M contendo proteína de interesse (1 mg/mL) foi diluída até à
concentração 10 – 100 µg/ml.
Também foram feitos experimentos de diálise em membrana de celulose com exclusão de
3.000 Da (Fisherbrand). As amostras de proteínas eluídas em tampão contendo 8 M de uréia ou
6M de guanidina, foram dialisadas contra 1 L de tampão acetato pH 5,0 contendo 1% glicerol até
que a concentração de equilíbrio chegasse a 0,01 M uréia ou guanidina. A diálise teve duração de
76
24 h com duas trocas de tampão.
8.4) Concentração das amostras purificadas
Após a diálise, as amostras contendo a proteína purificada foram concentradas em
dispositivos de ultrafiltração AMICON (3.000 Da) conforme instruções do fabricante (Millipore)
a uma rotação de 4.000 x g a 10 °C.
8.5) Dicroísmo Circular
Idem item 5.19.
9) RESULTADOS: CAPA PROTEICA DO RSPaV
9.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinate da capa proteica
do RSPaV usando o pacote de ferramentas EXPASY
O resultado da análise da proteína capsidial recombinante do RSPaV utilizando o
programa ProtParam, mostrou que ela é composta por 294 aminoácidos (com uma massa
molecular de 29197.1 Da), possui um ponto isoelétrico predito de 8.4, um índice de instabilidade
predito de 47.16, classificando-a como instável, um índice alifático de 69.25 epredomínio dos
aminoácidos Alanina (10,2 %) e Glicina (8,9 %) como evidenciado nas figuras 12 e 13.
77
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSM A S Q V G K L P S E
S N E A YE A R LK A L E L A R A Q K A P E V S SQ P P T L G G I L A K R K
R V I E N A LS K T V D M R E V L R H E S V V L S P NV M D E G A I D E L V
R A F G E S G I AE N V Q F D V A I D I A R R C S D V G SS Q R S T L I G K S
P F C E L N R S E IA G I I R E V T T L R RF C M Y Y A K I V W N I H L E T G
I P P A N W A K K G FN E N E K F A A F D FF L G V T D E S A L E P K G G
V K R A P T K A E M V A N IA S F E V K V L R Q T M A E G K R S S NL G E I
S G G T A G A L I N N P F A N VT H E
Figura 12. Sequência de aminoácidos da proteína da capa proteica recombinante do RSPaV clonada
emvetor pET28a. Os aminoácidos em vermelho e grifados correspondem à sequência do vetor pET28a
que contém a cauda de histidina; em pretocorrespondem à sequência de aminoácidos codificadas pela
ORF5(capa proteica) do RSPaV.
Figura 13. Quantidade e porcentagem de cada aminoácido presente na CP do RSPaV.
A predição da estrutura secundária baseada na sequencia primária de aminoácidos da capa
proteica do RSPaV pelo método de McGUFFIN, BRYSON; JONES (2000), utilizando o
programa PSIPRED, mostrou uma estrutura secundária contendo predomínio de α-hélice em
relação a β-folha e random coil como mostrado na figura 14.
78
Figura 14. Predição da estrutura secundária a partir da sequência de aminoácidos da capa proteica do
RSPaV utilizando o programa PSIPRED.
79
9.2) Expressão da proteína a 37 ºC
Em SDS-PAGE 10% (Figura 15) ficou evidenciada a expressão de uma proteína com
cerca de 29 kDa (~26 kDa referentes à proteína da capa proteica do RSPaV + 3.7 kDa referentes
à sequência que contém a cauda de histidina codificada pelo pET28a). A proteína capsidial do
RSPaV purificada sob condições desnaturantes usando resina à basede Níquel também foi
aplicada no mesmo gel. A partir de agora, a proteína recombinante de 29 kDa, será denominada
CP-RSPaV.
9.3) Western blot
Foram feitos dois SDS-PAGE idênticos, um foi corado com comassie (figura 13) e outro
para realização de western blot (figura 16) utilizando anticorpo monoclonal anti-histidina, que
reagiu especificamente com uma proteína de 29 kDa. Dessa forma, conclui-se que a proteína
detectada é a de interesse.
Figura 15. SDS-PAGE 10% evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína capsidial do
RSPaV usando resina à base de Níquel. (M) Marcador molecular (Fermentas). Testes de Expressão: (1)
Antes da indução com IPTG, (2) 3 horas após indução com IPTG 0,4 mM (3) Capa protéica recombinante
do RSPaV purificada sob condições desnaturantes.
80
Figura 16. "Western blot" utilizando gel idêntico ao da figura 13 evidenciando reação imunológica com
anti-soro monoclonal anti – histidina (M) Marcador molecular BenchMark pré-corado (Invitrogen) Testes
de expressão: (1) Antes da indução com IPTG. (2) 4 horas após indução com IPTG 0,5 mM.(3) Capa
proteica Recombinate do RSPaV purificada.
Após confirmação da expressão da CP-RSPaV 37 ºC foram feitos experimentos a fim de
obter a proteína na fração solúvel após a etapa de lise celular. Após nova expressão a 37 ºC,
oextrato celular da foi dividido em dois tubos e cada tubo foi sonicado com um tampão de lise
diferente:
Tampão A:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1
% Tween 20 pH 7,5).
Tampão B:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5)
A fração solúvel de cadaexperimento foi utilizada no processo de purificação da proteína
sob condição nativa (item 4.9.2) e antes da etapa de eluição com Imidazol 5µL da resina foram
coletados e aplicados no gel. Como controle, a fração insolúvel foi utilizada no processo de
purificação sob condição desnaturante.
81
Como evidenciado na figura 17, não foi possível obter a proteína de interesse na fração
solúvel, e a fração insolúvel utilizada como controle confirmou a presença da expressão da CPRSPaV.
Figura 17. SDS-PAGE 12 % evidenciando expressão em E. coli e purificação da proteína capsidial
doRSPaV a 37 ºC. (M) Marcador molecular (Invitrogen). Testes de Expressão: (1) Antes da indução com
IPTG, (2)3 horas após indução com IPTG 0,5 mM (3) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição
sob condição desnaturante.(4) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa
utilizando tampao de lise A. (5) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa
utilizando tampao de lise B.
9.4) Expressão a 17 ºC e 25 ºC
Muito tem sido feito no sentido de obter metodologias que possibilitem e otimizem a
expressão de proteínas solúveis. Uma das estratégias mais conhecidas para produção de proteínas
recombinantes solúveis é a expressão a baixas temperaturas (SCHEIN, 1989). Sabe-se que as
interações hidrofóbicas que levam à formação dos agregados protéicos são altamente favorecidas
pelas altas temperaturas (KIEFHABER et al, 1991). Além disso, baixas temperaturas inibem a
produção de “heat shock” proteases e aumentam a produção de chaperonas (FERRER et al,
82
2004). Algumas proteínas podem ser solubilizadas com agente não desnaturante (por exemplo, Larginina, N-Lauril Sarcosina, Sulfobetaína, Tampão Tris pH 12,5 com ou sem uréia 2M).
As figuras 18 e 19 mostram que mesmo utilizando baixas temperaturas a CP-RSPaV
permaneceu em corpos de inclusão utilizandos os tampões de lise A e B e D.
Tampão A: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 %
Triton X-100, 1 % Tween 20 pH 7,5)
Tampão B: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 %
Glicerol pH 7,5)
Tampão C: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,2 %N-Lauril
Sarcosina pH 7,5)
Tampão D: (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0.5 MSulfobetaína pH
7,5)
No entanto, o tampão C contendo baixa concentração do detergente N-Lauril Sarcosina
foi eficiente na solubilização da proteína de interesse.
