Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Animal
Pesquisa e caracterização de mutações em genes
relacionados com o metabolismo do ferro em
indivíduos com hiperferritinemia grave
Vera Lúcia Viana Santos
Dissertação
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
2012
Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Animal
Pesquisa e caracterização de mutações em genes
relacionados com o metabolismo do ferro em
indivíduos com hiperferritinemia grave
Dissertação orientada por:
Doutora Maria Paula Duarte Faustino Gonçalves (Departamento de Genética Humana,
Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge)
Professora Doutora Ana Maria Viegas-Crespo (Departamento de Biologia Animal, Faculdade de
Ciências da Universidade de Lisboa)
Vera Lúcia Viana Santos
Dissertação
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
2012
Aos meus avós
Florêncio Viana, Alzira Viana e Emília Rosa
na esperança que se orgulhem de mim lá onde estão.
Agradecimentos
Gostaria de dirigir as primeiras palavras deste trabalho a todos os que, durante a sua
realização, me colocaram desafios e me disponibilizaram diversas formas de apoio, pelo que a
todos expresso o meu reconhecido agradecimento:
Ao Professor Doutor José Pereira Miguel, Presidente do Conselho Directivo do INSA, e ao
Doutor João Lavinha, coordenador da Unidade de Investigação e Desenvolvimento do
Departamento de Genética Humana do INSA, que autorizaram e permitiram a realização deste
trabalho.
À Doutora Paula Faustino, pela oportunidade de realizar este trabalho, por toda a sua
amabilidade, sabedoria, orientação e por me ter acolhido tão bem no seu grupo.
À Professora Doutora Ana Crespo pela disponibilidade demonstrada na qualidade de
orientadora interna.
Ao Bruno, pelas preciosas indicações e ensinamentos, por se ter mostrado sempre disponível e
por ter acompanhado o meu trabalho. O maior agradecimento é para ti.
Às minhas colegas de laboratório, à Andreia pela confiança que sempre depositou em mim e à
Rute pela disponibilidade para me ajudar.
Aos colegas do grupo de investigação em metabolismo do RNA pelos óptimos momentos que
passamos juntos.
Às minhas amigas, à Cláudia pela entreajuda e por estar sempre presente ao longo de todo o
trabalho. À Dany por ter estado sempre ao meu lado, nos bons e nos maus momentos, apesar
de haver um oceano a separar-nos. À Vanessa pela dedicação sem fim, ajuda e infinita
paciência para me escutar. Às três agradeço a amizade e imprescindível apoio. Sem vocês tinha
sido mais difícil.
Aos meus amigos Agri, André, Hugo, Mariazinha e Tixa por terem sido tolerantes em relação a
todas as minhas ausências.
À minha família em especial ao meu pai pelo incentivo e confiança que sempre depositou em
mim, e à minha mãe pelos valores que me incutiu ao longo da vida. A ambos agradeço o
esforço e os sonhos de que abdicaram em prol dos meus. Ao Miguel pela disponibilidade,
auxílio e amizade.
À minha irmã, por todo o amor, compreensão, amizade, preocupação e infindável apoio ao
longo da minha vida e deste trabalho. Obrigada por me fazeres acreditar que eu posso
alcançar o universo.
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Projecto FCT, PEst-OE/SAU/UI0009/2011.
i
Resumo
O Ferro desempenha um papel biológico muito importante nos organismos vivos. No entanto,
tanto o seu excesso como a sua deficiência no organismo humano estão associados a
consequências negativas para a saúde. A Hemocromatose Hereditária (HH) é dos distúrbios
genéticos mais comuns em indivíduos de ascendência Norte-Europeia. Caracteriza-se por uma
absorção excessiva de ferro a nível intestinal e sua consequente acumulação em vários órgãos.
As complicações mais frequentes da doença são cirrose hepática, carcinoma hepatocelular,
cardiomiopatias, diabetes, problemas endócrinos, artrite e hiperpigmentação da pele. O gene
HFE é o principal associado à patologia (HH clássica, tipo I). Os genótipos mais comuns são a
mutação C282Y em homozigotia e a heterozigotia composta desta com a mutação H63D. Têm
surgido evidências de que mutações noutros genes possam estar envolvidas nesta patologia.
Entre estes encontra-se o gene do Receptor 2 da Transferrina (TfR2) sendo a HH resultante
(Hemocromatose do tipo III) caracterizada por sintomas clínicos idênticos aos da forma
clássica. A Hemocromatose do tipo II, ou Hemocromatose Juvenil, é a forma mais grave da
doença devido ao facto da sobrecarga de ferro ocorrer a um ritmo mais acelerado levando a
problemas em idades jovens. Este tipo de HH ocorre devido a mutações no gene da
Hemojuvelina, HJV (HH do tipo 2A) ou no da Hepcidina (HAMP) (HH do tipo 2B).
O objectivo principal deste estudo consistiu na pesquisa e caracterização de mutações em
genes relacionados com o metabolismo do ferro (HFE, TfR2, HJV, HAMP, BMP-6), em 11
indivíduos com hiperferritinemia muito grave (ferritina sérica > 2500 μg/L), cujos fenótipos não
eram justificáveis pelos genótipos HFE apresentados. As sequências génicas foram
amplificadas por metodologias de PCR e a análise mutacional dos fragmentos amplificados foi
efectuada recorrendo à sequenciação automática. Nesta análise foram detectadas 9
alterações, sendo que 3 delas são identificadas pela primeira vez neste estudo (a P124L no
gene HJV, a c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A no gene BMP-6). Posteriormente foram
realizados estudos in silico às sequências proteicas de modo a identificar possíveis alterações a
nível estrutural recorrendo ao programa bioinformática PolyPhen-2 e aos modelos HumDiv e
HumVar. Para além disso, também se procedeu à análise do impacto das alterações
nucleotídicas a nível do splicing utilizando para esse fim o software Human Splicing Finder.
Foi possível através desta pesquisa justificar a sobrecarga em ferro em 2 dos indivíduos em
estudo. Num dos casos, colocamos a hipótese de que a conjugação da homozigotia para a
mutação C282Y em HFE e da alteração R752H em heterozigotia no gene TfR2 seja o motivo da
sobrecarga em ferro verificada. No outro caso, encontrou-se a alteração P124L em
heterozigotia no gene HJV, que em co-herança com a homozigotia para a alteração C282Y,
também poderá estar na origem da hiperferritinemia grave.
A HH não clássica é caracterizada por uma grande heterogeneidade genética, que traduz
mecanismos fisiológicos complexos inerentes à homeostase do ferro, ainda não
completamente conhecidos. Com este estudo contribuímos para aumentar o conhecimento
sobre a fisiopatologia deste tipo de Hemocromatose e esclarecemos as relações
genótipo/fenótipo nalguns dos casos estudados.
Palavras-chave: Ferro; Hemocromatose Hereditária; Hiperferritinemia; HFE; TfR2; HJV; HAMP;
BMP-6;
ii
Abstract
Iron plays a very important role in biological organisms. However, its excess and deficiency in
the human body are both associated with negative health consequences. Hereditary
Haemochromatosis (HH) is an autossomal recessive disorder commonly found in Caucasians of
Northern European ancestry. It is characterized by an increased intestinal iron absorption and
subsequent accumulation on several organs, resulting in tissue damage. Hepatic cirrhosis,
hepatocellular carcinoma, cardiomyopathy, diabetes, endocrine abnormalities, arthritis and
skin hyperpigmentation are some examples of the most frequent clinical manifestations. HFE
gene is the main gene associated to the disease (HH type I). The most common genotypes
found in HH patients are the homozygosity for the C282Y mutation or its compound
heterozigosity with the H63D mutation. Some studies have shown that there are HH cases
without mutations in the HFE gene, where other iron metabolism related genes are involved.
Among these, is the Transferrin Receptor 2 gene (TfR2) which is associated with HH type III,
characterized by clinical symptoms similar to the ones observed with the classical HH. On other
hand, HH type II, also named juvenile haemochromatosis is a severe form of the disease,
where iron overload occurs faster and the patients present cardiomyopathy and/or endocrine
abnormalities at young age. This type of HH is the result of mutations in the hemojuveline
(HJV) (HH type 2A) or hepcidin (HAMP) (HH type 2B) genes.
The main aim of this study was to perform a mutational screening in 5 genes related with iron
metabolism (HFE, TfR2, HJV, HAMP, BMP-6) in 11 individuals presenting severe
hyperferritinemia (serum ferritin level > 2500 μg/L), whose phenotypes were not justified by
HFE genotypes. It was also intended the characterization of the mutations newly found. Gene
sequences were amplified by PCR methodologies and mutational analysis of amplified
fragments was performed by automated sequencing. In this analysis we detected 9 DNA
alterations, 3 of them reported for the first time in this study (P124L in the HJV gene, c.1281197 T→C and c.1542+4 G→A in BMP-6 gene). In silico studies were performed in order to
identify possible changes at protein structural level using the bioinformatics program
PolyPhen-2 and HumDiv e HumVar models. Furthermore, the impact of nucleotide changes at
the splicing level was also explored using the Human Splicing Finder software.
Through this study was possible to justify the iron overload in 2 of the individuals analyzed. In
one case, we put the hypothesis that the combination of homozygosity for the mutation C282Y
in HFE and the heterozygosity for the R752H in TfR2 gene is the reason for the observed iron
overload. In another case, we found one change in heterozygosity, P124L in HJV gene that coinheritance with homozygosity for the C282Y in HFE, can also be the cause of severe
hyperferritinemia.
The nonclassical HH is characterized by a large genetic heterogeneity, which translates into
complex physiological mechanisms involved in iron homeostasis, some of them still unclear.
This study was intended to contribute to increase knowledge of the pathophysiology of this
type of haemochromatosis.
Keywords: Iron; hereditary hemochromatosis; hyperferritinemia; HFE; TfR2; HJV; HAMP; BMP6;
iii
Índice geral
Páginas
Agradecimentos
Resumo
Abstract
Índice geral
Índice de Figuras
Índice de Tabelas
Abreviaturas e Notações
i
ii
iii
iv
vi
viii
x
I-Introdução
I.1-Ferro
I.2-Metabolismo do ferro
I.2.1-Absorção
I.2.2-Transporte, distribuição e armazenamento
I.2.3-Homeostase do ferro
I.2.3.1-Regulação intracelular
I.2.3.2-Regulação sistémica
I.3-Alterações patológicas no metabolismo do ferro
I.3.1-Diferentes tipos de Hemocromatose Hereditária e sua base molecular
I.3.1.1-Hemocromatose do tipo I
I.3.1.2-Hemocromatose do tipo II ou Hemocromatose Juvenil
I.3.1.3-Hemocromatose do tipo III
I.3.1.4-Hemocromatose do tipo IV ou Doença da Ferroportina
I.3.2-Diagnóstico
I.3.3-Tratamento
1
2
3
3
4
6
6
6
9
11
12
15
17
18
19
20
II-Objectivos
21
III-Materiais e Métodos
III.1-População estudada
III.1.1-Critérios de selecção da amostra
III.1.2-Obtenção de material genético
III.2-Reacção em cadeira da polimerase (PCR)
III.2.1-Amplificação por PCR de regiões dos genes em estudo
III.3-Electroforese em gel de agarose
III.4-Purificação dos produtos de amplificação
III.5-Sequenciação dos produtos purificados
III.6-Análise bioinformática
III.6.1-Análise das sequências nucleotídicas
III.6.2-Análise das alterações a nível proteico
III.6.3-Análise do impacto das alterações nucleotídicas a nível do splicing
23
24
24
24
24
24
31
32
32
33
34
34
34
IV-Resultados
IV.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro
IV.2-Pesquisa de alterações no gene HJV
IV.2.1-Alteração P124L
IV.2.1.1-Estudo do impacto da alteração P124L na proteína HJV
35
36
37
37
38
iv
IV.2.1.2-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
IV.3-Pesquisa de alterações no gene BMP-6
IV.3.1-Alteração c.857+12 C→T
IV.3.1.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
IV.3.2- Alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C
IV.3.2.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing
IV.3.3-Alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C
IV.3.3.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing
IV.3.4-Alteração c.1542+4 G→A
IV.3.4.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
IV.4-Pesquisa de alterações no gene TfR2
IV.4.1-Alteração c.1851 C→T
IV.4.1.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
IV.4.2-Alteração R752H
VI.4.2.1-Estudo do impacto da alteração R752H na proteína TfR2
IV.4.2.2-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
38
39
39
40
41
42
43
45
46
47
47
47
48
48
49
50
V-Discussão dos Resultados
V.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro
V.2- Discussão da relação genótipo / fenótipo nos diversos casos analisados
V.2.1-Caso 1
V.2.2-Caso 2
V.2.3-Caso 4
V.2.4-Caso 10
V.2.5-Caso 11
V.2.6-Casos onde não se detectaram alterações nos genes analisados
52
53
54
54
57
58
59
59
59
VI-Conclusão
61
VII-Referências Bibliográficas
64
VIII-Anexos
70
v
Índice de Figuras
Páginas
Figura I.1: Regulação da absorção intestinal de ferro.
4
Figura I.2: Distribuição do ferro no organismo humano adulto.
5
Figura I.3: Homeostase do ferro.
8
Figura I.4: Base genética e gravidade dos fenótipos comuns de hemocromatose.
12
Figura I.5: Estrutura do gene HFE, respectivo mRNA e proteína.
13
Figura I.6: Representação esquemática de mutações descritas no gene HFE.
15
Figura I.7: Representação esquemática de mutações descritas no gene HJV.
16
Figura I.8: Representação esquemática de mutações descritas no gene HAMP.
17
Figura I.9: Representação esquemática de mutações descritas no gene TfR2.
18
Figura I.10: Representação esquemática de mutações descritas no gene SLC40A1.
18
Figura III.11: Marcadores de massa molecular.
32
Figura IV.12: Detecção e identificação da mutação P124L no exão 3 do gene HJV
37
Figura IV.13: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína HJV de 10 espécies
de mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2.
38
Figura IV.14: Previsão da patogenicidade da alteração P124L na proteína HJV através do 38
programa Polyphen-2.
Figura IV.15: Detecção e identificação da alteração c.857+12 C→T a jusante do exão 2 do 39
gene BMP-6.
Figura IV.16: Detecção e identificação das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no gene 41
BMP-6.
Figura IV.17: Detecção e identificação das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C 44
no gene BMP-6.
Figura IV.18: Detecção e identificação das alterações c.1542+4 G→A no gene BMP-6.
46
Figura IV.19: Detecção e identificação da alteração c.1851 C→T no exão 16 do gene TfR2. 47
Figura IV.20: Detecção e identificação da alteração R752H no exão 18 do gene TfR2.
49
Figura VI.21: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína TfR2 de 10 50
espécies de mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2.
vi
Figura IV.22: Previsão da patogenicidade da alteração R752H na proteína TfR2 através 50
do programa Polyphen-2.
Figura V.23: Esquema representativo dos genes estudados e da localização das 53
alterações encontradas.
vii
Índice de Tabelas
Páginas
Tabela I.1: Classificação genética da Hemocromatose
10
Tabela III.2: Regiões dos genes estudadas
25
Tabela III.3: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR 25
para os exões do gene HFE
Tabela III.4: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR 26
para os exões do gene TfR2
Tabela III.5: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR 26
para os exões do gene HJV
Tabela III.6: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR 27
para os exões do gene HAMP
Tabela III.7: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR 27
para os exões do gene BMP-6
Tabela III.8: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HFE e 28
respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Tabela III.9: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene TfR2 e 28
respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Tabela III.10: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HJV e 29
respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Tabela III.11: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HAMP 29
e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Tabela III.12: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene BMP- 29
6 e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Tabela III.13: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HFE
30
Tabela III.14: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene TfR2
30
Tabela III.15: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HJV
30
Tabela III.16: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HAMP
31
Tabela III.17: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene BMP-6
31
Tabela III.18: Condições laboratoriais utilizados por cada reacção para a sequenciação 33
automática
viii
Tabela III.19: Condições de PCR para a sequenciação automática
33
Tabela IV.20 Características dos indivíduos em estudo, genótipo HFE e outros genes 36
onde foram detectadas alterações
Tabela IV.21: Descrição do efeito da alteração c.371 C→T no splicing do RNA de HJV
39
Tabela IV.22: Descrição do efeito da alteração c.857+12 C→T no splicing do RNA de 40
BMP-6
Tabela IV.23: Descrição do efeito das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no splicing 43
do RNA de BMP-6
Tabela IV.24: Descrição do efeito das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no 46
splicing do RNA de BMP-6
Tabela IV.25: Descrição do efeito da alteração c.1542+4 G→A no splicing do RNA de 47
BMP-6
Tabela IV.26: Descrição do efeito da alteração c.1851 C→T no splicing do RNA de TfR2
48
Tabela VI.27: Descrição do efeito da alteração c.2255 G→A no splicing do RNA de TfR2
51
Tabela V.28: Alterações moleculares identificadas neste estudo
54
ix
Abreviaturas e Notações
A
Adenina
β2-M
Beta-2-Microglobulina
BMP-6
Proteína morfogenética do osso-6 (Bone morphogenic protein-6)
C
Citosina
Cp
Ceruloplasmina
DCYTB
Citocromo b duodenal (Duodenal cytochrome b)
DMT1
Transportador de metais divalentes 1 (Divalent metal transporter-1)
DNA
Ácido desoxirribonucleico
EtBr
Brometo de Etídeo
Fe
Símbolo químico do ferro
Fe2+
Forma ferrosa de ferro
Fe3+
Forma férrica de ferro
Fe2Tf
Transferrina associada ao ferro
FPN-1
Ferroportina 1
Ft
Ferritina
G
Guanina
HAMP
Hepcidina (Hepcidin anti-microbial peptide)
HCP
Proteína transportadora de ferro hémico
HFE
High Fe ou Fe elevado
HH
Hemocromatose Hereditária
HJ
Hemocromatose Juvenil
HJV
Hemojuvelina
Hp
Hefastina
INSA
Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge
IREs
Elemento de resposta ao ferro (Iron Responsive Elements)
IRPs
Proteína reguladora do ferro (Iron Regultory Proteins)
IVS
Intrão
MHC I
Complexo maior de histocompatibilidade classe I
x
RNA
Ácido ribonucleico
mRNA
RNA mensageiro
pb
Pares de bases
PCR
Reacção em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction)
p/v
Percentagem expressa em peso por volume
ROS
Espécies reactivas de oxigénio (Reactive oxygen species)
SLC40A1
Gene da ferroportina (Solute carrier family 40 member 1)
SNP
Polimorfismo de um nucleótido (Single-nucleotide polymorphism)
T
Timina
Tf
Transferrina
TfR1
Receptor 1 da transferrina
TfR2
Receptor 2 da transferrina
V
Volts
xi
I-Introdução
I-Introdução
I.1-Ferro
O Ferro (Fe) tem um papel biológico muito importante nos organismos vivos. É um
micronutriente essencial mas potencialmente perigoso (Andrews and Schmidt, 2007). Trata-se
do metal mais abundante na crosta terrestre, estando tanto o seu excesso como a sua
deficiência no organismo humano associados a consequências negativas para a saúde (Aisen et
al., 2001).
