RODRIGO TAVANELLI HERNANDES
Estudo da aderência localizada de uma
amostra de Escherichia coli
enteropatogênica atípica
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina, para a obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo
2006
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
RODRIGO TAVANELLI HERNANDES
Estudo da aderência localizada de uma
amostra de Escherichia coli
enteropatogênica atípica
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para a obtenção do Título de
Doutor em Ciências pelo Programa de
Pós-graduação em Microbiologia e
Imunologia.
Orientadora:
Profª. Drª. Tânia A. T. Gomes do Amaral
São Paulo
2006
Hernandes, Rodrigo Tavanelli
Estudo da aderência localizada de uma amostra de Escherichia coli
enteropatogênica atípica./Rodrigo Tavanelli Hernandes. –São Paulo, 2006.
xxii, 109f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia.
Título em Inglês: Studies on the localized adherence of an atypical
enteropathogenic Escherichia coli strain.
1. Escherichia coli. 2. Aderência. 3. Intimina 4. Patogenicidade
Este trabalho foi desenvolvido na Disciplina de Microbiologia do
Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), com o
auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP).
Aos meus pais Antonio e Maria
Minha Tia Doracy
Minha querida avó Emília
Minha Grande amiga Teresinha
Pelo Amor sempre presente:
Dedico
Agradecimentos
À minha orientadora Profª Drª Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral pela
oportunidade de trabalhar sob sua orientação, pela confiança, ajuda e toda preocupação:
À você, toda a minha admiração e gratidão..........
Muito Obrigado!
À Profª Drª Mônica Aparecida Midolli Vieira pelos incentivos, ensinamentos e
principalmente pela amizade. Sua colaboração foi fundamental para a realização desse
trabalho.
À Profª Drª Sylvia Mendes Carneiro pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório,
pelos ensinamentos em Microscopia Eletrônica e principalmente pela amizade.
À Profª Drª Rosa Maria Silva pelo incentivo e pela importante presença em diversos
momentos deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Waldir Pereira Elias Junior pelo constante apoio científico e valiosa
colaboração durante a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcelo Ribeiro da Silva Briones pelo auxílio nos experimentos de
seqüenciamento.
Às Profªs Drªs Beatriz Ernestina Cabilio Guth, Roxane Maria Fontes Piazza, Isabel
Cristina Affonso Scaletsky e Sylvia Cardoso Leão pelo apoio no desenvolvimento deste
trabalho.
Aos docentes do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia que de
várias formas contribuíram para minha formação.
À Evanilde e Sandra Fabbricotti por toda ajuda técnica dada durante a realização deste
trabalho.
À Cristina, Paloma, Darcy, Vitória e Zoraide por toda cooperação que foram
essenciais para o desenvolvimento deste trabalho.
Á Magda Nisti e Paola Rossi pela colaboração durante todos estes anos.
Às queridas e eternas amigas Denise Yamamoto, Fábia Salvador, Fabiana Moreira e
Flávia Bastos pelo agradável convívio durante esses anos, pelos momentos de
descontração, incentivo e por tudo que passaram a representar para mim.
Aos amigos Cristiano, Samar e Eliane por toda amizade, apoio e torcida em todas as
fases da minha vida.
Aos amigos do Departamento de Microbiologia: Maria Cecília, Luís Fernando, Suely
Sampaio, Lucília Nishimura, Cecília Abe, Michele Rabelo, Kátia Aranda e Bianca
Bragato pela amizade e colaboração durante estes anos de convívio.
Às amigas Andreza Zamboni e Michelle Dulguer não só pelo apoio científico, mas
também pela grande amizade.
À Ana Carolina e Analy pela colaboração e conhecimentos trocados durante os
experimentos de seqüenciamento.
Á Cristina Viana pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho e também pela
amizade.
Ao meu Tio Adaucto e família pelo constante incentivo, apoio e carinho sempre
presentes: Muito Obrigado!
À Tia Joaninha, Tia Rosa e demais familiares: Obrigado por todo apoio e por todos os
momentos que compartilhamos juntos.
Súmario
Página
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas e Siglas
Resumo
Abstract
Introdução.........................................................................................................
1
Objetivo.............................................................................................................
15
Material e Métodos..........................................................................................
16
1. Amostras bacterianas.....................................................................................
16
2. Teste de adesão..............................................................................................
18
3. Teste de FAS..................................................................................................
19
4. Immunobloting...............................................................................................
19
5. Imunomarcação com soro anti-BFP...............................................................
20
6. Microscopia eletrônica de transmissão..........................................................
21
7. Técnicas de manipulação e de análise de DNA………………………….....
22
7.1 Extração de DNA plasmidial em pequena escala....................................
22
7.2 Extração de DNA plasmidial em larga escala.........................................
22
7.3 Eluição dos fragmentos do DNA do gel de agarose................................
22
7.4 Reações de digestão de DNA..................................................................
23
7.5 Reação de precipitação do DNA.............................................................
23
7.6 Extração de DNA genômico....................................................................
23
7.7 Eletroporação...........................................................................................
24
7.8. Reação de polimerização em cadeia (PCR)...........................................
24
7.9 Perfil plasmidial (Birnboim & Doly).....................................................
28
7.10 Construção do mutante em eae por nocaute não polar........................
29
7.11 Mutagênese por Mini-Tn 10................................................................
30
7.12 Pesquisa de Determinantes Genéticos de Virulência pelo ensaio de
Hibridação de Colônias (Colony blot).........................................................
31
7.13 Southern blotting..................................................................................
33
8. Produção de anti-soro em coelho...................................................................
34
9. Curva de crescimento.....................................................................................
34
10. Absorção do anti-soro utilizando-se o mutante não aderente......................
35
11. Seqüenciamento do DNA.............................................................................
35
Resultados.........................................................................................................
37
1. Seleção da amostra.........................................................................................
37
2. Caracterização da amostra 1551-2.................................................................
43
3. Cinética de Adesão.........................................................................................
47
4. Obtenção da amostra mutada 1551-2:eae-.....................................................
49
5. Southern-blot realizado para confirmar a mutação no gene eae da amostra
1551-2................................................................................................................
52
6. Microscopia eletrônica de transmissão..........................................................
55
7. Complementação da amostra 1551-2:eae- com o plasmídio pCVD438........
57
8. Construção de uma biblioteca de mutantes....................................................
59
9. Soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante não
aderente 143: caracterização e inibição de adesão.............................................
61
10. Clonagem do gene eae no vetor pMOS para seqüenciamento.....................
63
11. Seqüenciamento e Análise do gene eae da amostra 1551-2........................
65
Discussão...........................................................................................................
67
Conclusões.........................................................................................................
74
Referências Bibliográficas...............................................................................
75
Anexos...............................................................................................................
95
Lista de Figuras
Página
Figura 1
Representação esquemática dos genes que compõem a região
LEE...............................................................................................
Figura 2
5
Representação esquemática do translocon formado pelo sistema
de secreção tipo III e pelas proteínas secretadas........................... 7
Figura 3
Padrão de adesão localizada apresentado pela amostra E. coli
1551-2. Ensaio realizado em células HeLa, utilizando 6 horas de
contato...........................................................................................
Figura 4
41
Gel de agarose a 0,7% com perfis de bandas de DNA plasmidial
de 9 amostras de aEPEC de sorogrupos não EPEC e de E. coli R
861, contendo bandas de pesos moleculares conhecidos como
padrão............................................................................................ 41
Figura 5
Microscopia Eletrônica de Transmissão da amostra 1551-2......... 42
Figura 6
Ensaio de Imunoblot de proteínas totais das amostras E2348/69
e 1551-2, utilizando o soro anti-BFP............................................
Figura 7
43
Gel de agarose com o produto de amplificação do gene bfpL das
amostras: E2348/69, 1551-2 e E. coli HB101............................... 44
Figura 8
Gel de agarose com o produto de amplificação do gene fimH
das amostras: E2348/69, 1551-2, e HB101................................... 45
Figura 9
Imunomarcação com o soro policlonal anti-BFP das amostras:
E2348/69 (A) e 1551-2 (B)...........................................................
Figura 10
46
Cinética de adesão das amostras de aEPEC 1551-2 e protótipo
de tEPEC E2348/69......................................................................
48
Figura 11
Mapa do vetor suicida pJP5603 indicando o sítio de EcoRI onde
o fragmento de 924 pb do gene eae foi clonado para a obtenção
do plasmídio recombinante pRT2.................................................
Figura 12
50
Teste de adesão em células HeLa da amostra 1551-2 e derivada
mutante em intimina...................................................................... 51
Figura 13
Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas
totais das amostras 1551-2 e mutante em eae...............................
Figura 14
52
Representação esquemática dos fragmentos HindIII observados
na amostra selvagem 1551-2, e na amostra mutada em intimina
1551-2:eae-.................................................................................... 53
Figura 15
Southern blot para comprovar a inserção do vetor suicida
pJP5603 em eae. Em A, observa-se um gel de agarose a 1%
com DNA das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do vetor pRT2,
pJP5603 + fragmento de ~924 pb de eae clonado, digerido com
HindIII........................................................................................... 54
Figura 16
Microscopia eletrônica de transmissão da interação das
amostras 1551-2 (A e B) e 1551-2:eae- (C e D) com células
HeLa.............................................................................................. 56
Figura 17
Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas
totais da amostra 1551-2:eae- complementada com o plasmídio
recombinate pCVD438 bem como dos controles 1551-2:eae(controle negativo) e 1551-2 (controle positivo)..........................
Figura 18
57
Teste de FAS das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae- (B)
complementada com o gene eae da amostra E2348/69, protótipo
de tEPEC.......................................................................................
58
Figura 19
Análise do mutante não aderente da amostra 1551-2:eae-. A:
Curva de crescimento das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do
mutante não aderente (143). B e C: Padrão de adesão da
amostra 1551-2:eae- (B) e do seu mutante não aderente-143 (C)
às células HeLa.............................................................................
Figura 20
Teste de adesão em células HeLa das amostras 1551-2 (A) e
1551-2:eae- (B) na temperatura de 18ºC (6h)...............................
Figura 21
60
62
Immunoblot de extrato de proteínas totais das amostras: 1551-2,
1551-2:eae-, mutante não aderente, 1551-2 cultivada à 37ºC e
1551-2 cultivada à 18ºC, utilizando o soro produzido com a
amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante não aderente..... 62
Figura 22
Ensaio de inibição de adesão da amostra 1551-2:eae- com soro
absorvido com o mutante 143, realizado em células HeLa
durante 6 horas..............................................................................
Figura 23
63
Gel de agarose com o produto de amplificação do gene eae das
amostras 1551-2 e derivadas: 2) pISEQ (pMOS + fragmento de
3,1 kb clonado); 3) 1551-2; 4) pISEQ digerido com HindIII e 5)
pMOS............................................................................................
Figura 24
64
BLASTN da seqüência de 1077 nucleotídeos, obtida a partir do
sequenciamento dos clones pISEQ1, 2 e 3...................................
66
Lista de Tabelas
Página
Tabela 1
Características e origem das amostras de E. coli e plasmídios
utilizados neste estudo.....................................................................
17
Tabela 2
Primers e condições utilizadas para os ensaios de PCR..................
26/27
Tabela 3
Seqüência
dos
primers
utilizados
nos
experimentos
de
seqüenciamento…………………………………………………....
Tabela 4
36
Características clínicas, fenotípicas e genotípicas de 9 amostras de
EPEC atípicas não pertencentes a sorogrupos de EPEC que
expressam adesão localizada em 6 horas (AL6) na ausência de
Bundle forming pilus........................................................................
40
Lista de Abreviaturas e Siglas
AA
Aderência agregativa
AAF/I
Aggregative Adherence Fimbria I
AAF/II
Aggregative Adherence Fimbria II
AAF/III
Aggregative Adherence Fimbria III
AD
Aderência difusa
A/E
Attaching and effacing
AL
Aderência localizada
ATV
Solução de associação Tripsina-Versene
BFP
Bundle forming pilus
BSA
Soroalbumina bovina
CNF
Fator Necrotizante Citotóxico
DAEC
Escherichia coli difusamente aderente
DMEM
Meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dATP
2'- Desoxiadenosina 5'- Trifosfato
dCTP
2'- Desoxicitidina 5'- Trifosfato
dGTP
2'- Desoxiguanosina 5'- Trifosfato
dTTP
2'- Desoxitimidina 5'- Trifosfato
dNTPs
Desoxinucleotídeos Trifosfatos
EAEC
Escherichia coli enteroagregativa
EAF
EAST
EPEC Adherence Factor
Enteroaggregative Stable Toxin
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
EHEC
Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC
Escherichia coli enteroinvasora
EPEC
Escherichia coli enteropatogênica
ETEC
Escherichia coli enterotoxigênica
ExPEC
Escherichia coli extra-intestinal
LB
(caldo ou ágar) Luria Bertani
LEE
locus of enterocyte effacement
LT
Toxina termo-lábil
MEM
Meio mínimo essencial de Eagle
MSHA
Hemaglutinação manose-sensível
ORF
Open reading frame
PBS
Solução tampão salina fosfato
PCR
Reação de polimerização em cadeia
q.s.p.
quantidade suficiente para
SDS
Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SFB
Soro fetal bovino
SSC
Solução tampão cloreto de sódio/citrato de sódio
ST
STEC
Toxina termo-estável
Escherichia coli produtora de toxina Shiga
Stx
Shiga toxin
TE
Solução tampão Tris-EDTA
TEB
TEMED
Solução tampão Tris-EDTA- borato
N,N, N', N'- Tetrametil-etilenodiamino
TSB
Tryptic Soy Broth
UV
Ultra-violeta
UPEC
α 32P- dCTP
Escherichia coli Uropatogênica
Citosina trifosfato marcado com fósforo 32 radioativo
Unidades
%
Porcentagem
G
Grama
Kb
Kilobase
kDa
Kilodalton
kV
Kilovolt
M
Molar
mA
Miliampere
Mda
Megadalton
Mg
Miligrama
mL
Mililitro
mM
Milimolar
Mm
Milímetro
N
Normal (normalidade)
ºC
Grau centigrade
Pb
Pares de base
Rpm
Rotação por minuto
U
Unidade
V
Volt
v/v
Volume/volume
X
Vezes
μg
Micrograma
μL
Microlitro
μm
Micrômetro
Resumo
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) compreende uma das seis categorias
diarreiogênicas da espécie. Atualmente, ela é dividida em duas subcategorias, EPEC
típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC), tendo por base a presença do plasmídio EAF
(EPEC adherence factor), que só ocorre entre as tEPEC.