83
Figura 18. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial doRSPaV
expressa a 17 ºC(M) Marcador molecular (Invitrogen).(1)5µL da resina coletados antes da etapa de
eluição sob condição desnaturante utilizados como controle da expressão.(2) 5µL da resina coletados antes
da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise A. (3) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise B.(4) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise C.(5) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise D.
Figura 19. SDS-PAGE 12 % evidenciando os ensaios de solubilizaçãoda proteína capsidial doRSPaV
expressa a 25 ºC(M) Marcador molecular (Invitrogen) (1)5µL da resina coletados antes da etapa de
eluição sob condição desnaturante utilizados como controle da expressão (2) 5µL da resina coletados antes
da etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise A (3) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise B (4) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise C (5) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição sob condição nativa utilizando tampao de lise D.
9.5) Expressão utilizando extresse osmótico e choque térmico e expressão utilizando
omeio auto-indutivo
A figura 20 evidencia que outras estratégias como o a expressão utilizando o meio auto-
84
indutivo proposto por STUDIER (2005) e a utlização dométodo do estresse osmótico e choque
térmico proposto por OGANESYAN et al. (2006) não foram eficientes na obtenção da proteína
de interesse na fração solúvel quando as células foram lisadas comtampão contendo 100 mM
NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7.5.
Figura 20. SDS-PAGE 12 %(1)pellet bacteriano a partir de 30µL de cultura contendo células não
induzidas com IPTG. (2) pellet bacteriano a partir de 30µL de culturacrescida em meio auto-indutivo após
48h. (3) pellet bacteriano a partir de 30µL de cultura após 16h de indução com IPTG utilizando método do
estresse osmótico e choque térmico. (4) pellet bacteriano a partir de 30µL de cultura após 3h de indução
com IPTG 37ºCusado como controle. (M) Marcador molecular Invitrogen. (5) 5µL da resina coletados
antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando a fração solúvel do sonicado do extrato celular do
meio auto-indutivo.(6) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição sob condição nativa utilizando a
fração solúvel do sonicado do extrato celular utilizando o método do estresse osmótico e choque térmico.
(7) 30µLde cultura após 3h de indução com IPTG a 37 ºC.
9.6) Arctic Express
Embora baixa temperatura de cultivo seja uma estratégia para aumentar a expressão de
proteína solúvel, as chaperoninas da E. coli, que facilitam oenovelamento adequado de proteínas,
85
perdem a atividade em temperaturas reduzidas. Alinhagem de céluas Arctic Express co-expressa
Chaperoninas Cpn10 e Cpn60 adaptadas ao frio, a partir da bactéria psicrofílica, Oleispira
antarctica. Estas chaperoninas têm alta atividade de enovelamentoa temperaturas 12 °C.
Os testes de expressão a 12 °C utilizando esta linhagem celular não foram eficientes na
obtenção de proteínas na fração solúvel após a sonicação do extrato celular como mostra a figura
21.
O extrato celular induzido foi dividido em dois tubos e cada amostra foi sonicada com um
tampão de lise diferente:
Tampão A:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 1
% Tween 20 pH 7,5).
Tampão B:
(100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 % Glicerol pH 7,5)
A fração insolúvel foi utilizada no processo de purificação sob condição desnaturante
como controle.
86
Figura 21. SDS-PAGE 12 %(M) Marcador molecular Invitrogen. (1) 5µL da resina coletados antes da
etapa de eluição da purificação da fração insolúvel, o corpo de inclusão, sob condição desnaturante. (2)
5µL da resina coletados antes da etapa de eluição da purificação da fração solúvel utilizando o tampão A.
(3) 5µL da resina coletados antes da etapa de eluição da purificação da fração solúvel utilizando o tampão
B.
9.7) Purificação e reenovelamento da proteína recombinante expressa a 37 ºC
Efetivamente, apenas 1 a 5 % das ORFs expressas em sistemas heterólogos tiveram suas
estruturas resolvidas. Isso se deve, principalmente, à dificuldade de obtenção de proteínas
solúveis (SHEN et al., 2005).Quando nenhuma das estratégias é eficiente e, as proteínas
continuam presentes apenas nos corpos de inclusão, inevitavelmente, as metodologias
envolvendo o uso de agentes desnaturantes passam a ser utilizadas. Os corpos de inclusão podem
conter, além das proteínas, outros tipos de polipeptídeos, fosfolipídios e ácidos nucléicos,
dependendo do sistema de expressão e condições de crescimento (VALAX; GEORGIOU, 1993).
A presença desses contaminantes pode reduzir e prejudicar, significativamente, o processo de
reenovelamento das proteínas de interesse (MAACHUPALLI-REDDYet al., 1997). Dessa forma,
o corpo de inclusão foi lavado em etapas utilizando Triton X-100 a 1 %, deoxicolato a 2 % e
87
uréia 0,5 M. Esse procedimento adicional contribuiu significativamente para o sucesso nos
experimentos de reenovelamento das proteínas. Após intensa lavagem do corpo de inclusão
conforme mencionado no item 4.15 a pureza da proteína purificada conforme descrito no item 4.8
foi avaliada analisando gel de poliacrilamida 12 % (figura 22). Não existe um tampão universal
para o reenovelamento, é necessário testar diferentes condições e limitar o que é mais eficiente
para cada proteína (YASUDA et al., 1998). A melhor forma de reenovelamento, diálise ou
diluição, não pode ser deduzida com base em propriedades moleculares das proteínas. O
procedimento adequado deve ser determinado caso a caso (RUDOLPH; LILIE, 1996).
Na maioria dos tampões utilizados nos experimentos de reenovelamento houve
precipitação total das proteínas, no entanto os tampões R3 e R8 a maior parte das proteínas
permaneceram solúveis após 20.000 g 18 ºC por 60 min (Figura 23).
Figura 22. SDS-PAGE 12 % corado com nitrato de prata.(M) Marcador molecular (Invitrogen). (1) (2)
(3) (4) e (5): etapas da eluiçãoda CP-RSPaV recombinante (6): Resina
88
Figura 23. SDS-PAGE 12 % evidenciando sobrenadante dos testes de reenovelamento após 20.000 x g
por 60min. (M) Marcador molecular Invitrogen. 1,2,3,4,5,6,7 e 8 correspondem ao sobrenadante dos testes
de reenovelamento com os tampões R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7 e R8 respectivamente.
9.8) Dicroísmo Circular
Os espectros do dicroísmo circular foram obtidos utilizando aparelho Jasco, de 190 a 260
nm, para estimar o conteúdo de estrutura secundária e a qualidade da proteína. Tendo em vista
que os resultados fornecidos pelos métodos utilizados pelos programas SELCON3, CDSSTR, e
CONTINL são similares, os valores apresentados relativos às frações de estrutura secundária da
proteína refletem as médias dos resultados obtidos com os três programas. A deconvolução do
espectro mostrou que a estrutura secundária continha (80 %) α-hélice, (3 %) folha-β, (10 %)
voltas e (7 %) desordenado (Figura 24).
89
80
60
2
-1
deg cm decagrame )
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
200
210
220
230
240
250
260
(nm)
Figura 24. Espectro do dicroísmo circular da capa proteica do RSPaV. A conformação da proteína
consiste em (80 %) α-hélice, (3 %) folha-β, (10 %) voltas e (7 %) desordenado.
9.9) Ensaios de Cristalização
As proteínas obtidas a partir da expressão a 17 ºC lisadas com tampão contendo N-Lauril
Sarcosina (item 5.4) e as proteínas renoveladas utilizando o tampao R3 foram concentradas até 4
mg/ mL, aplicadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (figura 25) para verificação da pureza e
então iniciaram-se os ensaios de cristalização com os Kits Cristal Screen 1 e 2, testando 96
condições diferentes. As placas foram incubadas em sala refrigerada a temperatura constante de
18 °C e pôde-se perceber a presença de precipitados cristalinos, alguns precipitados escuros, e a
presença de pequenos cristais em forma de agulha, no entanto nenhuma condição apresentou
cristal difratável quando analisado no Laboratório Nacional de Luz Sincrontron. Essas placas
estão sob intensa observação e algumas condições de refinamento estão em andamento com o
objetivo de se conseguir cristais difratáveis para os futuros estudos estruturais.