A maioria das células utiliza o ferro como co-factor em processos bioquímicos. É fundamental
no transporte de oxigénio e na síntese de DNA, sendo também essencial no metabolismo
celular (Wang and Pantopoulos, 2011). A utilidade deste deve-se a uma coordenação química
flexível e à sua capacidade redox, permitindo a associação a proteínas e ligação a moléculas de
oxigénio, possibilitando também a transferência de electrões e a mediação de reacções de
catálise. O ferro pode encontrar-se em solução na forma ferrosa (Fe2+) ou na forma férrica
(Fe3+), sendo a troca de electrões entre estas duas formas o que lhe confere o potencial redox
(Aisen et al., 2001).
Apesar de muito abundante a maior parte do ferro encontra-se na forma Fe3+, a qual é
praticamente insolúvel em água a pH neutro. Assim sendo, de forma a tornar possível a sua
utilização, os organismos vivos evoluíram sistemas complexos de transporte e distribuição,
bem como uma homeostase sujeita a um controlo interno (Andrews and Schmidt, 2007). A
troca de electrões é essencial para as reacções redox que ocorrem a nível celular. Contudo,
esta capacidade de troca electrónica potencia a formação de espécies reactivas de oxigénio
(ROS) que aumentam o stresse oxidativo comummente associado a danos celulares (Garrick,
2011), dado estas possuírem a capacidade de danificar moléculas biológicas como os lípidos,
carbohidratos, proteínas e ácidos nucleicos (Roy and Enns, 2000).
A alimentação humana fornece duas formas de ferro, o hémico e o não hémico. O primeiro
encontra-se na carne e é facilmente absorvido, graças à acção de enzimas pancreáticas que
libertam o grupo heme da molécula de globina no lúmen intestinal. O ferro não hémico está
presente essencialmente em cereais, grãos e em alguns vegetais, e é menos absorvido que o
hémico (Johnson-Wimbley and Graham, 2011). A fracção mais importante do ferro celular
encontra-se associada a proteínas na forma hémica. De entre estas, as hemoproteínas mais
comuns são a hemoglobina e a mioglobina que transportam oxigénio, respectivamente, no
sangue e nos músculos. O ferro não hémico encontra-se sobretudo em metaloproteínas, as
quais desempenham diversos papéis funcionais desde a transferência de electrões à catálise
(Papanikolaou and Pantopoulos, 2005).
O organismo humano adulto contém cerca de 3 a 4 g de ferro. Diariamente são absorvidas a
partir da dieta alimentar entre 1 a 2 mg de modo a compensar as perdas diárias ocorridas pela
transpiração, descamação das células epiteliais e por processos hemorrágicos (Zhang and Enns,
2009). Não existe nenhuma via de excreção eficaz deste metal, deste modo um organismo
saudável deverá ter a capacidade de avaliar a sua quantidade de ferro interna e de responder
adequadamente às suas oscilações, alterando os processos de absorção e de acumulação, pois
a ausência de resposta ou respostas indevidas podem levar ao aparecimento de diversas
patologias (Roy and Enns, 2000).
-2-
I-Introdução
I.2-Metabolismo do Ferro
I.2.1-Absorção
Em mamíferos, o ferro da dieta é absorvido no duodeno ao nível dos enterócitos (Figura I.1). A
absorção ocorre em dois passos principais: absorção pela membrana apical e transferência
para a corrente sanguínea através da membrana basolateral (Fleming and Sly, 2002).
O ferro não hémico absorvido a partir dos alimentos encontra-se maioritariamente na forma
Fe3+ sendo necessária a sua redução à forma Fe2+. Esta redução ocorre devido à acção de uma
reductase férrica denominada citocromo b duodenal (DCYTB) expressa nas vilosidades do
lúmen intestinal, na zona do duodeno. Assim sendo, esta reductase é o primeiro elemento
importante na absorção do ferro. A sua expressão aumenta em resposta à carência e níveis
baixos de ferro e hipoxia (Mckie et al., 2001). Por outro lado, a absorção do ferro hémico
parece ser mediada por uma proteína transportadora (HCP) expressa ao nível dos enterócitos
intestinais. Este receptor foi descrito recentemente e quando alterado parece modificar a
absorção do ferro que se encontra nesta forma. Quando a expressão deste transportador é
aumentada como resultado de hipóxia ou deficiência em ferro verifica-se consequentemente
um aumento dos níveis de ferro no organismo (Shayeghi et al., 2005; Wang et al., 2010).
O transportador de metais divalente 1 (DMT1) é responsável pela entrada dos iões Fe2+ do
lúmen intestinal para a mucosa requerendo um pH baixo para funcionar (Gunshin et al., 2005).
Após a entrada na célula o Fe2+ pode ser armazenado intracelularmente na forma de ferritina
(Ft) (esta acomoda até 4500 átomos de Fe3+ por molécula), ou pode atravessar o enterócito até
à zona basolateral onde se localiza a proteína ferroportina-1 (FPN-1), responsável pela saída de
ferro da célula e a sua entrada em circulação (Garrick, 2011). O ferro que é retido na Ft
endotelial é perdido após 2 ou 3 dias para o lúmen intestinal por processos de descamação
(Andrews and Schmidt, 2007).
A FPN-1 parece ser o único exportador de ferro nas células duodenais, assim como nos
macrófagos, hepatócitos e nos trofoblástos sinciciais da placenta. A exportação de ferro pela
FPN-1 depende da interacção de duas oxidases: ceruloplasmina (Cp) presente em circulação e
hefastina (Hp) localizada na membrana basolateral dos enterócitos. Estas são responsáveis
pela conversão de Fe2+ em Fe3+ que será depois incorporado na transferrina (Tf) (Zhang and
Enns, 2009). Esta proteína existente em circulação tem elevada afinidade com o ferro, sendo a
responsável pelo seu transporte a nível sistémico (Zhang and Enns, 2009; Johnson-Wimbley
and Graham, 2011)
-3-
I-Introdução
Figura I.1: Regulação da absorção intestinal de ferro. O ferro hémico é absorvido pela proteína
2+
transportadora de ferro hémico (HCP), sofre endocitose, e o Fe é libertado dentro do endossoma ou
2+
3+
3+
2+
lisossoma. A porção de ferro não hémico inclui Fe e Fe . O Fe é reduzido a Fe pelo ácido ascórbico
no lúmen intestinal ou por ferroreductases, onde se inclui a citocromo b duodenal (DCYTB). Na
2+
membrana apical, o meio ácido potencia a passagem do Fe para o enterócito através do transportador
de metais divalente 1 (DMT1). Na membrana basolateral, a passagem do ferro para a transferrina (Tf)
em circulação é mediado pela ferroportina 1 (FPN-1) em associação com a hefastina (Hp). A hepcidina
tem afinidade para a FPN-1, causando a sua internalização e degradação levando a uma diminuição da
exportação do ferro para o sangue. O ferro que não é transferido para a circulação é armazenado no
enterócito sob a forma de ferritina (Adaptado de Zimmermann and Hurrell, 2007).
I.2.2-Transporte, distribuição e armazenamento
A maioria das células do organismo adquire/liberta ferro recorrendo ao “ciclo da transferrina”
(Garrick, 2011). O fluxo deste elemento do interior dos enterócitos para o sangue ocorre
através da membrana basolateral e é mediado pela FPN-1. O ferro é, posteriormente, oxidado
pela Hp e Cp entrando em circulação ligado à Tf (Fe2Tf). Este complexo é então distribuído pelo
organismo de acordo com as necessidades celulares (Papanikolaou and Pantopoulos, 2005;
Zimmermann and Hurrell, 2007). A Tf tem elevada afinidade com o ferro em circunstâncias
homeostáticas e é a proteína responsável pelo seu transporte em circulação. A Ft armazena-o
em altas concentrações mantendo-o sem acesso a substratos que levem à formação de ROS.
Em humanos sem patologias associadas ao metabolismo do ferro, cerca de 30% dos locais da
transferrina plasmática com função de ligação ao ferro estão ocupados (Andrews and Schmidt,
2007; Li et al., 2010).
O complexo Fe2Tf é distribuído na corrente sanguínea, ligando-se posteriormente ao receptor
1 da transferrina (TfR1), expresso na superfície celular. O complexo Fe2Tf-TfR1 entra nas
células por endocitose, a acidificação do endossoma provoca a dissociação do Fe3+ do
complexo Tf-TfR1 (Garrick, 2011). O ferro é depois libertado para o citoplasma da célula por
intermédio do DMT1 presente na membrada do endossoma, enquanto a Tf livre e o TfR1 são
recicladas para a superfície celular. O ferro que entra nas células eritróides é direccionado para
-4-
I-Introdução
as mitocôndrias onde é incorporado na protoporfirina originando grupos heme. Nos outros
tipos celulares é armazenado como ferritina e hemosiderina (Andrews, 1999).
Um homem adulto tem normalmente entre 35 a 45 mg de ferro por quilograma de massa
corporal. Nas mulheres esse valor é geralmente menor devido às perdas de sangue
decorrentes da menstruação. No organismo humano, mais de dois terços do ferro é utilizado
pela eritropoiese. As reservas no organismo estão maioritariamente localizadas nos
hepatócitos e nos macrófagos reticuloendoteliais. Estes últimos fagocitam os eritrócitos
senescentes armazenando o ferro que fica disponível para ser posteriormente reutilizado. Esta
reciclagem é muito importante dado que a eritropoiese requer cerca de 20 mg de ferro
diariamente, mas só 1 a 2 mg são normalmente absorvidas por dia através do duodeno (Figura
I.2) (Roy and Enns, 2000; Frazer et al., 2003).
Figura I.2: Distribuição do ferro no organismo humano adulto. Devido a processos como a descamação
da pele é perdido ferro diariamente, sendo a reposição efectuada por absorção diária de cerca de 1 a
2mg proveniente da alimentação. A maior parte do ferro que está em circulação encontra-se ligada à
hemoglobina. A reciclagem do ferro presente nos eritrócitos senescentes mediado pelos macrófagos é
crucial para manter os níveis de ferro. Os maiores reservatórios de ferro são o fígado, os macrófagos
reticuloendoteliais e o tecido muscular (Adaptado de Andrews, 1999).
-5-
I-Introdução
I.2.3-Homeostase do ferro
O facto de não existir uma via de excreção eficiente de ferro do organismo, faz com que a
quantidade que é absorvida a partir da alimentação e as perdas que ocorrem estejam sujeitas
a um crítico processo de regulação a fim de manter a homeostasia (Andrews, 1999). Em
indivíduos saudáveis, o sistema de manutenção da homeostase é responsável pela regulação
da requisição, absorção, acumulação e controlo das reservas deste elemento. No entanto, a
absorção em humanos parece assumir o papel mais importante na regulação do balanço do
ferro do que a sua eliminação (Finch, 1994). A homeostase do ferro é regulada através de dois
mecanismos: um intracelular, consoante a quantidade de ferro que a célula possui, e outro
sistémico, onde a hepcidina tem um papel muito importante.
I.2.3.1-Regulação intracelular
Relativamente à regulação intracelular, de forma a evitar o excesso ou deficiência de ferro no
interior da célula, existem proteínas reguladoras as proteínas reguladoras do ferro (IRPs) que
controlam a expressão pós-transcricional de alguns genes envolvidos no metabolismo do ferro
através de elementos de resposta ao ferro (IREs). Estes elementos em hairpin estão localizados
nas regiões não transcritas (5´-UTR ou 3´-UTR) de vários RNA mensageiros (mRNAs) que
codificam proteínas envolvidas no metabolismo do ferro. Os IREs são reconhecidos pelas
proteínas IRPs e controlam a transcrição dos genes, a estabilidade ou a tradução dos mRNAs.
Assim os genes que possuem estas estruturas são directamente regulados pelo ferro
(Campillos et al., 2010; Arora, 2012). As interacções IRE/IRP regulam o nível de expressão de
mRNAs que codificam para proteínas necessárias à aquisição (TfR1, DMT1), armazenamento
(Ft), utilização e exportação de ferro (Muckenthaler et al., 2008).
Quando existe deficiência deste elemento na célula, as IRPs ligam-se aos IREs que são
sequências altamente conservadas e que se encontram nas regiões 3´ ou 5´ do mRNA. Se os
IREs estão na extremidade 3´ do mRNA, quando se ligam as IRPs, estas protegem o mRNA da
degradação e promovem a síntese proteica (ex. do TfR1), promovendo uma maior absorção de
ferro pela célula; simultaneamente a ligação IRPs aos IREs na extremidade 5´ do mRNA
(exemplo da ferritina) impedem a sua tradução, diminuindo assim o armazenamento de ferro
na célula. Quando existe excesso de ferro no interior das células, as IRPs são inactivadas, a não
ligação dos IRPs ao IRE na extremidade 5´ do mRNA favorece a síntese da proteína (exemplo da
ferritina), enquanto na extremidade 3´ bloqueia a tradução (ex TfR), diminuindo assim a
absorção de ferro pela célula (Muckenthaler et al., 2008; Arora, 2012).
I.2.3.2-Regulação sistémica
O primeiro fenómeno de regulação na absorção do ferro ocorre a nível do duodeno e é o
chamado “bloqueio da mucosa”. Após a ingestão de uma grande quantidade de alimentos
ricos em ferro e consequente aumento do seu nível nos enterócitos, a absorção deste
elemento pelo intestino é activamente reduzida passadas algumas horas. Esta diminuição da
absorção ocorre devido a uma rápida diminuição no nível de mRNA do DCYTB e do DMT1.
Desta forma, os elementos transportadores de ferro são inversamente regulados pelo nível
deste nos enterócitos, podendo existir um bloqueio da absorção directamente no lúmen
-6-
I-Introdução
intestinal e na membrana basolateral nos enterócitos duodenais, caso seja detectado um
excesso de ferro (Frazer et al., 2003).
Existe outro mecanismo de regulação do ferro que é denominado “regulação das reservas”.
Neste caso, a absorção deste elemento da dieta ocorre de acordo com as reservas do
organismo. Em situações de escassez a absorção pode triplicar, no entanto quando os níveis
regularizam, a absorção retorna ao normal em alguns dias, de forma a impedir que venha a
ocorrer um excesso de ferro no organismo. O funcionamento desta via de regulação implica a
sinalização entre o fígado, músculos e o intestino. Esse mecanismo não está completamente
entendido e tem sido proposto que requer a programação de percursores das células das
criptas do epitélio intestinal após a detecção da saturação da transferrina plasmática (Taylor et
al., 1988; Roy and Enns, 2000).
Finalmente a absorção de ferro pode ainda ser controlada por outro sinal, conhecido como
“regulador de eritropoiese”. Este sinal é muito importante na regulação da absorção porque a
maioria do ferro no organismo é utilizado neste processo. Assim sendo, a regulação pela
eritropoiese é mais eficiente para aumentar a absorção deste elemento do que a “regulação
das reservas” (Andrews, 1999; Papanikolaou and Pantopoulos, 2005) acima descrita. A
natureza deste mecanismo, ainda não está completamente esclarecido, no entanto, sabe-se
que está relacionado com a síntese de hepcidina. Este sinal é assim, sensível a mudanças na
taxa de eritropoiese, levando um aumento da taxa a uma diminuição da produção de
hepcidina (Fried, 2009).
Tal como referido anteriormente, a ausência de um mecanismo específico para eliminar o
excesso de ferro exige que exista uma fina comunicação entre os locais de absorção, utilização
e armazenamento. O elemento primordial desta regulação sistémica é a hormona hepcidina
produzida no fígado (Hentze et al., 2010). Esta é codificada pelo gene HAMP localizado no
braço longo do cromossoma 19 (19q13.1) (Ganz, 2003) e é secretada a partir do fígado pelos
hepatócitos (Peslova et al., 2009).
A hepcidina é o regulador central do ferro e a sua produção nos hepatócitos varia em resposta
ao aumento da quantidade deste elemento no organismo, assim como em caso de inflamação,
infecção, anemia, hipóxia e aumento da taxa de eritropoiese (Camaschella and Silvestri, 2011).
A deficiência na quantidade desta hormona é responsável por sobrecarga de ferro, enquanto o
seu excesso leva ao aparecimento de anemia (Babitt et al., 2006).
Quando os níveis de ferro no organismo são elevados, o aumento de hepcidina em circulação
promove a sua interacção com a FPN-1, levando primeiro à internalização desta e à sua
posterior degradação proteolítica. Desta forma é impedida a libertação de ferro dos
hepatócitos, macrófagos e enterócitos (Dunn et al., 2007). Essa perda de FPN-1 na superfície
celular conduz a uma redução da exportação de ferro das células, aumentando a sua
concentração intracelular (Zhang and Enns, 2009). Assim, a hepcidina controla a absorção
intestinal e a libertação de ferro dos macrófagos para o plasma num processo de retroacção
negativa (Dunn et al., 2007). Para além da acção sobre a FPN-1, a hepcidina regula ainda
negativamente o DMT1 duodenal, impedindo a entrada de ferro para os enterócitos (Mena et
al., 2008) (Figura I.3).
-7-
I-Introdução
Em condições fisiológicas, a expressão de hepcidina nos hepatócitos é regulada por um
conjunto de proteínas também expressas nestas células como a HFE (High Fe ou Fe elevado),
receptor 2 da transferrina (TfR2), hemojuvelina (HJV), proteínas morfogénicas do osso (BMP),
matriptase-2, entre outras (Zhang and Enns, 2009). Estas proteínas, expressas à superfície
celular, têm a capacidade de activar várias vias de transdução de sinal, incluindo as vias BMPSMAD, JAK-STAT e HIF1 que culminam com a alteração da transcrição do gene HAMP. Destas a
BMP-SMAD parece ser particularmente importante e perturbações nestas vias vão abolir a
resposta da hepcidina a diversos estímulos. A HJV é membro de uma família de proteínas que
funciona como co-receptor para as proteínas BMP. Esta liga-se a receptores do tipo BMP-1 e
por estimulação com outras BMPs que melhoram a fosforilação da SMAD1/5/8. Essas SMADs
activadas formam complexos que se movem até ao núcleo das células onde podem estimular a
expressão de hepcidina (Darshan and Anderson, 2009) (Figura I.3).