As EPEC promovem, no epitélio intestinal, a lesão attaching and effacing (A/E),
cujos determinantes genéticos estão localizados em uma ilha de patogenicidade
denominada região LEE (locus of enterocyte effacement). Um dos genes presentes nessa
região, o gene eae, codifica uma proteína de membrana externa (intimina) responsável
pela aderência íntima às células intestinais, observada na lesão A/E.
Uma característica fenotípica marcante das tEPEC é a produção do padrão de
adesão localizada (AL), no qual são observadas microcolônias bacterianas compactas
sobre células HeLa e HEp-2, após 3 horas de contato. O padrão AL está associado com
a expressão da fímbria denominada bundle-forming pilus (BFP), que é codificada pelo
plasmídio EAF e promove agregação bactéria-bactéria, dentro das microcolônias, bem
como a interação inicial, que precede a aderência íntima mediada por intimina. Por
outro lado, a maioria das aEPEC promove a formação de microcolônias mais frouxas,
após ensaios mais prolongados (ensaios de 6 horas), o que caracteriza a chamada adesão
semelhante à AL (AL-like).
Durante um estudo anterior, sobre o potencial de virulência de 59 amostras de
aEPEC, foi observado que 9 delas produziam AL típica (em 6 horas), mesmo na
ausência de BFP. Após um amplo estudo das suas características fenotipicas e
genotipicas, uma amostra (1551-2) foi selecionada para a identificação da estrutura
responsável pela formação de microcolônias compactas. Ensaios de microscopia
eletrônica revelaram que o padrão AL da amostra 1551-2 refletia bactérias
internalizadas e que um mutante não-polar em eae (1551-2:eae-), perdia essa
propriedade, embora continuasse aderindo de forma difusa (AD). O seqüenciamento da
região variável do gene eae revelou que a intimina da amostra 1551-2 pertence ao
subtipo omicron (ο).
Para caracterizar a adesina responsável pela AD no mutante 1551-2:eae-, foram
obtidos mutantes não aderentes utilizando-se o transposon Mini-Tn10. Um desses
mutantes foi empregado para a absorção de um soro produzido com a amostra 15512:eae- Esse soro foi capaz de inibir a adesão da amostra 1551-2:eae- a células HeLa e,
em ensaios de immunoblot, revelou uma banda de aproximadamente 25 kDa.
Podemos concluir que o padrão AL da amostra 1551-2 reflete um processo de
internalização provavelmente mediado por intimina, e que novos fatores de virulência,
possivelmente uma proteína de ~25 kDa, poderiam desempenhar importante papel na
interação de amostras de aEPEC in vitro.
Abstract
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) comprise one of the 6 diarrheagenic
categories of the species. Presently, it is sub-grouped into two sub-categories, typical
EPEC (tEPEC) and atypical EPEC (aEPEC), based on the presence of the EAF (EPEC
adherence factor) plasmid, which occurs only in tEPEC.
EPEC promote, in the intestinal epithelium, an attaching and effacing lesion
(A/E) whose genetic determinants are located in a pathogenicity island named LEE
(locus of enterocyte effacement). One of the LEE genes, the eae gene, encodes an outer
membrane protein (intimin), which is responsible for the intimate adherence to the
intestinal cells, observed in the A/E lesions.
A marked phenotypic characteristic of tEPEC is the production of the localized
pattern of adherence (LA), where compact bacterial microcolonies are detected on HeLa
and HEp-2 cells, after 3 hours of contact. The LA pattern is associated with the
expression of the bundle-forming pilus (BFP), which is encoded on the EAF plasmid
and promotes bacterium-bacterium aggregation within the microcolonies as well as the
initial interaction that precedes the intimate adherence by intimin. On the other hand,
most aEPEC form microcolonies looser than those seen in LA, after more prolonged
assays (6 h assays), a phenotype that characterizes the so called LA-like pattern of
adherence.
During a previous study on the virulence potential of 59 strains of aEPEC, it was
observed that 9 of them produced typical LA, even in the absence of BFP. After an
ample analysis of their phenotypic and genotypic characteristics, one strain (1551-2)
was selected for the identification of the structure responsible for compact microcolony
formation in this strain. Electron microscopy assays have revealed that the LA pattern of
strain 1551-2 reflected, in fact, internalized bacteria, and that a non-polar mutant in eae
(1551-2:eae-), had lost this property but maintained a strong diffuse adherence.
Sequencing experiments of the variable region of the 1551-2 intimin molecule revealed
that it corresponds to intimin subtype omicron (ο).
To further characterize the adhesin responsible for the diffuse adherence
phenotype in strain 1551-2:eae-, non-adherent mutants were obtained by transposon
mutagenesis with Mini-Tn10. One of these non-adherent mutants was then used to
absorb an antiserum produced against strain 1551-2:eae-. This absorbed antiserum
inhibited the diffuse adherence of strain 1551-2:eae- to HeLa cells and, in immunoblot
experiments, it has revealed a protein band of approximately 25kDa.
From the data presented in this study, it is possible to conclude that the LA
phenotype of aEPEC strain 1551-2 comprises, rather, an internalization process
probably mediated by intimin, and that novel virulence factors, possibly a ~25 kDa
protein, could play an important role in the interaction of aEPEC strains in vitro.
Introdução
1. Escherichia coli diarreiogênica
A diarréia infecciosa tem sido considerada uma das principais causas de
mortalidade infantil nos países em desenvolvimento, onde é considerada endêmica
(Hanson et al., 1993). Suas manifestações clínicas são variáveis em característica e
severidade, relacionando-se tanto com o estado imunológico do indivíduo, como com a
natureza dos agentes etiológicos, destacando-se bactérias, vírus e protozoários (Thea &
Keusch, 1993).
As amostras de Escherichia coli associadas a infecções intestinais, denominadas
E. coli diarreiogênicas, estão classificadas em seis categorias tomando-se por base os
mecanismos de virulência específicos, as síndromes clínicas decorrentes, os sorotipos
(combinação de antígenos somáticos O e flagelares H), os aspectos epidemiológicos e
os tipos de interação com linhagens celulares cultivadas in vitro (Nataro & Kaper,
1998). As seis categorias de E. coli diarreiogênicas são: E. coli enteropatogênica
(EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli
produtora de toxina Shiga (STEC) – EHEC (E. coli enterohemorrágica; subgrupo de
STEC capaz de causar lesão attaching and effacing), E. coli enteroagregativa (EAEC) e
E. coli difusamente aderente (DAEC). As bactérias pertencentes a cada uma dessas
categorias causam diarréia por mecanismos distintos, afetam diferentes grupos
populacionais e expressam diferentes fatores de virulência (Levine, 1987; Nataro &
Kaper, 1998).
As principais características que definem as categorias de E. coli diarreiogênicas
estão apresentadas no Quadro 1.
1
Quadro 1. Principais características das categorias diarreiogênicas de Escherichia coli.
Categoria de E. coli diarreiogênica
Principais características a
EPEC
Gene eae, plasmídio EAF (pEAF)
ETEC
Produção de toxinas termolábil (LT) e/ou
termoestável (ST)
EIEC
Invasão de células em cultura de tecidos e
produção de cerato-conjuntivite em cobaia.
a,
STEC (EHEC)
Stx1 e/ou Stx2 (gene eae)
EAEC
Adesão agregativa (AA)
DAEC
Adesão difusa (AD)
Adaptado de Nataro & Kaper (1998).
2. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)
O termo “E. coli enteropatogênica-EPEC” foi criado por Neter et al. (1955) para
designar determinados sorogrupos de E. coli associados à diarréia, distinguindo-os
assim dos sorogrupos de E. coli encontrados em indivíduos normais ou pacientes com
processo de infecção extra-intestinal. A classificação em sorogrupos baseia-se no tipo
de antígeno O (antígeno somático correspondente à parte polissacarídica da molécula de
lipopolissacarídeo da membrana externa). Com base nesse antígeno, as linhagens de E.
coli categorizadas como EPEC compreendem doze diferentes sorogrupos: O26, O55,
O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142 e O158 (W.H.O., 1987).
A infecção por EPEC ocorre principalmente em crianças menores de um ano
(Nataro & Kaper, 1998). O principal sintoma clínico das infecções por EPEC é a
2
diarréia aguda, embora alguns casos de diarréia persistente também tenham sido
relatados (Levine & Edelman, 1984; Donnenberg, 1995; Fagundes-Neto, 1996).
A categoria das EPEC pode ser dividida em duas subcategorias, EPEC típica
(tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC), tendo por base a presença de um plasmídio de alto
peso molecular denominado plasmídeo EAF – EPEC adherence factor (pEAF) (Kaper,
1996; Trabulsi et al., 2002).
O mecanismo central de patogenicidade das EPEC compreende a promoção de
uma lesão característica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E)
(Moon et al., 1983). Essa lesão caracteriza-se pela adesão íntima da bactéria ao epitélio
intestinal e destruição localizada das microvilosidades intestinais, levando ao
surgimento de uma estrutura em forma de pedestal na superfície da célula hospedeira,
formada pelo acúmulo de actina polimerizada e outros elementos do citoesqueleto
(Rothbaum et al., 1982; Knutton et al., 1987; Silva et al., 1989; Finlay et al., 1992).
Diversas amostras da categoria STEC também produzem a lesão A/E, embora sua
propriedade de virulência principal consista na produção de uma ou mais toxinas Shiga,
que são codificadas por genes fágicos (stx) (Nataro & Kaper, 1998). Na lesão A/E,
ocorre concentração de actina polimerizada (F-actina), o que levou ao desenvolvimento
de um teste específico para identificar E. coli com atividade A/E, denominado teste de
FAS (Fluorescent-actin staining) (Knutton et al., 1989). Nesse teste, a faloidina
marcada com isotiocionato de fluresceína liga-se especificamente à actina filamentosa,
em cultura de células epiteliais, abaixo de cada bactéria aderida. O teste de FAS
representa um importante recurso no diagnóstico de EPEC e também de outros
microrganismos capazes de produzir esta lesão histopatológica peculiar.
Vários fatores estão envolvidos na formação da lesão A/E, dentre os quais uma
adesina de membrana externa de 94 kDa, a intimina, que é codificada pelo gene eae. A
3
intimina liga-se ao seu receptor translocado Tir (Translocated intimin receptor) para
produzir uma adesão íntima e irreversível à célula epitelial, levando a crer que a
essência da infecção por EPEC deve-se a uma interação entre a região carboxi-terminal
da intimina e Tir, translocada na superfície da célula eucariótica (Frankel et al., 1998).
Estudos conduzidos por Kelly et al. (1998) demonstraram que a porção da intimina que
se liga ao receptor na célula hospedeira está localizada nos 280 resíduos de aminoácidos
da porção carboxi-terminal da molécula. Essa região da molécula de intimina que se liga
ao receptor foi denominada Int280 (Frankel et al., 1995) A alta variabilidade da região
carboxi-terminal da intimina originou uma classificação desta proteína em pelo menos
20 sub-tipos distintos de intimina. (Adu-Bobie et al., 1998; Zhang et al., 2002; Garrido
et al., 2006; Blanco et al., 2006). Esta variabilidade no C-terminal de intimina pode
estar relacionada com recombinação gênica, como forma de escape da resposta imune
do hospedeiro, ou a uma adaptação a novos nichos ecológicos, uma vez que alguns dos
diferentes sub-tipos de intimina parecem ter tropismo por diferentes segmentos
intestinais.
Além da intimina, uma série de outras proteínas, que são secretadas pela bactéria
através de um sistema de secreção tipo III (SSTT), está envolvida na formação da lesão
A/E. Essas proteínas são denominadas EPEC-secreted proteins (Esp), sendo as mais
conhecidas EspA, EspB e EspD.
Os genes que codificam a lesão A/E estão localizados dentro de uma ilha de
patogenicidade denominada locus of enterocyte effacement (região LEE – representada
na figura 1), a qual na amostra protótipo de EPEC E2348/69, apresenta ~35 kb
(McDaniel et al., 1995). A região LEE está organizada em cinco regiões de funções
conhecidas: LEE1, LEE2, LEE3, LEE5, e LEE4. Nas regiões LEE1, LEE2 e LEE3,
encontram-se os genes que codificam o SSTT. Na região LEE4, encontram-se os genes
4
que codificam as Esps e em LEE5, localizam-se os genes eae (que codifica intimina), tir
(que codifica Tir) e cesT (que codifica um chaperone essencial para a secreção e
translocação do receptor Tir). Além desses elementos, LEE codifica proteínas efetoras
(Map, EspF, EspG, EspH, EspZ), chaperones (CesAB, CesD, CesD2, e CesF) e
proteínas reguladoras (Ler, GrlA, GrlR) (Dean et al., 2005; Deng et al., 2004). A
ativação da região LEE1 por uma proteína heterodimérica que se liga ao DNA (IHF –
Integration host factor) resulta na expressão de ler, o primeiro gene do operon LEE1.
Ler é um regulador positivo de outros genes da região LEE (Mellies et al., 1999).
Figura 1: Representação esquemática dos genes que compõe a região LEE.
Adaptado de Dean, Maresca & Kenny (2005).
No modelo proposto da patogênese de EPEC, as bactérias apresentariam uma
aderência inicial às células do hospedeiro, possivelmente mediada por uma fímbria do
tipo IV, denominada Bundle-forming pilus (BFP) e/ou pelo flagelo (Girón et al.,1991;
Girón et al., 2002). Esse contato com a célula hospedeira ativaria genes do SSTT (escN,
escV, escF, entre outros), para a formação de um complexo semelhante a uma seringa,
onde filamentos de EspA, ligados ao SSTT por EscF, formariam uma organela na
5
superfície bacteriana que atuaria como um translocon por onde seriam injetadas nas
células hospedeiras diversas proteínas efetoras e/ou receptoras, além das proteínas que
formariam poros na membrana da célula hospedeira (EspB e EspD) (Chen e Frankel,
2005)
Em EPEC, quando Tir é translocada, o domínio extracelular passa a atuar como
receptor da intimina, enquanto que as porções amino- e carboxi-terminal ficam expostas
no citosol. Na porção carboxi, um resíduo de tirosina é fosforilado e atua como
mobilizador de proteínas do citoesqueleto: uma proteína adaptadora (Nck) recruta NWASP (Wiskott-Aldrich syndrom protein), que por sua vez ativa o complexo regulador
de nucleação de actina Arp2/3 (Actin related protein 2/3), culminando com a formação
do pedestal.