90
Figura 25. SDS-PAGE 12 % evidenciando a proteína CP-RSPaV purificada. (M) Marcador molecular
Invitrogen.(1) CP-RSPaV reenovelada. (2) CP-RSPaV purificada sob condição nativa utilizando tampào
de lise com 0,2 % de N-Lauril Sarcosina.
9.10) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
É ideal que a amostra a ser cristalizada seja homogênea. DLS é uma técnica que permite
estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução.
Proteínas com distribuição monomodal têm maior probabilidade de produção de algum tipo de
cristal. Se existir agregação entre moléculas isso é reconhecido pelo aumento do RH. A maioria
das soluções proteicas, tanto amostras de VPg como de CP, mostraram agregados protéicos com
raio hidrodinâmico maior que 100 nm. No caso da CP, agregados maiores que 500 nm eram
formados quando a proteína concentrada (5 mg/mL) era estocada por aproximadamente 24h a
4ºC. Variando-se concentração proteica, valores de pH, concentração salina e concentração de
aditivos foi possível reduzir o RH em até 10 vezes chegando próximo a 10 nm. Diferentes sais
91
foram utilizados nos tampoes das amostras de proteínas baseando-se na série de Hofmeister (Fig
24), que ordena os íons de acordo com suas propriedades cosmotrópicas/caotrópicas. Ânions
cosmotrópicos e cátions caotrópicos estabilizam proteínas, enquanto ânions caotrópicos e cátions
cosmotrópicos as desestabilizam (ZHAO, 2005; YANG 2009). Ânions e cátions cosmotrópicos
são formadores da estrutura da água (“water structure-makers”), fortemente hidratados, possuem
uma forte interação com as moléculas de água. Esses íons proporcionam uma camada de
hidratação muito bem estruturada e coesa e levam ao efeito salting-out, ou seja, solubilizam
proteínas. A posição de um íon na série de hofmeister é determinada essencialmente pelo seu
grau de hidratação.
Figura 26. Serie de Hofmeister, as espécies à esquerda do ânion Cl - são chamadas de cosmotrópicos,
enquanto as especies à direita são chamadas caotrópicos.
Ao contrário do cosmotrópico um ânion caotrópico como o SCN- possui baixa afinidade
pela água e alta polarizabilidade, preferindo assim ligar-se à interface água-proteína,
desestabilizando a estrutura proteíca (COLLINS; NEILSON; ENDERBY, 2007). Cátions
possuem um efeito relativamente menos dominante que ânions com mesma densidade de carga,
pois, os últimos são mais polarizáveis e mais fortemente hidratados (COMBARIZA; KESTNER;
JORTNER, 1994, GROSSFIELD; REN; PONDER, 2003).
92
9.10.1) . Resultados DLS CP RSPaV.
Utilizando tampões Tris 10 mM e 150 mM KCl 1 mM DTT pH 7.0,Tris 10 mM e 150
mM NaCl 1 mM DTT pH 7.0 ou Tris 10 mM e 150 mM NaF 1 mM DTT pH 7.0, foram obtidos
resultados semelhantes com relação ao raio hidrodinâmico (Figuras 27 e 28).
Figura 27. Ilustração das medidas de DLS da proteína da capa proteica do RSPaV.
93
Figura 28. Plotagem de 10 aquisições de 10 segundos cada referentes à proteína da Capa Proteica do
RSPaV.
Estes resultados mostram que mesmo conseguindo diminuir o raio hidrodinamico das
amostras proteicas ainda não foi obtida total desagregação. A tendência de agregação de
proteínas de capsídios já foi, muitas vezes, relatada na literatura tanto para vírus humanos como
vírus vegetais. Existem dúvidas sobre o processo termodinâmico da montagem do capsídio a
partir das proteínas da capa proteica. (BANCROFT, 1967; ZANDI et al., 2004). De fato, para
muitos vírus, incluindo Hepatitis B virus da (HBV), Human Papilloma virus (HPV), Cowpea
Chlorotic Mottle virus, BromeMosaic virus, Broad BeanMottle virus, Sindbis virus, and Tobacco
Mosaic virus (TMV), proteínas da capa proteica formam espontaneamente capsídios em
determinadas concentrações, salinidade, pH e temperatura (CERES and ZLOTNICK, 2002;
ZANDI and REGUERA, 2005; WINGFIELD et al., 1995). Sabe-se que altas concentrações de
determinados sais evitam o self-assembly de proteínas formadoras de capisídio (BANCROFT et
al., 1967) assim como a remoção de Ca 2+ (SPEIR et al., 1995). No entanto mesmo associando-se
às condições de alta força iônica (>500mM NaCl) a agentes quelantes (por ex: EDTA, o qual
quela o cálcio em pH maior que 7) não foi possível obter amostras com RH menores que 10 nm.
94
9.11) Amplificaçao usando primers com sítio para TEV protease
Os mesmos plasmídeos utilizados nestes experimentos de expressão e purificação foram
incluídos nas reações de PCR utilizando os primers com sítio de clivagem para TEV protease.
Inicialmente apresentaram-se alguns problemas relativos àdimerização dos primers que foram
solucionados com adição de 5 % de DMSO na reação e possibilitando a amplificação de uma
única banda como é evidenciado na figura 29.
Figura 29. Gel de agarose 1% evidenciando amplificação da sequência relativa a CP do RSPaV. (M)
Marcador Molecular Fermentas Middle Range. (A), (B) (C) e (D) produto amplificado.
9.12) Clonagem do fragmento da cp em vetor pMAL
A sequência codificadora da Capa Proteica do RSPaV foi amplificada utilizando primers
com sítios para Bam HI e Hind III e em seguida clonada em vetor pMAL. Após clonagem uma
95
digestão utilizando as mesmas enzimas foi realizada para de investigar a presença do inserto
liberado para confirmação do sucesso do experimento (figura 30).
Figura 30. Gel de agarose 1,5% evidenciando liberação do fragmento de aproximadamente 800 pb
referente à sequência codificadora da CP do RSPaV clonada em vetor de expressão pMAL. (M) Marcador
molecular Fermentas Middle Range. (C) Plasmídeo Controle digerido apenas com enzima Bam HI. (P)
Plasmídeo digerido com enzimas Bam HI e Hind III.
Para confirmar a inserção do sítio de clivagem para a TEV protease, as amostras foram
sequenciadas
e
alinhadas
utilizando
o
e
o
Multalin:
(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). Um refinamento das sequências obtidas
com baixa qualidade foi realizado utilizando oBioEdit Sequence Alignment Editor.
9.13) Sequenciamento do gene da capa preteica do RSPaV, confirmando sucesso na
inserção do sítio de clivagem para TEV protease
96
O gene daproteína capsidial do RSPaV que foi expressa, purificada e submetida a ensaios
cristalográficos, foi sequenciado utilizando os mesmos primers usados na clonagem. O
sequênciamento nos dois sentidos de leitura permitiu um alinhamento que confirmou a presença
do sítio da TEV protease como mostrado na figura 31.
Figura 31. Alinhamento das sequências referentes ao gene da capa proteica do RSPaV. A seta verde no
topo da figura indica a sequência de nucleotídeos referentes ao sítio da TEV protease.
97
9.14) Purificaçãoda TEV protease
Figura 32. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostrasda TEV purificada utilizando resina à base de Níquel.
(M) Marcador molecular; (1,2,3 e 4) Etapas da eluição da TEV protease.