Figura I.3: Homeostase do ferro. Quando os níveis de ferro no organismo são elevados, proteínas como
a HFE, Hemojuvelina (HJV) e o Receptor 2 da Transferrina (TfR2) aumentam a expressão hepática de
hepcidina. A HJV actua como co-receptor para os ligandos BMP que activam a via de sinalização SMAD
induzindo a expressão da hepcidina. A via pela qual a HFE e a TfR2 induzem a expressão da hepcidina
continua por esclarecer (marcada na figura a tracejado). A infecção e inflamação aumentam o nível de
citocinas, como a interleucina-6 (IL-6) que estimulam a expressão de hepcidina. Esta liga-se
posteriormente à FPN1 na superfície de macrófagos, enterócitos e hepatócitos. O complexo é depois
internalizado e degradado, diminuindo a libertação de ferro das células e reduzindo a sua absorção no
intestino. A hepcidina também diminui a expressão de proteínas envolvidas na absorção de ferro no
intestino, como o DCYTB, o DMT1. Em contraste, o aumento da actividade eritropoiética suprime a
expressão da hepcidina, assim como estados de anemia e hipóxia. Na figura, as linhas sólidas indicam as
vias de transdução de sinal conhecidas, a tracejado estão indicadas as vias ainda não completamente
esclarecidas (Adaptado de Dunn et al., 2007)
Tal como referido, a expressão de hepcidina é regulada em parte por BMPs, (Babitt et al.,
2006) tendo sido os níveis de mRNA do BMP-6 associados a alterações nas concentrações de
mRNA do gene HAMP (Kautz et al., 2008). Esta associação foi confirmada através da
observação de ratinhos em que o gene BMP-6 foi desactivado e onde se verificou um aumento
significativo da quantidade de ferro no fígado e noutros órgãos. Nesses casos, verificou-se a
-8-
I-Introdução
presença de outras moléculas BMPs, mas que não compensaram a ausência de BMP-6,
sugerindo assim que a função regulatória do ferro é exclusiva da proteína BMP-6, entre o
grupo das BMPs (Andriopoulos et al., 2009). A observação de que o excesso de ferro em
ratinhos com alterações no BMP-6 é significativamente maior do que em ratinhos com
deficiência ao nível do gene HFE, fez levantar a hipótese de que, em humanos, mutações no
gene BMP-6 possam causar sobrecarga grave em ferro, como por exemplo alguns casos de
hemocromatose juvenil, para a qual a base genética ainda não foi caracterizada (Meynard et
al., 2009).
Um outro factor regulador da expressão da hepcidina é, como referido, o TfR2. Este é
predominantemente expresso em hepatócitos. Tal como o TfR1, o TfR2 é uma proteína
membranar, com cerca de 45% de aminoácidos idênticos ao TfR1. A diferença fundamental
entre estas duas proteínas encontra-se no domínio citoplasmático. A presença de mutações no
TfR2 causa uma forma recessiva de Hemocromatose Hereditária, o que levanta a hipótese que
este receptor seja, também ele, sensível aos níveis de ferro no organismo (Zhang and Enns,
2009).
I.3-Alterações patológicas no metabolismo do ferro
O mecanismo de regulação do metabolismo do ferro é muito complexo e existem vários
factores genéticos e ambientais que podem causar a desregulação deste sistema levando a um
aumento ou a uma diminuição da quantidade deste elemento no organismo, sendo que ambos
os fenómenos comprometem a saúde e podem originar doenças de gravidade variável
(Andrews, 1999).
Os efeitos clínicos da carência de ferro estão descritos na literatura médica desde o século XVI,
em relatos de um distúrbio denominado clorose que afectava raparigas adolescentes
(Guggenheim, 1995). Actualmente, a deficiência neste elemento é a doença nutritiva mais
comum no mundo afectando cerca de 2 biliões de pessoas (Zimmermann and Hurrell, 2007).
Apesar de ser mais comum em países em desenvolvimento, verifica-se uma elevada
prevalência desta carência em determinadas populações de países industrializados como os
Estados Unidos (CDC, 2002). Os sintomas e sinais da deficiência em ferro são parcialmente
evidenciados pela presença de anemia. Estes incluem palidez, fadiga, fraca resistência ao
exercício físico e diminuição da capacidade de trabalho (Andrews, 1999). Para além disso,
vários estudos indicam que existe uma relação entre a carência deste elemento e problemas
cognitivos e comportamentais em crianças (Grantham-mcgregor and Ani, 2001). A falta de
ferro resulta na maioria dos casos da deficiente ingestão deste metal ou numa absorção
ineficaz, contudo, hemorragias, tumores e parasitoses também podem provocar a sua
diminuição no organismo (Andrews, 1999).
Contrariamente, a sobrecarga em ferro conduz à sua deposição e acumulação em vários
órgãos, como no fígado e no coração. O seu excesso apresenta, geralmente, uma de duas
características padrão ao nível do armazenamento do ferro. Quando a eritropoiese é normal
mas o ferro plasmático excede a capacidade da Tf se ligar a ele (por exemplo no caso da
hemocromatose) este é depositado nas células parênquimais do fígado e do coração. Em
contraste, quando o excesso se deve ao aumento do catabolismo dos eritrócitos (por exemplo
em casos de transfusão de sangue), a acumulação ocorre primeiro nos macrófagos
-9-
I-Introdução
reticuloendoteliais e só depois nas células parênquimais. O armazenamento nestas últimas é
particularmente perigoso pois pode causar danos nos tecidos e fibrose (Andrews, 1999;
Deugnier and Turlin, 2011). Para além disso, o excesso de ferro está associado a casos de
cancro, como o carcinoma hepático, cancro do esófago, melanoma e leucemias (Huang, 2003).
Conforme a origem da sobrecarga em ferro as anomalias podem ser classificadas como
genéticas ou adquiridas. De entre as genéticas, existem quatro tipos de desregulações
transmitidas de modo autossómico recessivo e uma de modo autossómico dominante (Tabela
I.1) (Deugnier and Turlin, 2011). A hemocromatose do tipo I é a mais prevalente, sendo
responsável por cerca de 90% dos casos de sobrecarga em ferro e resulta de mutações do gene
HFE que levam a alterações funcionais na proteína codificada pelo gene referido. A
Hemocromatose do tipo IIA e IIB ou Hemocromatose Juvenil é caracterizada pela acumulação
de ferro no organismo numa fase precoce da vida que leva a manifestação de sintomas clínicos
antes dos 30 anos de idade, sendo que resultam de mutações associadas, respectivamente,
aos genes da HJV ou HAMP (Roetto et al., 2003). A Hemocromatose do tipo III está relacionada
com mutações no gene TfR2 (Papanikolaou and Pantopoulos, 2005). Uma forma distinta de
doença hereditária transmitida de modo autossómico dominante é a doença da ferroportina
que está relacionada com mutações patogénicas no gene SLC40A1 que codifica a proteína
exportadora de ferro FPN-1 (Montosi et al., 2001; Sebastiani and Walker, 2007). Ainda dentro
das anomalias genéticas relacionadas com o metabolismo do ferro, encontramos as doenças
da ferroportina do tipo A, aceruloplasminemia hereditária, atransferrinemia hereditária entre
outras. As anomalias adquiridas são aquelas que, não estando directamente implicadas no
metabolismo do ferro, têm a capacidade de gerar uma sobrecarga deste elemento no
organismo. Incluem-se aqui as doenças hematológicas como as talassémias e a anemia
falciforme, que levam a uma sobrecarga em ferro, quer pela produção de um factor eritróide
inibidor da expressão de hepcidina quer pela necessidade de múltiplas transfusões sanguíneas.
Algumas doenças crónicas no fígado, como por exemplo, a inflamação necrótica dos
hepatócitos, a infecção com o vírus da hepatite C e até o próprio consumo de álcool mostrou
poder inibir a expressão de hepcidina (Deugnier and Turlin, 2011).
Tabela I.1: Classificação genética da Hemocromatose
Tipo de
Hemocromatose
Tipo I ou clássica
Gene
Cromossoma
Proteína
Hereditariedade
NºOMIM
HFE
6p
HFE
235 200
Tipo II A ou
juvenil
Tipo II B ou
juvenil
Tipo III
HJV
1q
Hemojuvelina
HAMP
19q
Hepcidina
TfR2
7q
SCL40A1
2q
Receptor 2 da
transferrina
Ferroportina 1
Autossómica
Recessiva
Autossómica
Recessiva
Autossómica
Recessiva
Autossómica
Recessiva
Autossómica
Dominante
Tipo IV ou
doença da
ferroportina
- 10 -
602 390
606 464
604 250
606 069
I-Introdução
I.3.1-Diferentes tipos de Hemocromatose Hereditária e sua base molecular
A Hemocromatose Hereditária (HH) é a forma mais comum de sobrecarga primária de ferro. A
sua associação à deposição hepática deste elemento foi a base para o termo Hemocromatose,
dos étimos gregos haima para sangue e chromatos para cor, o qual foi cunhado em 1889 por
Von Recklinghausen. Foi descrita pela primeira vez por Trousseau em 1865 como uma
patologia caracterizada pela presença de diabetes, pigmentação da pele de cor bronze e por
cirrose. A origem familiar da Hemocromatose foi postulada por Shiedon em 1935, este
classificou a doença como um erro no metabolismo (Andrews, 1999). À semelhança de outras
patologias genéticas, inicialmente esta doença foi descrita apenas fenotipicamente e só
recentemente, em 1996, é que a base genética molecular foi estabelecida (Feder et al., 1996;
Lyon and Frank, 2001).
Trata-se de uma doença hereditária do metabolismo do ferro em que a absorção intestinal é
excessiva relativamente às reservas do organismo. Ao longo do tempo o excesso de ferro
absorvido leva à saturação da Tf no plasma e à deposição deste em vários tecidos (Fleming and
Sly, 2002). A HH é a doença genética mais comum em indivíduos descendentes de populações
do Norte da Europa afectando 1 em cada 200 a 300 indivíduos sendo mais prevalente em
indivíduos do sexo masculino do que feminino (Lyon and Frank, 2001). Apesar das
manifestações clínicas da HH variarem muito, os sintomas mais característicos são artrite,
arritmia e falha cardíaca, diabetes, cirrose hepática, fadiga, hiperpigmentação da pele,
hipotiroidismo, hipogonadismo e carcinoma hepatocelular (Samuel et al., 2010). Os sinais da
doença são mais frequentes em homens do que em mulheres devido ao efeito protector das
perdas de sangue decorrentes da menstruação e da gravidez em mulheres pré-menopáusicas.
A sintomatologia apresentada por homens e mulheres também tende a diferir sendo os
sintomas mais comuns no sexo feminino a fadiga e a hiperpigmentação e nos homens a cirrose
e diabetes (Lyon and Frank, 2001). Com o aumento da concentração de ferro no fígado, a
prevalência de cirrose, diabetes e doença cardíaca é maior, o que tem implicações directas na
taxa de mortalidade. Em geral, pessoas com HH sintomática têm menor taxa de sobrevivência
do que indivíduos da mesma idade e sexo sem esta patologia (Hanson et al., 2001).
O fenótipo de HH é determinado em primeiro lugar pela taxa e pela magnitude de sobrecarga
em ferro que é dependente das proteínas alteradas e da sua interacção com a hepcidina. Um
rápido influxo de ferro no plasma causa rapidamente problemas cardíacos e insuficiência
endócrina. Em contraste, o aumento gradual de ferro leva a um fenótipo mais suave e o
aparecimento de sintomas é mais tardio. No entanto fenótipos intermédios também estão
descritos (Figura I.4) (Pietrangelo, 2010).
- 11 -
I-Introdução
Figura I.4: Base genética e gravidade dos fenótipos comuns de hemocromatose. As características
básicas da HH são produto de mutações em genes do metabolismo do ferro (HJV, HAMP, TfR2, FPN e
HFE). Dependendo do gene envolvido e da sua interferência com a hepcidina, o fenótipo da
hemocromatose varia. Se o gene tem um papel importante na síntese de hepcidina (HAMP ou HJV), a
sobrecarga de ferro acontece rapidamente e atinge níveis muito elevados, nesse caso o quadro clínico
será grave com o aparecimento de sintomas nas primeiras décadas de vida, afectando principalmente o
coração e as glândulas endócrinas. Se o gene mutado não afectar tão criticamente este processo (como
o HFE) o fenótipo irá manifestar-se mais tardiamente. Existem ainda, fenótipos intermédios (mutações
no TfR2 ou combinações raras de mutações) (Adaptado de Pietrangelo, 2010).
I.3.1.1-Hemocromatose do tipo I
A principal causa da HH são mutações no gene HFE (High Fe ou Fe elevado) localizado no braço
curto do cromossoma 6 (6p21.2) (Feder et al., 1996; Sebastiani and Walker, 2007). Este gene é
constituído por sete exões, os primeiros seis codificam os domínios que constituem a proteína
(péptido de sinal, domínios α1, α2 e α3, domínio transmembranar e o citoplasmático), o
sétimo exão não é codificante (Figura I.5) (Fleming and Sly, 2002).
- 12 -
I-Introdução
Figura I.5: Estrutura do gene HFE, respectivo mRNA e proteína. A). O gene HFE consiste em 7 exões
(topo) dos quais apenas os seis primeiros codificam o mRNA da HFE (centro). Cada um desses exões
codifica um domínio independente da proteína HFE (abaixo). tm- domínio transmembranar; cytodomínio citoplasmático. B) Proteína HFE associada com a β2-microglobulina na superfície celular. Os
três domínios extracelulares da HFE são designados por α1, α2 e α3. A β2-microglobulina (β2-M) está
associada ao domínio α3 (Adaptado de Fleming and Sly, 2002).
O transcrito HFE principal tem cerca de 4,2 kb, no entanto foram descritos outros com
diferentes dimensões (Jeffrey et al., 1999; Thénié et al., 2000; Sánchez et al., 2001). Estes são
atribuídos a mecanismos de splicing alternativo, sendo o seu significado biológico ainda
desconhecido na maioria dos casos (Fleming and Sly, 2002; Martins et al., 2011).
Existem duas mutações mais frequentes no gene da HFE, a C282Y e a H63D (Sebastiani and
Walker, 2007). A maioria dos doentes com Hemocromatose do tipo I tem a transição de G→A
no nucleótido 845 (exão 4) do gene HFE, que resulta na substituição de uma cisteína por uma
tirosina no aminoácido 282 da proteína (C282Y). Esta mutação em homozigotia impede a
interacção da proteína HFE com o seu chaperone β2-microglobulina (β2-M) o que leva a que
não haja o seu direccionamento para a membrana, pelo que a HFE fica predominantemente
localizada no reticulo endoplasmático das células e é posteriormente degradada. Actualmente
ainda não é totalmente conhecida a fisiopatologia da doença associada à HFE. De acordo com
o modelo da programação dos enterócitos, da falta da HFE funcional resultará numa redução
da entrada de Fe2-Tf para as células das criptas duodenais, o que levará a uma falsa avaliação
de carência em ferro no duodeno, pois a quantidade deste elemento armazenado está a
aumentar. O resultado é uma regulação positiva da expressão de proteínas do metabolismo do
ferro e um aumento na absorção e transporte deste do lúmen duodenal para a circulação. Por
outro lado, é colocada também a hipótese de que, devido ao papel que a HFE tem na síntese
da hepcidina, a existência da forma mutada possa de alguma forma alterar os sinais ou
factores apropriados para a expressão desta hormona crucial na homeostase do ferro. Desta
forma o organismo não terá a capacidade de regular a absorção de ferro (Fleming and Sly,
2002).
A maioria dos indivíduos com Hemocromatose Hereditária são descendentes de um ancestral
comum Celta que viveu há cerca de 60 ou 70 gerações, portador de uma única mutação
missense a C282Y (Ajioka et al., 1997). Dado que esta mutação não confere um obstáculo à
- 13 -
I-Introdução
reprodução e pode até ter sido vantajosa no passado aos seus portadores, foi transmitida à
descendência e espalhada através de migrações, sendo em geral mais frequente em indivíduos
do Norte da Europa (Merryweather-Clarke et al., 1997). Em Portugal existem diferenças
regionais nas frequências alélicas desta mutação, sendo que a norte do país a frequência é
idêntica à encontrada em alguns países do Norte da Europa com um valor de 5,8 % enquanto a
sul a frequência é de 0,9 % (Cardoso et al., 2001).
A outra mutação comum no gene HFE é a H63D, que corresponde a uma transversão de G→C
no nucleótido 187 do gene, resultando na substituição de histidina por aspartato no
aminoácido 63 da proteína (H63D). Esta é encontrada em 15-40% da população caucasiana
(Fleming and Sly, 2002), e pensa-se que impede a formação de uma ponte salina, alterando a
conformação proteica daquela região. Esta variante da proteína HFE ao contrário da resultante
da C282Y é processada, transportada e expressa à superfície. No entanto, não tem a mesma
afinidade pelo TfR1 que a proteína não alterada. Como consequência dá-se uma maior
deposição de ferro nas células (Waheed et al., 1997). Esta mutação é mais prevalente que a
anterior (Merryweather-Clarke et al., 1997). Em Portugal, ao contrário do que acontece com a
mutação C282Y, a mutação H63D apresenta uma distribuição mais homogénea (17-19
%)(Cardoso et al., 2001). Em termos evolutivos a mutação H63D é anterior à C282Y. A primeira
poderá ter surgido em vários locais diferentes como resultado de pressões selectivas sobre o
gene HFE. Estas pressões podem ter acontecido devido à presença de doenças infecciosas ou
condições ambientais de indisponibilidade de ferro (Rochette et al., 1999).
Verificou-se que alguns dos indivíduos compostos heterozigoticamente para a C282Y e para a
H63D podem desenvolver excesso de ferro, no entanto a penetrância deste genótipo é menor
do que para a homozigotia da C282Y. Aos indivíduos homozigóticos para a H63D estão
também associados ao aumento de ferro. A penetrância clinica deste genótipo é menor, no
entanto têm vindo a ser reportados uma grande variedade de fenótipos (Gobbi et al., 2004).
Outras mutações no gene HFE têm sido descritas, sobretudo em heterozigotia composta com a
C282Y, e associadas a casos de hemocromatose do tipo I mas de carácter menos grave. É o
caso da mutação S65C, que corresponde a uma transversão de A→T no nucleótido 193 do
gene HFE, resultando na substituição de uma serina por uma cisteína (Trifa et al., 2012). Ainda,
outras mutações raras na proteína HFE têm sido identificadas, como por exemplo a G93R,
I105T e a Q283P (Figura I.6)(Lyon and Frank, 2001).
- 14 -
I-Introdução
Figura I.6: Representação esquemática de mutações descritas no gene HFE. A mutações mais
frequentemente associadas a HH encontram-se no exão 2 (H63D) e no exão 4 (C282Y). As caixas a
cinzento representam os exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005) .
I.3.1.2-Hemocromatose do tipo II ou Hemocromatose Juvenil
A Hemocromatose do tipo II ou Hemocromatose juvenil (HJ) é o tipo mais grave desta
patologia podendo levar à morte de indivíduos jovens (Gobbi et al., 2002). Trata-se de uma
doença hereditária com transmissão autossómica recessiva que normalmente surge antes dos
30 anos. Enquanto na HH o depósito e acumulação de ferro evolui lentamente e afecta mais os
homens, no tipo juvenil a evolução/gravidade dá-se mais rapidamente e afecta os dois sexos
em igual proporção. Tal como a HH clássica as principais complicações clínicas são:
hipogonadismo, doença cardíaca, cirrose hepática, diabetes, artropatias e pigmentação da
pele, mas neste tipo com maior gravidade. No entanto, neste caso os sintomas mais comuns
são o hipogonadismo e as cardiomiopatias. O depósito rápido de ferro pode ser fatal na grande
maioria dos doentes com HJ, devido a falha cardíaca (Andrews, 1999; Roetto et al., 2003).
A HJ é geneticamente heterogénea e está relacionada com alterações em um de dois genes. A
Hemocromatose Juvenil do tipo 2A é a forma mais frequente (cerca de 90% dos casos de HJ) e
está associada ao locus 1q21 (Roetto et al., 1999). O gene responsável foi identificado em 2004
como sendo o da HJV (Papanikolaou et al., 2004). Mutações neste gene causam sobrecarga
grave em ferro o que, correlacionado com baixos níveis de hepcidina, sugere que a HJV afecta
positivamente a cascata que regula a expressão desta hormona ao nível do fígado (Figura
I.3)(Babitt et al., 2006).