Apesar de não influenciarem a formação da lesão A/E, foi demonstrado que
algumas proteínas codificadas por LEE teriam alguma importância no desenvolvimento
da diarréia. EspF atuaria nas tight junctions, levando à perda de resistência elétrica
transepitelial e à indução de apoptose; EspH teria um papel na modulação da estrutura
do citoesqueleto da célula hospedeira; Map (Mitochondrial-associated protein)
interferiria na função mitocondrial e também na formação de filopódio e EspG, que
apresenta seqüência semelhante à de genes de virulência em Shigella flexneri, seria
responsável pela desestabilização da rede de microtúbulos da célula hospedeira.
Recentemente, EspZ foi descrita como uma nova proteína secretada pelo SSTT, mas sua
função permanece desconhecida (Kristen et al., 2005).
Além das proteínas codificadas por LEE, 3 proteínas descritas recentemente, que
não são codificadas por LEE, mas utilizam o SSTT para serem translocadas, podem
alterar processos celulares quando da interação com as células hospedeiras: Cif (Cycleinhibiting factor), responsável pela interrupção da divisão celular (Marchès et al.,
6
2003), EspI, também denominada NleA (non-LEE encoded factor) (Mundy. et al., 2004,
Gruenheid, et al., 2001), essencial para virulência in vivo e EspJ, que atua modulando a
dinâmica da infecção (Dahan et al., 2005). A Figura 2 é uma representação esquemática
do translocon formado pelo sistema de secreção tipo III e pelas Esps.
Figura 2: Representação esquemática do translocon formado pelo
sistema de secreção tipo III e pelas proteínas secretadas. Adaptado de
Nas tEPEC, muitos genes da região LEE são regulados in trans por um ativador
transcricional denominado Plasmid encoded regulator (Per), que é codificado por
pEAF. O regulador Per foi descoberto primeiramente devido à sua capacidade de
aumentar a expressão de eae (Gomez-Duarte & Kaper, 1995). Embora os detalhes ainda
sejam desconhecidos, é provável que o produto do regulador per (perA, perB, e perC)
forme um complexo regulador global afetando a transcrição de vários genes localizados
tanto no cromossomo como no pEAF, permitindo dessa forma que as tEPEC respondam
7
a diferentes condições ambientais e a diferentes fases de crescimento (Finlay & Abe,
1998).
Uma característica fenotípica marcante entre as tEPEC é a produção do padrão
de adesão localizada (AL), caracterizado pela formação de microcolônias bacterianas
compactas sobre a superfície de células HeLa e HEp-2, após 3 horas de contato
bactérias-células (Scaletsky et al., 1984). Aparentemente, o padrão AL está associado
com a produção de BFP, sendo que esta fimbria exerceria funções de agregação
bactéria-bactéria dentro das microcolônias bem como promoveria a aderência que
precede a aderência íntima mediada pela intimina (Girón et al., 1991).
A biogênese de BFP é codificada por um operon formado por 14 genes,
localizado no pEAF (Sohel et al., 1996; Stone et al., 1996), sendo que a regulação da
sua expressão envolve tanto genes plasmidiais (Tobe et al., 1996) como cromossômicos
(Zhang & Donnenberg, 1996), além de sinais ambientais característicos do intestino
delgado (Puente et al., 1996; Ordoñez, 1998).
Estudos realizados por Bieber et al. (1998) demonstraram que, além de
promover a agregação bacteriana em microcolônias, BFP estaria envolvida com o
evento de dispersão das bactérias dos mesmos agregados e que uma amostra mutante
nessa capacidade de dispersão apresentava uma virulência 200 vezes inferior, quando
comparada com a amostra selvagem. Esse fenômeno de agregação e dispersão foi
também examinado por Knutton et al. (1999), sendo associado às alterações na
conformação da estrutura quaternária de BFP, cujos feixes de filamentos ficariam
progressivamente maiores e mais espessos. Com a dispersão, as bactérias poderiam
infectar outros sítios promovendo uma colonização mais eficiente da mucosa do
intestino delgado. Essas evidências, no entanto, levaram a hipóteses controversas sobre
o papel de BFP na aderência inicial de tEPEC às células intestinais, uma vez que Hicks
8
et al. (1998) sugeriram que BFP não estaria envolvida no estágio inicial de aderência de
tEPEC a tecidos intestinais humanos mantidos in vitro, mas apenas na formação do
complexo tridimensional das microcolônias.
As aEPEC, por sua vez, apresentam como principal característica a presença da
região LEE e ausência de pEAF e dos genes stx. Embora pertençam aos mesmos
sorogrupos das tEPEC, seus antígenos flagelares são distintos, conseqüentemente,
amostras típicas e atípicas de EPEC pertencem a diferentes sorotipos (Trabulsi et al.,
2002). Amostras de alguns sorotipos de aEPEC apresentam fatores de virulência
adicionais como a expressão da toxina enteroaggregative E. coli heat-stable toxin
(EAST-1) nos sorotipos O128:H2 e O119:H2 (Dias, 1998), enterohemolisinas no
sorotipo O111:H9 (Campos et al., 1994), o padrão de adesão agregativa a células
epiteliais no sorotipo O125:H6 (do Valle et al., 1997) e a adesina afimbrial AfaE-1 no
sorotipo O55:H7 (Keller et al., 2002). A grande maioria das amostras de aEPEC não é
capaz de produzir AL em ensaios de aderência de 3 horas; de modo geral, essas
amostras apresentam a formação de microcolônias mais frouxas, visualizadas após
ensaios mais prolongados (ensaios de 6 horas) promovendo a chamada adesão
semelhante à AL (AL-like) (Rodrigues et al., 1996). As principais características que
diferem as tEPEC das aEPEC encontram-se listadas no Quadro 2.
9
Quadro 2: Principais características entre EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica
(aEPEC).
tEPEC
aEPEC
Lesão A/E
Presente
Presente
pEAFa
Presente
Ausente
Genes stx
Ausente
Ausente
Expressão de BFP
Presente
Ausente
Padrão de adesão
AL (3 horas)
AL-like/AD/AL(6 horas)
O55:H6, O86:H34, O111:H2,
O26:H11, O55:H7, O55:H34,
O114:H2, O119:H6, O127:H6,
O86:H8, O111ac:H8, O111:H9,
O142:H6, O142:H34
O111:H25, O119:H2b, O125ac:H6,
Principais sorotipos
O128:H2b
a
detectado por hibridação com uma seqüência críptica de pEAF (sonda EAF)
b
contêm o operon bfp incompleto (Bortolini et al., 1999)
Pelo menos até meados da década de 90, tEPEC foi a causa principal de diarréia
infantil no Brasil (Trabulsi et al., 1961; Toledo et al., 1983; Trabulsi et al., 1985; Gomes
et al., 1991; Rosa et al., 1998; Scaletsky et al., 1999) e outros países em
desenvolvimento, embora fosse rara em países desenvolvidos (Nataro & Kaper, 1998).
Atualmente, aEPEC parece apresentar um maior significado em diarréia em países
desenvolvidos e alguns estudos preliminares vêm sugerindo que esse grupo tem
emergido como causa importante de diarréia também nos países em desenvolvimento
(Trabulsi et al., 2002, Franzolin et al., 2005).
10
3. Adesinas em Escherichia coli diarreiogênicas
A existência de fatores de aderência adicionais a intimina tem sido então
sugerida, e diversos estudos utilizando modelos com linhagens celulares epiteliais e
intestinais in vitro têm sido realizados, no sentido de investigar a existência e a natureza
de novas adesinas tanto em amostras de STEC como em amostras de aEPEC.
Tarr et al. (2000) identificaram, no DNA de uma amostra de E. coli O157:H7,
um gene cromossômico associado com aderência, que codifica uma proteína similar à
proteína IrgA de Vibrio cholera (Goldberg et al., 1992). Essa proteína de 67 kDa foi
denominada adesina homóloga a IrgA (Iha).
Estudo realizados por Nicholls et al. (2000), em amostras de STEC-LEE
positivas, caracterizaram o locus gênico efa 1 (fator de aderência de EHEC), o qual foi
responsável pela adesão de STEC O111:H- em culturas de células CHO. LifA
(lymphostatin) é uma proteína de 365 kDa homóloga a Efa 1 encontrada em amostras de
EPEC.
Tatsuno et al. (2001) investigaram o papel do plasmídio pO157 na aderência de
E. coli O157:H7 (cepa Sakai) e relataram a importância de um gene denominado toxB
na aderência dessa amostra e na inibição de ativação de linfócitos gastrointestinais
murinos e humanos.
Torres et al. (2002) descreveram no cromossomo de EHEC O157:H7, cepa
EDL933, um operon fimbrial com alta homologia ao operon da fímbria polar longa
(LPF) de Salmonella enterica serovar Typhimurium. Esse estudo revelou que LPF
participa no aumento da aderência de E. coli O157:H7 a células eucarióticas e tem
importante papel na formação de microcolônias bacterianas. No mesmo ano, Doughty et
11
al. (2002) descreveram um operon fimbrial relacionado à LPF em amostras de STEC
pertencentes ao sorotipo O113:H21 (lpfO113).
Paton et al. (2001) ao estudar o megaplasmídeo de uma amostra de STEC
O113:H21 (98NK2) identificou um gene denominado saa que codifica uma adesina
autoaglutinante. Essa adesina autoaglutinante (Saa) foi a primeira a ser descrita em
amostras de STEC LEE-negativas.
Estudos recentes conduzidos por Scaletsky et al. (2005) identificaram a
existência de uma nova adesina em uma amostra de aEPEC do sorotipo O26:H11. Um
inserto de aproximadamente 15 kb da região genômica dessa amostra denominada locus
for diffuse adherence (lda), confere aderência difusa em células HEp-2 quando expressa
em E. coli K-12. Surpreendentemente, ensaios de mutagênese sítio dirigida no gene
ldaG (subunidade estrutural) não mostrou nenhuma alteração no padrão de aderência da
amostra original.
Os genes envolvidos com a biogênese da fímbria tipo 1 estão organizados em
um operon cromossômico, presente na maioria das amostras de E. coli
independentemente de sua origem (Orndorff & Bloch, 1990). O produto do gene fimH
(FimH) determina a ligação aos receptores celulares e também tem capacidade de ligarse à fibronectina (Krogfelt et al., 1990).
4. Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) em sorogrupos não
EPEC
Em estudos epidemiológicos conduzidos em São Paulo pelo laboratório da Dra.
Tânia Gomes em colaboração com o Centers for Disease Control and Prevention de
Atlanta, Ga., U.S.A., a região LEE (avaliada pela presença do gene eae) foi encontrada
12
em um grupo de amostras de E. coli não pertencentes aos sorogrupos de EPEC, as quais
eram desprovidas de pEAF e dos genes stx (E. coli eae+ EAF- stx-) (Gomes et al., 1998).
Com base nessas características genéticas tais amostras foram, posteriormente,
classificadas como EPEC atípicas. Amostras de EPEC atípicas, não pertencentes a
sorogrupos de EPEC, foram isoladas tanto de crianças diarréicas como de algumas
crianças sem alterações gastrointestinais (Gomes et al., 1998).
Com o intuito de caracterizar o potencial de virulência dessa coleção de
amostras, Vieira et al. (2001) realizaram uma extensa análise genotípica e fenotípica
dessas amostras. Essa análise revelou uma diversidade de combinações de genes de
virulência das demais categorias patogênicas de E. coli. Entretanto, um sub-grupo,
desprovido de quaisquer desses marcadores, apresentando apenas o gene eae, foi o
único que mostrou associação epidemiológica com diarréia (Vieira et al., 2001).
Portanto, no nosso entender, esse sub-grupo é de grande interesse, uma vez que, em
diversos estudos epidemiológicos sobre a diarréia aguda, cerca de 20 a 30% dos casos
ainda permanecem sem diagnóstico (Gomes et al., 1991; Rosa et al., 1998).
Vieira et al. (2001) verificaram também que, com a exceção de uma única
amostra, que causou destacamento celular, todas as demais amostras de sua coleção
aderiam às células HeLa e Caco-2, a maioria exibindo o padrão AL-like ou variações do
padrão AL. No entanto, um grupo de 9 amostras apresentou a formação de
microcolônias compactas compatíveis com AL, embora apenas em ensaios de 6 horas
(AL6). Foi investigada, nessas amostras, a presença do gene bfpA, que codifica a
subunidade estrutural da fímbria BFP (Donnenberg et al., 1992; Sohel et al., 1993) e
verificou-se que eram desprovidas do referido gene. Tal resultado levou-nos a um
estudo preliminar onde investigamos, por meio de immunoblot, com soro policlonal
anti-BFP, se algumas dessas amostras eram capazes de expressar BFP, e o observado foi
13
que nenhuma delas apresentou bandas compatíveis com a dessa fimbria. Esse resultado
lêvantou uma importante questão: Que tipo de estrutura estaria mediando a interação
bacteriana evidente no padrão AL? Essa estrutura teria papel na aderência a células
cultivadas ou mantidas in vitro?
14
Objetivo
O presente estudo tem como objetivo principal identificar e caracterizar a
estrutura
relacionada
à
formação
de
microcolônias
bacterianas
compactas,
características do padrão AL (6 h), em uma amostra de EPEC atípica, desprovida de
BFP e não pertencente a sorogrupos de EPEC.
15
Material e Métodos
1. Amostras bacterianas
As 9 amostras de aEPEC, produtoras de AL6, estudadas foram isoladas de 5
crianças (16 a 41 meses de idade) com diarréia e 4 crianças sem diarréia na cidade de
São Paulo, São Paulo, Brasil (Vieira et al., 2001). Elas pertenciam a pelo menos 8
sorotipos distintos compreendendo, portanto, clones distintos (Vieira et al., 2001).
Inicialmente, todas as amostras foram avaliadas quanto à pureza, por meio de
testes bioquímicos convencionais, e quanto à manutenção das propriedades de
virulência já estabelecidas, conforme Vieira et al. (2001).
Nos diversos experimentos que compõem este estudo, foram utilizadas, como
controles, as seguintes amostras: E. coli E2348/69 (amostra protótipo de tEPEC,
sorotipo O127:H6, produtora de AL) e as amostras não patogênicas E. coli-K12 HB101
e DH5α. Na Tabela 1, encontram-se listadas todas as amostras bacterianas e plasmídios
utilizados neste estudo bem como suas principais características.
Os cultivos bacterianos foram realizados em caldo Luria Bertani (LB-anexo 1.1),
ágar MacConkey (Difco Laboratories) e Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM),
conforme as necessidades experimentais. Todas as amostras foram conservadas a -70ºC
em caldo Luria-Bertani (LB), acrescido de 20% de glicerol (LB-glicerol).