9.15) Digestão enzimática das proteínas expressas clonadas em vetor pET28a (his-tag)
e vetor pMAL (MBP) utilizando TEV protease
Após inserção do sítio de clivagem para TEV protease, as proteínas foram expressas e
purificadas como já descrito, e então utlizadas para testes de clivagem, que envolveu proteínas
codificadas pelas sequências inseridas no vetor pET28a e em vetor pMAL.
98
Figura 33. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação e e digestão com TEV
protease.(A1) Amostra controle contendo proteína CP do RSPaV de 28 kDa fusionada à Maltose binding
protein de 43 kDa, totalizando uma massa molecular de aproximadamente 71 kDa.; (A2) Amostra
contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP misturada com TEV protease por 16h a 4 ºC; (A3)
Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP misturada com TEV protease por 16h a 22 ºC;
(M) Marcador Molecular GE protein mixture.; (B1) Amostra controle contendo proteína CP do RSPaV
fusionada à His-tag. (B2) Amostra contendo proteína CP do RSPaV misturada com TEV protease por 16h
a 4 ºC; (A3) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à His-tag misturada com TEV protease
por 16h 22 ºC.
Como observado na figura 34, a digestão foi eficiente apenasem experimentos envolvendo
proteínas expressas utilizando vetor pMAL, a qual é fusionada à MBP. A digestão não foi
eficiente nos experimentosenvolvendo a proteína contendo his-tag, provavelmentedevido à
presença do detergente N-Lauril Sarcosina, o qual pode não ter sido totalmente removido durante
as etapas de diálise, prejudicando a atividade da protease.
9.16) purificação da proteína digerida utilizando TEV protease.
99
Após digestão utilizando a TEV protease aproteína de interesse foi isolada utilizando
resina à base de Níquel e posteriormente resina à base de amilose.
Figura 34. SDS-PAGE 10 % evidenciando amostras proteicas após purificação,e digestão com TEV
protease e posterior isolamento do fragmento de interesse (1) Maltose binding protein de 43 kDa; (M)
Marcador Molecular GE protein mixture.; (2) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP
antes da adição da TEV protease.; (3) Amostra contendo proteína CP do RSPaV fusionada à MBP 16 h
após adição da TEV protease.;(4) Amostra contendo a Proteína CP do RSPaV isolada da Maltosee TEV
protease.
100
9.17) Ensaios de cristalização após digestão utilizando TEV protease.
Após isolamento do fragmento de interesse, correspondente à proteína capisidial do
RSPaV, iniciou-se os ensaios de cristalização, as placas foram incubadas em sala refrigerada a
uma temperatura constante de 18 °C e estão sob intensa observação, algumas condições de
refinamento estão em andamento com o objetivo de se conseguir cristais difratáveis para os
futuros estudos estruturais.
10) RESULTADOS E DISCUSSÃO: VPg DO SBMV
10.1) Análise da sequência de aminoácidos da proteína recombinante VPg do SBMV
usando o pacote de ferramentas EXPASY
O resultado da análise da proteína capsidial recombinante VPg utilizando o programa
ProtParam (Figura 35), mostrou que ela é composta por 111 aminoácidos (com uma massa
molecular de 12,295.6kDa), possui um ponto isoelétrico predito de 5.38 quando a cauda de
histidina e a região polilinkerestão presentes. Após inserção do sítio de clivagem para TEV
protease e remoção da cauda de histidina e região polilinker, ela apresenta 77 aminoácidos, massa
molecular de 8,751.7kDa e ponto isoelétrico teórico de 4.29.
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGST L P P D L S V I E I P
FEDVETRSYEFIEVEIKGRGKAKLGKREFAWIPESG
KYWADDDDDSLPPPPEVVDGKMVWTSAQE
Figura 35. Sequência de aminoácidos da proteína VPg clonada emvetor pET28a. Os aminoácidos em
vermelho e grifados correspondem à sequência do vetor pET28a que contém a cauda de histidina; em
preto e negrito correspondem à sequência de aminoácidos da VPg do SBMV.
101
10.2) Expressão, purificação e concentração das proteínas VPg
O rendimento a partir de 1 L de cultura de células, após o processo de purificação foi: 3
mL de VPg a 7 mg/mL, totalizando 21 mg de proteína pura por litro de cultura.
A proteína VPg mostrou-se estável até à concentração de 11 mg/mL. A pureza das
amostras foi verificada em SDS-PAGE 12 % e 15 % comomostra a figura 36.
Figura 36. SDS-PAGE 15% corado com comassie evidenciando pureza da VPg do SBMV.(M) Marcador
molecular Fermentas (VPg) Proteína concentrada.
102
10.3) Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
10.3.1) Resultados DLS VPg
Os menores valores de raio hidrodinâmico (próximos de 10 nm) foram obtidos quando a
VPg estava em tampão TrispH 7 e pH 8 e concentração de NaCl ou KCl maior ou igual a 150
mM (figuras 37 e 38).
Figura 38. Ilustração das medidas de
DLS da proteína VPg em tampão Tris
10 mM e 150 mM NaCl.
Figura 37. Ilustração das medidas de
DLS da proteína VPg em tampão Tris
10 mM e 150 mM KCl.
103
Figura 39. Plotagem de 20 aquisições de 20 segundos cada, referentes à proteína daVPg do SBMV.
Em tampão tris com pH 9 ou maior e em pH 6 ou menor evidenciou-se aumento no valor
do raio hidrodinâmico. O mesmo aconteceu com concentração de NaCl e KCl menor que 100
mM. Após encontrar a melhor condição utilizando a técnica de DLS (Tris 10 mM e 150 mM
KCl) uma nova purificação foi feita utilizando este tampão desde a etapa de sonicação, na
tentativa de evitar agregação antes, durante e depois da etapa de purificacão, pois algumas
proteínas uma vez agregadas podem não mais desagregar em seu estado nativo. As causas mais
frequentes de agregacao não específica de proteínas são condições sub-ótimas dos solventes e
contaminação por outras proteínas. Desta forma muito tempo foi gasto nesta etapa do projeto,
pois mesmo apresentando alto grau de pureza e uma populacão protéica monomodal a amostra
ainda permanecia com um RH relativamente alto. Tentou-se reverter a formação de agregados
incluindo cossolventes que desestabilizam as interações proteína-proteína. Foram usadas baixas
concentrações de cossolventes carregados são usadas para evitar interações eletrostáticas que
podem facilitar a agregação (SHARME, 2000; NEAGU, 2001; TIMASHEFF, 1998). Outra
estratégia é a utilização de espécies caotrópicas que interagem com grupos peptídicos prevenindo
interações intermoleculares que levam à agregação (LU, 2001; EDWIN, 2002; BALDWIN,
1996). A adição de açúcares e álcoois poli-hídricos que interagem com a proteína mais
104
fracamenteque com a água (TIMASHEFF, 1998), alguns aminoácidos, e agentes redutores como
DTT e beta-mercaptoetanol, que inibem a formação de pontes dissulfeto não nativas, podem
também prevenir a agregação de proteínas.
As placas dos experimentos que utilizaram a VPg apresentaram cristais em 14 condições e
algumas delas podem ser visualizadas na figura 40.
Figura 40. Algumas condições em que a proteína VPg apresentou cristais.
A proteínaVPg quando em tampão contendo 150 mM de KCl cristalizou em 4 dias,
diferente de quando estava em 150 mM de NaCl que necessitou de 21 dias para cristalizar.
105
A utilização de luz UV para diferenciação de cristais de sais e proteínas confirmaram a
natureza proteica dos cristais (Cristais de sal não fluorescem sob Luz UV, ao contrário de cristais
proteicos que fluorescem devido ao triptofano) como pode ser vizualiadonas figuras 41e 42.
