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Proteínas
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Proteínas
Estruturas conformacionais
São resultantes das forças de ligação entre os diferentes segmentos da cadeia
polipeptídica e freqüentemente envolvem grupamentos funcionais das cadeias laterais.
Estrutura secundária
As rotações em torno das ligações adjacentes à ligação peptídica originam essencialmente
dois tipos de estrutura: as hélices e as folhas pregueadas.
Estabilização das conformações
Tanto as hélices como as folhas pregueadas são estabilizadas por pontes de hidrogênio
que se estabelecem entre o oxigênio do grupo carbonila (＞C=O) de determinados
aminoácidos e o hidrogênio do grupo amina (＞N-H) de outros aminoácidos.
Nas hélices, estes grupos pertencem à mesma cadeia polipeptídica (segmentos peptídicos
adjacentes); nas folhas pregueadas estes grupos pertencem a cadeias diferentes (ou à
mesma cadeia depois da cadeia ter se dobrado).
As estruturas dos diferentes aminoácidos influenciam a adoção, pela cadeia, de um
determinado tipo de estrutura secundária, isto é, existe uma correlação entre seqüência
e conformação.
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O ácido glutâmico, a alanina e a leucina dão principalmente origem à α hélices, enquanto
a valina e a isoleucina originam folhas β pregueadas.
Prolina, glicina e asparagina causam reversões na cadeia, através das qual a cadeia
polipeptídica dobra 180º.
Para a formação de α hélices (a mais freqüente, com 3,6 resíduos de aminoácidos) a
rotação ocorre no mesmo sentido; para a formação de folhas β pregueadas, os ângulos
de torção têm sinal contrário.
Ligações por pontes
de hidrogênio entre
resíduos da mesma
cadeia
As folhas β pregueadas são:
paralelas quando as cadeias
polipeptídicas estão
dispostas paralelamente no
mesmo sentido;
Ligações por
pontes de
hidrogênio
entre cadeias
ou segmentos
polipeptídicos
diferentes
antiparalelas quando estão
em sentidos opostos.
α hélice
Folha β pregueada
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Estrutura terciária
Este nível de estrutura corresponde à conformação tridimensional das cadeias
polipeptídicas e é fundamental para a atividade biológica.
Enquanto a estrutura secundária é determinada por interações de grupos R próximos
entre si, a estrutura terciária é conferida pela interação a longa distância na seqüência
de aminoácidos da cadeia.
Resíduos de aminoácidos muito distanciados uns dos outros, na seqüência, podem se
encontrar próximos devido aos enrolamentos e formar, desse modo, regiões
indispensáveis ao funcionamento da proteína - por exemplo, o centro ativo das enzimas.
Forças que estabilizam a estrutura
terciária
Pontes de hidrogênio entre grupos R
de resíduos pertencentes a alças
adjacentes
Atração iônica entre grupos R com
cargas elétricas opostas
Interações hidrofóbicas
Ligações dissulfeto
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Estrutura quaternária
Corresponde a associações, quase sempre reversíveis, mantidas por ligações fracas
(não covalente) entre várias cadeias polipeptídicas idênticas ou diferentes.
A estrutura quaternária designa o arranjo de subunidades polipeptídicas (monômeros).
A proteína é, portanto oligomérica sendo, por exemplo, um dímero se for constituída
por duas subunidades ou um tetrâmero se for constituída por quatro subunidades.
Observação: O número de cadeias polipeptídicas de uma proteína oligomérica pode ser avaliado
pela determinação do número de resíduos N-terminal existente na molécula de proteína.
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Estrutura da toxina diftérica
Apresenta segmentos em α−hélice, em folha
β-pregueada e sem estrutura regular.
Desnaturação
As proteínas sofrem desnaturação em decorrência de alterações na sua estrutura
conformacional.
Na desnaturação não ocorre o rompimento das ligações covalentes do esqueleto da
cadeia polipeptídica, ou seja, a estrutura primária da proteína é mantida. Entretanto,
as alterações no seu arranjo espacial resultam na perda da atividade biológica.
A desnaturação pode ser provocada por:
Calor
Valores extremos de pH
Solventes orgânicos (ex: etanol, acetona, etc.)
Solutos (ex: uréia, etc.)