16
Tabela 1: Características e origem das amostras de E. coli e plasmídios utilizados neste
estudo
Amostra ou
plasmídio
Características relevantes
Referência ou origem
0471-1
0621-6
1331-2
1551-2
2041-1
Amostras de aEPEC, sorogrupo não EPEC, que
expressam AL6
Vieira et al. (2001)
1112-6
2932-2
3522-6
4632-3
1551-2:eae-
Amostra 1551-2 mutada no gene eae
Este estudo
E2348/69
Amostra protótipo de tEPEC do sorotipo O127:H6
Levine et al. (1985)
CVD206
E2348/69 mutada em eae
Donnenberg & Kaper 1991
HB101
E. coli híbrida B/K-12 (Sm)
Boyer & Roulland-Dussoix,
1969
DH5α
E. coli supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZ ΔM15) hsdR17
Sambrook et al., 1989
DH5αλpir
DH5α lisogenizada com λpir (Nal)
Elliott & Kaper, 1997
S17αλpir
Pro, res-, mod+, RP4-2, Tc::UM-Km::Tn7 (SM)
Simon et al., 1983
R861
Amostra de E. coli portadora de plasmídios de pesos
moleculares conhecidos
Central Public Health
Laboratory, Londres, Reino
Unido
pJP5603
Plasmídio vetor suicida de baixo número de cópias
contendo o replicon R6K; 3,1kb (Km)
Penfold & Pemberton, 1992
pGEM-T Easy
Vetor plasmidial utilizado para clonagem de produtos
amplificados por PCR
Promega
pMOSBlue
Vetor plasmidial utilizado para clonagem de produtos
Blunt
Amersham Biosciences
pRT1
pGEM-T Easy contendo um fragmento de ~924pb
amplificado com os primers AE11/AE12
Este estudo
pRT2
pJP5603 contendo um fragmento EcoRI de ~924pb
do gene eae extraído de pRT1
Este estudo
pISEQ1, 2 e 3
pMOSBlue contendo um fragmento de ~3kb
amplificado com os primers AE11/escD
Este estudo
pCVD438
pACY184 contendo o gene eae da amostra E2348/69
Donnenberg & Kaper 1991
17
2. Teste de Adesão
O padrão de adesão das amostras empregadas neste estudo foi avaliado em testes
em células HeLa, empregando-se a metodologia descrita por Cravioto et al (1979).
Monocamadas celulares incompletas, dispostas em microplacas de 24 orifícios contendo
lamínulas de vidro de 13 mm (preparadas no laboratório de cultivos celulares da
Disciplina de Microbiologia), foram lavadas com PBS (anexo 2.1) esterilizado e 1 mL
de Dulbecco Modified Essential Medium (DMEM) (anexo 2.2), acrescido de 2% de soro
fetal bovino e 1% de D-manose (anexo 2.3), foi adicionado a cada orifício da placa. Em
seguida, 20 uL de cultura bacteriana (cultivo em LB overnight) foram adicionados à
preparação e, após 6 h de incubação a 37oC (com intervalo para lavagem e troca de
meio após 3 horas), as preparações foram lavadas com PBS esterilizado, fixadas com
metanol e coradas com solução de May Grünwald (anexo 2.5) por 5 minutos e com
solução de Giemsa (anexo 2.6) por 20 min. As lamínulas foram observadas ao
microscópio óptico em aumento de imersão.
O ensaio de cinética de adesão, realizado para amostras selecionadas, foi
conduzido conforme a metodologia descrita acima, porém com os seguintes períodos de
incubação: 1 h, 2 h, 3 h, 4 h (3 h+1 h), 5 h (3 h+2 h) e 6 h (3 h+3 h). Após os diferentes
períodos de incubação, as preparações foram lavadas, fixadas, coradas e examinadas
como descrito acima.
Para a pesquisa da termorregulação da aderência, os ensaios de adesão foram
incubados à 18ºC por 3 horas. Após esse período, a monocamada foi lavada com PBS,
um novo meio foi adicionado e a placa foi reincubada à 18ºC por mais 3 horas. Em
seguida, as preparações foram lavadas, fixadas, coradas e examinadas como descrito
acima.
18
3. Teste de FAS (Fluorescent actin-staining)
A capacidade de causar acúmulo de actina em células HeLa foi avaliada pelo
teste de FAS (Knutton et al., 1989). Para essa finalidade, foi realizado um teste de
adesão, em cujo final, as células foram fixadas com solução de formaldeído a 3%
(anexo 3.1), lavadas e permeabilizadas com Triton X-100 a 1% (anexo 3.2), durante 5
minutos. Após lavagens, as preparações foram tratadas com FITC-faloidina (solução de
isotiocianato de faloidina marcada com fluoresceína) a 5 μg/mL (anexo 3.3) e lavadas
novamente. Em seguida, as lamínulas foram montadas em lâmina de vidro com 10 μL
de glicerol a 90% em PBS e analisadas por microscopia de fluorescência.
4. Immunoblotting
As amostras foram pré-cultivadas em LB por 18 h a 37ºC. A seguir, foram
inoculados 100 μL destas culturas em 10 mL de DMEM e esse volume foi incubado a
37ºC, sob agitação constante, por um período de aproximadamente 6 h. Em seguida, as
culturas foram centrifugadas a 15.000 g por 15 minutos, os sedimentos foram
ressuspensos em 150 μL de tampão de amostra (anexo 4.1) e posteriormente, as
suspensões foram fervidas por 10 minutos, segundo a metodologia descrita por
Laemmli (1970).
As proteínas separadas através de SDS-PAGE (eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio) a 12% (anexo 4.4) foram transferidas
para membrana de nitrocelulose por eletroforese. As membranas foram bloqueadas por
2 h com soroalbumina bovina (BSA a 3% - anexo 5.2) em solução de Tris pH 7,3
contendo Tween 20 à 0,05% (anexo 5.3). Em seguida, foram tratadas por 1 hora com o
soro policlonal diluído 500 vezes em Tampão Tris (anexo 5.3). Após as lavagens, foi
adicionado o anticorpo secundário, anti-imunoglobulina de coelho, produzido em cabra
19
e conjugado com fosfatase alcalina (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA) a uma
diluição de 1:2000, durante 1 h. As membranas foram reveladas pela imersão em
solução do substrato diaminobenzidina. O soro anti-BFP foi gentilmente cedido pelo Dr.
Jorge Girón (University of Arizona, Tucson, AZ), o soro anti-intimina universal foi
gentilmente cedido pelo Dr. Gad Frankel (Imperial College of Science, Technology and
medicine, Londres, Reino Unido) e o soro produzido contra a amostra 1551-2:eae-, foi
obtido neste estudo.
5. Imunomarcação com o soro anti-BFP
As amostras foram primeiramente cultivadas em LB (anexo 1.1), por 18 h a
37ºC. Após o crescimento, foi realizada uma diluição 1:100 em DMEM (anexo 2.2)
acrescido de 2% de soro fetal bovino, e incubadas por 3 h a 37ºC sem agitação. Após
esse período de incubação, as amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 700g, o
DMEM foi retirado e o sedimento, lavado com 1 mL de PBS esterilizado. Novamente
as amostras foram centrifugadas nas mesmas condições e o sedimento foi ressuspenso
em 100 μL de PBS esterilizado. De cada suspensão foram aplicados 10 μL em tela para
microscopia eletrônica. Após 5 minutos, o excesso das suspensões foi retirado e 10 μL
do soro anti-BFP, diluído 1:5 em PBS-BSA a 1%, pH 8,0, foram aplicados à
preparação.
Após 1 hora à temperatura ambiente, as telas foram submetidas a 5 lavagens
consecutivas com PBS-BSA a 1%, pH 7,2, e então, adicionados 10 μL do conjugado
proteína A-ouro coloidal, diluído 1:10 em PBS-BSA a 1%, pH 7,2. Após 1 hora, as
preparações foram lavadas 5 vezes com PBS-BSA a 1%, pH 7,2 e 5 vezes com água
bidestilada, e coradas com molibdato de amônio a 2% para posterior análise em
20
microscópio eletrônico de transmissão Leo 906E, no laboratório de Biologia Celular do
Instituto Butantan, em colaboração com a Drª Sylvia Mendes Carneiro.
6. Microscopia eletrônica de transmissão
Primeiramente, foi realizado um ensaio de interação de 6 horas com células
HeLa cultivadas até a obtenção de monocamadas semi-confluentes, sobre lamínulas de
vidro colocadas nos poços de microplacas de 24 orifícios. Após esse período de
interação, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas em solução fixadora
durante, no mínimo, 2 horas.
Resumidamente, as células foram pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1%
(anexo 6.3) e desidratadas em gradiente de etanol (Merck). A embebição e inclusão do
material foram feitas em resina Spurr (Spurr, 1969) da seguinte maneira: cápsulas de
gelatina transparente foram preenchidas com a resina e emborcadas sobre as lamínulas,
previamente recobertas por uma fina camada de resina, no local de maior densidade de
material. As lamínulas com as cápsulas mantidas na vertical foram levadas para
polimerizar em estufa a 70ºC durante 2 horas.
Em seguida, as lamínulas foram retiradas com jato de N2 líquido e as cápsulas
com material foram levadas ao ultramicrótomo MT6000 (Sorvall) para a confecção de
cortes finos (60-70 nm). Os cortes foram coletados em grades de cobre e contrastados
com acetato de uranila a 2% (anexo 6.4) e citrato de chumbo (anexo 6.5) (Reynolds,
1963).
O exame do material e as micrografias eletrônicas foram feitos ao Microscópio
Eletrônico de Transmissão Leo 906E, no laboratório de Biologia Celular do Instituto
Butantan em colaboração com a Drª Sylvia Mendes Carneiro.
21
7. Técnicas de manipulação e de análise de DNA
Exceto quando indicado, as técnicas de manipulação e de análise de
DNA utilizadas estão descritas em Sambrook et al. (2001) e Ausubel et al. (1995).
7.1 Extração de DNA plasmidial em pequena escala
A extração de DNA plasmidial em pequena escala foi realizada utilizando-se o
kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI,
USA), conforme recomendações do fabricante.
7.2 Extração de DNA plasmidial em larga escala
O kit Qiagen – Plasmid Midi (Quiagen Inc., EUA) foi empregado para a
extração de DNA em larga escala, segundo recomendações do fabricante. Os
sedimentos de DNA foram ressuspensos em TE (anexo 7.5) e analisados quanto a
sua pureza e concentração em gel de agarose.
7.3 Eluição dos fragmentos do DNA do gel de agarose
Após separação e visualização dos fragmentos de DNA, estes foram eluídos do
gel utilizando o kit: Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison,
WI, USA), conforme recomendações do fabricante.
22
7.4 Reações de digestão de DNA
As reações de digestão com as enzimas de restrição foram realizadas em um
volume final de 20 μL. As reações foram realizadas empregando-se os tampões e as
temperaturas apropriadas, de acordo com as recomendações do fabricante para cada
enzima de restrição empregada neste estudo.
7.5 Reação de precipitação do DNA
O DNA foi precipitado pela adição, a uma solução de 100 μL de DNA em
tampão TE, de 10 μL de acetato de sódio 3 M (pH 4,8) e 300 μL de etanol (p.a.), a
solução foi homogeneizada e incubada a -70ºC durante 1 hora. Após este período a
solução foi centrifugada a 4ºC durtante 15 minutos a 16.000 g, o sobrenadante foi
então descartado e 800 μL de etanol 80% foram acrescentados para lavagem do
sedimento. A solução foi novamente centrifugada a 16.000 g por 5 minutos. Após
essa centrifugação todo etanol foi removido e o sedimento foi seco à temperatura
ambiente e então ressuspenso em água ou no tampão de interesse.
7.6 Extração de DNA genômico
A extração de DNA genômico foi realizada utilizando-se o Easy-DNA™ Kit
(For genomic DNA isolation – Protocol #3 – Invitrogen, USA), conforme
recomendações do fabricante.
23
7.7 Eletroporação
O DNA recombinante foi transformado em células bacterianas competentes
através de eletroporação. As células competentes foram preparadas segundo
metodologia descrita por Ausubel et al., (1995), aliquotadas em volumes de 40 μL e
mantidas à -70ºC.
Para a transformação, as células competentes foram descongeladas em gelo e 1
μL de DNA plasmidial foi adicionado à alíquota de células competentes. Essa
msitura foi transferida para cubetas apropriadas de 0,2 cm (Biorad, EUA),
previamente resfriadas. Para eletroporação foi utilizado um eletroporador GenePulse
(Biorad, EUA), a 2,5 kV, 25 μF e controle de pulso de 200Ω.
Após a eletroparação foi adicionado imediatamente 1 mL de mio SOC (anexo
10) à reação, e a mesma foi incubada à 37ºC durante 1 hora sob agitação a 250 r.p.m.
Em seguida, os cultivos foram plaqueados em diferentes volumes em agar LB (anexo
1.1) contendo antibioóticos apropriados e as placas incubadas à 37ºC por 18 horas.
7.8. Reação de polimerização em cadeia (PCR)
A técnica de PCR utilizou DNA molde obtido a partir de uma colônia bacteriana
cultivada em meio sólido (16-18 horas a 37ºC), ressuspensa em 300 μl de água
bidestilada esterilizada e submetida à fervura durante 10 minutos. As reações foram
realizadas em banho de gelo, em tubos tipo Eppendorf de 0,2 ml, onde foram
colocados o DNA molde (lisado bacteriano) e todos os reagentes (Invitrogen, USA)
descritos a seguir:
24
Tampão PCR (10 x).....................................................................
1x
dNTPs (1 mM)............................................................................
0,2 mM*
MgCl2 (50 mM)...........................................................................
1,5 mM
Primer F......................................................................................
100 pmoles
Primer R......................................................................................
100 pmoles
Taq DNA polimerase (5U/μl)......................................................
2,5 U
DNA molde.................................................................................
5,0 μl
Água bidestilada esterilizada q.s.p. .............................................
50,0 μl
* Concentração final de cada nucleotídeo em uma reação.
Em seguida, as preparações foram colocadas em um aparelho termociclador
(GeneAMP PCR System 2400, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) e
submetidas a ciclos específicos de condições de desnaturação, anelamento e
extensão. As seqüências nuleotídicas dos primers utilizados estão descritas na Tabela
2.
25
Tabela 2: Primers e condições utilizadas para os ensaios de PCR
Marcadores
saa
Descrição
Seqüências (5’ – 3’)
desnaturação
Anelamento
extensão
94ºC 30
seg.
58ºC
1min.
72ºC
40 seg.
94ºC 45
seg.
55ºC 30
seg.