O gene HJV tem cerca de 4,2kb e foi identificado por Papanikolaou e colaboradores
(Papanikolaou et al., 2004). É transcrito e processado num mRNA maduro contendo a
totalidade dos exões e em quatro variantes de splicing adicionais, que codificam três isoformas
proteicas de 200, 314 e 426 aminoácidos. A HJV é essencialmente expressa no fígado adulto e
fetal, no coração e no músculo (Martinez et al., 2004; Papanikolaou et al., 2004). A proteína
codificada pelo transcrito principal, a variante que não sofre splicing, contém múltiplos
domínios incluindo um péptido sinal na zona N-terminal, um domínio de três aminoácidos
repulsive guidance domain (RGD), um factor de Von Willebrand (vWf) e um domínio
transmembranar na zona C-terminal característico de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol
- 15 -
I-Introdução
(GPI-anchor) (Papanikolaou et al., 2004). A remoção dessa âncora poderá gerar uma isoforma
solúvel (Lin et al., 2005). A HJV revela uma considerável homologia na sequência de
aminoácidos com os factores proteicos repulsive guindance molecules (RGM) que actuam
como co-receptores de BMPs, que são factores de crescimento com papéis importantes em
várias actividades biológicas através de ligações a determinados receptores, desencadeando
vias de sinalização que regulam a transcrição de genes específicos. A HJV actua como coreceptor de BMP para modular a transcrição do gene HAMP, tendo assim um papel importante
no metabolismo do ferro através da regulação da expressão da hepcidina (Papanikolaou et al.,
2004). Encontram-se descritas várias mutações (Figura I.7), essencialmente localizadas nos
exões 3 e 4 deste gene que codificam a zona mais conservada da estrutura proteica,
nomeadamente o domínio RGD, vWf e o domínio transmembranar (Lanzara et al., 2004) .
Figura 7: Representação esquemática de mutações descritas no gene HJV. A maior parte das mutações
encontram-se no exão 3 e no 4, sendo neste último que se encontra a G320V que está presente na
maioria dos indivíduos com HJ subtipo 2A. As caixas a cinzento representam os exões do gene
(Adaptado de Le Gac and Férec, 2005) .
Várias mutações no gene da HJV têm sido descritas nos últimos anos em diversas populações.
A maioria dos indivíduos com HJ do tipo 2A apresenta uma transversão de G→T no nucleótido
959 do gene da HJV, que resulta na substituição de uma Glicina por uma Valina na posição 320
da proteína (G320V). Casos de HJ relacionados com mutações no gene da HJV não parecem ser
agravados quando existem mutações no gene HFE, nomeadamente no caso da mutação H63D
(Lanzara et al., 2004; Lee et al., 2004; Papanikolaou et al., 2004).
A Hemocromatose Juvenil do tipo 2B é menos frequente (correspondendo a cerca de 10% dos
casos de HJ) e está associada ao locus 19q13.1 onde está localizado o gene HAMP, constituído
por 3 exões e que codifica para a hepcidina (Park et al., 2001). Caracteriza-se por uma
sobrecarga em ferro particularmente mais grave que a do subtipo 2A. Os seus portadores
tendem a apresentar precocemente sintomas cardíacos (Santos et al., 2009). Existem várias
mutações descritas no gene HAMP (Figura I.8) que parecem estar relacionadas com este tipo
- 16 -
I-Introdução
de HJ, nomeadamente a R56X e a C70R (Roetto et al., 2003). Esta última corresponde a uma
troca de T→C, que resulta na substituição de uma cisteína por uma arginina. Esta alteração de
um aminoácido neutro por um básico leva a alteração do péptido, uma vez que uma das oito
císteinas conservadas e que são criticas para a estabilidade do polipéptido é modificada
(Roetto et al., 2004). São vários os estudos que indicam que estados homozigóticos para as
mutações referidas estão associados a sobrecarga de ferro (Gobbi et al., 2002; Lanzara et al.,
2004).
Figura I.8: Representação esquemática de mutações descritas no gene HAMP. No caso das mutações
no gene HAMP estão descritas algumas mutações, não existindo nenhuma frequentemente associada à
HJ subtipo 2B. As caixas a cinzento representam os exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec,
2005).
I.3.1.3-Hemocromatose do tipo III
A Hemocromatose do tipo III está relacionada com alterações no TfR2. A primeira mutação
identificada foi a Y250X, esta é uma mutação nonsense que foi descrita em 6 indivíduos de 2
famílias Italianas (Camaschella et al., 2000). O gene TfR2 é constituído por 18 exões, localiza-se
em 7q22 e codifica para a proteína TfR2 que está envolvida na captura de Tf pelos hepatócitos
e também na síntese de hepcidina (Santos et al., 2012).
O fenótipo apresentado por estes doentes é idêntico ao dos indivíduos com HH do tipo I, no
entanto também é detectado em indivíduos jovens à semelhança do que acontece no caso da
HJ (Le Gac and Férec, 2005). Esta patologia é rara e têm sido descritos poucos casos de
mutações no TfR2 (Figura I.9), no entanto, tanto em modelos animais como em doentes com
HH do tipo III verifica-se um decréscimo dos níveis de hepcidina (Majore et al., 2006).
- 17 -
I-Introdução
Figura I.9: Representação esquemática de mutações descritas no gene TfR2. A Y250X foi a primeira
mutação a ser descrita neste gene e está localizada no exão 6. As caixas a cinzento representam os
exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005).
I.3.1.4-Hemocromatose do tipo IV ou Doença da Ferroportina
A Hemocromatose do tipo IV também conhecida por doença da ferroportina foi reconhecida
clinicamente em 1999 (Pietrangelo et al., 1999) e ligada ao gene SLC40A1 em 2001. Este gene
localizado na região 2q32 é constituído por 8 exões (Figura I.10), codifica a ferroportina que é
uma proteína envolvida na exportação celular de ferro (Montosi et al., 2001)
Anomalias no funcionamento da FPN-1 provocam uma retenção e acumulação anormal de
ferro predominantemente nos macrófagos reticuloendoteliais no fígado e baço. Esta retenção
de ferro intracelular provoca uma diminuição nos níveis plasmáticos deste elemento e como
tal há uma redução da disponibilidade deste para se ligar à Tf. Este facto explica porque é que
os níveis de saturação da Tf são normais ou baixos em fases mais avançadas da doença. A
maior parte dos casos relatados são fenotipicamente mais suaves do que os que envolvem a
HH clássica, possivelmente porque a deposição reticuloendotelial de ferro é menos prejudicial
do que a deposição parenquimatosa (Pietrangelo, 2004).
Figura 10: Representação esquemática de mutações descritas no gene SLC40A1. A maioria das
mutações descritas encontra-se no exão 5 e no exão 6. As caixas a cinzento representam os exões do
gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005).
- 18 -
I-Introdução
I.3.2-Diagnóstico
Os indivíduos com hemocromatose normalmente absorvem 2 a 3 vezes mais ferro a partir da
alimentação do que indivíduos normais. A maioria não apresenta sintomatologia até à idade
adulta (à excepção de portadores de HJ) apesar da saturação da Tf sérica estar aumentada
desde a adolescência. Os primeiros sintomas são inespecíficos e incluem fadiga, disfunção
eréctil e aumento da pigmentação da pele (Andrews, 1999). Até à década de 1990, o
diagnóstico de HH baseava-se fundamentalmente na confirmação histológica de sobrecarga
em ferro. Deste modo, realizavam-se biópsias hepáticas como parte integrante da investigação
do doente com suspeita de hemocromatose ou de flebotomias quantitativas, nos casos em
que a biopsia hepática não era indicada (Santos et al., 2009). Actualmente, os marcadores
bioquímicos mais importantes utilizados para determinar o status de ferro no organismo são o
índice de saturação da transferrina sérica e os valores de ferritina sérica (Hanson et al., 2001).
O índice de saturação (IS) da transferrina sérica é a razão ferro sérico/capacidade de fixação do
ferro. Em condições normais, 20 a 50% dos sítios de ligação do ferro na transferrina estão
ocupados. Valores de saturação superiores a 50% em mulheres pré-menopausicas e superior a
60%, em mulheres pós-menopausicas e nos homens, é indicativo de HH, talassemia, hepatites,
ingestão excessiva de ferro ou toma de progesterona. Consequentemente após tratamentos
de reposição de ferro podem ser encontrados valores superiores a 100% de IS. Níveis baixos
podem estar presentes em casos de anemia ferropénica, subnutrição e na anemia das doenças
crónicas (Andrews, 1999; Hanson et al., 2001).
Valores de ferritina sérica elevados estão associados a manifestações clínicas de HH, pois como
é uma proteína intracelular de armazenamento de ferro, a sua concentração correlaciona-se
significativamente com a quantidade de ferro armazenada no organismo (1 μg/L corresponde
a 10mg de ferro armazenado)(Hanson et al., 2001).
Tem sido definida como sobrecarga de ferro a presença de pelo menos duas constatações de
índice de saturação da transferrina iguais ou superiores a 50% em mulheres e 60% em
homens; e/ou concentrações séricas de ferritina >200 μg/L em mulheres e >300 μg/L em
homens (Bacon et al., 1999; Santos et al., 2009). Indivíduos identificados com estes
parâmetros bioquímicos alterados, portanto com excesso de ferro, têm uma probabilidade
incerta de desenvolver complicações clínicas. Estudos familiares sugerem que 50-70% de
homens e 40-50% de mulheres vão desenvolver sintomas ou complicações devido ao excesso
de ferro no organismo, alguns desses sintomas inespecíficos como é o caso da diabetes e dos
problemas articulares (Hanson et al., 2001). Para esclarecer o diagnóstico de que será um caso
de HH, para além da análise de parâmetros bioquímicos também são efectuados estudos
moleculares às mutações C282Y e H63D no gene HFE. Os testes genéticos nem sempre são
preditivos do desenvolvimento da doença pois há indivíduos com o genótipo que nunca
apresentam os efeitos nefastos resultantes da sobrecarga em ferro (a penetrância é baixa) e
há indivíduos com sobrecarga em ferro sem estas mutações mais frequentes (Olynyk et al.,
1999; Pietrangelo et al., 1999)
- 19 -
I-Introdução
I.3.3-Tratamento
O tratamento para a hemocromatose não se alterou substancialmente desde 1950 e inclui
flebotomias para indivíduos sintomáticos e pré-sintomáticos. A flebotomia terapêutica é o
principal tratamento aplicado a indivíduos com este tipo de patologia. Este procedimento é
seguro, eficaz e económico. Cada 450 a 500mL de sangue contém cerca de 200 a 250mg de
ferro (Andrews, 1999). O tratamento inicial para doentes sintomáticos é composto por
flebotomias semanais ou quinzenais de uma unidade (450mL) de sangue, até que o doente
apresente uma ligeira hipoferritinémia. A terapêutica de manutenção consiste em flebotomias
em intervalos de 2 a 6 meses, dependendo da sobrecarga do indivíduo de modo a manter os
valores de ferritina sérica abaixo dos 50 μg/L (Lyon and Frank, 2001).
A concentração de Ft no soro reflecte as reservas corporais de ferro e é utilizada para
monitorizar o progresso da terapia. Se o tratamento se iniciar numa fase precoce da doença é
possível prevenir danos nos órgãos e aumentar a sobrevivência. É possível estabilizar a cirrose,
hipogonadismo e problemas articulares. A dependência de insulina dos diabéticos não pode
ser travada mas pode ser diminuída e retardada (Hanson et al., 2001; Pietrangelo, 2004).
Outro tipo de terapêutica para o excesso de ferro no organismo é a terapia com quelantes de
ferro que aumenta a excreção deste, no entanto é menos utilizada porque é menos eficiente e
mais cara do que as flebotomias e para além disso tem bastantes efeitos secundários
indesejáveis (Hanson et al., 2001) .
Os doentes com excesso de ferro no organismo são também aconselhados a evitar
suplementos alimentares ricos em ferro e a restringir a ingestão de vitamina C, uma vez que
esta facilita a absorção de ferro. Adicionalmente devem evitar o consumo de alimentos ricos
neste elemento como a carne vermelha (Andrews, 1999).
- 20 -
II-Objectivos
II-Objectivos
O objectivo principal deste trabalho consistiu na pesquisa e caracterização de mutações em
genes relacionados com o metabolismo do ferro, nomeadamente no gene HFE, TfR2, HJV,
HAMP e BMP-6. A pesquisa foi realizada num grupo de 11 indivíduos com parâmetros
bioquímico de grande sobrecarga em ferro, apresentando uma hiperferritinemia muito grave
(ferritina sérica > 2500 μg/L).
Estes indivíduos já tinham sido estudados na Unidade de Genética Molecular do
Departamento de Genética Humana deste Instituto no que respeita à pesquisa das mutações
comuns no gene HFE (C282Y e H63D) normalmente associadas a Hemocromatose Hereditária
do tipo I (clássica). A maioria dos indivíduos não apresentava os genótipos considerados de
risco nesse gene, apenas dois deles eram homozigóticos para a mutação C282Y, o que mesmo
assim é improvável que justifique os níveis de ferritina sérica destes indivíduos uma vez que
são muito superiores à média apresentada por doentes com HH do tipo I. Assim, com este
estudo pretendeu-se pesquisar outros determinantes genéticos, nomeadamente mutações em
cinco genes relacionados com o metabolismo do ferro, que pudessem justificar a sobrecarga
grave de ferro manifestada por estes doentes.
Para se atingir este objectivo principal, tivemos ainda como objectivos secundários:
- A implementação no laboratório da metodologia de PCR para amplificação enzimática in vitro
do gene BMP-6.
- A optimização de algumas metodologias de PCR, já anteriormente utilizadas no laboratório
na amplificação dos outros genes, mas que se revelaram insatisfatórias por originarem
amplificações fracas ou inespecíficas.
- A pesquisa e utilização das ferramentas informáticas necessárias para os estudos in silico de
análise das sequências nucleotídicas de modo a identificar possíveis alterações nas regiões
codificantes assim como de polimorfismos, e para o estudo do impacto das alterações
nucleotídicas a nível do splicing e a nível proteico.
A identificação de mutações associadas a HH é essencial quer para diagnóstico molecular quer
para programas de rastreio populacional. É também fundamental para a compreensão da
elevada heterogeneidade fenotípica e da baixa penetrância e variável expressividade desta
patologia. Para além disso, o estudo funcional das mutações encontradas pode contribuir
significativamente para o conhecimento do papel de algumas proteínas envolvidas no
metabolismo do ferro e portanto da fisiopatologia da doença.
- 22 -
III-Materiais e Métodos
III-Materiais e Métodos
III.1-População estudada
Neste trabalho foram estudados 11 indivíduos, com hiperferritinemia grave que foram
seleccionados de entre os doentes recebidos, no período de 2004 a 2012, na Unidade de
Genética Molecular do Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge (INSA), em Lisboa, para pesquisa das mutações C282Y e H63D do gene HFE. Os
indivíduos tinham idades compreendidas entre os 29 e os 71 anos datados à altura da sua
entrada no INSA para estudo das mutações anteriormente referidas. Sete indivíduos eram do
sexo masculino (64% da amostra) e 4 do feminino (36% da amostra). Todos vieram
encaminhados de centros de saúde e de hospitais da zona de Lisboa: Hospital de Santa Maria,
Instituto Português de Oncologia e Hospital do Barreiro.
III.1.1-Critérios de selecção da amostra
Os indivíduos seleccionados para o estudo possuíam níveis de ferritina muito elevados, sendo
que valores superiores a 200 μg/L em mulheres e superiores a 300 μg/L em homens são
considerados indicadores de sobrecarga em ferro no organismo (Bacon et al., 1999).
Os indivíduos analisados no presente trabalho apresentavam todos níveis de ferritina
superiores a 2500 μg/L, sendo então classificados como indivíduos com hiperferritinemia
grave.
III.1.2-Obtenção de material genético
O DNA genómico foi extraído a partir de amostras de sangue periférico colhidas em EDTA na
Unidade de Genética Molecular do Departamento de Genética Humana do INSA.
III.2-Reacção em cadeira da polimerase (PCR)
A reacção em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou a genética molecular uma vez que veio
permitir a rápida amplificação, isto é, criação de múltiplas cópias de DNA, por replicação
enzimática. Esta técnica foi descrita em 1988 por Saiki e colaboradores e desde a sua origem
têm surgido várias utilizações em investigação. A amplificação dos fragmentos de DNA é
selectiva, delimitada por duas regiões de sequência conhecida. A síntese de DNA in vitro
envolve a síntese enzimática através de uma polimerase de DNA termoestável isolada de uma
bactéria denominada Thermus aquaticus (Taq) resistente a elevadas temperaturas (Saiki et al.,
1988; Mullis, 1990). A reacção de PCR consiste numa série de ciclos, cada um dos quais
envolve reacções a temperaturas diferentes. Cada ciclo envolve a desnaturação de DNA,
emparelhamento de oligonucleótidos iniciadores e síntese de DNA (Saiki et al., 1988; Mullis,
1990).
III.2.1-Amplificação por PCR de regiões dos genes em estudo
No presente estudo foram amplificadas por PCR as regiões dos genes HFE, TfR2, HJV, HAMP e
BMP-6 descritas na Tabela III.2.
- 24 -
III-Materiais e Métodos
Tabela III.2: Regiões dos genes estudadas
Genes
HFE
TfR2
HJV
HAMP
BMP-6
Regiões analisadas
Exões 1 a 6
Exões 1 a 18
Exões 2 a 4
Exões 1 a 3 e Promotor Proximal
Exões 2 a 6
As misturas de reacção (mix) foram preparadas na bancada limpa, livre de ácidos nucleicos,
numa sala exclusiva para preparação de PCR, com material exclusivo e todo o processo foi
realizado em gelo (4ºC).
Os reagentes utilizados e a ordem pela qual foram adicionados estão descritos nas Tabelas III.3
a III.7. As sequências de oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar as diferentes
regiões em estudo constam das Tabelas III.8 a III.12. As condições de amplificação de cada
fragmento por PCR encontram-se nas Tabelas III.13 a III.17, tendo por base tanto bibliografia
existente como optimizações efectuadas no decorrer do trabalho laboratorial.
Após a preparação da mix na sala de PCR, esta foi aliquotada para os tubos de PCR e no
laboratório foram adicionados os DNAs em estudo. Em todas as reacções foi usado um
controlo negativo (sem adição de DNA) a fim de se controlarem possíveis contaminações. Os
tubos com as misturas de reacção foram colocados num termociclador (Biometra T Gradient)
previamente programado para as condições de amplificação óptimas.