Detergentes
Agitação vigorosa
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Classificação das
proteínas de
acordo com a
função biológica
Classe
Exemplo
Enzimas
Ribonucleases
Tripsina
Proteínas transportadoras
Hemoglobina
Lipoproteínas
Proteínas nutritivas e de reserva
Ovoalbumina (ovo)
Caseína (leite)
Proteínas contráteis ou de movimento
Actina
Miosina
Tubulina
Proteínas estruturais
Colágeno
Elastina
Queratina
Fibroína
Proteínas de defesa
Fibrinogênio
Trombina
Veneno de serpente
Toxinas bacterianas
Proteínas reguladoras
Insulina
Hormônio de crescimento
Repressores
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Classificação das proteínas de acordo com a forma
Proteínas globulares
Com cadeia(s) polipeptídica(s) fortemente
enrolada em forma globular ou esférica.
Usualmente solúvel em sistemas aquosos e
se difundem facilmente.
Proteínas globulares são quase todas as
enzimas, as proteínas de transporte, os
anticorpos e as proteínas de reserva
nutritiva.
Proteínas fibrosas
Com cadeia(s) polipeptídica(s) estendida ao
longo de um eixo. São insolúveis em água,
compridas e filamentosas. A maioria tem
função estrutural.
Proteínas fibrosas típicas são: a queratina,
o colágeno e a fibroína. Incluem, também,
as proteínas que participam de processos
contráteis como a actina e miosina.
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Composição em
aminoácidos de duas
proteínas
Os números representam
resíduos de cada aminoácido,
por molécula de proteína
Aminoácido
Citocromo
humano*
Quimotripsinogênio
bovino**
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Total
6
2
5
3
2
2
8
13
3
8
6
18
3
3
4
2
7
1
5
3
104
22
4
15
8
10
10
5
23
2
10
19
14
2
6
9
28
23
8
4
23
245
* proteína mitocondrial transportadora de elétrons.
** precursor inativo da enzima digestiva quimotripsina.
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Proteínas Conjugadas
Classe
Grupo prostético*
Exemplo
Lipoproteínas
Lipídeos
Lipoproteína do sangue
Glicoproteínas
Carboidratos
γ-globulina do sangue
Fosfoproteínas
Grupos fosfato
Caseína do leite
Hemoproteínas
Heme (ferroporfirina)
Hemoglobina
Flavoproteínas
Nucleotídeos de flavina
Desidrogenase succínica
Metaloproteínas
Ferro
Zinco
Ferritina
Desidrogenase alcoólica
* porção de uma proteína conjugada não constituída por aminoácidos.
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Características moleculares de algumas proteínas
Peso
Molecular
Nº. de
Resíduos
Nº. de
Cadeias
5.733
51
2*
Ribonuclease (pâncreas bovino)
12.640
124
1
Lisozima (clara de ovo)
13.930
129
1
Mioglobina (coração eqüino)
16.890
153
1
Quimotripsina (pâncreas bovino)
22.600
241
3*
Hemoglobina (humana)
64.500
574
4*
Albumina do soro (humana)
68.500
≈ 550
1
Hexoquinase (levedura)
96.000
≈ 800
4*
149.900
≈ 1.250
4*
1.000.000
≈ 8.300
≈ 40*
Insulina (bovina)
γ - globulina (cavalo)
Desidrogenase glutâmica (fígado bovino)
* proteínas oligoméricas (duas ou mais cadeias polipeptídicas).
Observação:
Peso molecular (proteínas simples) ÷ 110 = ≈ Número de resíduos de aminoácidos
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Trabalhando com proteínas
Para estudar uma proteína é necessário em primeiro lugar separar esta proteína das demais.
Uma preparação pura é essencial para que as propriedades e possíveis atividades possam ser
determinadas.
A fonte de uma proteína é geralmente um tecido ou célula microbiana. O primeiro passo é
romper a célula e liberar o material intracelular, numa solução chamada de extrato bruto.
Para o rompimento da célula são utilizadas técnicas como a homogeneização, sonicação (uso
de ondas sonoras), ciclos de congelamento e descongelamento, detergentes (se a proteína em
questão estiver solidamente acoplada a uma membrana), entre outras.
Após o rompimento, a centrifugação diferencial é utilizada para preparar frações sub-celulares
ou para isolar organelas específicas.