72ºC
90 seg.
94ºC
1min.
64ºC
1min.
72ºC
1min.
59ºC 1
min.
Jenkins et al. 2003
760 pb
Batisson et al. 2003
250 pb
Badea et al. 2003
72ºC
1min.
925 pb
Szalo et al. 2002
55ºC
1min.
72ºC
2min.
920 pb
Scaletsky et al. 2005
94ºC
1min.
52ºC
50seg.
72ºC
1min.
573 pb
Doughty et al. 2002
94ºC
1min.
65ºC
1min.
72ºC
1min.
391 pb
Deng et al. 2001
94ºC
30seg.
52ºC
1min.
72ºC
2min.
30seg.
2.685 pb
Zhang et al. 2002
CGT GAT GAA CAG GCT ATT GC
porcine A/Eassociated gene
CTC GAG AGT GCC TTT CCT GG
Plasmidial locus
found in EHEC
O157:H7 implicated
in adhesion
TAA AGC AGA AAA ATG CGA CAG
AAG AT
IrgA homologous
adhesion
CAA ATG GCT CTC TTC CGT CAA TGC
CAG GTC GGG GTT ACC AAG T
94ºC 1
min.
ldaG
Locus for diffuse
adherence
AAA GAT CTG TGA TGA GGT TCA GGT GAA G
AAA TCT AGA TGC AGA CGC AAC TAC AGC CA
94ºC
1min.
lpfAO113
long polar fimbria
ATG AAG CGT AAT ATT ATA G
paa
toxB
iha
GGA TCC ATG AGG AAC ATA A
TAG TAA GTA GAG TAG AAC TGG GGG ATG
TTA TTT CTT ATA TTC GAC
ler
LEE-encoded
regulator
eae ι
Intimina Iota
CAT CCG TGA TGG TCT GCT GAC C
ACA GCT GAC GGC CCA CCC AG
TTT ATC CTG CTC CGT TTG CT
CCC GAA TTC GGC ACA AGC ATA AGC
Referências
119 pb
STEC
autoagglutinating
adhesion
ATG GAC ATG CCT GTG GCA AC
Tamanho do
fragmento
Condições
26
Tabela 2 (continuação) - Primers e condições utilizadas para os ensaios de PCR.
Marcadores
eae ζ
Descrição
Intimina Zeta
eae
(AE11/AE12)
Região conservada do
gene eae
cat
Gene que confere
resistência
ao
cloranfenicol
encontrado
no
plasmidio pBSL181.
bfpL
Bundle-forming pillus
Seqüências (5’ – 3’)
Fímbria tipo I
Anelamento
extensão
53ºC
1min.
72ºC 2
min.
30seg.
2.430 pb
CCC GAA TTC GGC ACA AGC ATA AGC
94ºC
30seg.
CCC GGC ACA AGC ATA AGC TAA
ATG ACT CAT GCC AGC CGC TCA
94ºC
1min.
68ºC
1min.
72ºC
1min.
924 pb
GGG CAC CAA TAA CTG CCT TA
94ºC
1min.
60ºC
1min.
72ºC
1min.
1.000 pb
Este estudo
94ºc
30seg.
58ºC
30seg.
72ºC
1min.
~500 pb
Drª Rosa Maria
Silva (comunicação
pessoal)
94ºC
30seg.
63ºC
30seg.
72ºC
1min.
~508 pb
Johnson & Stell
2000
94ºC
30seg.
57ºC
30seg.
68ºC
5min.
~3.100 pb*
TAG TTG TAC TCC CCT TAT CC
TGT GAC GGA AGA TCA CTT CG
GAG TGG TGT CAC AGG GCT TCT GTT
GAC GTC ACC TGC CCT CCG GTA
TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG
eae
(AE11/escD)
Intimina
Referências
desnaturação
ACA GTT CTG GTG GTG CTA TCC CGT
fimH
Tamanho do
fragmento
Condições
CCC GGC ACA AGC ATA AGC TAA
CAG AAC ATT CAG CCG TAC
Zhang et al. 2002
Gannon et al. 1993
Gannon et al., 1993;
este estudo
* Fragmento amplificado com Elongase® Amplification System (Invitrogem, USA)
27
7.9 Perfil plasmidial (Birnboim & Doly)
A análise do perfil plasmidial foi realizada por meio da extração dos plasmídios
por lise alcalina, segundo metodologia descrita por Birnboim & Doly (1979).
As amostras em estudo foram semeadas em LB (anexo 1.1) e incubadas a 37ºC
durante 12-18 horas, sob agitação. Após esse período, as culturas foram centrifugadas, o
sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspenso em 100μL de solução I (anexo 7.1).
Depois de um período de 30 minutos em banho de gelo, foram adicionados 200 μL de
solução II (anexo 7.2). Depois de homogeneizadas, as preparações foram adicionadas de
150 μL de solução III (anexo 7.3) e, após 15 minutos de centrifugação a 16.000g, 100
μL da solução de acetato de sódio (anexo 7.4) foram acrescentados juntamente com 250
μL de etanol a 80%, e as preparações foram incubadas por 30 minutos a -20ºC. Após
este intervalo, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 16.000g, o sobrenadante
aspirado e 2 volumes de etanol a 70% foram adicionados, deixando as amostras à
temperatura ambiente por 2 minutos. As preparações foram novamente centrifugadas
por 2 minutos e os sobrenadantes aspirados. Depois de secos em temperatura ambiente,
os sedimentos foram suspensos em 20 μL de TE (anexo 7.5).
Após a extração, o DNA plasmidial foi analisado através de eletroforese em gel
de agarose (0,7%). As bandas de DNA plasmidial da amostra E. coli R861 foram
utilizadas como marcadores de pesos moleculares conhecidos.
28
7.10 Construção do mutante em eae por nocaute não polar
A estratégia de mutagênese não-polar foi empregada com a finalidade de se
obter uma derivada da amostra 1551-2 que não expressasse intimina. Para atingir este
objetivo, foi utilizado o vetor suicida pJP5603, clonado com parte do gene a ser
nocauteado (Penfold & Pemberton, 1992).
Inicialmente, um fragmento de 924 pb do gene eae foi amplificado, a partir da
amostra selvagem 1551-2, e clonado no vetor pGEM – T Easy (Promega, Madison, WI,
USA). Após ligação, células competentes de E. coli JM109 foram transformadas por
eletroporação e plaqueadas em agar LB contendo ampicilina (100 μg/ml), IPTG
(isopropil-β-D-tiogalactopiranosídio) (0,5 mN) e X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-βD-galactosídio) (80 μg/ml), conforme descrito pelo fabricante. As colônias brancas,
resistentes a ampicilina, foram selecionadas para confirmação da presença do inserto
por PCR e por reações de digestão com EcoRI. Após essa etapa de clonagem, o
fragmento do gene eae clonado em pGEM – T Easy foi extraído do vetor com EcoRI,
eluído do gel utilizando o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System
(Promega, Madison, WI, USA), e ligado ao vetor pJP5603 (Km) no sítio de EcoRI.
Após ligação, as células competentes de E. coli DH5αλpir foram transformadas também
por eletroporação e plaqueadas em ágar LB contendo canamicina (50 μg/mL) e X-Gal
(80 μg/ml). As colônias brancas, resistentes a canamicina, foram selecionadas e testadas
para a presença do inserto por PCR. As colônias que apresentaram o inserto foram
armazenadas a –70ºC em LB-glicerol contendo canamicina. Em seguida, o DNA
recombinante foi extraído e transferido para E. coli S17-λpir por eletroporação.
Para os experimentos de conjugação, foi utilizada como receptora a amostra
selvagem 1551-2 que apresenta resistência ao ácido nalídixico (selecionada neste
estudo). As amostras de E. coli S17-1λpir (KmR) (doadora) e 1551-2 (NalR) (receptora)
29
foram cultivadas por 16 a 18 h em 3 ml de caldo LB contendo os respectivos
antibióticos. Em seguida, 1 ml da doadora e 100 μl da receptora foram centrifugados a
700g, por 15 minutos, e ressuspensos em 100 μl de LB.
Os cultivos foram misturados sobre a superfície de membranas de filtração de
poros de 0,45 μm (Millipore), dispostas sobre placas de Petri contendo ágar LB. Duas
membranas foram colocadas em cada placa. Após incubação por 16 a 18 h, o
crescimento de cada membrana foi suspenso novamente em 10 ml de PBS. A seguir, 50,
100 e 150 μl da suspensão (mistura de conjugação) foram semeados em ágar LB
contendo canamicina e ácido nalidíxico.
Os mutantes aqui selecionados foram avaliados quanto à perda da capacidade de
expressar a adesina intimina por immunoblot, utilizando anti-soro específico contra
intimina, gentilmente cedido pelo Dr. Gad Frankel do Imperial College of Science,
Londres.
7.11 Mutagênese por Mini-Tn 10
O Transposon Mini-Tn10 foi empregado para a construção de um banco de
mutantes da amostra 1551-2:eae-, já mutada no gene eae, que codifica a adesina
intimina.
O Transposon Mini-Tn 10 (Alexeyev et al., 1995) foi introduzido na amostra
1551-2:eae- por conjugação entre a amostra doadora S17-λpir (que contém o plasmídio
pBSL181, com o transposon Mini-Tn10) e amostra receptora, 1551-2:eae-. As amostras
S17-λpir (pBSL181) doadora (CloR) e 1551-2:eae- receptora (NalR) foram cultivadas
por 16 a 18 horas em 3 ml de caldo LB contendo os respectivos antibióticos. Em
seguida, 1 ml da doadora e 100 μl da receptora foram centrifugados a 700g, por 15
minutos e ressuspensos em 100 μl de LB.
30
Os cultivos foram misturados sobre a superfície de membranas de filtração de
poros de 0,45μm (Millipore), dispostas sobre placas de Petri contendo ágar LB. Após
incubação por 18 horas, o crescimento de cada placa contendo as membranas foi
suspenso em 10 ml de PBS. Foram realizados 10 eventos de conjugação.
7.12 Pesquisa de Determinantes Genéticos de Virulência pelo ensaio de Hibridação
de Colônias (Colony blot)
As amostras de aEPEC foram semeadas em 3 mL de caldo LB (anexo 1.1) e
incubadas por 16 horas em estufa a 37ºC. A seguir, foram semeadas em placas de agar
MacConkey , por meio da técnica de placas mestre e incubadas por 16 horas à 37ºC. Em
seguida, uma folha de papel de filtro Whatman nº. 541 (Whatman, New Jersey, EUA)
de mesmo diâmetro da placa foi pressionada sobre as colônias bacterianas a fim de
transferi-las para os filtros, procedendo-se à incubação dos mesmos por 1 hora à 37ºC.
Os filtros assim obtidos foram tratados segundo metodologia descrita por Maas (1983),
com solução desnaturante (anexo 8.1), expostos aos vapores de água fervente durante 3
minutos e novamente tratados com solução desnaturante por 1 minuto, à temperatura
ambiente. Após esse período, os filtros foram imersos em solução neutralizante (anexo
8.2) durante 4 minutos e colocados para secar a 65ºC.
Os fragmentos de DNA utilizados como sondas foram obtidos por PCR,
marcados com 50 μCi de [α-32P] dCTP (Amesham Biosciences UK Limited), com
atividade específica de 3.000 Ci/nmol utilizando-se o kit Ready-To-Go DNA labelling
Beads (-dCTP) (Ameshan Biosciences UK Limited), segundo especificações do
fabricante.
Os fragmentos de DNA, num total de 100ng, em volume de 45μL de água,
foram desnaturados por 5 minutos a 100ºC e, em seguida, mantidos em banho de gelo.
31
A solução foi transferida para os microtubos do kit contendo a mistura de marcação e
delicadamente homogeneizada. Em seguida, 50 μCi de [α-32P] dCTP foram adicionados
à mistura e o tubo foi incubado a 37ºC por 20 minutos. A purificação dos nucleotídeos
marcados não incorporados foi realizada em microcolunas de Sephadex G50
ProbeQuant G50 microcolumns (Pharmacia-Biotech, New Jersey, EUA), segundo
recomendações do fabricante. O fragmento sonda assim obtido foi mantido a -20ºC até
o momento do uso.
Os filtros foram incubados durante 1 hora à 65ºC, em solução de pré-hibridação
(anexo 8.4) acrescida de 100μg/mL de DNA desnaturado de esperma de salmão
(Eppendorf, USA), sob agitação lenta. Foi empregado o volume de 5mL de solução de
hibridização por filtro. Em seguida, os filtros foram transferidos para sacos plásticos
contendo nova solução de pré-hibridação (anexo 8.4) acrescida de aproximadamente 105
cpm/mL da sonda radioativa, previamente desnaturada à 100ºC por 5 minutos. Os sacos
de hibridização foram selados e incubados por 18 horas à 65ºC sob agitação lenta. Após
este período, os filtros foram transferidos para recipientes adequados para posterior
lavagem. A seguir, a solução de hibridação contendo a sonda radioativa foi retirada, e os
filtros foram lavados por duas vezes durante 15 minutos à 65ºC, sob agitação lenta, em
solução de SSC a 0,1 x e SDS a 0,1% e duas vezes em solução de SSC a 0,1 x e SDS a
0,05%. Após este período, os filtros foram secos à temperatura ambiente e
autoradiografados, pela exposição a filmes de raio X (X-Omat-R, Eastman Kodak –
Rochester, NY, USA), em cassetes apropriados contendo tela intensificadora, por 18
horas à -70ºC. Em seguida, o filme foi revelado em revelador automático de filmes de
raios X.
32
7.13 Southern blotting
Após separação eletroforética e visualização do DNA genômico digerido, o gel
de agarose foi submetido a dois banhos de aproximadamente 15 minutos à temperatura
ambiente com solução desnaturante (anexo 9.1). Em seguida, o gel foi submetido a dois
banhos de água para lavagem da solução desnaturante e transferido para dois banhos
consecutivos de solução neutralizante (anexo 9.2) por 15 minutos à temperatura
ambiente.
O DNA genômico da amostra 1551-2 e do seu mutante em intimina (extraído
com o kit DNA Easy – Invitrogen), digeridos com HindIII, foi tranferido do gel de
agarose para a membrana de nylon positivamente carregada, utilizando-se o aparato de
transferência Vaccugene XL – Vaccum Blotting System (Pharmacia, EUA), durante 1
hora sob vácuo a baixa pressão (50 mbar), segundo recomendação do fabricante. Após
transferência, a membrana de nylon contendo o DNA cromossômico foi retirada do
equipamento e submetida a um banho de 20 minutos à temperatura ambiente com
solução SSC 2 x, e seca ao ar. A seguir a membrana foi colocada em um recipiente, que
continha solução de pré-hibridação por 1 hora à 37ºC.