Tabela III.3: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões
do gene HFE
Reagentes
H2O bidestilada
Tampão B (10X)
Tampão α (10X)
DMSO (99,9%)
BSA (10 mg/ml)
MgCl2 (25Mm)
Oligonucleótidos
iniciadores S
(15pmol/ μL)
Oligonucleótidos
iniciadores AS
(15pmol/ μL)
dNTPs (100 Mm)
Polimerase Taq
(Promega)
(5 U/μL)
Polimerase Taq
(Applied
Biosystems)
(5 U/μL)
Mix+DNA
(Vf=25 μL)
Exão 1
25
0,5
Exão 2
15,42
2,5
2,5
0,43
2
0,5
Exão 3
15,42
2,5
2,5
0,43
2
0,5
Exão 4
15,42
2,5
2,5
0,43
2
0,5
Exão 5
25
0,5
Exão 6
25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,075
0,5
-
0,5
-
0,5
-
0,075
0,075
-
0,15
0,15
0,15
-
-
24,5+0,5
As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; Vf- Volume final;
- 25 -
III-Materiais e Métodos
S- oligonucleótidos directos AS- oligonucleótidos inversos;
Tabela III.4: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões
do gene TfR2
Reagentes
Exão
1
Exão
2
Exão
3
Exão
4+5+6
Exão
7+8+9
Exão
10
Exão
11+12
+13
Exão
14+15
+16
Exão
17
Exão
18
H2O bidestilada
Tampão B (10X)
Tampão α
(10X)
DMSO (99,9%)
BSA (10 mg/ml)
MgCl2 (25Mm)
Oligonucleótidos
iniciadores S
(15pmol/ μL)
Oligonucleótidos
iniciadores AS
(15pmol/ μL)
dNTPs (100 Mm)
Polimerase Taq
(Promega) (5
U/μL)
Mix+DNA
(Vf=25 μL)
17,9
2,5
25
-
14,45
2,5
14,45
2,5
25
-
25
-
25
-
25
-
25
-
25
-
2,5
0,45
2
0,5
0,5
2,5
0,45
2
0,5
2,5
0,45
2
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,15
0,075
0,5
0,15
0,5
0,15
0,075
0,075
0,075
0,075
0,07
5
0,07
5
24,5+0,5
A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1;
As quantidades dos reagentes estão expressas em μL;
Vf- Volume final;
S- oligonucleótidos directos AS- oligonucleótidos inversos;
Tabela III.5: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões
do gene HJV
Reagentes
H2O bidestilada
Tampão David (10X)
Tampão B (10X)
BSA (10 mg/mL)
Oligonucleótidos
iniciadores S (15pmol/ μL)
Oligonucleótidos
iniciadores AS (15pmol/ μL)
dNTPs (100 Mm)
Polimerase Taq (Promega)
(5 U/μL)
Polimerase Taq (Applied
Biosystems)
(5 U/μL)
Mix+DNA
(Vf=25 μL)
Exão 2
20
2,5
0,35
0,5
Exão 3
25
0,5
Exão 4
20
2,5
0,35
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,075
0,5
-
0,15
-
0,15
24,5+0,5
A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1;
As quantidades dos reagentes estão expressas em μL;
Vf- Volume final;
S- oligonucleótidos directos AS-oligonucleótidos inversos;
- 26 -
III-Materiais e Métodos
Tabela III.6: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões
do gene HAMP
Reagentes
H2O bidestilada
Tampão B (10X)
Tampão α (10X)
Tampão PCR
(Applied Biosystems)
(10X)
DMSO (99,9%)
BSA (10 mg/ml)
MgCl2 (25Mm)
Oligonucleótidos
iniciadores S
(15pmol/ μL)
Oligonucleótidos
iniciadores AS
(15pmol/ μL)
dNTPs (100 Mm)
Polimerase Taq
(Promega) (5 U/μL)
Polimerase Taq
(Applied Biosystems)
(5 U/μL)
Mix+DNA
(Vf=25 μL)
Promotor Proximal
15,8
2,5
-
Exão 1
25
-
Exão 2+3
19,2
2,5
2,5
0,35
2
0,5
0,5
1,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
0,075
0,2
-
0,15
-
0,1
24,5+0,5
A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1;
As quantidades dos reagentes estão expressas em μL;
Vf- Volume final;
S- oligonucleótidos directos AS-oligonucleótidos inversos;
Tabela III.7: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões
do gene BMP-6
Reagentes
Tampão B (10X)
Oligonucleótidos
iniciadores S
(15pmol/ μL)
Oligonucleótidos
iniciadores AS
(15pmol/ μL)
Polimerase Taq
(Promega) (5 U/μL)
Mix+DNA
(Vf=25 μL)
Exão 2
25
0,5
Exão 3+4
25
0,5
Exão 5+6+7
25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,075
0,075
0,075
24,5+0,5
A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1;
As quantidades dos reagentes estão expressas em μL;
Vf- Volume final;
S- oligonucleótidos directos AS-oligonucleótidos inversos;
- 27 -
III-Materiais e Métodos
Tabela III.8: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HFE e respectiva
dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)
Exão
Directo
1
CGGAGATTTAACGGGGACGT
2
Reverso
Dimensão do
fragmento
(pb)
Referência
Bibliográfica
TCGATTTTTCCACCCCCGCC
168
(Le Gac et al.,
2001)
GGTGTGTGGAGCCTCAACAT
AGCTCTGACAACCTCAGGAA
377
3
GGACCTATTCCTTTGGTTGCA
TCCTCCACTCTGCCACTAGAGTA
374
4
AGTTCCAGTCTTCCTGGCAA
AGCTCCTGGCTCTCATCAGT
368
5
GTGAGATGAGGATCTGCTCT
GGCAGAGGTACTAAGAGACT
234
6
CCTAGGTTTGTGATGCCTCT
TAGGTTCAACTCTCTCCTGA
186
Tabela III.9: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene TfR2 e respectiva
dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)
Exão
Directo
Reverso
Dimensão
do
fragmento
(pb)
Referência
Bibliográfica
1
TCGCTGGGGGACAGCCTG
TCAAATGAGCATGGTGGTGGGG
232
*
2
TCACTGACCTCATTATTGCC
AAGGCTGGCGGGTGGCAAGA
440
3
GTGAGAGCCGTCCCCCTCCC
AGACACCAGGCCTGGGCC
386
(Roetto et
al., 2001)
*
4
ACGTCTCTGGCATCCTTCCCT
GGTGAGCGCCCCGAGCCGCG
276
5+6
CGCGGCTCGGGGCGCTCACC
ACCCTGAACGATTCTCACTG
452
7+8
ATCCTCTCCGTGGGATGGACA
ACCCACAATCACCCTGTGG
588
*
9
CTGGGTCTCTCTACAACTTCCCC
GCCCCCTATCTTGCCAGGG
292
*
10
GAGAGACACAGGCAGATGGAGG
TCCCTCACTGCCTCTCTGCC
286
*
11+12+13
AGGACAGAAGAAGA
GGGGGTTGGGGAAG
558
*
14+15+16
GGAATAGGGGGTGA
TGGCCTGGGCAGTG
686
*
17
CACTCTGTCCTCGTCTACCT
CAGGACTGGGAAGAGAGCAT
427
*
18
TGGCTGGCGGGA
GCCACCTCCCTGACCCTG
434
*
*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;
- 28 -
(Roetto et
al., 2001)
III-Materiais e Métodos
Tabela III.10: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HJV e respectiva
dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)
Exão
Directo
Reverso
Dimensão
do
fragmento
(pb)
Referência
Bibliográfica
2
CCCCAAATTCCAGTCTGTT
CTCATTCAGGCTCACATGC
382
3
GCAAACTACACTCCGATAGAG
GTGCCCGTGGAAGAATCTCAT
681
(Lanzara et
al., 2004)
*
4
TAACTATGTATGAGGTCTGATTGGG
TATGCCAATCTGTATCTCCAAATCA
757
*
*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;
Tabela III.11: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HAMP e respectiva
dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)
Exão
Directo
Reverso
Dimensão
do
fragmento
(pb)
Referência
Bibliográfica
PP
AGCCTCCTGGGCTTAAGCGAT
TGGGTCTTGAGCTTGCTCTGG
862
*
1
AGCAAAGGGGAGGGGGCTCAG
ACCAC
TCCCATCCCTGCTGCCCTGCTA
AGGAC
262
TCTCAGAGGTCCACTGGGC
GACACTCGGCAGAGAGAAAG
448
(Merryweat
her-Clarke
et al., 2003)
(Jacolot et
al., 2004)
2+3
PP-Promotor Proximal;
*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;
Tabela III.12: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene BMP-6 e respectiva
dimensão dos fragmentos de DNA amplificados
Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)
Exão
Directo
Reverso
Dimensão
do
fragmento
(pb)
Referência
Bibliográfica
*
2
ATCCCCGTAGTAAGCCGTGG
CCCTGCACAGACATAGCTGG
411
3+4
ATCCTGACGCTGAGACAGG
GCCCGACATCTGAGACTGTG
1216
GCCTGGCATGTGGTAAACTCTC
CCACCTCCAACTGTGCTTCC
1449
5+6+7
*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;
- 29 -
III-Materiais e Métodos
Tabela III.13: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HFE
1-Desnaturação
inicial
Exão
1
2
3
4
5
6
2.1Desnaturação
2.2Emparelhamento
dos Olig. Inic.
2.3Síntese de DNA
3Extensão final
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
94
94
94
94
94
94
5´
10´
10´
10´
5´
5´
94
94
94
94
94
94
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
57
55
53
55
57
57
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
72
72
72
72
72
72
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
72
72
72
72
72
72
5´
10´
10´
10´
5´
5´
Nº de
ciclos
de 2.1
a 2.3
35
32
32
32
35
35
Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;
Tabela III.14: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene TfR2
1Desnaturação
inicial
Exão
1
2
3
4
5+6
7+8
9
10
11+12+13
14+15+16
17
18
2.1Desnaturação
2.2Emparelhamento
dos Olig. Inic.
2.3Síntese de DNA
3Extensão final
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
95
95
95
95
94
94
95
95
95
95
95
94
10´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
10´
10´
10´
10´
5´
95
95
95
95
94
94
95
95
95
95
95
94
30´´
30´´
1´
1´
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
1´
30´´
30´´
63
58
67
61
63
61
61
64
68
59
63
63
30´´
30´´
1´
1´
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
45´´
30´´
30´´
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
30´´
1´
1´
1´
30´´
30´´
30´´
30´´
30´´
45´´
30´´
30´´
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
10´
10´
10´
10´
5´
5´
5´
10´
10´
10´
10´
5´
Nº de
ciclos
de
2.1 a
2.3
35
32
35
35
35
35
32
36
35
35
30
35
Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;
Tabela III.15: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HJV
1-Desnaturação
inicial
Exão
2
3
4
2.1Desnaturação
2.2Emparelhamento
dos Olig. Inic.
2.3Síntese de DNA
3Extensão final
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
94
94
94
5´
5´
5´
94
94
94
45´´
45´´
45´´
56
58
52
30´´
30´´
30´´
72
72
72
1´30´´
1´30´´
1´30´´
72
72
72
10´
10´
10´
Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;
- 30 -
Nº de
ciclos
de 2.1
a 2.3
35
35
35
III-Materiais e Métodos
Tabela III.16: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HAMP
1-Desnaturação
inicial
Exão
PP
1
2+3
2.1Desnaturação
2.2Emparelhamento
dos Olig. Inic.
2.3Síntese de DNA
3Extensão final
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
95
95
94
5´
5´
5´
95
95
94
30´´
30´´
45´´
60
61
68
30´´
30´´
30´´
72
72
72
1´
30´´
30´´
72
72
72
10´
10´
10´
Nº de
ciclos
de 2.1
a 2.3
32
32
40
Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;
Tabela III.17: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene BMP-6
1-Desnaturação
inicial
Exão
2
3+4
5+6+7
2.1Desnaturação
2.2Emparelhamento
dos Olig. Inic.
2.3Síntese de DNA
3Extensão final
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
T(ºC)
TMP
95
95
95
5´
5´
5´
95
95
95
30´´
30´´
30´´
62
61
61
30´´
30´´
30´´
72
72
72
30´´
1´30´´
1´30´´
72
72
72
10´
10´
10´
Nº de
ciclos
de 2.1
a 2.3
30
30
30
Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo.
III.3-Electroforese em gel de agarose
A electroforese em gel de agarose é o método mais vulgarmente utilizado na separação,
identificação e purificação de fragmentos de DNA. Esta técnica baseia-se no facto das
moléculas de DNA, tal como acontece com outras moléculas biológicas, possuírem carga
eléctrica. A detecção dos fragmentos de DNA no gel de agarose é possível através da coloração
com brometo de etídeo (EtBr). Este composto intercala-se entre as bases dos ácidos nucleicos,
emitindo fluorescência quando iluminado com radiação ultravioleta (Lee et al., 2012).
Após a amplificação dos exões dos genes referidos anteriormente realizou-se uma
electroforese em gel de agarose contrastado com EtBr. Os fragmentos de DNA obtidos foram
identificados com o auxílio do marcador de massa molecular DNA ladder 100bp plus da
Applichem ou do marcador HyperLadder II da Bioline (Figura III.11). Em todas as situações, a
preparação do gel foi realizada de modo semelhante, diferindo apenas na concentração de
agarose utilizada que variou entre 1% e 1,5% (p/v) de acordo com as dimensões do fragmento.
Os géis com as amostras e os marcadores já referidos foram sujeitos a electroforese durante
30 minutos a 90 V e foram visualizados sob luz ultravioleta num transiluminador Uvitec
Cambridge. As amostras aplicadas no gel foram preparadas misturando 10 µL de produto de
PCR e 5 µL de azul de bromofenol. Após o visionamento das bandas foi efectuado o registo
fotográfico. Quando a utilização dos produtos de PCR não foi imediata, estes foram
armazenados à temperatura de 4ºC.
- 31 -
III-Materiais e Métodos
A
B
Figura III.11: Marcadores de massa molecular. A) Marcador HyperLadder II, num gel de agarose a 1,5%,
é descrito o tamanho de cada banda no gel em pb. B) Marcador DNA ladder 100bp plus, num gel de
1,7% de agarose, é igualmente descrito o tamanho de cada banda no gel em pb.
III.4-Purificação dos produtos de amplificação
Os produtos de PCR foram purificados com o objectivo de eliminar os oligonucleótidos
iniciadores, sais, enzimas e nucleótidos não incorporados que se mantêm na mistura de PCR
em conjunto com os fragmentos de DNA amplificados, de modo a não interferirem com o
método de sequenciação automática. Quando a amplificação foi conseguida utilizando tampão
α a purificação foi efectuada através do método de coluna, com recurso ao kit
NucleoSpin®Extract II PCR clean-up, de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de
amplificação que resultaram da amplificação com as outras misturas de reacção foram
purificados com EXOSAP-IT PCR Clean-up kit. Foi adicionado directamente a 5 μL de produto
resultante da amplificação 2,5 μL de EXOSAP-IT, sendo esta mistura posteriormente incubada a
37ºC durante 15 min seguido de 15 min a 80ºC.
Em alguns casos os produtos de purificação foram visualizados em gel de agarose como
descrito anteriormente para confirmar a eliminação dos oligonucleótidos iniciadores e a
quantidade de produto purificado disponível para sequenciar.
III.5-Sequenciação dos produtos purificados
A sequenciação automática é um método que possibilita a identificação de sequências
nucleotídicas assim como de alterações na cadeia de DNA. Esta técnica foi desenvolvida por
Sanger e colaboradores em 1977, e consiste na utilização de bases alteradas quimicamente,
denominadas didesoxi que não possuem o grupo hidroxilo terminal que permitiria a ligação da
base seguinte (Sanger et al., 1977). A reacção de síntese termina sempre que é incorporada na
cadeia uma destas bases alteradas, uma vez que na sua presença não se formam ligações
fosfodiester com o nucleotido seguinte. Estes fragmentos de DNA são separados por
- 32 -
III-Materiais e Métodos
electroforese em função do tamanho e a sequência pode ser lida. A sequenciação automática
assenta nos princípios referidos anteriormente, com algumas diferenças resultantes da
evolução tecnológica. Os didesoxirribonucleotidos terminadores da reacção de sequenciação
são marcados com um fluorocromo na extremidade 3´, que emite radiação quando é atingido
por uma fonte de luz de excitação. Os fragmentos são separados em função do tamanho numa
electroforese capilar durante a qual o aparelho regista a intensidade de fluorescência que é
detectada na janela de leitura para cada um dos canais correspondentes aos terminadores
utilizados. Os dados são posteriormente analisados por um software e no final obtém-se um
electofluorograma da sequência onde é possível identificar os nucleótidos.
A pesquisa de mutações foi efectuada por sequenciação dos produtos de PCR purificados. Os
reagentes utilizados e a ordem pela qual foram adicionados estão descritos na Tabela III.18.
No processo de sequenciação foram utilizados os oligonucleótidos iniciadores das respectivas
reacções de amplificação, a uma concentração de 2pmol/μL para um volume final de 10 μL,
tendo sido os produtos purificados submetidos ao programa descrito na Tabela III.19,
realizado no termocliclador (T1 Thermocycler). Após o processo de sequenciação, os produtos
foram enviados para a unidade de tecnologia e inovação (UTI) do INSA onde foram
precipitados e submetidos a electroforese capilar a fim de se obterem as respectivas
sequências nucleotídicas no dispositivo 3130X Genetic Analyser, Abi Prism (Applied
Biosystems).
Tabela III.18: Condições laboratoriais utilizados por cada reacção para a sequenciação automática
Reagentes
H2O bidestilada
Tampão BigDye
Oligonucleótido iniciador S ou AS (2pmol/ μL)
BigDye (Applied BioSystems)
DNA purificado
Quantidade (em μL)
3,5
3,5
1
0,5
1,5
As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; 25 ciclos
S- oligonucleótido directo; AS-oligonucleótido inverso;
Tabela III.19: Condições de PCR para a sequenciação automática
Sequenciação
Temperatura T(ºC)
Tempo
Desnaturação inicial
96
1´
Desnaturação
96
10´´
Emparelhamento dos
50*
5´´
oligonucleótidos iniciadores
Síntese de DNA
60
4´
*No PCR para sequenciação dos exões 11+12+13 e 14+15+16 do gene TfR2 a temperatura de emparelhamento dos
oligonucleótidos iniciadores utilizada foi de 60ºC.
III.6-Análise bioinformática
A análise bioinformática consiste na utilização de uma diversidade de bases de dados e de
programas informáticos que permitem análises tão diversas como a identificação de genes e
respectiva estrutura, tradução de sequências de nucleótidos em sequências de aminoácidos,
- 33 -
III-Materiais e Métodos
previsão de estruturas de ácidos nucleicos e de proteínas e de alterações nestas, assim como,
previsão sobre a localização e função de proteínas, entre outras (Saeys et al., 2007).
III.6.1-Análise das sequências nucleotídicas
A análise das sequências foi feita usando o software Chromas versão 2.33 disponível on line
(http://www.technelysium.com.au/chromas.html), de modo a identificar possíveis alterações
nos exões dos genes em estudo.
No caso de se encontrar alterações, recorreu-se às bases de dados Ensemble
(http://www.ensembl.org/index.html), GeneCards ® (http://www.genecards.org/) e PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) a fim de se verificar se o polimorfismo já havia sido
descrito.