Figura 41.Cristais de VPg fluorescendo quando iluminados por UV
Figura 42.Cristal de VPg
Mesmo conseguindo vários cristais de VPg e em diferentes condições, foram feitas
otimizações tentando conseguir cristais maiores, uma vez que os maiores cristais tinham apenas
106
100 µm. Algumas placas otimizadas estão no Desy sob observação, assim como as placas dos
experimentos de micro batch, micro seeding e streak seeding. Alguns cristais foram escolhidos
pelo professor Christian Betzel e foram utilizados para testes de difração nas instalações do Petra
III situado no Desy, onde há uma poderosa fonte de luzque possibilita a análise de cristais
pequenos, pois gera raios X de altissíma intensidade. No entanto, não foi possível fazer um bom
recolhimento de dados, desta forma iniciaram-se experimentos com a finalidade de remover os 34
aminoácidos codificados pelo pET28a, que incluem a his-tag. Mesmo conhecendo os inúmeros
benefícios que as tags podem trazer à proteína, há relatos na literatura mostrando que a adição
datag pode alterar a conformação proteica (CHANT et al., 2005), alterar a atividade biológica
(FONDA et al,. 2002), e resultar em uma flexibilidade não desejada em estudos estruturais
(SMYTH et al., 2003).
10.4)Amplificação da sequência codificador da VPg usando primers com sítio para
TEV protease
Experimentos iniciais mostraram que o pET28a, contendo a sequência codificadora da
VPg, não poderia ser usado como template para nova clonagem, uma vezque reações contendo
pET28a vazio (C-) amplifica bandas de aproximadamente 200 e 300 pares de bases (figura 43).
107
Figura 43. Gel nativo de agarose 1 %.M: Marcador molecular DNA Ladder 100 bp (Invitrogen);C+:
reação controle utilizando como template o pET28a contendo sequência codificadora da VPg. C-: Reação
controle onde o template é o pET28a (vazio) sem inserto.
Para superar este problema, folhas de feijoeiro infectadas pelo SBMV foram utilizadas
para purificação do vírus. Após a purificação, partículas virais foram utilizadas como fonte de
RNA,um cDNA foi feito utilizando o primer antissensoe utilizado como template da reação de
PCR.
10.5) Purificação das partículas virais
Uma fração do vírus purificado foi observada em gel SDS-PAGE 12 % (Figura 44).
Observou-se uma única banda de aproximadamente 30 kDa referente à proteína capsidial do
vírus. A amostra não apresentou contaminante mostrando a eficiência do procedimento de
purificação. A relação da leitura da absorbância à luz ultravioleta 260 nm/280 nm foi de 1,648.
108
Os dados de absorbância permitiram o cálculo da concentração viral que foi de aproximadamente
10 mg/ml.
Figura 44. SDS-PAGE 12% evidenciando a proteína capsidial das partículas virais purificadas. (M)
Marcador para proteínas Dalton Mark VII-L (Sigma), valores representados em kDa. (1) Proteína
capsidial do SBMV.
10.6) Extração do RNA viral do SBMV
A partir do vírus purificado, o RNA viral foi extraído, purificadoe analisado em gel de
agarose 1 % evidenciando banda com massa molecular de aproximadamente 4,2 kb,
109
correspondente ao RNA genômico do SBMVe evidenciando também poucos sinais de
degradação (Figura 45).
Figura 45. Análise do RNA viral extraído de partículas purificadas de SBMV em gel de agarose 1 %.
(M): Marcador de tamanho molecular em kb; (R): RNA com 4,2kb.
10.7) Amplificação da sequ6encia codificadora da VPg a partir do cDNA
O RNA purificado foi utlizado na construção do cDNA e, então, utilizado como template
em diferetes condições de PCR (figura 46).
110
Figura 46. Gel de agarose 1%evidenciandodiferentes reações de PCR utilizando cDNA como template.
(M): Marcador de tamanho molecular em kb; (1, 2, 3 e 4) Fragmento de 300 pb amplificado em diferentes
reações de PCR.
Os fragmentos amplificados referentes ao gene da VPg (300 pb) foram clonados em
vetores pET28a e pMAL-c2x. A confirmação da clonagem foi realizada utilizando plasmídios
recombinantes digeridos durante 1 hora a 37 ºC com as enzimas Bam HI e Hind III. Como
esperado, foi liberado um fragmento de DNA com mesmo tamanho do DNA amplificado (300 pb
para VPg) como verificado na figura 47.
111
Figura 47. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dosvetores recombinates pET28a
e pMAL-c2x.. (M): Marcador molecular DNA Ladder 100 pb (Invitrogen). (1): Fragmento referente ao
DNA plasmidial pMAL-c2x na parte superior do gel e fragmento liberado de aproximadamente 300 pb
referente ao gene da VPg. (2): Fragmento referente ao DNA plasmidial pET28a na parte superior do gel e
fragmento liberado de aproximadamente 300 pb referente ao gene da VPg.
10.8) Sequenciamentro e alinhamento VPg
Diferentemente das sequências referentes aos genes da CP do RSPaV e MP do SBMV, as
sequências referentes ao gene da VPg, obtidas através da reação de Big Dye, apresentaram
alinhamento desordenado, principalmente pela baixa qualidade das sequências obtidas quando
utilizado o primer senso (Figura 48).
112
Figura 48. Alinhamento de uma única sequência obtida utilizando primer reverse comparada com a
sequência original do gene da VPg.
10.8.1) Refinamento do alinhamento utilizando BioEdit
Utilizando apenas as sequências obtidas utilizando primer reverse, foi possível fazer o
alinhamento através do BioEdit, mostrando o sucesso na inserção do sítio da TEV protease.
Figura 49.
113
Figura 49. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína VPg do SBMV. A seta verde
indica a sequência de nucleotídeos referentes ao sítio da TEV protease.
10.9) Expressão e purificação da proteína do movimento
Testes iniciais de expressão e purificação da proteína do movimento utilizando pMALc2x não mostraram resultados satisfatórios e o estabelecimento de um protocolo ideal está em
andamento.
10.9.1) Expressão e purificação da VPg utilizando pMAL-c2x
A proteína VPg fusionada à Maltose Binding Protein de 43 kDa foi expressa e purificada
de acordo com os itens 6.1 e 6.2. Frações referentes às etapas de eluição foram aplicadas em
114
SDS-PAGE 12 % confirmando eficiência do processo de purificação como mostrado na figura
50.
Figura 50. SDS-PAGE 15 %evidenciando amostrasda VPg-MBPpurificada utilizando resina à base de
Amilose. (M) Marcador molecular; (1 a 7) Etapas da eluição utlizando tampão contendo 10 mM de
maltose.
Esta proteína VPg-MBP foi concentrada e uma fração foi utilizada para ensaios
cristalográficos como descrito no item 11. Outra fração foi utilizada para testes de digestão
enzimática adicionando TEV protease como já descrito e pôde ser confirmado através de SDSPAGE como mostrado na figura 51.
115
Figura 51. SDS-PAGE 15 % . (M) Marcador molecular; (1 e 2): amostras digeridas pela TEV protease
evidenciando bandas referentes à MBP (seta preta) e VPg (seta vermelha)
Após digestão enzimática, foi realizada uma nova purificação por troca iônica, utilizando
colunas mono-Q acoplada ao AKTA purifier a fim de separar VPg, MBP e TEV protease. Esta
etapa não foi eficiente, uma vez que a VPg se liga fortemente à coluna e sua eluição só é possível
utilizando pH elevado a ponto de desnaturar a proteína. Para evitar a utilização da coluna monoQ, a purificação foi realizada com sucesso utilizando expressão a partir do vetor pET28a como
pode ser observado nos resultados item 10.8.2.