As membranas foram então submetidas à hibridação com sonda marcada
radioativamente para sequências gênicas de nosso interesse, sendo processadas e
reveladas como descrito para o Colony-blot.
33
8. Produção de anti-soro em coelho
A amostra 1551-2:eae- foi cultivada em DMEM a 37ºC por 18 h sem agitação.
Em seguida, as células bacterianas foram coletadas e ressuspensas em 2 ml de PBS com
0,5% de formaldeído, procedimento realizado em esterilidade e mantidas a 4ºC. Para as
imunizações, o inóculo foi ajustado para uma concentração bacteriana equivalente ao
tubo 1 da escala de MacFarland (3x108 UFC/ml) em solução salina. Essa suspensão foi
inoculada por via endovenosa em coelhos albinos jovens (raça New Zealand), com
aproximadamente 60 dias de idade. O esquema de imunização foi realizado de acordo
com o descrito por Ewing (1986) e incluiu inoculações em volumes crescentes de 0,5 a
4,0 ml com intervalos de 3 dias entre as mesmas.
A sangria branca foi realizada após uma semana da última dose reforço. O
sangue coletado foi mantido por 2 horas a 37ºC e, então, centrifugado (700 g durante 10
min) para separação do soro. O soro coletado foi inativado por incubação à 56ºC por 1
hora.
9. Curva de crescimento
Para a realização da curva de crescimento, a amostra 1551-2:eae- e a amostra
mutada não aderente 143 foram cultivadas durante 18h à 37ºC. Após esse período cada
cultura foi diluída na razão 1:50, utilizando-se erlenmeyer de 250 mL contendo 20 mL
de caldo LB pré-aquecido à 37ºC. Essa suspensão foi incubada, com agitação, a 37ºC
por 30 minutos e só após esse período foi retirado 1 mL para a realização da primeira
leitura da DO600.
As leituras foram realizadas em intervalos de 20 minutos até que o teste tivesse
completado 3 horas de duração, gerando assim 10 pontos de comparação.
34
10. Absorção do anti-soro utilizando-se o mutante não aderente
Foi realizada utilizando-se o mutante não aderente obtido neste estudo o qual foi
cultivado em 100 mL de caldo LB durante 18 horas à 37ºC. Após esse período, o cultivo
bacteriano foi dividido em 4 tubos plásticos de centrífuga e centrifugado a 5.200g por 5
minutos. Após essa centrifugação, 2 dos tubos de centrífuga foram armazenados em
geladeira e aos outros 2 tubos foram adicionados 5 mL de PBS, sendo então submetidos
à fervura por aproximadamente 1 hora. Em seguida, esses tubos foram novamente
centrifugados à 5200g por 5 minutos, o sobrenadante foi desprezado e, ao sedimento,
foi adicionado aproximadamente 1 mL de soro.
Essa mistura foi mantida por 2 horas à 48ºC, e homogeneizada a cada 15
minutos. Após 2 horas de incubação, a mistura sedimento + soro foi centrifugada à
11600 g por 30 minutos, e o sobrenadante (soro) foi transferido para outro tubo.
11. Sequenciamento do DNA
Com o objetivo de sequenciar a região C-terminal do gene eae da amostra 15512, um fragmento de aproximadamente 3,1 kb foi amlificado, através de reação de PCR
com a enzima Elongase (Invitrogen, USA), utilizando-se os primers AE11/escD. Esse
fragmento foi então clonado no vetor pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit (Amersham
Biosciences), segundo recomendações do fabricante. Os plasmídios recombinantes
obtidos foram denominados de pISEQ1, pISEQ2 e pISEQ3
Para o seqüenciamento do inserto dos 3 clones recombinantes, pISEQ1, 2 e 3
(pMOS + gene eae da amostra 1551-2), foram utilizados os oligonucleotídeos
escD/SeqR2/SeqR3 descritos na Tabela 3, sendo os procedimentos realizados em
seqüencidador automático ABI377/96 (Applied Biosystems), utilizando terminadores de
cadeia dideoxinocleotídeos fluorescentes BigDye, com o seguinte programa: 96ºC 5
35
min.; 25 x [96ºC 20 seg., 50ºC 10 seg.; 60ºC 4 min.]. As seqüências resultantes (reads),
em forma de cromatogramas, foram utilizadas para montar seqüências da região clonada
– contigs – com o auxílio dos programas Phred, Phrap e Consed (Gordon et al., 1988).
Tabela 3: Seqüência dos primers utilizados nos experimentos de seqüenciamento.
Primers
Seqüências
escD
CAG AAC ATT CAG CCG TAC
SeqR2
CCT AGA GGG GTG GTT TGT GG
SeqR3
GCT GAG TAC CAT GTA TAT TTC CCG
36
Resultados
1. Seleção da amostra
Com o objetivo de eleger uma amostra para a caracterização da estrutura
responsável pelo padrão AL (figura 3), em ensaios de 6h, uma coleção de 9 amostras,
obtidas anteriormente em nosso laboratório, foi submetida a um ensaio de adesão para
confirmar o padrão anteriormente descrito. A coleção de amostras também foi analisada
quanto ao perfil de bandas de DNA plasmidial (figura 4), e a combinação de genes de
virulência que apresentavam (tabela 4).
Vieira et al. (2001) haviam demonstrado previamente que estas amostras eram
potencialmente capazes de promover lesões A/E, em células HeLa e em células
intestinais Caco-2, uma vez que foram positivas no teste de FAS. Neste estudo, esta
propriedade foi confirmada em células HeLa, para uma amostra selecionada (1551-2),
pela observação da formação de lesão A/E (formação de estruturas semelhantes a
pedestais, sob as bactérias aderidas intimamente, por microscopia eletrônica de
transmissão) (Figure 5).
A ocorrência de plasmídios de alto peso molecular compatíveis com pEAF foi
analisada em gel de agarose. Embora 8 das 9 amostras tenham apresentado uma ou duas
bandas de alto peso molecular (entre 27 e 110 MDa), uma amostra (1551-2) foi
desprovida de plasmídios (Figure 4; Tabela 4). Além disto, somente duas amostras
(0471-1 e 2932-2) carrearam bandas de 60-65 MDa, as quais foram compatíveis com o
tamanho de pEAF.
37
Os sub-tipos de intimina haviam sido previamente analisados por PCR para 5 (α,
β, γ, δ, e ε) (Vieira et al., 2001) de pelo menos 16 subtipos conhecidos de intimina
(Garrido et al. 2006). Neste estudo, esta analise foi estendida para outros dois subtipos
(ι and ζ) (Zhang et al. 2002); observou-se que duas amostras carrearam intimina β,
enquanto as 7 restantes foram não tipáveis, com os primers testados.
O envolvimento de varias estruturas adesivas recém descritas em E. coli, isto é,
Saa, Paa, ToxB, Iha, Lpf e Lda, nas propriedades de aderência das amostras foi avaliada
por PCR. A presença de ler (LEE-encoded regulator) foi também avaliada. Os dados
das seqüências de virulência encontradas foram combinados com dados reportados
previamente para estas amostras (Vieira et al, 2001; Gomes et al., 2004) e estão
apresentados na Tabela 3. É interessante ressaltar que 3 amostras foram desprovidas do
gene regulatório ler, ou que as seqüências desse gene, nestas 3 amostras, diferiam nas
regiões de anelamento dos primers.
A caracterização dessa coleção de 9 amostras de aEPEC, sorogrupo não EPEC,
que expressam AL na ausência de BFP, revelou uma grande diversidade genética e de
sorotipos, porém nenhuma adesina comum, que pudesse estar envolvida com a
formação de microcolônias bacterianas compactas, foi identificada. Apenas duas
amostras foram positivas quando testadas com a sonda paa e lfpAO113 (0621-6 e 4632-3
respectivamente). Apesar de todas as 9 amostras terem sido positivas para a sonda eae,
o subtipo de intimina não pode ser determinado para a maioria das amostras, sendo o
subtipo β encontrado em apenas duas amostras (2932-2 e 4632-3).
A amostra de aEPEC 1551-2, que havia sido isolada de uma criança com
diarréia sem nenhum outro patógeno associado (Vieira et al., 2001), foi eleita para a
identificação da estrutura responsável pela formação de microcolônias bacterianas
compactas na ausência de BFP, por ser desprovida de bandas de DNA plasmidial, e de
38
fatores adicionais de virulência, até então descritos. A ausência de bandas de plasmídios
nessa amostra demonstra que o fenótipo de interesse é codificado por genes localizados
no cromossomo bacteriano.
39
Tabela 4. Características clínicas, fenotípicas e genotípicas de 9 amostras de EPEC atípicas não pertencentes a sorogrupos de EPEC que
expressam adesão localizada em 6 horas (AL6) na ausência de Bundle forming pilus.
Amostras
Diarréia
Idade do
Sorotipoa
Paciente
Bandas de DNA
Tipo de
plasmidial b (MDa)
Intimina
Genes de Virulênciad
(meses)
0471-1
Sim
24
ONT:H19
60,8; 39, 3
NT
eae irp2
0621-6
Sim
16
O41:H-
110,0; 88,0
NT
ler eae inv paa
1331-2
Sim
35
O70:H2
81,8
NT
ler eae irp2
1551-2
Sim
23
ONT: H-
-
NT
eae
2041-1
Sim
41
ONT: H2
36,4
NT
ler eae
1112-6
Não
24
R:H11,21
75,9
NT
ler eae irp2 astA pet
hly
2932-2
Não
34
O153:H7
65,5
β
ler eae
3522-6
Não
23
ONT:H11
75,9; 27,2
NT
eae irp2 astA pet hly
4632-3
Não
16
ONT: H-
45,2
β
ler eae irp2 astA lpfA
a
NT, não tipável com os anti-soros O1 to O173 e H1 to H56; H-, imóvel; R, rugosa (Vieira et al., 2001)
Tamanho aproximado; somente bandas de alto peso molecular (> 15 MDa)
c
NT, não tipável com as seqüências testadas (α, β, γ, δ, ε, ι, ζ) (Vieira et al., 2001 e este estudo).
d
E. coli seqüências genéticas pesquisadas: bfpA, perA, EAF, E-hly, inv, EAEC, aggR, aggC, aafC, aspU, shf, irp2, pet, pic, astA, pap, afa, sfa ,
daaC, cdt, cnf, hly (Vieira et al., 2001; Gomes et al., 2004); e saa, paa, toxB, iha, ldaG, lpfA e ler (este estudo).
b
40
Figura 3: Padrão de adesão localizada apresentado pela amostra E. coli 1551-2. Ensaio
realizado em células HeLa, utilizando 6 horas de contato. Pode-se observar a presença de
agregados compactos de bactérias aderidas em regiões localizadas das células.
Figura 4: Gel de agarose a 0,7% com perfis de bandas de DNA plasmidial de 9 amostras de
aEPEC de sorogrupos não EPEC e de E. coli R 861, contendo bandas de pesos moleculares
conhecidos como padrão. Observa-se a ausência de bandas de DNA plasmidial na amostra
1551-2.
41
Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão da amostra 1551-2. Observa-se nessa figura
a formação do pedestal característico detectado na lesão attaching and effacing (seta).
42
2. Caracterização da amostra 1551-2
Uma vez eleita uma amostra que mantivesse o padrão AL, fomos verificar se ela
realmente não era capaz de expressar a fímbria BFP. Para isso, foi realizado um
immunoblot com o soro policlonal anti-BFP, e observamos que a amostra 1551-2 não
foi capaz de expressar a fímbria BFP, pois não apresentou uma banda de proteína
compatível (~18 kDa) com a observada na amostra protótipo de EPEC E2348/69,
utilizada como controle positivo (Figura 6).
Figura 6: Ensaio de Imunoblot de proteínas totais das amostras E2348/69 e 1551-2,
utilizando o soro anti-BFP. Observa-se que somente a amostra E2348/69 é capaz de produzir
a proteína de 18 kDa (seta), correspondente à subunidade estrutural da fímbria BFP.
Dados obtidos por Vieira et al. (2001) já indicavam que a amostra 1551-2 não
reagia com a sonda bfpA, correspondente a sub-unidade estrutural da fímbria. Mesmo
em posse dessa informação, fomos buscar, por PCR, se a amostra em questão poderia
conter algum outro gene relacionado ao operon bfp, uma vez que dados obtidos por
Bortolini et al. (1999) indicaram que algumas amostras de EPEC apresentavam uma
deleção de aproximadamente 13 kb no operon bfp, o que resultava em uma ausência de
expressão dessa fímbria. Para tanto, foram utilizados primers para o gene bfpL, sendo
que as reações não geraram amplificação na amostra 1551-2 (figura 7).
43
Figura 7: Gel de agarose com o produto de amplificação do gene bfpL das
amostras: E2348/69, 1551-2 e E. coli HB101. Podemos observar que a
amplificação com a amostra 1551-2 não gerou um fragmento (~500 pb)
correspondente ao observado na amostra E2348/69, utilizada como controle
positivo do experimento.
Também pesquisamos nessa amostra, usando PCR para o gene fimH, a presença
do operon da fímbria tipo I, e verificamos que, nesse caso, também não ocorreu a
amplificação de uma banda referente ao gene fimH (correspondente à proteína adesiva
da fímbria), o que nos indica que essa amostra não expressa a fímbria tipo I (Figura 8).
44
Figura 8: Gel de agarose com o produto de amplificação do gene fimH das amostras:
E2348/69, 1551-2, e HB101. Podemos observar ausência de amplificação de um
fragmento de ~508 pb com a amostra 1551-2, ao contrário do observado na amostra
E2348/69, utilizada como controle positivo do experimento.
Finalizando esta fase de caracterização da amostra 1551-2, foi realizado um
ensaio de imunomarcação com o soro policlonal anti-BFP dessa amostra e da amostra
protótipo de EPEC E2348/69, utilizada neste caso como controle positivo para a
presença da fímbria BFP. Este ensaio de imunomarcação confirmou que realmente a
amostra 1551-2 não expressa a fímbria BFP (Figura 9).
45
A
B
Figura 9: Imunomarcação com o soro policlonal anti-BFP das amostras: E2348/69 (A) e
1551-2 (B). Observa-se que somente na amostra E2348/69 ocorre marcação da fímbria BFP.
A ausência de marcação na amostra 1551-2 indica que essa amostra não é capaz de
expressá-la. Magnitude: figura A: 12.930 x; figura B: 10.000 x.