III.6.2-Análise das alterações a nível proteico
A previsão do efeito das alterações encontradas a nível proteico baseou-se na utilização do
programa Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml). Esta é uma
ferramenta que prevê o possível impacto da substituição de um aminoácido na estrutura e
função da proteína. Esta previsão é baseada em regras empíricas directas que são aplicadas à
sequência e à informação estrutural e filogenética que caracterizam a substituição. De modo a
efectuar as previsões foi calculado através deste programa os modelos HumDiv e HumVar que
permitem avaliar o impacto de uma determinada alteração genética ao nível da proteína. O
primeiro, HumDiv, corresponde a uma compilação de todos os alelos com efeito prejudicial
conhecido sobre a função molecular causadora de doença mendeliana em humanos, presentes
no banco de dados UniProtkB (http://www.uniprot.org/), juntamente com as diferenças entre
as proteínas humanas e as suas homólogas de outras espécies de mamíferos, assumidas como
não prejudiciais. O HumVar é obtido usando todas as mutações que causam doenças em
humanos que estão descritas na base UniProtkB, juntamente com SNPs (polimorfismo de um
nucleótido) comuns que não estão envolvidos em patologias. Com o programa referido
anteriormente foram ainda efectuados alinhamentos das sequências de aminoácidos.
III.6.3-Análise do impacto das alterações nucleotídicas a nível do splicing
Para a previsão das alterações de splicing recorreu-se ao programa Human Splicing Analyser
(http://www.umd.be/HSF/) que é uma ferramenta que prevê os efeitos das mutações nos
sinais de splicing ou identifica estes locais em qualquer sequência humana. Este software
pesquisa sequências de acordo com matrizes de similaridade, determinadas anteriormente, e
que estão associadas a elementos que influenciam o processo de splicing de pré-mRNA
(Desmet et al., 2009).
- 34 -
IV-Resultados
IV-Resultados
IV.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro
Neste trabalho foram seleccionados 11 indivíduos com fenótipo de hiperferritinemia grave que
apresentavam níveis de ferritina superiores a 2500 μg/L (Tabela IV.20). Estes indivíduos já
haviam sido rastreados para a existência das mutações comuns no gene HFE, normalmente
associadas a Hemocromatose Hereditária do tipo I. A maioria dos indivíduos (número 3 ao 11
na Tabela IV.20) não apresenta os genótipos considerados de risco nesse gene. Dois desses
indivíduos (número 1 e 2 na Tabela IV.20) apresentam um genótipo de risco para HH (são
homozigóticos para a mutação C282Y) o que pode explicar, em parte, o fenótipo. Contudo, os
níveis de Ferritina destes indivíduos são bastante superiores à média apresentada por doentes
típicos com HH do tipo I, o que sugere que possam ter co-herdado outras mutações em outros
genes relacionados com o metabolismo do ferro que estejam a agravar o fenótipo.
Para a realização da pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do
ferro, nomeadamente no gene HFE, TfR-2, HJV, HAMP e BMP-6, foram escolhidas
metodologias já utilizadas no laboratório. Algumas foram optimizadas e outras implementadas
de novo. Assim, recorreu-se ao DNA dos referidos indivíduos e procedeu-se à amplificação por
PCR das sequências génicas a analisar, tal como descrito no capítulo de materiais e métodos.
Seguiu-se a sequenciação automática dos fragmentos e a leitura das respectivas sequências
que, nalguns casos, revelou a presença de alterações pontuais nalguns dos genes analisados
(Tabela IV.20). As alterações detectadas foram posteriormente estudadas ao nível da
interferência na estrutura proteica e no possível impacto no splicing do respectivo gene.
Tabela IV.20: Características dos indivíduos em estudo, genótipo HFE e outros genes onde foram
detectadas alterações
Indivíduo
Sexo
Idade
(anos)
Ferritina
sérica
(µg/L)
Ferro
(µg/dL)
Saturação
Transferrina
(%)
Gene HFE
H63D
C282Y
:20-60
91
HH
YY
73
61
31
100
HH
HD
HD
HH
HH
HD
HH
HD
DD
YY
CC
CC
CC
CY
CC
CC
CC
CC
11
M
**
4000
HD
*Gene/s relacionados com o metabolismo do Fe onde se encontraram alterações;
**Sem referência da idade do indivíduo;
CC
:15-200
:35-140
:20-50
1
F
56
:30-300
8000
:50-175
270
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M
M
F
M
M
M
F
F
M
48
33
31
61
71
49
44
29
50
3900
3499
3728
5026
3977
5390
2823
3488
9567
272
165
114
154
39
64
302
Gene/s
Alterados
*
BMP-6
TfR-2
HJV
BMP-6
BMP-6 e
TfR2
BMP-6
HD- Heterozigotia para a H63D; DD- Homozigotia para a H63D; HH- Indivíduo sem mutação H63D; CY- Heterozigotia
para a C282Y; YY- Homozigotia para a C282Y; CC- Indivíduo sem mutação C282Y;
Valor de Referência para indivíduos do sexo feminino;
Valor de Referência para indivíduos do sexo masculino;
- 36 -
IV-Resultados
IV.2-Pesquisa de alterações no gene HJV
IV.2.1-Alteração P124L
Após a aplicação da metodologia descrita no capítulo de materiais e métodos, no caso da
amostra do indivíduo 2 (portador da mutação C282Y em homozigotia) foi observada uma
alteração no exão 3 do gene HJV.
A sequenciação automática do fragmento de DNA amplificado com 681 pb, englobando o exão
3 do gene HJV (Figura IV.12; A e B) revelou uma transição C→T, em heterozigotia, no codão
124 (c.371 C→T), que tem como consequência a alteração do resíduo de prolina (CCT) para um
de leucina (CTT). Esta alteração não se encontra identificada na base de dados Ensemble
(http://www.ensembl.org/index.html consultado a 22-08-12), no GeneCards ®
(http://www.genecards.org/
consultado
a
22-08-12)
nem
no
PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed consultado a 22-08-12).
A
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 C/N
pb
2000
1000
300
B
P124L
Figura IV.12: Detecção e identificação da alteração P124L no exão 3 do gene HJV: A) Amplificação do
material genético visível em gel de agarose. B) Electroferograma da reacção de sequenciação
automática. M-Marcador corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo
negativo que corresponde a uma reação de PCR realizada na ausência de DNA; A amostra número 2
corresponde ao indivíduo número 2 na Tabela IV.20.
- 37 -
IV-Resultados
IV.2.1.1-Estudo do impacto da alteração P124L na proteína HJV
As sequências de aminoácidos das proteínas HJV de um grupo de espécies de mamíferos
diferentes (Figura IV.13) foram alinhadas utilizando a ferramenta bioinformática PolyPhen-2.
Neste alinhamento foi ainda incluída a sequência peptídica humana, tendo-se verificado que o
aminoácido nativo (P124) é altamente conservado entre espécies.
P124L
Figura IV.13: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína HJV de 10 espécies de
mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2. Homo sapiens-Homem; Oryctolagus cuniculusCoelho; Tursiops truncates-Golfinho; Felis catus-Gato; Loxodonta africana-Elefante; Tarsius syrichtaTarsius; Bos taurus-Boi; Canis familiaris-Cão; Microcebus murinus- Rato lemur; Cavia porcellusPorquinho-da-índia.
O programa Polyphen-2 foi também utilizado para calcular os modelos HumDiv e HumVar
(Figura IV.14) que permitem prever a influência da alteração provocada pela mutação na
proteína, ou seja o seu impacto na patogenicidade da proteína. Neste caso pretende-se
compreender em que medida a alteração P124L poderá interferir na estrutura final da HJV. No
modelo HumDiv esta alteração apresentou um score de 0,978 e no modelo HumVar de 0,913
indicando ambos uma previsão de impacto nocivo desta alteração ao nível da proteína.
Figura IV.14: Previsão da patogenicidade da alteração P124L na proteína HJV através do programa
Polyphen-2.
IV.2.1.2- Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
Embora a mutação P124L no gene HJV seja do tipo missense, ou seja com um impacto directo
de alteração de codão no gene e de aminoácido na proteína, há sempre a possibilidade deste
tipo de mutações poder também afectar, de algum modo, o processo de splicing. Esta hipótese
foi também analisada através de um estudo in silico. Assim, o estudo do efeito da alteração
- 38 -
IV-Resultados
c.371 C→T (P124L) a nível dos sinais de splicing foi efectuado usando o software Human
Splicing Finder (Tabela IV.21). Desta análise verificou-se que não surgiu nenhum novo local
aceitador ou dador de splicing e que desapareceu um motivo enhancer e um silencer, existindo
ainda o aparecimento de um silencer com score de 61,36.
Tabela IV.21: Descrição dos fenómenos de splicing provocados pela alteração c.371 C→T em
comparação com os fenómenos que ocorrem na forma nativa do RNA de HJV
Sinais de splicing
Score da
sequência nativa
(0-100)
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
Motivo silencer
Variação (%)
81,25
Score da
sequência
alterada
(0-100)
80,6
77,51
83,04
90,90
67,64
86,54
93,05
61,36
-
+11,65
Desaparece
Mantem-se
Novo
Desaparece
-0,8
IV.3-Pesquisa de alterações no gene BMP-6
IV.3.1-Alteração c.857+12 C→T
Na amostra do indivíduo número 1 (portador da mutação C282Y em homozigotia), foi
observada uma alteração na região intrónica a jusante do exão 2 do gene BMP-6, ou seja, no
intrão 2 deste gene.
Após a reacção de PCR que visou amplificar o exão e intrão 2 do referido gene, o produto foi
sujeito a uma electroforese em gel de agarose, permitindo a visualização do fragmento de 411
pb (Figura IV.15.A). Posteriormente, a sequenciação automática (Figura IV.15.B) permitiu a
identificação de uma transição C→T na IVS2. Encontrou-se esta alteração em heterozigotia na
posição +12 (c.857+12C→T), ou seja, 12 desoxirribonucleótidos após o final do exão 2 do
referido gene.
A
pb
M
1
2
3
4
5
6
2000
1000
300
100
- 39 -
7
8
9
10 C/N
IV-Resultados
B
Figura IV.15: Detecção e identificação da alteração c.857+12 C→T a jusante do exão 2 do gene BMP-6.
A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose. B) Electroferograma da reacção de
sequenciação automática. M-Marcador corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II;
C/N-Controlo negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; A amostra número 1
corresponde ao indivíduo número 1 na Tabela IV.20.
Esta alteração já havia sido identificada anteriormente com a referência rs2241669
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2241669).
IV.3.1.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
A análise do efeito da alteração c.857+12 C→T a nível do splicing não revelou alterações ao
nível dos locais aceitadores/dadores de splicing nem alterações significativas ao nível dos
scores dos motivos enhancer e silencer (Tabela IV.22).
Tabela IV.22: Descrição do efeito da alteração c.857+12 C→T no splicing do RNA de BMP-6
Sinais de splicing
Score da
sequência nativa
(0-100)
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
70,57
67,86
Motivo silencer
86,72
73,91
63,18
Score da
sequência
alterada
(0-100)
69,91
67,25
Não surgem diferenças
82,05
82,05
63,18
- 40 -
Variação (%)
-0,94
-0,9
Mantem-se
Mantem-se
Mantem-se
IV-Resultados
IV.3.2-Alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C
No exão 4 do gene BMP-6 foram detectadas duas alterações presentes simultaneamente no
indivíduo 4 (portador da mutação H63D em heterozigotia) e no indivíduo número 10 (portador
da mutação H63D em homozigotia).
Após as amostras de DNA terem sido sujeitas à reacção de PCR, confirmou-se a amplificação
do fragmento do exão 4 do gene BMP-6 com o tamanho esperado (1216 pb) (Figura IV.16.A).
A sequenciação automática destes fragmentos (Figura IV.16.B e C) revelou uma transição de
C→T, em heterozigotia no nucleótido 1029 (c.1029 C→T), que altera o codão GCC para GCT.
Essa alteração não tem consequência ao nível da alteração dos aminoácidos, sendo que ambos
os codões codificam o aminoácido alanina. No mesmo fragmento (Figura IV.16.D e E) foi ainda
identificada uma transversão de G→C, em heterozigotia no nucleótido 1104 (c.1104 G→C),
que altera o codão GTG para GTC. Contudo esta alteração não tem, mais uma vez,
consequência ao nível da alteração dos aminoácidos, sendo que ambos os codões codificam
uma valina.
Ambas as alterações, c.1029 C→T e c.1104 G→C, já se encontram descritas correspondendo,
respectivamente, às referências rs61733611 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/
snp_ref.cgi?rs=rs61733611) e rs17557 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?search
Type=adhoc_search&type=rs&rs=rs17557).
A
pb
M
1
2
3
4
5
6
2000
1000
300
B
C
- 41 -
7
8
9 10 C/N
IV-Resultados
D
E
Figura IV.16: Detecção e identificação das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no gene BMP-6. A)
Amplificação do material genético, visível em gel de agarose, do exão 3, do intrão 3 e exão 4 do gene
BMP-6. B e C) Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 4 e
número 10, respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1029 C→T. D e E)
Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 4 e número 10,
respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1104 G→C. M-Marcador corresponde ao
marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma
amplificação feita sem DNA; As amostras número 3 e 9 correspondem, respectivamente, aos indivíduos
número 4 e 10 na Tabela IV.20.
IV.3.2.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing
Dado que a alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C, apesar de encontradas na região
codificante, não geram substituição de aminoácidos, o impacto destas nos sinais de splicing foi
analisado (Tabela IV.23). No que diz respeito à alteração c.1029 C→T verificou-se que não
surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, no entanto, os scores obtidos para
locais aceitadores putativos previamente existentes aumentaram ligeiramente. Os motivos
enhancer mantêm-se todos e verifica-se o aparecimento de dois novos motivos silencer com
scores de 60,99 e 62,45. Por sua vez a alteração c.1104 G→C não cria nenhum local novo
aceitador ou dador de splicing, no entanto leva à eliminação de dois motivos enhancer (scores
de 74,38 e 78,38 na sequência nativa) e ao aparecimento de um novo com score mais elevado
de 84,76.
- 42 -
IV-Resultados
Tabela IV.23: Descrição do efeito das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no splicing do RNA de BMP6
Alteração
Sinais de splicing
Score da
sequência nativa
(0-100)
c.1029 C→T
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
78,03
85,51
80,56
77,50
82,22
87,46
81,01
65,60
73,94
Score da
sequência
alterada
(0-100)
78,88
86,4
56,72
76,09
76,77
80,36
75,65
75,65
72,1
60,99
62,45
70,07
74,38
78,16
80,20
Não surgem diferenças
84,76
70,18
Motivo silencer
c.1104 G→C
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
Motivo silencer
Variação (%)
+1,08
+1,05
Desaparece
Novo
Mantem-se
Mantem-se
Mantem-se
Mantem-se
Mantem-se
Novo
Novo
-5,23
Novo
Desaparece
Desaparece
Mantem-se
IV.3.3-Alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C
Foram encontradas duas alterações a jusante do exão 5 do gene BMP-6, ou seja no intrão 5.
A alteração c.1281+24 T→C estava presente nos indivíduos número 1 (homozigótico para a
mutação C282Y), 4 e 11 (portadores da mutação H63D em heterozigotia) e 10 (homozigótico
para a mutação H63D). No que diz respeito ao indivíduo número 1 esta alteração foi
encontrada em homozigotia enquanto nos outros se verificou estar em heterozigotia. A
segunda alteração encontrada nesta região, c.1281-197 T→C, estava presente nos indivíduos
1, 4 e 10. Sendo que o indivíduo 1 é o único que a possui no estado homozigótico.
Após a reacção de PCR, a análise em gel de agarose permitiu a visualização das bandas que
correspondem à amplificação do fragmento de 1449 pb, correspondente ao exão 5, 6 e 7 do
gene BMP-6 (Figura IV.17.A). De seguida, a sequenciação automática (Figura IV.17.B, C, D e E)
permitiu a identificação de uma transição T→C na IVS5, na posição +24 (c.1281+24 T→C), ou
seja, 24 desoxirribonucleótidos a jusante do exão 5 do referido gene. A sequenciação
automática (Figura IV.17.F, G e H) da mesma região permitiu ainda a identificação da transição
T→C na IVS5 localizada na posição c.1281-197 T→C, ou seja, 197 desoxirribonucleótidos a
montante do exão 6.
- 43 -
IV-Resultados
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pb
1449
B
C
D
E
F
G
- 44 -
C/N
IV-Resultados
H
Figura IV.17: Detecção e identificação das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no gene BMP6. A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose do exão 4, 5 e 6 e do intrão 4 e 5 do
gene BMP-6. B, C, D e E) Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos
número 1, 4, 10 e 11 respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1281+24 T→C. F, G e H)
Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 1, 4 e 10,
respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1281-197 T→C. C/N-Controlo negativo que
corresponde a uma amplificação feita sem DNA; As amostras número 1, 3, 9 e 10 correspondem,
respectivamente, aos indivíduos número 1, 4, 10 e 11 na Tabela IV.20.
A alteração c.1281+24 T→C já havia sido identificada anteriormente e designada pela
referência rs267172 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=267172). Por
outro lado, a alteração c.1281-197 T→C não havia sido ainda descrita.
IV.3.3.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing
O impacto destas duas alterações (c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C) foi analisado ao nível do
impacto destas nos sinais de splicing (Tabela IV.24). Relativamente à alteração c.1281+24 T→C
verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, para além disso,
surgiram dois novos motivos enhancer com scores de 80,86 e de 80,96. Por sua vez a alteração
c.1281-197 T→C também foi analisada recorrendo ao human splicing finder. Desta análise
verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, sendo que o
local dador de splicing da sequência alterada apresenta um score de 39,28 enquanto o da
sequência nativa é de 66,11. Para além disso, verifica-se o aparecimento de um motivo
enhancer e o desaparecimento de um motivo silencer.
- 45 -
IV-Resultados
Tabela IV.24: Descrição do efeito das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no splicing do RNA
de BMP-6
Alteração
Sinais de splicing
Score da
sequência nativa
(0-100)
c.1281+24 T→C
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
70,39
Score da
sequência
alterada
(0-100)
69,49
75,41
82,46
66,91
76,27
83,23
Não surgem diferenças
76,83
84,31
80,86
80,96
66,91
72,92
81,98
Mantem-se
Mantem-se
Novo
Novo
Mantem-se
Mantem-se
-1,51
66,11
39,28
-40,59
79,72
75,18
62,75
Não surgem diferenças
81,13
76,77
77,21
-
Mantem-se
Novo
Mantem-se
Desaparece
Motivo silencer
c.1281-197 T→C
Local aceitador de
Splicing
Local dador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
Motivo silencer
Variação (%)
-1,27
IV.3.4-Alteração c.1542+4 G→A
No indivíduo número 10 (portador da mutação H63D em homozigotia) foi observada outra
alteração, esta na região 3´-UTR do exão 7 do gene BMP-6.
A sequenciação automática deste fragmento (Figura IV.18) permitiu identificar uma transição
G→A no exão 7, em heterozigotia, na posição +4, ou seja, 4 desoxirribonucleótideos depois do
codão de terminação do referido gene. Verificou-se ainda, que esta alteração não havia sido
identificada anteriormente nas bases de dados consultadas.
Figura IV.18: Detecção e identificação da alteração c.1542+4 G→A no gene BMP-6. Electroferograma
da reacção de sequenciação automática no indivíduo número 10.
- 46 -
IV-Resultados
IV.3.4.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
Verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, e surgiu um
novo Branch Point, assim como um motivo enhancer, este último com score de 82,10 (Tabela
IV.25).
