O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa
Alunos:
•Ana Paulina
•Inês Coturela
•Rodrigo Silva
Responsáveis:
•Ana Cunha
•Hernâni Gerós
•Richard Gonçalves
•António Teixeira
Objectivos
• Preparar extractos celulares de bagos de uvas verdes e
maduras e dosear teor de proteína
• Determinar a actividade enzimática da MDH
• Dosear açúcares e ácidos orgânicos por HPLC
• Realizar curvas de resposta da fotossíntese à luz por
fluorometria de pulso de amplitude modelada (PAM)
• Observar cortes histológicos por microscopia de
epifluorescência
• Explicar algumas modificações bioquímicas e fisiológicas
que ocorrem durante o desenvolvimento do bago
Preparação de extractos celulares
N2(l)
Determinação
da [proteínas]
Medição de
actividades
enzimáticas
Determinação da
concentração de
açúcares e ácidos pelo
HPLC
Actividade da malato desidrogenase
Actividade da malato desidrogenase
Tampão Tris-HCl, pH 8
NADH
Extracto celular
Oxaloacetato
Cuvete
Actividade da malato desidrogenase
• Doseamento de [proteína]
pelo método de Bradford
l = 595 nm
[proteína]bago verde = 3,2 mg/ml
Actividade da malato desidrogenase
• Espectros de absorção do NADH e do NAD+
Actividade da malato desidrogenase
• Velocidade inicial da reacção
vi
pH = 8,0
[oxaloacetato] = 10 mM
Actividade da malato desidrogenase
• Gráfico de Michaelis-Menten
Actividade da malato desidrogenase
• Estimativa de parâmetros cinéticos por modelo matemático
Km = 118,2 mM oxaloacetato
Vmax =21 µmole de NAD+/min/mg de proteína
Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC
• Cromatogramas de padrões e extractos
Série de padrões de
concentrações
conhecidas
bago maduro
bago verde
Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC
Açúcares
45
45
40
40
Teor (mg/g peso fresco)
Teor (mg/g peso fresco)
Malato
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
verdes
maduras
S
G
verdes
F
S
G
maduras
F
Curvas de resposta da fotossíntese à luz
Fluorometria de Pulso Amplitude Modulado (PAM)
Folhas (madura/ senescente)
120
120
100
100
80
80
60
ETR
ETR
Bago verde
40
60
40
20
20
0
0
200
400
600
800
1000
0
PAR
Órgão
Bago verde grande
Bago verde pequeno
Folha madura
Folha senescente
0
200
400
600
800
1000
PAR
a (eficiência PSII)
0,593
0,538
0,726
0,618
ETRr máx. (capacidade PSII)
83,7
73,0
100,1
61,4
Microscopia
Microscopia
Microscopia
Conclusões
1. Foram obtidos extractos celulares de uvas verdes e de uvas maduras
2. No bago verde a concentração de ácido málico é muito elevado, sendo
residual no bago maduro
3. No bago maduro a concentração de açúcares é muito elevada, sendo
mínima no bago verde
4. Os principais açúcares acumulados no bago maduro são os
monossacarídeos glucose e frutose
5. A actividade da malato desidrogenase é compatível com a acumulação
do malato medida no bago verde
6. Tal como as folhas, o bago verde é fotossinteticamente activo
7. Folhas mais velhas têm actividade fotossintética inferior à dos bagos
verdes
8. A microscopia de fluorescência revelou a presença de clorofila
essencialmente numa zona externa do bago assim como nos tecidos
que envolvem a semente
9. O bago da uva é uma fábrica bioquímica complexa dado que
produz/acumula/metaboliza uma ampla variedade de compostos
Material e Equipamento
Bancada de Trabalho
Centrifuga
Pipetas automáticas
Balança de precisão
Medidor de pH
Microscópio de fluorescência