46
3. Cinética de Adesão
Com o objetivo de se conhecer a evolução do padrão AL da amostra 1551-2, foi
realizada uma cinética de adesão dessa amostra, em paralelo com a da amostra
E2348/69 (protótipo de tEPEC, portanto portadora de bfpA), onde foi possivel se
observar comportamentos bastante distintos.
Enquanto com a amostra protótipo E2348/69, em 2 horas de ensaio já se pode
observar microcolônias pequenas e bem compactas, para a amostra 1551-2 a tendência a
formar microcolônias compactas só começa a se pronunciar após 4 horas de incubação
(3h + 1h). A presença de microcolônias compactas bem definidas na amostra E2348/69
já pode ser observada após 3 horas de ensaio, sendo que ao final de 6 horas (3 h + 3 h),
ainda se observa a presença de microcolônias grandes e compactas. Para a amostra
1551-2, após 5 (3 h + 2 h) horas de ensaio podemos verificar o predomínio de
microcolônias pequenas e compactas, enquanto que ao final das 6 horas de ensaio (3 h +
3 h) o que se observa é a presença de microcolônias bastante compactas e muito bem
definidas (Figura 10).
47
1551-2
E2348/69
Figura 10: Cinética de adesão das amostras de aEPEC 1551-2 e protótipo de tEPEC
E2348/69. Ensaio utilizando células HeLa e diferentes períodos de incubação. Aumento
microscópico: 1000 x
48
4. Obtenção da amostra mutada 1551-2:eaePara verificar o envolvimento da intimina no estabelecimento do padrão AL
compacto, decidiu-se realizar uma mutação no gene eae. Com esse objetivo, o sistema
que utiliza o vetor suicida pJP5603 foi escolhido, pois contém a origem de replicação
R6K ori, derivada de pUTKm, um fragmento de 1861 pb derivado de Tn5, conferindo
resistência à canamicina, e um fragmento de 760 pb de pSUP202, carregando o sítio
RP4 Mob para a mobilização do plasmídio (Penfold & Pemberton 1992). Este vetor é
dependente, portanto, da complementação in trans dos genes que codificam a proteína
Pir para que ocorra sua replicação estável na amostra hospedeira.
Foi amplificado por PCR um fragmento interno ao gene eae de 924 pb a partir
da amostra selvagem 1551-2 (utilizando os primers AE11/AE12). O fragmento
amplificado foi clonado no vetor pGEM-T Easy (Promega), originando o clone pRT1.
A seguir, o fragmento de eae foi extraído de pRT1, após digestão com a enzima EcoRI,
e clonado no sítio de EcoRI do vetor pJP5603, originando o plasmídio denominado
pRT2 (Figura 11). Este plasmídio foi utilizado para transformar a amostra de E. coli
DH5α-λPir. Os clones assim obtidos foram avaliados por PCR, pRT2 foi extraído e
transformado na amostra E. coli S17-λPir. Esta foi utilizada como doadora nos
experimentos de conjugação com a amostra selvagem 1551-2.
De 20 transconjugantes testados, um resistente à canamicina e que não
expressava a adesina intimina foi selecionado para estudos posteriores. Esse
transconjugante (mutante) foi denominado 1551-2:eae-.
O mutante no gene eae foi construído, portanto, pela inserção do plasmídeo
pRT2 no cromossomo da amostra selvagem por meio de recombinação homóloga. Esse
processo altera a seqüência de DNA da ORF de eae de maneira que uma proteína
truncada, resultante da fusão do gene lacZ’ de pRT2 com o gene eae nocauteado da
49
amostra 1551-2, é transcrita sem interrupção da transcrição dos genes adjacentes (Elliot
& Kaper, 1997).
Figura 11: Mapa do vetor suicida pJP5603 indicando o sítio de EcoRI onde o fragmento de 924
pb do gene eae foi clonado para a obtenção do plasmídio recombinante pRT2.
50
A figura 12 compara o padrão de adesão da amostra 1551-2 com o da amostra
1551-2:eae-. É importante destacar nessa figura o padrão de adesão da amostra 15512:eae- que, mesmo sem a presença da intimina, continua aderindo intensamente sobre
células, só que agora num padrão semelhante ao padrão de adesão difusa (AD) da
categoria diarreiogênica DAEC.
Figura 12: Teste de adesão em células HeLa da amostra 1551-2 e derivada
mutante em intimina. A: padrão de adesão da amostra selvagem 1551-2. Note a
presença de microcolônias compactas e bem definidas (seta). B: padrão de adesão
difusa da amostra 1551-2:eae-, mutada em intimina.
O mutante 1551-2:eae- foi avaliado quanto a perda da capacidade de expressar intimina
de 2 maneiras: por immunoblot e também pelo teste de FAS. A reação de immunoblot,
realizada com extratos protéicos totais das amostras selvagem 1551-2 e mutada 15512:eae-, utilizando soro anti-intimina, revela que somente a amostra selvagem foi capaz
de expressar uma proteína de 94 kDa correspondente a intimina, ao passo que a amostra
mutada 1551-2:eae- não apresentou qualquer banda nessa altura. Assim sendo, podemos
confirmar que a amostra 1551-2:eae- deixou de expressar intimina (Figura 13).
51
Figura 13: Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas totais das
amostras 1551-2 e mutante em eae. Observa-se a presença da proteína de 94 kDa
referente a adesina intimina tanto na amostra controle (E2348/69), como na
amostra selvagem, mas não na amostra 1551-2:eae- mutada em eae.
5. Southern-blot realizado para confirmar a mutação no gene eae da
amostra 1551-2
Este experimento foi realizado para demonstrar que o gene eae, que codifica a
adesina intimina, havia realmente sido interrompido pela inserção do vetor suicida
pJP5603. Na figura 14, apresentamos um esquema do resultado esperado tanto na
amostra 1551-2 como na 1551-2:eae-, provavelmente mutada no gene eae. A enzima
escolhida para este experimento foi HindIII, pois não corta o gene eae (Nº de acesso no
GenBank: AF022236), devendo, assim, gerar um fragmento de aproximadamente 10kb.
Na amostra 1551-2:eae- esse fragmento não seria observado, mas, no lugar dele, seriam
observados dois fragmentos menores.
Como podemos observar na figura 15 a amostra selvagem 1551-2 revelou uma
banda de aproximadamente 10 kb enquanto a amostra mutada revelou duas bandas.
Com base nesses dados, podemos afirmar que o gene eae da amostra 1551-2 foi
52
interrompido pela inserção do vetor suicida pJP5603 por um processo de recombinação
homóloga.
Figura 14: Representação esquemática dos fragmentos HindIII observados na
amostra selvagem 1551-2, e na amostra mutada em intimina 1551-2:eae-. Observa-se
a inserção do vetor suicida pJP5603 no gene eae, e os fragmentos esperados no
Southern-blot. Esquema adaptado de Miller & Mekalanos 1988.
53
A
B
Figura 12: Southern blot para comprovar a inserção do vetor suicida pJP5603 em eae. Em A, observa-se um
gel de agarose a 1% com DNA das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do vetor pRT2, pJP5603 + fragmento de
~924 pb de eae clonado, digerido com HindIII. Em B, observa-se o Southern blot do DNA cromossômico
das amostras selvagem 1551-2 e mutada 1551-2:eae- hibridizados com a sonda eae. Na amostra 1551-2,
observa-se um fragmento de aproximadamente 10kb (A), enquanto, na amostra mutada, observa-se a
presença de 2 fragmentos marcados pela sonda (B e C). O vetor pRT2 digerido com HindIII foi utilizado
como controle positivo desse experimento (seta).
54
6. Microscopia eletrônica de transmissão
Com o intuito de melhor entender os eventos que ocorrem durante o processo de
adesão da amostra selvagem 1551-2, bem como de seu mutante em intimina 1551-2:eae, optamos por realizar um ensaio de interação com células HeLa e análise por
microscopia eletrônica de transmissão.
Como se pode observar na Figura 16A, a amostra selvagem não só adere às
células HeLa como também as invade. É importante ressaltar que o campo ilustrado na
foto da Figura 16A revela o que pode ser observado em qualquer área examinada nas
preparações. Em pequenos aumentos, eram observadas apenas microcolônias compactas
e frouxas, mas quando maiores aumentos foram utilizados, grande parte das bactérias
dessas microcolônias encontrava-se interiorizada, de forma quase que individualizada,
dentro de estruturas que lembram vacúolos. Em alguns desses vacúolos, foi possível
detectar mais de uma bactéria, sugerindo um processo de multiplicação intracelular.
Essa observação revela que a amostra selvagem 1551-2 não só foi capaz de invadir as
células HeLa, como também foi, aparentemente, capaz de se multiplicar em seu interior.
O mesmo não foi observado com a amostra 1551-2:eae-, mutante em intimina.
Como se pode observar na Figura16D, essa amostra foi capaz de aderir às células HeLa
num padrão bem diferente do observado na amostra selvagem, mas não foi capaz de
invadi-las. O mutante em intimina perdeu a capacidade de se agregar formando
microcolônias compactas, e passou a aderir às células HeLa num padrão que nos
recorda a adesão difusa (AD).
55
Figura 16: Microscopia eletrônica de transmissão da interação das amostras 15512 (A e B) e 1551-2:eae- (C e D) com células HeLa. Observa-se que somente a
amostra selvagem 1551-2 foi capaz de invadir as células HeLa em ensaios de 6h,
ao passo que a amostra 1551-2:eae-, mutada em intimina, foi somente capaz de
aderir num padrão semelhante ao difuso. A seta indica uma microcolônia com
bactérias internalizadas.
56
7. Complementação da amostra 1551-2:eae- com o plasmídio pCVD438
A mutação no gene eae da amostra selvagem 1551-2 fez com que esta perdesse a
capacidade de formar microcolônias, mas não de aderir. Tentando avaliar a similaridade
funcional do gene eae da amostra selvagem 1551-2 com o da amostra protótipo de
EPEC E2348/69, resolvemos complementar a amostra mutada em intimina, 1551-2:eae, com o plasmídio pCVD438, que consiste em um plasmídio recombinante contendo o
gene eae da amostra protótipo E2348/69 (Donnenberg & Kaper 1991).
Após realizada a eletroporação, as colônias resistentes a cloranfenicol foram
selecionadas e primeiramente testadas quanto a capacidade de expressar intimina por
immunoblot. Na figura 17, pode-se observar que a amostra complementada voltou a
expressar a adesina.
Figura 17: Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas totais da amostra
1551-2:eae- complementada com o plasmídio recombinate pCVD438 bem como dos
controles 1551-2:eae- (controle negativo) e 1551-2 (controle positivo). Observa-se a
presença da proteína de 94 kDa referente a adesina intimina em todas as amostras com
exceção do controle negativo.
57
Com
base
nesse
resultado,
decidiu-se
averiguar
se
essas
amostras
complementadas com o gene eae, provenientes da amostra protótipo E2348/69,
resgatariam a capacidade de promover a lesão A/E averiguada pelo teste de FAS (Figura
18). Diferentemente do que esperávamos essas amostras não foram capazes de
promover a lesão A/E, sendo assim FAS negativas. Como controle positivo para esse
experimento, a amostra CVD206 (E2348/69 mutada em intimina) foi transformada com
o plasmídio recombinante pCVD438, onde foi possível observar que, após a
complementação, a amostra restaurou a sua capacidade de acumular filamentos de
actina avaliado através do teste de FAS.
Para melhor compreender o papel do gene eae na invasão da amostra selvagem
1551-2, o mesmo foi submetido a seqüenciamento com o objetivo de se verificar se a
intimina dessa amostra é semelhante a algum tipo já descrito, ou se seria um novo tipo
de intimina, apresentando função de invasão celular.
A
B
Figura 18: Teste de FAS das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae- (B) complementada com o gene eae
da amostra E2348/69, protótipo de tEPEC. Observa-se o acúmulo de filamentos de actina somente na
amostra 1551-2 em A (seta), enquanto a amostra 1551-2:eae- (B) complementada foi incapaz de induzir
o acúmulo dos filamentos de actina.
58
8. Construção de uma biblioteca de mutantes
Não só os ensaios de microscopia eletrônica de transmissão, bem como os
ensaios de microscopia óptica, realizados em células HeLa, revelaram que apesar da
amostra 1551-2:eae- não formar microcolônias, ela não perdeu a capacidade de aderir
às células HeLa em ensaios de 6 horas. Na ausência da adesina intimina, que outra
estrutura poderia estar mediando a adesão entre a amostra 1551-2:eae- e as células
HeLa?
No intuito de tentar responder essa pergunta, construímos um banco de mutantes
utilizando o vetor pBSL181 que contém o transposon mini-Tn10. Esse transposon
insere-se ao acaso no cromossomo da célula provocando mutações aleatórias. Como o
interesse era estudar a estrutura responsável pela adesão da amostra 1551-2:eae-, os
mutantes obtidos foram testados quanto à perda da capacidade aderente.
Foram selecionadas aproximadamente 2.000 colônias provenientes de vários
eventos de conjugação. Todas essas colônias foram testadas individualmente e 5
mutantes não aderentes foram então selecionados para o prosseguimento deste estudo.
Foi então realizada uma curva de crescimento dos cinco mutantes não aderentes e
apenas dois deles foram capazes de se reproduzir de forma semelhante à amostra 15512:eae- . Esses dois mutantes foram então repurificados em placas de MacConkey
(contendo ácido nalidíxico, kanamicina e cloranfenicol) e novamente submetidos a teste
de adesão de 6 horas para confirmar a perda da capacidade de adesão.
Como ambos os mutantes não aderentes selecionados apresentaram resultados
muito similares, o mutante não aderente-143 foi selecionado para o prosseguimento
deste estudo. Tanto os resultados obtidos com a curva de crescimento, como o teste de
adesão às células HeLa encontram-se ilustrados na Figura 19.
59
O mutante não aderente 143 também foi avaliado através de Southern-blot,
utilizando como sonda o gene cat, com o objetivo de avaliar se havia uma única cópia
do transposon inserido no genoma dessa amostra não aderente. O DNA genômico do
mutante não aderente 143 foi digerido com EcoRV e após hibridação com o gene cat
revelou um único fragmento de aproximadamente 2,5 kb (dados não mostrados)
Figura 19: Análise do mutante não aderente da amostra 1551-2:eae-. A: Curva de crescimento das
amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do mutante não aderente (143). B e C: Padrão de adesão da amostra
1551-2:eae- (B) e do seu mutante não aderente-143 (C) às células HeLa. Observa-se que o mutante não
aderente (143) perdeu completamente a sua capacidade de aderir às células HeLa em ensaios de adesão
de 6 horas.