A seguir são utilizadas técnicas preliminares de separação de proteínas. Essas técnicas em
geral não resultarão em uma amostra pura, mas tem a importante tarefa de preparar o
homogenato bruto para procedimentos mais eficientes.
Os métodos clássicos para separação de proteínas utilizam propriedades que variam de uma
proteína para outra, como tamanho, carga e propriedades ligantes. Alguns métodos modernos
incluem clonagem de DNA e seqüenciamento genômico.
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Separação e Purificação de Proteínas
Homogeneização e
Centrifugação Diferencial
O homogeneizador é um tubo de
ensaio de parede espessa através do
qual passa um êmbolo bem ajustado.
A centrifugação diferencial é utilizada
para separar componentes celulares.
A técnica leva em consideração as
diferentes velocidades de
sedimentação de várias organelas de
diferentes formatos, tamanhos e
densidade em uma solução.
À medida que o homogenato celular
é submetido a forças centrífugas (g)
crescentes, diferentes componentes
celulares são precipitados.
Se a proteína desejada não se
encontra no precipitado, ele é
descartado e o sobrenadante
centrifugado a uma velocidade maior.
Se a proteína em questão for
solúvel, ao final do procedimento já
estará parcialmente purificada.
600 rpm
O tubo se
move
lentamente
para cima e
para baixo
enquanto o
pilão gira
Homogenato é peneirado
para remover o tecido
conjuntivo e os vasos
sanguíneos
pilão de
teflon
Centrifugar o homogenato a
600 g x 10 minutos
Homogenato de
tecido e sacarose
(moído em
tampão de
sacarose 0,25M)
Sobrenadante 1
Centrifugar sobrenadante
1 a 15.000 g x 5 minutos
Núcleos e células
não rompidas
Sobrenadante 2
Mitocôndrias,
lisossomos e
corpúsculos
Sobrenadante 3: fração solúvel
do citoplasma (citosol)
Ribossomos e microssomos,
fragmentos do retículo
endoplasmático, complexo
de Golgi e membrana
plasmática
Centrifugar
sobrenadante
2 a 100.000 g
x 60 minutos
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Técnicas preliminares de separação de proteínas
“Salting out”
As proteínas, contidas nas frações sub-celulares ou organelas, são freqüentemente submetidas
a uma purificação bruta com base na solubilidade. A solubilidade de proteínas é geralmente
diminuída em altas concentrações de sal, um efeito denominado “salting out” (adição de sal). A
adição de certos sais em altas quantidades pode precipitar seletivamente algumas proteínas,
enquanto outras permanecem em solução.
As proteínas apresentam solubilidades diferentes em compostos polares e iônicos, e
permanecem solúveis por causa da sua interação com a água.
Quando o sulfato de amônio, (NH4)2 SO4, (reagente mais utilizado nesta etapa) é adicionado a
uma solução de proteínas, uma parte da água é removida da proteína para formar ligações íondipolo com os sais. Com menos água disponível para hidratar as proteínas, elas começam a
interagir entre si por meio de ligações hidrofóbicas. A uma quantidade definida de sulfato de
amônio, um precipitado que contem proteínas é formado. Essas proteínas são centrifugadas e,
se forem proteínas contaminantes, são descartadas.
A seguir, mais sal é adicionado e um conjunto diferente de proteínas, que pode conter a
proteína em questão, precipitará. Este precipitado é coletado por centrifugação e guardado.
A quantidade de sulfato de amônio é normalmente medida em comparação com uma solução
saturada a 100%. Um procedimento comum consiste em levar a solução a cerca de 40% de
saturação e centrifugar o precipitado que se forma. Depois mais sal é adicionado ao
sobrenadante, normalmente a um nível de 60% a 70% de saturação, e o novo precipitado
formado é separado por centrifugação.
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Diálise
Uma membrana (tubo de diálise ou papel celofane) contendo a solução de proteína e
outros solutos permite que a água e solutos pequenos, como sais (NaCl; (NH4)2SO4;
etc.) e açúcares (glicose; etc.), passem livremente através dela. Não permite, porém,
a passagem de solutos grandes como as proteínas.
O tubo de diálise contendo a mistura de moléculas de proteína (azul) e de moléculas
pequenas (vermelhas) é imerso em um volume grande de solução tampão (a).
