CLONAGEM E EXPRESSÃO DA PROTEÍNA PT2L4 DE MANDIOCA EM SISTEMA
BACTERIANO E ESTUDOS DE RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO
Luís Vinícius Sousa de SOUZA (Bolsista PIBIC/CNPq)
Faculdade de Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas.
Profª. Drª. Cláudia Regina Batista de SOUZA (Orientadora) - [email protected]
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas.
Na natureza as plantas estão sujeitas a diferentes tipos de estresses abióticos, como extremos
de temperatura e alta salinidade. A compreensão dos mecanismos bioquímicos e moleculares
pelos quais estes organismos respondem a estes estresses é essencial para a obtenção de
culturas geneticamente melhoradas. A expressão heteróloga de proteínas constitui uma
ferramenta de grande importância biotecnológica, e são inúmeros os exemplos de trabalhos que
utilizam esta ferramenta para a produção de proteínas recombinantes em estudos funcionais.
Desta forma, o objetivo principal deste trabalho foi a expressão heteróloga, em sistema
bacteriano, da proteína Pt2L4 da mandioca (Manihot esculenta Crantz), espécie cultivada
principalmente em países tropicais em desenvolvimento, onde sua raiz é uma grande fonte de
calorias para pessoas de baixa renda devido a sua alta produtividade e resistência a diferentes
tipos de estresses. A seqüência de cDNA do gene Mec1 que codifica a Pt2L4, rica em ácido
glutâmico, foi inserida no vetor de expressão pET29a (Novagen, USA) nos sítios das enzimas de
restrição NdeI e XhoI gerando a construção pET29a-Pt2L4, a qual foi introduzida em células de
Escherichia coli, sendo a expressão induzida por 1 mM de IPTG (isopropil-β-tiogalactosídeo). A
análise eletroforética em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) dos extratos protéicos
totais de células bacterianas transformadas com a construção pET29a-Pt2L4 revelou uma banda
adicional, com forte intensidade e com massa molecular esperada de aproximadamente 20 kDa,
a qual não foi detectada no controle negativo (vetor pET29a sem inserto). A proteína
recombinante Pt2L4 foi purificada por meio de cromatografia de afinidade por coluna de níquel,
sendo isolada uma banda única de 20 kDa em tampão de eluição com 250 mM de imidazol. Por
último, foram realizados estudos preliminares de resposta ao estresse salino monitorando-se o
crescimento de bactérias expressando a proteína recombinante Pt2L4 submetidas a diferentes
concentrações de cloreto de sódio.
Palavras-chave: Estresse abiótico, Expressão heteróloga em sistema bacteriano,
Mandioca, Proteína recombinante, SDS-PAGE.
Título do projeto do orientador: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE PLANTAS EM SISTEMA
BACTERIANO E ESTUDOS DE RESPOSTA A ESTRESSES ABIÓTICOS E BIÓTICOS.
Classificação do trabalho na Tabela de Áreas do Conhecimento no CNPq.
Grande-área: Ciências Biológicas
Área: Bioquímica
Sub-área: Biologia molecular