10.9.2) Expressão, purificação e concentração da VPg utilizando pET28a
A proteína VPg foi purificada primeiramente contendo a região polilynker e acauda de
histidina. Posteriormente, a TEV protease foi utilizada para digestão proteica na proporção 1:50
e, em seguida, uma nova purificação foi realizada, removendo a protease e a tag. A pureza das
amostras foi verificada em SDS-PAGE 15 % comomostra a figura 52. A digestão foi realizada na
presença e na ausência de EDTA.
116
Figura 52. SDS-PAGE 15 % evidenciando digestão enzimática. (M) Marcador molecular; (A): VPg
fusionada à his-tag purificada; (B) VPg-his6 digerida com TEV protease. (seta preta = TEV protease; seta
verde = VPg; seta vermelha = polylinker+his6);(C): VPg-his6 digerida com TEV protease na presença de
EDTA; (D e E): VPg isolada.
Como observado na figura 52, a partir da proteína recombinante de 112 aminoácidos, foi
possível remover os 34 aminoácidos codificados pelo pET28a (polilynker + 6His), permitindo a
purificação de uma proteína VPg contendo 78 aminoácidos, com sequência idêntica à da proteína
codificada pelo vírus na natureza. Esta remoção de aminoácidos alterou muito pouco o ponto
isoelétrico da proteína, passando de 5.7 para 4.5, permitindo assim utilizar as mesmas condições
de tamponamento já utilizadas em experimentos anteriores. O tamanho da proteína foi reduzido
em aproximadamente 3,5 kDa, passando de 12,5 kDa para 9 kDa, aumentando significantemente
sua solubilidade, conforme pôde ser verificado no seguinte experimento:500 µL de proteínas com
e sem a tag foram concentradas até 20 mg/mL, centrifugadas por 15.000 x g por 30 minutos a 10
ºC e, em seguida, o precipitado ressuspendido em 10 µL de tampão de amostra para aplicação em
SDS-PAGE 15 % (Figura 53).
117
Figura 53. SDS-PAGE 15 % comparando o precipitado de amostras contendo Histag e amostras com a
Histag removida. (M): Marcador molecular; (VH6): VPg fusionada a Histag precipitada a partir de
amostras centrifugadas;.(V): VPg com Histag removida precipitada após centrifugação.
Utilizando comprimento de onda 260 nm e 280 nm, e gel de agarose corado com brometo
de etídio, foi verificada total remoção de material genético da amostra.
10.10) Ensaios de cristalização
Mesmo com grandes avanços nas últimas décadas no campo da cristalografia, a obtenção
de cristais adequados para coleta de dados ainda representa o "bottleneck" na determinação de
estruturas. Infelizmente, a cristalização de proteínas ainda é um método de tentativa e erro que
pode consumir muito tempo, por isso foram iniciados os “screenings” a partir da obtenção de
soluções de proteínas estáveis e apenas as melhores condições com relação à pureza e
polidispersividade foram utilizadas. As placas contendo os “screenings” iniciais das condições de
cristalização realizados pelo método de difusão de vapor por gota sentada utilizando o robô
118
Honeybee 961 (Genomic Solutions Ltd) são checadas semanalmente. Experimentos realizados
com a capa proteica não apresentaram cristais.
10.11) Efeito do TFE na estrutura secundária da VPg do SBMVmonitorado atravé de
dicroísmo circular
As propriedades estruturais da VPg purificada na ausência e na presença de TFE foram
investigadas por espectroscopia UV-CD. O espectro de CD da VPg na ausência de TFE
apresentavam características estruturais de uma proteína intrinsecamente desordenada sendo seu
mínimo próximo de 205 nm e uma elipicidade negativa em 190 nm (Figura 54). A Figura 51
mostra que a adição de TFE na solução tampão induziu a formação de α-hélice, baseada na
elipicidade positiva a 190 nm, uma pequena mudança de 205 a 209 nm, e aumento na na
elipicidade negativa a 222 nm. A tabela 2 representaas porcentagens de estruturas secundárias de
VPg realizadas com o programa CONTINLL. Os cálculos de estrutura secundária são
consistentes com a discussão feita anteriormente, indicando a propensão de formação de α-hélice
com incremento de TFE, a partir de 8 a 15 %. Como resultado da formação de α-hélice, a
porcentagem de estrutura aleatória diminuiu de 37 para 31%. Outras estruturas secundárias
apresentaram ligeiras flutuações ou diminui com a adição de TFE, o que sugere que estas
estruturas constituem um núcleo estável de VPg.
Tabela 2
Porcentagens de estruturas secundárias da proteína VPg na ausência e presença de TFE
TFE
(%)
0
10
20
30
α-hélice
(%)
8
8
9
15
Folha-β
(%)
31
33
35
32
Voltas(%)
24
23
23
22
aleatórios
(%)
37
36
33
31
119
Figura 54. Espectros de UV-CD da VPg na ausência (linha preta), presença de TFE 10 % (linha
vermelha), 20 % (linha laranja) e 30 % (linha amarela).
10.12) Interação da sonda ANS
A ligação da sonda ANS na proteína VPg foi monitorada utilizando espectroscopia de
fluorescência no estado estacionário. A ANS é uma sonda que pode ser utilizada para investigar
as mudanças estruturais em proteínas. Esta sonda apresenta uma elevada afinidade para
ambientes hidrofóbicos em proteínas, dando origem a um aumento da fluorescência,
significativamente com um deslocamento para o azul, característica da sua emissão máxima. O
espectro de fluorescência da ANS em tampão fosfato de sódio aumentou na presença de VPg
(Figura 55). Esta mudança na emissão de fluorescência para o azul é característico da ligação da
ANS àsregiões em que a proteína está desestruturada. A presença de TFE em solução tampão
provavelmente induziu a estabilização das estruturas secundárias da VPg, uma vez que o TFE
compete por ligações de hidrogénio com moléculas de água, permitindo desse modo, que a
proteína faça ligações de hidrogênio em sí mesma.
120
Figura 55. Espectro da emissão da fluorescência da sonda ANSligada à VPgna ausência (linha vermelha)
epresença de TFE 30 % (linha amarela). Emissão de ANS em tampão fosfato na ausência (linha preta) e
presença de TFE 30 % ( linha laranja)
10.13) Efeito do dATP e TFE no raio hidrodinâmico da VPg.
Utilizando dATP 1mM, dATP 1mM combinado com TFE e TFE 30 % foi possível
diminuir o raio hidrodinâmico da amostra de VPg purificada, obtendo valores muito similares no
tamanho do complexo proteico, como pode ser observado nas figuras 56 a 57. Estes resultados
indicam que dATP 1 mM e TFE 30%, podem, independentemente, reduzir o tamanho do
complexo proteico. Mostra ainda, que a presença do TFE 10%, não diminui o raio hidrodinâmico
do complexo proteico.
121
Figura 57. Ilustração das
medidas de DLS da proteína
da VPg do SBMV na
presença de tampão contendo
Figura 56. Ilustração das medidas de DLS
da proteína da VPg do SBMV na presença
de tampão contendo 1 mM dATP e 30 %
TFE.
Figura 58.Ilustração das
medidas de DLS da proteína da
VPg do SBMV na presença de
tampão contendo 1 mM d
ATP.
Figura 59. Ilustração das medidas de
DLS da proteína da VPg do SBMV na
presença de tampão contendo 30 % de
TFE.
122
10.14) NMR
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio por diferença de transferência de saturação
(STD-RMN) foi utilizada para avaliar a interação entre VPg e dATP, dCTP, dGTP, dUTP e
adenina. Quando o experimento foi repetido utilizando dATP na ausência de VPg nenhum sinal
foi observado. O local de ligação para cada nucleotídeo esta mostrado com suas respectivas
porcentagens de STD. Para dATP (Figura 60-a), o próton do H em C8 foi encontrado como o
principal responsável pela ligação da VPg. Outros locais de ligação detectados são os prótons de
H no C1 ', C2' e C3 'da ribose. Quando a adição de 30% de TFE, temos observado o mesmo
padrão como na figura 58-a. Para dCTP (Figura 60-b), o próton do H em C5 da pirimidinae os
prótons de H em C1 e C2 parecem ser igualmente importantes para o reconhecimento da VPg.