Como a membrana semipermeável permite a passagem apenas das moléculas pequenas,
sua concentração dentro e fora do tubo tende a se igualar (b).
Após várias trocas de tampão (c), restam apenas as moléculas de proteína dentro do tubo
de diálise (d).
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Métodos cromatográficos utilizados para purificação de proteínas
Coluna Cromatográfica - Diversos métodos de fracionamento de proteínas fazem uso de
coluna cromatográfica, e exploram as diferenças de carga, tamanho, especificidade de
ligação e outras propriedades das proteínas.
Os elementos padrões de uma coluna de
cromatografia incluem um material sólido e
poroso, a matriz, que preenche a coluna (fase
estacionária); e uma solução, a fase móvel, que
flui (ou elui) através da matriz.
A solução que atravessa a coluna é retirada na
base, o efluente, e é constantemente reposta no
topo a partir de um reservatório.
A solução de proteína a ser separada é assentada
no topo da coluna e atravessa a matriz sólida por
percolação. As proteínas migram através da
coluna e são retardadas em diferentes graus de
intensidade, de acordo com as diferentes
interações com o material da matriz.
Diferentes tipos de proteínas (A, B e C) irão
gradualmente se separando uma das outras,
formando bandas. A migração é mais rápida ou
mais devagar dependendo das propriedades
individuais das proteínas.
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Cromatografia de exclusão por tamanho
Separa proteínas de acordo com o tamanho e é também chamada de filtração em gel
ou peneira molecular.
A matriz é composta de partículas de gel com
ligações cruzadas contendo poros ou cavidades
de tamanho específico.
As partículas, normalmente em forma de esferas,
são polímeros de carboidratos, como a dextrana
(Sephadex) e a agarose (Sepharose), ou de
poliacrilamida (Bio-Gel)
A estrutura de ligação cruzada desses polímeros
produz poros no material. A extensão das
ligações cruzadas pode ser controlada para
selecionar um tamanho de poro desejado.
Uma mistura de proteínas é aplicada na coluna .
As proteínas com molécula pequena podem
penetrar no interior das esferas, porém as
proteínas maiores não o fazem.
À medida que o solvente flui pela coluna as
moléculas pequenas de proteína penetram nas
esferas e são retardadas.
As moléculas grandes de proteína emergem
primeiro da coluna.
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Cromatografia de troca iônica
Explora as diferenças e magnitudes da carga elétrica líquida de proteínas em um
determinado pH. A matriz é constituída por um polímero sintético (resina).
A resina de troca iônica é um ligante que pode
conter carga positiva ou negativa. Uma resina
carregada negativamente é um trocador catiônico
(+) e uma resina carregada positivamente é um
trocador aniônico (-).
A coluna é equilibrada com tampão de pH e força
iônica adequadas, desta forma, a resina de troca
se liga a contra-íons. Uma resina de troca catiônica
normalmente se liga a íons Na+ ou K+ e um
trocador aniônico normalmente se liga a íons Cl-.
Uma mistura de proteínas é assentada na coluna
para eluir através dela.
As proteínas com carga líquida oposta à carga
líquida do trocador ficarão na coluna, trocando de
lugar com os contra-íons ligados. As proteínas sem
carga líquida ou com carga líquida igual à do
trocador irão eluir.
Depois que todas as proteínas não ligadas são
eluídas, o eluente mudará para um tampão com
um pH que remova a carga nas proteínas ou para
um tampão com uma maior concentração de sal.
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Exemplo: Resina carregada com grupos sulfônicos
trocadora de cátions
A mistura de proteínas (ou de aminoácidos) deve estar em solução ácida. Portanto, são
cátions com carga líquida positiva, porém, com diferentes graus de ionização.
sítios aniônicos
partícula
de resina
+
NH3-CHR1-COOH
SO3 Na+
+
NH3-CHR2-COOH
NH3-CHR3-COOH
SO3 Na+
+
+
troca de cátions
NH3-CHR4-COOH
SO3 + NH3-CHR1-COOH
+ 2 Na+
SO3 + NH3-CHR3-COOH
Aminoácidos com maior carga positiva (lisina, arginina e histidina) deslocam, com mais
facilidade, o Na+ da resina e são ligados mais fortemente.