Tabela IV.25: Descrição do efeito da alteração c.1542+4 G→A no splicing do RNA de BMP-6
Sinais de splicing
Score da
sequência nativa
(0-100)
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
Motivo silencer
Variação (%)
78,4
Score da
sequência
mutada
(0-100)
78,33
52,64
83,11
62,23
82,27
82,10
62,23
Novo
Desaparece
Novo
Mantem-se
-0,08
IV.4-Pesquisa de mutações no gene TfR2
IV.4.1-Alteração c.1851 C→T
No presente estudo verificou-se a existência de uma alteração no gene TfR2 no exão 16,
presente na mostra do indivíduo número 10. Inicialmente, o material genético após ter sido
sujeito a uma reacção de PCR foi analisado numa electroforese em gel de agarose (Figura
IV.19.A). Esta análise permitiu a confirmação da amplificação do fragmento com 686 pb que
resulta da amplificação dos exões 14, 15 e 16 do gene TfR2 e dos respectivos intrões. Foi
identificada, recorrendo à sequenciação automática (Figura IV.19.B), uma transversão G→T no
exão 16, em heterozigotia, que altera o codão 617 de GCC para GCT, sendo que ambos
codificam uma alanina.
Esta alteração havia já sido identificada anteriormente e identificado pela referência
rs2075674 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2075674).
A
M
1
2
3
4
5
6
pb
1500
1000
500
- 47 -
7
8
9
10 C/N
IV-Resultados
B
Figura IV.19: Detecção e identificação da alteração c.1851 C→T no exão 16 do gene TfR2. A)
Amplificação do material genético visível em gel de agarose do exão 14, 15 e 16 e dos respectivos
intrões. B) Electroferograma da reacção de sequenciação automática. M-Marcador, corresponde ao
marcador de peso molecular DNA ladder 100bp plus; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma
amplificação feita sem DNA; A amostra número 9 corresponde ao indivíduo número 10 na Tabela IV.20.
IV.4.1.1-Estudo do impacto da alteração ao nível do splicing
Com esta análise verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de
splicing, desapareceu um motivo enhancer que na forma nativa tinha um score de 80,00 e
surgiu um novo motivo silencer com score de 63,28 (Tabela IV.26).
Tabela IV.26: Descrição do efeito da alteração c.1851 C→T no splicing do RNA de TfR2
Score da
sequência nativa
(0-100)
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
Motivo silencer
82,73
Score da
sequência
alterada
(0-100)
83,44
78,12
84,69
80,72
80,00
75,65
63,36
Não surgem diferenças
82,05
70,77
70,77
80,97
63,28
73,23
Variação (%)
+0,86
Mantem-se
Mantem-se
Mantem-se
Desapareceu
Mantem-se
Novo
Desapareceu
IV.4.2-Alteração R752H
No caso da amostra do indivíduo 1 (homozigótico para a mutação C282Y), para além das
alterações já referidas, foi detectada uma alteração no exão 18 do gene TfR2.
O DNA do indivíduo em estudo foi sujeito a uma reacção de PCR, em seguida a análise em gel
de agarose permitiu a observação da banda que resultou da amplificação do exão 18 do gene
TfR2 (Figura IV.20.A), fragmento esse com 434 pb. A sequenciação automática (Figura IV.20.B)
- 48 -
IV-Resultados
revelou uma transição G→A, em heterozigotia no codão 752 (c.2255 G→A), que tem como
consequência a alteração do resíduo de arginina (CGC) para um de histidina (CAC).
Esta alteração já se encontra identificada pela designação
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=rs41295942)
rs41295942
A
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
C/N
2000
1000
300
B
Figura IV.20: Detecção e identificação da alteração R752H no exão 18 do gene TfR2. A) Amplificação do
material genético visível em gel de agarose. B) Electroferograma da reacção de sequenciação
automática. M-Marcador, corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo
negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; I1- Indivíduo número 1; A amostra
número 1 corresponde ao indivíduo número 1 na Tabela IV.20.
VI.4.2.1-Estudo do impacto da alteração R752H na proteína TfR2
Realizou-se um alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína TfR2 de um grupo de
espécies de mamíferos diferentes (Figura VI.21), no programa bioinformático PolyPhen-2.
Neste alinhamento foi ainda incluída a sequência peptídica humana, tendo-se verificado que o
aminoácido nativo (R752) é altamente conservado entre as diferentes espécies.
- 49 -
IV-Resultados
R752H
*Sequências previstas
Figura VI.21: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína TfR2 de espécies de mamíferos
diferentes, utilizando o software PolyPhen-2. Homo sapiens-Homem; Equus caballus-Cavalo;
Oryctolagus cuniculus-Coelho; Sus scrofa-Javali; Canis familiaris-Cão; Canis lupus-Lobo; Bos taurus-Boi;
Loxodonta africana-Elefante.
O programa Polyphen-2 foi também utilizado para calcular os modelos HumDiv e HumVar
(Figura IV.22) de modo a prever a influência da alteração provocada pela alteração na
proteína. O modelo HumDiv apresentou um score de 1 e o HumVar de 0,980, valores que
indicam uma levada probabilidade desta alteração levar a modificações graves na proteína
TfR2.
Figura IV.22: Previsão da patogenicidade da alteração R752H na proteína TfR2 através do programa
Polyphen-2.
IV.4.2.2-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing
Da análise efectuada aos potenciais sinais de splicing verificou-se que não surgiu nenhum novo
local aceitador ou dador de splicing mas que desapareceu um motivo enhancer e um motivo
silencer (Tabela VI.27).
- 50 -
IV-Resultados
Tabela VI.27: Descrição do efeito da alteração c.2255 G→A no splicing do RNA de TfR2
Score da
sequência nativa
(0-100)
Local aceitador de
Splicing
Branch Point
Motivo enhancer
Motivo silencer
81,84
Score da
sequência
alterada
(0-100)
81,73
72,31
77,07
74,54
62,75
77,39
Não surgem diferenças
72,31
72,31
76,12
- 51 -
Variação (%)
-0,14
Desaparece
Mantem-se
Mantem-se
Desaparece
Mantem-se
V-Discussão dos Resultados
V-Discussão dos Resultados
V.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro
Nos 11 casos seleccionados para este estudo, foram detectadas 9 alterações pontuais das
quais 2 são missense e 7 SNPs (polimorfismo de um nucleótido). Das alterações detectadas, 6
estão já descritas enquanto as restantes 3 são reportadas pela primeira vez neste trabalho
(P124L no gene HJV, c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A no gene BMP-6). Do total das
alterações identificadas, 4 são recorrentes na amostra testada, ou seja, foram encontradas em
mais do que um indivíduo. A localização das alterações encontra-se esquematizada na Figura
V.23.
HJV
BMP-6
TfR2
Alteração missense
SNPs
Figura V.23: Esquema representativo dos genes estudados e da localização das alterações
encontradas. As caixas a azul representam os exões do gene HJV, BMP-6 e TfR2.
A Tabela V.28 resume os resultados obtidos relativamente às mutações detectadas nos
diferentes indivíduos. Verificou-se que dos 11 indivíduos testados apenas 5 se mostraram
portadores de mutações nos genes HJV, BMP-6 ou TfR2. De seguida, discute-se
pormenorizadamente cada uma das situações.
- 53 -
V-Discussão dos Resultados
Tabela V.28: Alterações moleculares identificadas neste estudo
Indivíduo
nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Genótipo HFE
HH
HH
HD
HD
HH
HH
HD
HH
HD
DD
HD
YY
YY
CC
CC
CC
CY
CC
CC
CC
CC
CC
Genes
onde se
identificou
alteração
BMP-6
TfR2
HJV
S.A.
BMP-6
S.A.
S.A.
S.A.
S.A.
S.A.
BMP-6
TfR2
BMP-6
Alterações no
DNA
Localização
c.857+12 C→T
c.1281+24
T→C
c.1281-197*
T→C
c.2255 G→A
c.371 C→T *
c.1281+24
T→C
c.1281-197
T→C*
c.1029 C→T
c.1104 G→C
c.1281+24
T→C
c.1281-197
T→C*
c.1029 C→T
c.1104 G→C
c.1542+4
G→A *
Intrão 2
Intrão 5
+/+
Intrão 5
+/+
Exão 18
Exão 3
Intrão 5
+/+/-
Intrão 5
+/-
Exão 4
Exão 4
Intrão 5
+/+/+/-
Intrão 5
+/-
Exão 4
Exão 4
Região
3´UTR do
exão 7
Exão 16
Intrão 5
+/+/+/-
A343A
V368V
-
+/+/-
A617A
-
c.1851 C→T
c.1281+24
T→C
Alelos
afectados
Mutação
na
proteína
+/-
-
+/-
R752H
P124L
-
A343A
V368V
-
HD- Heterozigotia para a H63D; DD- Homozigotia para a H63D; HH- Indivíduo sem mutação H63D; CY- Heterozigotia
para a C282Y; YY- Homozigotia para a C282Y; CC- Indivíduo sem mutação C282Y;
S.A.-Sem Alterações
*-Alterações descritas pela primeira vez neste estudo;
+/+ Alteração encontrada em homozigotia;
+/- Alteração encontrada em heterozigotia;
V.2-Discussão da relação genótipo / fenótipo nos diversos casos analisados
V.2.1-Caso 1
O caso número 1 corresponde a um indivíduo do sexo feminino com 56 anos de idade com
8000 µg/L de ferritina. Este indivíduo possui um genótipo de risco para o desenvolvimento de
Hemocromatose Hereditária do tipo I visto ser homozigótico para C282Y. Contudo o facto de
ser mulher, ainda relativamente jovem, e ter um nível elevadíssimo de ferritina levou-nos a
seleciona-la para análise de mutações em outros genes relacionados com o metabolismo do
- 54 -
V-Discussão dos Resultados
ferro. A co-herança do genótipo de risco em HFE com mutações em outros genes relacionados
com o metabolismo do ferro já tem sido descrita na literatura como um factor agravante do
fenótipo de Hemocromatose (Biasiotto et al., 2004; Van Dijk et al., 2007). Esta análise levou à
identificação de 4 alterações diferentes nos genes em estudo, 3 delas presentes no BMP-6 e
uma no TfR2.
No gene BMP-6 foi detectada a alteração c.857+12 C→T no estado heterozigótico, localizada a
jusante do exão 2 deste gene. A análise de splicing (Tabela IV.22) revelou que esta alteração
não leva a alteração dos locais aceitadores ou dadores de splicing, para além de não implicar
nenhuma alteração do Branch Point assim como dos scores dos motivos enhancer e silencer.
Deste modo, é pouco provável que promova alterações no splicing, como sejam mecanismos
de splicing alternativo. Esta alteração havia já sido descrita na base de dados do PubMed com
uma frequência de alelo minor, T, de 10,3% (MAF: minor allele frequency). Este é um conceito
que se refere à frequência na qual o alelo menos comum para cada polimorfismo ocorre numa
determinada população e tem sido amplamente empregado em estudos de análise do
genoma. A população utilizada para a determinação da MAF para esta alteração, 1000Genome
phase 1, engloba a análise de 1094 indivíduos provenientes de várias partes do mundo. Em
suma, podemos então concluir que esta alteração se trata de um polimorfismo de um
nucleótido (SNP), o qual não parece ter associação a patologia.
Neste mesmo indivíduo foram também encontradas no gene BMP-6 as alterações c.1281+24
T→C e c.1281-197 T→C em estado homozigótico, localizadas na região intrónica a jusante do
exão 5 do gene BMP-6. A alteração c.1281+24 T→C está já descrita no PubMed, com uma MAF
(alelo C) de 34,9% (1000Genome phase 1), sendo assim um polimorfismo muito frequente. A
análise de splicing (Tabela IV.24) efectuada para este polimorfismo revela que esta alteração
não leva à modificação dos locais aceitadores ou dadores de splicing, assim como do Branch
Point. Contudo, verifica-se o aparecimento de dois motivos enhancer cujos scores não
ultrapassam os 81%. Dado que este local na sequência nativa tinha já um consenso elevado
para a presença de motivos enhancer, pode concluir-se que os dois novos motivos que aqui
aparecem não deverão influenciar grandemente o mecanismo de splicing.
Por outro lado, a alteração c.1281-197 T→C em BMP-6 não se encontra descrita no PubMed. A
análise do efeito desta alteração ao nível do splicing (Tabela IV.24) revelou que esta leva à
diminuição acentuada do score de um local dador de splicing de 66,11 para 39,28 na presença
da mutação, não se tendo verificado alterações ao nível do Branch Point. Verificou-se ainda
que esta também leva ao aparecimento de um motivo enhancer e ao desaparecimento de um
motivo silencer (ambos com valores de score baixos). O facto de se verificar a grande
diminuição do score para o local dador de splicing, conferida pelo polimorfismo, apenas
poderá ter significado biológico no caso de naturalmente ocorrer alguma variante de splicing
do BMP-6, a qual resulte da inclusão parcial do intrão 5 até sensivelmente à posição c.1281197. Contudo, não se encontra descrito na literatura qualquer referência a mecanismos de
splicing alternativo associados ao BMP-6. Assim parece pouco provável que haja qualquer
influência deste polimorfismo no fenótipo de sobrecarga em ferro deste indivíduo.
Para além das alterações acima descritas foi ainda detectada no indivíduo número 1 a
alteração R752H (c.2255 G→A) no gene TfR2. Esta alteração já foi previamente descrita com
- 55 -
V-Discussão dos Resultados
uma MAF associada ao alelo A de 9% (Pubmed). Ao nível proteico conduz à substituição do
aminoácido arginina pelo aminoácido histidina. A arginina é um aminoácido polar com carga
positiva e índice de hidrofobicidade de -4,5, enquanto a histidina é polar, tem carga neutra e
tem um índice de hidrofobicidade de -3,2 (http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid
consultado a 04-09-12). O facto de ambos os aminoácidos serem hidrofílicos não leva a uma
previsão de alteração ao nível do folding da proteína. Contudo, o alinhamento múltiplo (Figura
IV.20) realizado para a zona desta mutação, revelou que o resíduo R752 é muito conservado
em termos evolutivos, pelo que poderia ser importante para a função da proteína. Esta
previsão é corroborada pelos scores obtidos pelos modelos HumDiv e HumVar indicando um
impacto potencialmente patogénico associado a esta alteração (Figura IV.21).
No que diz respeito ao seu impacto ao nível do processamento do RNA (Tabela IV.27),
verificou-se que esta alteração não deverá estar implicada em mecanismos de splicing
alternativo, uma vez que não origina novos locais aceitadores ou dados de splicing. Mais ainda
as variações detectadas nos motivos silenciadores e enhancer de splicing não são consideradas
significativas.
Em suma, existem dados obtidos neste estudo que indicam um possível impacto negativo da
R752H ao nível da estrutura (e possivelmente da funcionalidade) da proteína TfR2. Contudo,
um estudo previamente publicado, no qual foi analisada uma amostra de 51 indivíduos com
sobrecarga em ferro, concluiu que a frequência desta alteração era semelhante neste grupo de
indivíduos quando comparada com a obtida para o grupo controlo (Santos et al., 2011). Foi,
deste modo, descartada a hipótese por estes autores de este polimorfismo estar associado à
sobrecarga em ferro nos indivíduos que dela são portadores. No entanto, não se pode
descartar por completo que tenha esse efeito num indivíduo que, já por si, é afectado pela
homozigotia da mutação C282Y no gene HFE (que é o caso do indivíduo número 1). Está
descrito que num estado fisiológico, a proteína HFE se encontra associada ao receptor TfR1 ao
nível da membrana celular. Aquando de um aumento dos níveis circulantes de ferro supõe-se
que a proteína HFE se dissocie deste receptor e passe a associar-se ao TfR2, desencadeando
uma cascata de sinalização que culmina com o aumento da expressão de hepcidina no fígado
(Schmidt et al., 2009). É ainda hipotizado que a TfR2 possa ainda estar envolvido na activação
da expressão da hepcidina por um mecanismo independente da HFE. Efectivamente, o
knockdown conjunto de HFE e TfR2 gera um fenótipo mais grave do que o knockdown
individual de cada um destes genes (Wallace et al., 2009). Deste modo, uma alteração no
estado heterozigótico ao nível do gene do TfR2 poderá não ter um efeito notório num
indivíduo sem alterações no gene HFE, no entanto podemos levantar a hipótese de um efeito
patológico aditivo no caso deste indivíduo com mutações em HFE.
Em suma, a heterozigotia para a R752H em TfR2 aliada à homozigotia para a C282Y em HFE
poderá estar na causa da elevadíssima hiperferritinémia do indivíduo 1. No entanto, será
necessária a realização de estudos funcionais relativamente à mutação R752H para confirmar
esta hipótese.
- 56 -
V-Discussão dos Resultados
V.2.2-Caso 2
Na amostra do caso número 2, correspondente a um indivíduo do sexo masculino de 48 anos,
com o genótipo de risco no gene HFE e com um valor de ferritina sérica de 3900 µg/L, foi
detectada por sequenciação automática a alteração c.371C→T, localizada no exão 3 do gene
HJV.
Esta alteração no DNA leva à substituição do aminoácido prolina pelo aminoácido leucina na
proteína (P124L). A prolina é um aminoácido apolar, com carga neutra e com índice de
hidrofobicidade de -1,6, enquanto a leucina, também apolar de carga neutra, tem um índice de
hidrofobicidade positivo de 3,8. (http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid consultado a 31-0812). O índice de hidrofobicidade dos aminoácidos é muito relevante no folding das proteínas.
Os aminoácidos com este índice positivo têm características hidrofóbicas, por outro lado, os
que apresentam índices negativos são hidrofílicos. Assim sendo, a diferença de hidrofobicidade
entre os aminoácidos resultantes da mutação P124L podem alterar a conformação da proteína
HJV, uma vez que os resíduos hidrofóbicos tendem a localizar-se no interior da proteína,
enquanto os hidrofílicos a ser expostos ao contacto com o ambiente aquoso.
A informação obtida no alinhamento de sequências homólogas em espécies diferentes é
reconhecido como um factor importante para compreender a variação genética em humanos
(Miller and Kumar, 2001). Num determinado conjunto de sequências, uma fracção de
aminoácidos está conservada mesmo entre espécies distantes que divergiram há milhares de
anos. Ao longo da evolução as variações que aparecem nessas posições conservadas estiveram
sob uma pressão selectiva muito forte, sugerindo que esses resíduos de aminoácidos são
críticos para a função da proteína. Assim, o resultado de alinhamentos múltiplos
interespecíficos pode ser informativo de quais as regiões proteicas mais susceptíveis a
promover o desenvolvimento de uma doença quando estão mutadas em humanos. O
alinhamento múltiplo (Figura IV.12) realizado para a zona desta alteração, revelou que a P124
é um resíduo muito conservado, pelo que poderá ser importante para a função da proteína.
A alteração c.371 C→T localiza-se no exão 3 do gene, local que codifica para 3 domínios
distintos da proteína HJV: um péptido de sinal, um domínio RGD (repulsive guidance domain) e
um factor de von Willebrand. Mutações nestes locais podem comprometer a interacção com
as integrinas durante a interação proteína-célula, o que pode causar uma diminuição ou uma
perda de função por parte da proteína HJV (Giancotti, 1999). No nosso caso em estudo, a
probabilidade desta alteração causar mudanças significativas na proteína foi ainda evidenciada
pelos scores (HumDiv e HumVar) calculados pelo Polyphen-2 (Figura IV.13). Concluímos assim,
através da análise dos diversos resultados referentes à proteína que, a nova mutação P124L
em HJV, terá muito provavelmente, efeito negativo sobre a funcionalidade da HJV.