Para dGTP (Figura 60-c), o próton do H em C8 parece ter pouca importância na ligação da VPg.
Assim como no caso de dCTP, os prótons de H em C1 e C2 são os principais responsáveis pela
interação observada entre dGTP e VPg.. Estes resultados indicam que tanto dCTP como dGTP
utilizam a ribose como os principais epitopos de ligação. Já o dATP, usa o motivo purina como a
principal ligação e os resultados sugerem um reconhecimento molecular mais específico para este
nucleotídeo.
123
Figura 60. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e os ligantes: (a) dATP; (b)
dCTP; (c) dGTP; (d) dTTP.
Figura 61. Espectro de RMN de 1H mapeando locais de interação entre VPg e adenina.
124
11) RESULTADOS: SERINO PROTEASE
11.1) Sequenciamento da região codificadora da serino protease do SBMV
Após sequenciamento do fragmento do vetor pET28a, utilizando primers que flanqueiam
o promotor T7, foi possível confirmar o sucesso nas etapas de clonagem envolvendo a inserção
do sitio para TEV protease (Figura 62).
Figura 62. Alinhameto das sequências codificadoras da serino protease do SBMV.
Utilizando a sequência codificadora do sítio de clivagem para TEV protease, alinhada
juntamente com as sequências obtidas no sequênciamento, foi possível confirmar sucesso na
inserção da sequência do sítio de clivagem, a qual está contida no primer senso (Figura 63).
125
Figura 63. Sequenciameto mostrandosucesso nainserção do sítio de clivagem para TEV protease. As
sequências referentes ao sítio para TEV protease estão delimitadas pela linha verde.
11.2) Teste de solubilidade da Serino protease do SBMV
Após confirmação do sucesso nas etapas de clonagem, foram realizados diversos
experimentos com objetivo de obter a proteína de interesse solúvel, após lise celular seguida de
centrifugação (Figura 64).
Figura 64. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão
proteicaseguida de lise celular. P: Precipitado da expressão 18° Cpor 16 h. M: marcadorde
massamolecular pré corado, 1 e 2: sobrenadantes da expressão 18 °C utilizando tampao de sonicação
126
contendo 10 e 15 % de glicerol respectivamente.3 : Sobrenadante da expressão a 18°C utilizando tampão
de sonicação contendo 0,2% de NLS 4:Sobrenadante da expressão utilizando estresse osmótico. 5:
Sobrenadante da expressão utilizando meio auto indutivo.
11.3) Predição da porção N-terminal da serinon protease do SBMV
A predição da proteína classificou a sequência de aminoácidos das posições 1 a 6 e 3 a 38
(Laranja) como possível peptídeo sinal e classificouas sequências de aminoácidos das posições 7
a 29 e 39 a 62 (Verde) como possível região transmembrânica (Figura 65).
Figura 65. Predição da estrutura secundária da serino protease do SBMV.
11.4) Amplificação da sequência codificadora da serino protease utilizando primer a
fim de reduzir a proteína em 64 aminoácidos
O primer senso, nomeado Serine_NoTransmembrane, permitiu a amplificação de DNA
que codifica a serino protease do SBMV, com exceção destes 64 aminoácidos supracitados, os
127
quais dificultavam a obtenção da proteína expressa solúvel. A proteína passou a ser chamada de
serino (-64).
Figura 66. Gel de agarose 1 %
evidenciando a amplificação da
sequencia codificadora da serino
protease do SBMV, antes (Ser1) e
depois (Ser2) da remoção dos
nucleotídeos codificadores da região
transmembrânica.
Figura 67. Gel de agarose 1%
evidenciando a amplificação da
sequência codificadora da serino
protease obtida utilizando colônias
bacterianas transformadas como fonte
de DNA para reação de PCR usando
primer serino_Notransmembrane.
11.5) Sequenciamento da região codificadora da serino protease após remoção da
porção N-terminal
128
Figura 68. Resultado do sequenciamento da serino protease indicando sucesso nas etapas de clonagem.
11.6) Teste solubilidade da Serino protease do SBMV após remoção da porção Nterminal
Após remoção da região transmembrânica da serino protease (-64), novos testes de
expressão e purificação foram realizados. Várias estratégias comprovaram amanutenção da
solubilidade da proteína após lise celular.
129
Figura 69. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão
proteicaseguida de lise celular. M: marcador de massamolecular pré corado. De 1 a 7 correspondem aos
sobrenadantes após lise celular seguida de centrifugação. 1 e 2: sobrenadantes da expressão 18°C
utilizando tampao de sonicação sem glicerol e contendo 15% de glicerol respectivamente.3: Sobrenadante
da expressão a 18° C utilizando tampao de sonicação contendo 0,2 % de NLS 4:Sobrenadante da
expressão utilizando estresse osmótico. 5: Sobrenadante da expressão utilizando meio auto indutivo. 6:
Sobrenadante da expressão utlizando linhagem pLysS. 7: Sobrenadante da expressão utlizando linhagem
Star™ (DE3).
11.7) Expressão e purificação serino(-64)
Após confirmação da expressão da serino (-64) e manutenção de sua solubilidade após
lise celular seguida de centrifugação, foram iniciados testes de expresão e purificação em larga
escala (Figura 70).
Figura 70. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot após expressão
proteicaseguida de lise celular. P: precipitado obtido após lise celular. M: marcadorde massamolecular pré
corado, SN: sobrenadante obtido após lise celular seguida de centrifugação. R: aliquota da resína a base de
130
níquel após passagem total do sobrenadante através da coluna. E: fraçao da etapa de eluição utilizando
tampão contendo 300 mM de imidazol. C: BSA 50 mg/ mL utilizado como controle.
A proteína expressa e purificada em larga escala foi analisada em SDS-PAGE 15 %
(Figura 71).
Figura 71. M: Marcador de massa molecular; T células de E. coliapós centrifugação do meio de cultura
após indução por 10 horas. SN1: sobrenadante após lise celular seguida de centrifugação. SN2
sobrenadante após adição de polietilenemina seguida de centrifugação. Ser: Fração da eluição com tampão
contendo imidazol. R: alíquota contendo a resina usada na purificação após eluição.
Após confirmação da purificação da proteína, ela foi concentrada e utilizada em
experimentos de interação descritos no item 8.6.
12) RESULTADOS: PROTEÍNA DO MOVIMENTO
12.1) Expressão da provável MP em vetor pET28a
131
Utilizando a linhagem E. coli linhagem BL21(DE3)-RIL transformada com pET28a
contendo a sequência codificadora da ORF1 do SBMV, proteína do movimento recombinante
expressa foi purificada em coluna contendo resina à base de níquel (Figura 72).
Figura 72. Gel de poliacrilamida 12% mostrando a expressão da proteína de aproximadamente 22 kDa
(MP-His). (M) Marcador para proteínas, Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen); (A) Amostra-controle
contendo pET28a sem inserto. (B) 1 h de indução de amostra contendo pET28a recombinante, (C) MP-His
purificada (17 kDa referente à MP + 5 kDA referente à cauda de histidina).
12.2) Dicroísmo circular após reenovelamento
Após expressão, purificação e reenovelamento, a proteína do movimento recombinante foi
concetrada a 5 mg/mL e usada em experimentos de dicroísmo circular. Utilizando tampão 10 mM
fosfato de sódio e 50 mM NaF, foi possível avaliar as porcentagens de estruturas secundárias.