Aminoácidos com menor quantidade de carga positiva (ácidos glutâmico e aspártico) se ligam
com a menor intensidade.
Todos os demais aminoácidos têm quantidade intermediária de carga positiva.
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Cromatografia de Afinidade
Separa as proteínas por suas propriedades específicas de ligação.
A característica diferenciadora é o polímero da
matriz se unir de forma covalente a algum
composto, chamado de ligante, que se une
especificamente, também, à proteína desejada.
As outras proteínas da amostra, que não se ligam
à matriz, podem ser facilmente eluídas com
tampão.
A proteína ligada pode ser eluída da coluna ao
serem adicionadas altas concentrações do ligante
ao eluente, que compete pela ligação da proteína
com a fase estacionária. A proteína se une ao
ligante na fase móvel e é recuperada no efluente.
A interação proteína-ligante também pode ser
interrompida por uma solução contendo alta
concentração de sal, que enfraquece a ligação da
proteína ao ligante da matriz, interferindo com as
interações iônicas.
Exemplo: Se a função biológica de uma
proteína de interesse necessita de ATP, então,
usando-se ATP como ligante cria-se uma
afinidade com a matriz. Quando a solução de
proteínas se move através da coluna, as
proteínas dependentes de ATP (incluindo a
proteína de interesse) se ligam à matriz.
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Eletroforese
A eletroforese se baseia na movimentação de partículas em um campo elétrico, em
direção a um eletrodo de carga oposta.
Eletroforese em acetato de celulose
Uma mistura de proteínas (A, B e C) é
aplicada sobre uma tira de papel ou acetato
de celulose, umedecida com tampão de pH
conhecido.
A tira é colocada em um equipamento
apropriado e um campo elétrico é aplicado
ao sistema (a).
As proteínas migram de sua posição inicial
para os pólos, de acordo com a carga que
apresentam no pH do tampão utilizado (b).
Depois de algum tempo, a eletroforese é
interrompida e a posição das proteínas é
revelada (c).
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Pontos isoelétricos de algumas proteínas
Proteínas
Pepsina
pI
< 1,0
Proteínas
pI
Hemoglobina
6,8
Ovoalbumina
4,6
Mioglobina
7,0
Soroalbumina
4,9
Quimotripsinogênio
9,5
Urease
5,0
Citocromo C
10,7
β-lactoglobulina
5,2
Lisozima
11,0
γ-globulina
6,6
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Eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida
Uma molécula se desloca em uma velocidade proporcional à sua densidade de
carga total, tamanho e forma.
As amostras são aplicadas em poços na parte superior do gel. Moléculas carregadas
negativamente migram através da matriz do gel em direção ao ânodo, em resposta
ao campo elétrico aplicado. A mobilidade das moléculas pequenas é maior do que a
das grandes com a mesma densidade de carga.
Após a eletroforese, as moléculas
separadas são visualizadas por
meio de técnicas de coloração, de
fluorescência ou por técnicas
radiográficas.
O pH no gel deve ser alto o
suficiente de forma que
praticamente todas as proteínas
possuam carga líquida negativa e
se movam em direção ao ânodo
quando a voltagem é aplicada.
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Exemplo: Eletroforese em gel de poliacrilamida da purificação de uma proteína
de Escherichia coli.
A amostra é aplicada e uma corrente elétrica atravessa o meio. Após a separação das
proteínas, o gel é corado para revelar as posições das proteínas.
Diferentes amostras são
aplicadas em depressões (poços)
no topo do gel. As proteínas se
movem no gel quando um
campo elétrico é ligado.
As proteínas podem ser
visualizadas, após a eletroforese,
por tratamento do gel com um
corante (ex: Coomassie blue).
Cada banda no gel representa
uma proteína diferente,
proteínas menores se movem
mais rapidamente que as
proteínas maiores e são
localizadas próximo a base do
gel.
(a)
(b)
A primeira raia mostra uma série de padrões de proteínas de massa conhecida, que servem de
marcadores de peso molecular. As duas raias seguintes mostram a proteína antes e após a sua
síntese ser induzida. A quarta raia mostra a proteína no extrato celular bruto. As raias
subseqüentes mostram a proteína após sucessivas etapas de purificação. A proteína purificada é
uma cadeia polipeptídica (Mr ∼ 38.000).