A análise efectuada pelo software Human Splicing Finder (Tabela IV.21) revelou que esta
mutação provavelmente não estará implicada em processos de splicing alternativo, uma vez
que não são originados novos locais aceitadores ou dadores de splicing. Verifica-se ainda que
surge um novo motivo silenciador de splicing mas este apresenta um score muito baixo para
ser considerado relevante.
- 57 -
V-Discussão dos Resultados
Deste modo, provavelmente, a heterozigotia para a nova mutação P124L em HJV aliada à
homozigotia para a C282Y em HFE pode justificar o fenótipo apresentado por este indivíduo
(Tabela IV.20). Estão também já descritos na literatura alguns casos nos quais alterações em
heterozigotia nos genes HJV e HAMP estão associados ao agravamento do fenótipo de
hemocromatose em indivíduos homozigóticos para a C282Y ou compostos heterozigóticos
H63D/C282Y (Biasiotto et al., 2004; Van Dijk et al., 2007).
V.2.3-Caso 4
O caso número 4 corresponde a um indivíduo do sexo feminino, jovem com apenas 31 anos de
idade com 3728 µg/L de ferritina sérica. Não apresenta genótipo de risco em HFE, pois apenas
apresenta heterozigotia para a mutação H63D. De notar que a H63D é bastante prevalente na
população portuguesa (frequência alélica entre 17 e 19%) (Cardoso et al., 2001), pelo que na
população em geral é muito frequente encontrarem-se indivíduos heterozigóticos para este
alelo, não sendo, só por si, justificação para o fenótipo apresentado.
A análise genética efectuada neste estudo a este indivíduo levou à identificação de 4
alterações diferentes, todas localizadas no gene BMP-6.
Duas dessas alterações já foram discutidas neste capítulo do trabalho, a c.1281+24 T→C e
c.1281-137 T→C, e foram identificadas no estado heterozigótico. Para além destas foram ainda
encontradas as alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C, ambas localizadas no exão 4.
A alteração c.1029 C→T encontra-se descrita no PubMed com uma MAF para o alelo T de 1,9%
(amostra 1000Genome phase 1), sendo assim um polimorfismo relativamente raro ao qual não
foi atribuída, até a data, importância clinica. A análise de splicing (Tabela IV.23) revelou que
esta alteração não leva a variações significativas no que respeita aos locais aceitadores de
splicing. Para além disso, verifica-se que aparecem 2 novos motivos silencer. Os scores obtidos
para estes motivos são relativamente baixos (60,99 e 62,45) quando comparados com os
valores observados para os 5 motivos enhancer localizados na mesma região (76,09; 76,77;
80,36; 75,65 e 75,65). Deste modo pode-se afirmar que esta alteração deverá ser inócua no
que respeita a alterações no processo de splicing. A alteração c.1104 G→C também já se
encontra descrita no PubMed, sendo a MAF para o alelo C, de 40,7% (1000Genome phase 1). É
deste modo classificado como um polimorfismo relativamente frequente e, provavelmente,
sem relevância clinica. A análise de splicing (Tabela IV.23) revela que esta alteração não
deverá levar a alterações nos locais dadores de splicing. Para além disso, verifica-se que
desaparecem dois motivos enhancer com scores de 74,38 e 78,16. O desaparecimento desses
motivos no exão deixaria em aberto a hipótese de este deixar de ser reconhecido como tal e
poder haver o aparecimento de um variante de splicing com a exclusão do exão 4. Contudo
com a alteração é também criado um novo motivo enhancer, motivo este com um score
superior ao dos motivos que desaparecem (84,76) e deste modo parece compensar a ausência
dos motivos nativos.
Deste modo, as alterações encontradas neste indivíduo, juntamente com a heterozigotia para
a H63D não deverão ser suficientes para justificar o fenótipo apresentado por este indivíduo.
Fica assim por explicar este fenótipo. Levanta-se a hipótese de que a lesão molecular possa
ainda ser encontrada noutro gene também associado com o metabolismo do ferro.
- 58 -
V-Discussão dos Resultados
Alternativamente ou concomitantemente poderão existir ainda causas de índole ambiental ou
outras patologias associadas.
V.2.4- Caso 10
O caso número 10 corresponde a um indivíduo do sexo masculino com 50 anos de idade, com
homozigotia para a mutação H63D no gene HFE, e com um nível altíssimo de 9567 µg/L de
ferritina sérica. Aqui foram identificadas 6 alterações diferentes, 5 no gene BMP-6 e uma no
TfR2.
No BMP-6 foram encontradas as seguintes alterações: c.1281+24 T→C, c.1281-197 T→C,
c.1029 C→T, c.1104 G→C e c.1542+4 G→A. Todas as alterações se encontraram no estado de
heterozigotia, tendo as 4 primeiras já sido discutidas nos casos acima descritos. A alteração
c.1542+4 G→A não se encontra descrita no PubMed. A análise de splicing (Tabela IV.25) revela
que não existe alteração no local aceitador de splicing, por outro lado há um aumento do valor
do score do local de branch point de 52,64 para 82,27, para além disso verifica-se o
desaparecimento de um motivo enhancer concomitante com o aparecimento de outro com
um score semelhante. O branch point corresponde a um loop que ocorre durante o processo
de splicing. Após o aparecimento dessa estrutura, ocorrem reacções que levam à libertação do
intrão e à fusão dos exões adjacentes. Por fim, o intrão é separado do complexo pelo
spliceossoma, sendo posteriormente degradado (Corvelo et al., 2010).
Relativamente à mutação encontrada em heterozigotia no gene TfR2, c.1851 C→T (A617A), já
se encontra descrita no PubMed com uma MAF de 15,4% para o alelo T e sendo um
polimorfismo descrito como não tendo importância clinica relevante (Lee et al., 2001; Santos
et al., 2011). A análise de splicing (Tabela IV.26) revelou que não existem alterações que
justifiquem a existência de mecanismos de splicing alternativo.
Apesar de, neste indivíduo, terem sido encontradas várias alterações aliadas à homozigotia
para a H63D no gene HFE, o quadro de sobrecarga em ferro neste indivíduo é extremamente
grave e o genótipo observado não o justifica.
V.2.5-Caso 11
O caso número 11 corresponde a um indivíduo do sexo masculino, cuja informação relativa à
idade nos é desconhecida. É sabido que apresenta heterozigotia para a mutação H63D no gene
HFE. Neste caso encontrou-se apenas uma alteração no gene BMP-6, a c.1281+24 T→C em
heterozigotia, anteriormente descrita para o indivíduo número 1. Os valores de ferritina
observados neste caso são de 4000 µg/L, um fenótipo característico de excesso de ferro, mas
que é pouco provável que seja justificado pela presença da mutação anteriormente referida
juntamente com a H63D em heterozigotia no gene HFE.
V.2.6-Casos onde não se detectaram alterações nos genes analisados
Nos casos número 3 e de 5 a 9 não se encontraram alterações nos genes analisados, foi apenas
confirmada a presença ou ausência das mutações comuns (C282Y e H63D) no gene HFE. Estes
indivíduos à semelhança dos casos discutidos anteriormente possuíam uma hiperferritinemia
muito grave (ferritina sérica > 2500 μg/L) que não foi possível justificar com este estudo.
- 59 -
V-Discussão dos Resultados
Colocamos a hipótese que o excesso de ferro destes indivíduos seja resultado de uma
Hemocromatose secundária que ocorre como resultado de outra patologia, exemplo hepatite
C, ou de uma condição que leve a uma sobrecarga em ferro, exemplo múltiplas transfusões.
Outros factores comuns como o alcoolismo também podem justificar o fenótipo destes
doentes uma vez que indivíduos com doença hepática provocada pelo alcoolismo apresentam
frequentemente um aumento dos depósitos de ferro no organismo que são reflectidos por
elevados níveis séricos de ferro (Ferritina sérica e saturação da Transferrina) (Harrison-Findik,
2007). Não excluímos no entanto a hipótese da hiperferritinemia apresentada por estes 6
indivíduos ser de origem genética, porque podem possuir alterações em genes que não
estudamos e que podem estar implicados no metabolismo do ferro, ou em regiões não
analisadas nos genes estudados.
- 60 -
VI-Conclusão
VI-Conclusão
A desregulação da homeostase do ferro é muito comum e origina situações patológicas que
vão desde a anemia à sobrecarga em ferro. A Hemocromatose Hereditária do tipo I (ou
clássica) é uma doença autossómica recessiva, causada por mutações no gene HFE, frequente
em Caucasianos de ascendência Norte-Europeia. É caracterizada pela absorção
inapropriadamente elevada de ferro da alimentação, resultante da disrupção dos mecanismos
moleculares que deveriam manter a homeostase do ferro no organismo. Apesar das
manifestações clínicas da HH variarem muito, os sintomas mais característicos são artrite,
arritmia, falha cardíaca, diabetes, cirrose hepática, fadiga, hiperpigmentação da pele,
hipotiroidismo, hipogonadismo e carcinoma hepatocelular (Samuel et al., 2010). A detecção
precoce desta patologia é importante porque os danos provocados pelo excesso de ferro no
organismo podem ser prevenidos com tratamento adequado antes do início da
sintomatologia.
Há, contudo, outros tipos de Hemocromatoses Hereditárias, causadas por mutações em outros
genes relacionados com o metabolismo do ferro. O facto do genótipo clássico de risco para a
HH, não parecer ser suficiente para justificar o fenótipo de hiperferritinemia muito grave
(ferritina sérica > 2500 μg/L) apresentado pelos 11 indivíduos em estudo, levou à pesquisa de
mutações em alguns genes relacionados com o metabolismo do ferro: HFE, TfR2, HJV, HAMP e
BMP-6. Assim, o estudo apresentado nesta dissertação visa detectar mutações nos genes
referidos e compreender as respectivas associações genótipo/fenótipo.
A análise dos resultados obtidos permite constatar que, de entre os genes analisados, foram
identificadas alterações nos genes HJV, BMP-6 e TfR2 em 5 dos 11 indivíduos estudados. Das
alterações detectadas, 6 estão já descritas em bases de dados enquanto as restantes 3 (a
P124L no gene HJV, a c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A no gene BMP-6) são reportadas pela
primeira vez neste trabalho. No entanto, apenas em 2 indivíduos com hiperferritinemia grave
foi possível a partir do genótipo encontrado explicar o fenótipo apresentado. Foi o caso do
indivíduo número 1 e 2. No primeiro, o nível elevadíssimo de ferritina de 8000 µg/L pode ser
justificado devido à conjugação da homozigotia para a C282Y no gene HFE e da alteração
R752H em heterozigotia no gene TfR2. Os estudos in silico realizados para a TfR2_R752H
evidenciam que esta mutação afecta a funcionalidade da proteína TfR2. Esta alteração poderá
não ter um efeito notório num indivíduo sem alterações no gene HFE, no entanto podemos
hipotizar um efeito nocivo aditivo num indivíduo que a co-herdou com ambos os genes HFE
mutados. No caso do doente número 2, um indivíduo ainda relativamente jovem mas com um
valor de ferritina sérica de 3900 µg/L, apresenta a alteração P124L em heterozigotia no gene
HJV que, em conjugação com a homozigotia para a C282Y em HFE, também parece justificar o
elevado excesso de ferro apresentado, que não é justificável apenas pelas alterações comuns
no gene HFE.
Assim, fica por esclarecer a causa dos fenótipos de hiperferritinemia bastante elevada
apresentada pelos restantes indivíduos, não sendo de excluir a hipótese de hemocromatose
secundária. Esta poderá ser devida a vários factores ambientais, como por exemplo, toma de
medicação, alcoolismo, transfusões, assim como consequência de outra patologia. É de referir
ainda que, se a hiperferritinémia apresentada for de causa genética, é possível que existam,
nos indivíduos estudados, alterações que não foram detectadas porque nem toda a extensão
de cada um dos genes em estudo foi analisada. Optou-se por analisar as regiões dos genes
- 62 -
VI-Conclusão
onde já estão descritas mutações ou onde a sua existência seria de prever ser mais gravosa em
termos de expressão do gene. Outra hipótese é que estes indivíduos possam possuir mutações
noutros genes actualmente ainda não associados ao metabolismo do ferro, pois a HH não
clássica é caracterizada por uma grande heterogeneidade genética, que traduz mecanismos
fisiológicos complexos ainda não completamente conhecidos.
Assim, as próximas pesquisas na área do metabolismo do ferro deverão continuar a considerar
a hipótese de serem diversos os genes envolvidos nesta patologia e deverão incidir na
pesquisa de novas alterações genéticas nesses genes. Neste âmbito, um dos genes estudados
neste trabalho foi o BMP-6, onde ainda não se encontrou nenhuma alteração relevante capaz
de provocar HH em humanos mas há indícios de que tal aconteça em ratinhos (Meynard et al.,
2009). Espera-se que, no futuro, a descoberta de mutações neste gene em doentes humanos
com HH prove inequivocamente a envolvência do factor BMP-6 na regulação do metabolismo
do ferro no Homem. Assim, um maior conhecimento acerca dos genes e proteínas
relacionadas com os diversos tipos de HH permitirá uma melhor compreensão da variabilidade
fenotípica e genética e dos mecanismos subjacentes a esta patologia.
Como prosseguimento do trabalho realizado para esta dissertação, pretende-se efectuar a
confirmação e validação dos resultados obtidos através da execução de estudos funcionais
para as novas alterações encontradas. Deverão ser realizados estudos tanto em sistemas in
vivo como in vitro. No primeiro caso o material de partida serão células presentes no sangue
periférico dos indivíduos doentes (células mononucleares do sangue periférico), enquanto no
segundo serão utilizadas células transfectadas com construções com as alterações em estudo.
Em ambos os casos, pretende-se a síntese de cDNA a partir dos RNAs, obtidos das células
anteriormente mencionadas, seguida de reacção de PCR com vista à análise do impacto das
alterações ao nível do splicing. No caso das alterações missense encontradas pretende-se
ainda a análise da localização da proteína na célula através da realização de protocolos de
imunofluorescência.
Para além disso, é também importante que as alterações novas descritas neste trabalho
nomeadamente a c.371 C→T (P124L na HJV), a c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A em BMP-6,
sejam pesquisadas em pelo menos 50 indivíduos da população em geral (100 cromossomas)
para saber se se tratam de polimorfismos. Acresce ainda que, o estudo das famílias dos
doentes permitirá tirar conclusões acerca da segregação das mutações com fenótipos de
sobrecarga em ferro, sobretudo nas famílias onde há segregação de diversos genes mutados
(em cromossomas diferentes) relacionados com o metabolismo do ferro, por exemplo na
família do indivíduo 1 (HFE e TfR2) e família do indivíduo 2 (HFE e HJV). Eventualmente, estas
famílias deverão ser enviadas para uma consulta de aconselhamento genético.
Em conclusão, com este trabalho demos uma pequena contribuição para o conhecimento da
complexidade de alterações genéticas que podem estar na origem da HH não clássica e da sua
relação genótipo/fenótipo.
- 63 -
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- 69 -
VIII-Anexos
Anexo 1: Soluções

Tampão de PCR 10X (Applied Biosistems)
100 mM Tris-HCl (pH 8,3 a 25ºC)
500 mM KCl
15 mM MgCl2
0,01 % (p/v) gelatina

Tampão de PCR α 10X
116 mM (NH4)2SO4
670 mM Tris-HCl pH 8,8
15 mM MgCl2
0,67 mM EDTA
100 mM β-mercaptoetanol

Tampão de PCR David 10X
166 mM (NH4)2SO4
670 mM Tris-HCl pH 8,8
67 mM MgCl2
0,067 mM EDTA
100 mM β-mercaptoetanol

Tampão de PCR B 10X
50 mM KCl2
10 mM Tris-HCL pH 8,8
150 uM MgCl2
0,01 % (p/v) gelatina
DNTPs (0,04 x 100 Mm)

Tampão TBE 10X (Invitrogen)
1,0 M Tris
0,9 M ácido bórico
- 71 -
Anexo 2: Código Genético e Sequências génicas
Código Genético Padrão
Aminoácidos
Ácido aspártico
Ácido Glutâmico
Alanina
Arginina
Asparaginina
Císteina
Fenilalanina
Glicina
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Prolina
Serina
Tirosina
Treonina
Triptofano
Valina
N- Aminoácido A, T, G ou C.
Abreviatura
Asp
Glu
Ala
Arg
Asn
Cys
Phe
Gly
Gln
His
Ile
Leu
Lys
Met
Pro
Ser
Tyr
Thr
Trp
Val
Símbolo
D
E
A
R
N
C
F
G
Q
H
I
L
K
M
P
S
Y
T
W
V
- 72 -
Codão (5´→3´)
GAT e GAC
GAA e GAG
GCN
AGA, AGG e CGN
AAT e AAC
TGT e TGC
TTT e TTC
GGN
CAA e CAG
CAT e CAC
ATT, ATC e ATA
TTA, TTG e CTN
AAA e AAG
ATG
CCN
AGT, AGC e TCN
TAT e TAC
ACN
TGG
GTN
Sequências Génicas
Simbologia utilizada em todas as sequências génicas:
Este estilo- exões; Este estilo-UTR; Este estilo- oligonucleótidos iniciadores usados neste
trabalho; Este estilo-alterações encontradas no decorrer deste estudo.
Gene HFE
CTAAAGTTCTGAAAGACCTGTTGCTTTTCACCAGGAAGTTTTACTGGGCATCTCCTGAGCCTAGGCAATAGCTGTAGGGTGACTTCTG
GAGCCATCCCCGTTTCCCCGCCCCCCAAAAGAAGCGGAGATTTAACGGGGACGTGCGGCCAGAGCTGGGGAAATGGGCCCGCGAGCCA
GGCCGGCGCTTCTCCTCCTGATGCTTTTGCAGACCGCGGTCCTGCAGGGGCGCTTGCTGCGTGAGTCCGAGGGCTGCGGGCGAACTAG
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- 73 -
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- 74 -
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- 75 -
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- 76 -
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- 77 -
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CCTGGTTTCTCCTGCCCTTATGAATCGGGTTTTTTTCTGGGAGGAGTCCTCTAGTCACCTTCCTCCCCAGGTGACCAATGCTCAGGAC
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- 78 -
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TGCCCAGAGGAGGGAAGCTGGCAAGTTGAGGCTGAACTGGGTCTGATGGTGGCAGCAGTGAACAGACCTCACCTTCCAGCCTGTCTAG
TGATGGAATGGGGGTTGTTGCCCAGTAGTGAGCTCCCCAGCACTGGAAGTGAGTAAGCCTAAGTTGGATGATGTTGTAATAGAAACTC
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CTATTCCGGAGGCTCGGACAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGTGGAGGCTGCTGTGAGCCGAGATTGTGCCATTGCACTCCAGCCT
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CACTTCACCTCTATTTCGTCACCTAAAAATGAAAGTGAGGCCGGGTGCGGTAGCTCACGCCTGTAGTCCCAGCACTTTGGGAGGCCGA
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