132
Figura 73. Espectro do dicroísmo circular da MP reenovelada. 25 % Alfa hélice., 39 % Folha beta,18 %
Turns,18 % Desordenado.
12.3) Avaliação da interação entre MP do SBMV reenovelada e outras proteínas virais
Através de western blot foi possível propor que a MP do SBMV pode interagir com serino
protease e proteína capsidial do SBMV. A membrana de nitrocelulose contendo as proteínas
VPg, Serino protease, proteína capsidial, LAAO e BSA, foi incubada com MP reenovelada, a
qual foi imobilizada nas regiões da membrana contendo serino protease e contendo a proteína
capsidial. Diversas lavagens contendo tween 20 não desligaram a proteína que foi detectada
utilizando anticorpo policlonal específico para a MP. Pode-se propor ainda, que a região
transmembrânica da serino protease não é essencial para esta interação. Já a VPg, mesmo em
altas concentrações, não mostrou interação através de western blot, no entanto mostrou interação
quando aplicada diretamente na membrana de nitrocelulose e avaliada através de dot blot. As
proteínas LAAO e BSA foram utilizadas como controle, mostrando que mesmo 20 vezes mais
concentradas, não interagemcom a MP assim como não reage com anticorpos policlonais contra a
MP.
133
Figura 74. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de western blot.LA: LAAO, BSA albumina
de soro bovino. MP proteína do movimento recombinante. Se: serino protease sem a regiao
transmembranica. CP: proteína capsidial obtida através da aplicação direta de vírus SBMV purificado no
gel de poliacrilamida. VPg proteína VPg do SBMV purificada. M marcador de massa molecular pré
corado.
12.4) Dot blot utilizando proteínas que não interagiram com a MP
As proteínas aplicadas no gel e transferidas para membrana de nitrocelulose, que não
interagiram com a MP (VPg, LAAO e BSA), foram aplicadas diretamente na membrana em
experimento de dot blot. A membrana foi submetida às mesmas condições do experimento de
western blot supracitado.
134
Figura 75. Membrana de nitrocelulose usada em experimento de dot blot. MP: proteína do movimento
recombinante. VPgH6 proteína VPg do SBMV contendo cauda de histidina; VPg proteína VPg do SBMV
após remoção da cauda de histidina; LAAOL-amino-acid oxidase de Bothrops ; BSA albumina de soro
bovino.
12.5) Amplificação usando primers com sítio para TEV protease
A partir de plasmídios contendo as sequências codificadoras da MP, usados como
template, foram feitas reações de PCR visando a inserção do sítio da TEV protease e posterior
clonagem nos plasmídio pET28a e pMAL-c2x.
12.6) Amplificação dos gene da MP utilizando primes com sítio para TEV protease
O produto da reação de PCR, amplificado com os oligonucleotídeo senso contendo os
sítios da Bam HI e da TEV protease, foi analisado em gel nativo de agarose 1%, apresentando
única bandade aproximadamente 500 pb correspondente ao fragmento de tamanho esperado para
o possível gene codificador daproteína do movimento (Figura 76). O fragmento amplificado foi
purificado e ligado aos vetores pET28a e pMAL-c2x (Figura 77).
135
Figura 76. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando o fragmento de 500 pares de bases amplificado por
PCR. C+: reação controle utilizando como template o pET28a contendo sequência codificadora da MP
onde o primer foward não tem sítio para TEV protease. A: reação utilizando como template o pET28a
contendo sequência codificadora da MP onde o primer forward tem sítio para TEV proteaseM: Marcador
molecular DNA Ladder 100bp (Invitrogen); C-: Reação controle onde o template é o pET28a sem inserto.
É evidente a maior intensidade da banda referente ao controle C+, uma vez que o
oligonucleotídeo senso possui elevado número de bases (48 bases), dificultando assim o
anelamento ao template, mesmo em temperaturae concentração salina ideal.
136
Figura 77. Gel nativo de agarose 1 % evidenciando digestão enzimática dosvetores recombinates pET28a
e pMAL-c2x. (M): Marcador molecular DNA Ladder 100 pb (Invitrogen); (3): Fragmento referente ao
DNA plasmidial pMAL-c2x na parte superior do gel e fragmento liberado de aproximadamente 500 pb
referente ao gene da MP; (4): Fragmento referente ao DNA plasmidial pET28a na parte superior do gel e
fragmento liberado de aproximadamente 500 pb referente ao gene da MP.
12.7) Sequenciamento e alinhamento MP
O gene da proteína do movimento do SBMV foi sequenciado utilizando os mesmos
primers usados na clonagem. O sequênciamento nos dois sentidos de leitura permitiu um
alinhamento que confirmou a presença do sítio da TEV protease como mostrado na figura 78.
137
Figura 78. Alinhamento das sequências referentes ao gene da proteína do movimento (MP) do SBMV. A
seta verde no topo da figura indica a sequência de nucleotídeos referentes ao sítio da TEV protease.
13) CONCLUSÕES
1- Na primeira etapa deste projeto, foi possível testar diferentes construções dos vetores de
expressão e selecionar os mais adequados aos ensaios de purificação, baseando-se na
solubilidade, estabilidade e monodispersividade das soluções proteicas.
138
2- Os protocolos estabelecidos neste projeto de pesquisa permitem a expressão e obtenção
de grandes quantidades de proteína recombinante com alto grau de pureza.
3- Os resultados obtidos através de dicroísmo circular mostram que as proteínas estão
estruturadas e adequadas para realização de experimentos de interação com possíveis
ligantes e ensaios de cristalização.
4- Os resultados obtidos através de DLS mostram que em determinadas concentrações
proteicas, condições salinas e de pH, é possível obter amostras monomodais mesmo não
obtendo a proteína na forma monomérica.
5- Os resultados desta tese lançam as bases para futuros testes de cristalização e posterior
resolução das estruturas tridimensionais.
14) EXPERIMENTOS REALIZADOS PARALELAMENTE AOS EXPERIMENTOS
VINCULADOS AO PROJETO DE PESQUISA
Durante os últimosmeses, além dos experimentos envolvidos neste projeto de pesquisa, a
expressão e purificação deproteínas de Corynebaterium pseudotuberculosis também têm sido
realizadas,
visando
a
obtenção
de
cristais
para
posterioir
estudos
estruturais.
C.
pseudotuberculosis é uma bactéria que causaelevados prejuízos à pecuária de caprinos e ovinos.
Vetores pD444 contendo genes codificadores das proteínas formamidopyrimidine-DNA
glycosylase (mutM1), formamidopyrimidine-DNA glycosylase (mutM2), proteína quinase PknG
e Fosfolipase D de C. pseudotuberculosis, todas contendo His tag, foram expressas, purificadas
utilizando resina à base de níquel. Posteriormente, foram ainda, purificadas através de troca
iônica seguida de gel filtração. As proteínas foram submetidas a ensaios de cristalização e alguns
cristais iniciais indicam que o estudo é promissor. O refinamento das condições está em
andamento e sob intensa observação.
139
Figura 79. SDS-PAGE 12 % evidenciando purificações parciais de 3 proteínas envolvidas neste projeto. (MM)
Marcador molecular; (PknG): Proteína quinase PknG; (M1) Proteína DNA glicosilase mutM1. (M2) Proteína DNA
glicosilase mutM2.
Figura 80. SDS-PAGE 12 % evidenciando purificações da PLD e PknG. (M) Marcador molecular; (1): PLD. (2, 3,
4 e 5): Proteína quinase PknG.
140
Figura 81. Cristais iniciais de PknG, PLD e mutM2 de C. pseudotuberculosis.
141
15) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, M. J., et al. The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular
criteria for species demarcation. Archives of Virology, v. 149, p. 1045-1060, 2004.
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