60
9. Soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante
não aderente 143: caracterização e inibição de adesão.
A obtenção de um mutante não aderente que preserva sua capacidade de
replicação sugere que o mesmo deixe de expressar alguma proteína fundamental para o
fenótipo que se estuda. Ao absorver o soro produzido com a amostra mutada em
intimina, 1551-2:eae- com o mutante não aderente 143, esperamos encontrar nesse soro
apenas anticorpos contra proteínas que estejam relacionadas ao processo de adesão da
amostra 1551-2:eae-.
Como muitas fímbrias bacterianas têm sua expressão inibida com
cultivos em temperaturas inferiores a 25ºC, foi realizado um teste de adesão, durante 6 h
a 18ºC, da amostra 1551-2 e da amostra 1551-2:eae-. Na figura 20, está representada a
inibição de adesão a células HeLa observada com essas amostras.
Para visualizar qual ou quais seriam as proteínas que o mutante não aderente
deixou de expressar, foi realizado um experimento de immunoblot com extratos
bacterianos totais. Na Figura 21, pode-se observar que apenas uma banda de 25 kDa foi
diferencial entre a amostra selvagem 1551-2 e o mutante não aderente 143. É importante
ressaltar que essa banda não se tornou totalmente ausente no mutante 143, mas se
apresentou muito mais tênue.
Outro dado importante revelado por essa figura é que a amostra selvagem 15512 quando cultivada a 18ºC também deixa de expressar uma banda de aproximadamente
25 kDa. É importante ressaltar que são duas situações onde não se observa aderência, e
que a banda de 25 kDa encontra-se diferencialmente expressa.
61
Figura 20: Teste de adesão em células HeLa das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae(B) na temperatura de 18ºC (6h). Tanto a amostra selvagem como a amostra mutada
em intimina tiveram sua adesão inibida nessa temperatura.
Figura 21: Immunoblot de extrato de proteínas totais das amostras: 1551-2, 15512:eae-, mutante não aderente, 1551-2 cultivada à 37ºC e 1551-2 cultivada à 18ºC,
utilizando o soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante
não aderente. Observa-se nesse ensaio uma banda de aproximadamente 25 kDa que se
encontra reduzida no mutante 143 e ausente quando a amostra 1551-2 é cultivada à
18ºC.
62
Esse soro também foi utilizado para a realização de um ensaio de inibição de
adesão onde a adesão foi intensamente reduzida (Figura 22).
A
B
Figura 22: Ensaio de inibição de adesão da amostra 1551-2:eae- com soro absorvido com o
mutante 143, realizado em células HeLa durante 6 horas. Em A, observa-se a amostra 15512:eae-, utilizada nesse experimento como controle positivo, e em B, a amostra 1551-2:eae- na
presença do soro diluído 1:10. Observa-se uma intensa redução do número de bactérias
associadas ás células HeLa.
10. Clonagem do gene eae no vetor pMOS para seqüenciamento
Para a realização do seqüenciamento do gene eae da amostra 1551-2, foi
necessário realizar a clonagem desse gene em um vetor apropriado. Para a realização
desse experimento foi utilizado o Kit pMOS Blue Blunt End (Amersham Biosciences,
UK), que permite a clonagem de produtos de PCR. Para verificar se o fragmento de
aproximadamente 3,1 kb que continha o gene eae realmente havia sido clonado no vetor
pMOS, foi realizado um PCR utilizando os mesmos primers utilizados para a obtenção
do fragmento, bem como digestão com a enzima de restrição HindIII. Como se pode
observar na figura 23, foi possível detectar uma banda de aproximadamente 3,1 kb no
clone selecionado, compatível com a amplificada na amostra 1551-2, utilizada como
controle positivo da reação. Também se pode observar nessa figura que o DNA
63
plasmidial do clone selecionado, após digestão com a enzima HindIII, revelou uma
banda de aproximadamente 6 kb (sendo 2,8 kb referentes ao vetor pMOS e 3,1
referentes ao fragmento clonado).
Figura 23: Gel de agarose com o produto de amplificação do gene eae das
amostras 1551-2 e derivadas: 2) pISEQ (pMOS + fragmento de 3,1 kb
clonado); 3) 1551-2; 4) pISEQ digerido com HindIII e 5) pMOS.
Observa-se a presença de uma banda de aproximadamente 3,1 kb tanto no
pISEQ como na amostra 1551-2 utilizada como controle positivo. A digestão
do pISEQ com HindIII gerou um fragmento de aproximadamente 6 kb,
referente ao pMOS (2,8 kb) com o fragmento de 3,1 kb clonado.
64
11. Seqüenciamento e Análise do gene eae da amostra 1551-2
Com o objetivo de melhor conhecermos o gene eae da amostra 1551-2 um
fragmento de aproximadamente 3,1 kb (amplificado com os primers AE11 e escD) foi
clonado no vetor pMOS. Foram selecionados 3 clones denominados de pISEQ 1, 2 e3.
Esses 3 clones foram utilizados para o seqüenciamento de aproximadamente 1077
nucleotídeos pertencentes à região variável do gene eae denominada de Int280 (Frankel
et al., 1995). A análise da desses 1077 nucleotídeos seqüenciados revelou 98% de
identidade com o gene eae de uma amostra aEPEC do sorotipo O129:H-, pertencente ao
subtipo omicron (ο) (Figura 24). Estudos recentes (Blanco et al., 2006) identificaram
esse subtipo de intimina (omicron-ο) em outra amostra de aEPEC, sorogrupo não
EPEC, do sorotipo O84:H-.
Apesar do subtipo de intimina omicron (ο) ter sido relatado em duas amostras de
aEPEC, sorogrupo não EPEC, pertencentes aos sorotipos O129:H- e O84:H-, a
ocorrência de AL na ausência de BFP não foi reportada nessas amostras.
65
Figura 24: BLASTN da seqüência de 1077 nucleotídeos, obtida a partir do
seqüenciamento dos clones pISEQ1, 2 e 3. A análise dos 1077 nucleotídeos da
região C-terminal do gene eae da amostra 1551-2 revelou 98% de identidade com o
subtipo de intimina omicron (ο).
66
Discussão
Vários trabalhos vêm demonstrando que BFP, além de ser importante na
aderência que precede a aderência mediada por intimina, tem também importante papel
na formação das microcolônias bacterianas compactas observadas no padrão AL de
tEPEC (Trabulsi et al., 2002). Entretanto, ao caracterizar uma coleção de amostras de
aEPEC, não pertencentes aos sorogrupos clássicos de EPEC, Vieira et al. (2001)
identificaram 9 amostras que exibiam um padrão de aderência muito semelhante ao
padrão AL de tEPEC, exceto pelo fato de ser identificado apenas em ensaios mais
prolongados (6 horas) e na ausência de BFP.
Como o padrão de aderência mais
freqüentemente observado entre as aEPEC é o ALL, onde se formam microcolônias
bacterianas mais frouxas do que as do padrão AL (Trabulsi et al., 2002) e, ainda, como
as aEPEC compreendem um grupo muito heterogêneo, acreditamos que estudos em
subgrupos de amostras que compartilham determinadas propriedades poderiam auxiliar
na identificação de novos fatores de virulência e/ou combinações de genes de virulência
conhecidos, confirmando seu papel enteropatogênico bem como auxiliando em seu
diagnóstico. Assim, neste estudo, inicialmente, buscamos analisar o conjunto de
amostras de aEPEC desprovidas de BFP e produtoras de AL comparando diversas
características fenotípicas e genotípicas, algumas das quais publicadas anteriormente e
outras, obtidas neste estudo.
Até a publicação de Vieira et al. (2001) a ocorrência de microcolônias
bacterianas compactas (AL) em amostras de aEPEC desprovidas de BFP não havia sido
relatada. Estudos posteriores descreveram a ocorrência de AL na ausência de BFP em
algumas amostras de aEPEC do sorotipo O26:H11 (Scaletsky et al., 2005). Nesse
estudo, foi descrito um operon, denominado LDA, responsável pela expressão de uma
67
adesina afímbrial que confere o padrão de aderência difusa quando clonado em amostra
de E. coli-K12. Porém, os mecanismos pelos quais ocorre a formação de microcolônias
bacterianas compactas na ausência de BFP ainda permanecem desconhecidos.
Apesar do fenótipo de aderência comum, demonstramos que as 9 amostras de
aEPEC de nossa coleção são diversas com relação aos seus sorotipos, conteúdo
plasmidial, e perfil de genes de virulência. O amplo trabalho de caracterização teve o
objetivo também de tentar associar a ocorrência de AL com alguma adesina descrita nas
diversas categorias de DEC. As adesinas avaliadas por Colony-blot, nas nove amostras
produtoras de AL foram: Saa, Paa, ToxB, Iha, Lpf e Lda. Entretanto, nessa
caracterização, não pudemos associar a formação de microcolônias bacterianas
compactas a nenhuma adesina descrita até o momento. Por essa razão, uma amostra
(1551-2) foi selecionada com o intuito de se esclarecer como ocorre a formação de
microcolônias bacterianas na ausência de BFP. Essa amostra foi selecionada por ter sido
isolada de uma criança com diarréia na ausência de outro patógeno reconhecido, por não
apresentar bandas de DNA plasmídial e por ser portadora apenas da adesina intimina
entre todos os fatores testados.
Conhecendo a importância do gene eae, que codifica a adesina intimina, a
primeira pergunta foi qual seria o papel da intimina na aderência localizada de uma
amostra de aEPEC às células HeLa, na ausência de BFP. Com o objetivo de responder
essa pergunta, o sistema que utiliza do vetor suicida pJP5603 foi utilizado para obtenção
de um mutante não polar no gene eae da amostra 1551-2.
Dados da literatura revelam que a intimina desempenha diferentes papéis quanto
a sua importância na aderência às células HeLa. Donnenberg & Kaper (1991)
construíram um mutante em intimina da amostra E2348/69 denominado CVD206.
Estudos posteriores conduzidos por Cleary et al. (2004) mostraram que a capacidade da
68
amostra CVD206 de formar microcolônias bacterianas compactas não se encontrava
comprometida, mas a sua capacidade em promover o acúmulo dos filamentos de actina,
característicos da lesão A/E, avaliado pelo teste de FAS, não pode mais ser observada.
Nesse mesmo estudo, os autores demonstraram que essa propriedade só se encontrou
comprometida quando os autores utilizaram um mutante em bfpA, denominado
UMD901. Esse mutante foi capaz de aderir fracamente às células HeLa, perdendo,
assim, a capacidade de promover a aderência localizada característica da amostra
selvagem E2348/69. Esses mesmos autores também destacaram a importância de EspA
como uma adesina transitória ao utilizar um duplo mutante (bfpA e eae) denominado de
UMD886.
Analisando nossos resultados, ao contrário do que foi reportado por Cleary et al
(2004), observamos que, na ausência de intimina, a amostra 1551-2 continua aderindo
abundantemente às células HeLa, porém em um padrão distinto do observado com
amostra selvagem. A amostra 1551-2:eae-, mutada em intima, passou a aderir em um
padrão semelhante ao padrão AD, característico da categoria DAEC. Entretanto, o mais
importante é ressaltar que a amostra mutada em intimina perdeu a capacidade de forma
microcolônias compactas observadas no padrão AL. Ensaios de microscopia eletrônica
de transmissão revelaram que as microcolônias bacterianas compactas, observadas por
microscopia óptica, na realidade, consistem em um processo de internalização
totalmente dependente de intimina, e que a ausência desta adesina, embora não tenha
comprometido a aderência da amostra às células HeLa,
inibiu completamente a
formação de microcolônias compactas e, consequentemente, a sua internalização.
Se compararmos esses resultados com os obtidos por Carvalho et al. (2005) em
ensaios de inibição de adesão da amostra JPN15 (amostra E2348/69, segregante
espontânea de pEAF) com anticorpos contra a região variável de intimina, podemos
69
observar que, enquanto o bloqueio da intimina, por anticorpo, foi capaz de inibir a
aderência dessa amostra à células HeLa o mesmo não foi observado com a amostra
utilizada neste estudo, que continuou aderindo a essa linhagem, mesmo na ausência de
intimina, embora em um padrão diferente da amostra selvagem.
Uma tentativa de complementação do gene eae da amostra 1551-2:eae- foi
realizada utilizando-se o plasmídio recombinante pCVD438, que carreia o gene eae
(subtipo α) da amostra E2348/69 (protótipo de tEPEC) (Donnenberg & Kaper 1991).
Em ensaios de immunoblot, verificamos que a amostra 1551-2:eae- (pCVD438) teve
restaurada a sua capacidade de expressar a proteína de 94 kDa (intimina).
Surpreendentemente, quando fomos avaliar o padrão de adesão da amostra
complementada, observamos que o subtipo de intimina α não foi capaz de restaurar sua
capacidade de formar microcolônias compactas como observado na amostra selvagem
1551-2. A incapacidade de restaurar a lesão A/E poderia estar relacionada com uma
incompatibilidade entre a intimina expressa por E2348/69 com a proteína Tir (receptor
de intimina, injetado pela bactéria na célula hospedeira) da amostra 1551-2; a ligação de
intimina com Tir é que resulta na modulação do citoesqueleto e conseqüente formação
da lesão A/E (Knutton et al., 1989).
Como a amostra selvagem teve o seu subtipo de intimina não determinado, entre
aqueles que foram testados, resolveu-se então clonar e seqüenciar a região variável do
gene eae da amostra 1551-2, que corresponde aos últimos 280 aminoácidos da região Cterminal. Um recente trabalho realizado por Garrido et al. (2006) avalia a existência de
aproximadamente 20 subtipos de intimina, com base na tipagem com primers
específicos para cada subtipo, localizados dentro dessa região da intimina, que, além de
ser variável, corresponde à região que se liga ao receptor Tir. Os dados obtidos com o
seqüenciamento da Int280 da amostra 1551-2 revelaram 98% de identidade com o
70
subtipo de intimina omicron (ο) descrito em duas amostras de aEPEC pertencentes aos
sorotipos O129:H- e O84:H- (Garrido et al., 2006; Blanco et al., 2006). Nenhum
trabalho da literatura pesquisou até o momento se existe algum envolvimento entre a
ocorrência desse subtipo de intimina com padrão AL ou com a capacidade de invadir
células HeLa.
A mutação no gene eae revelou não só que a formação de microcolônias
compactas é um processo dependente de intimina, como sugeriu a existência de uma
nova adesina que medeia uma adesão difusa do mutante em intimina às células HeLa.
Com o objetivo de realizar uma caracterização inicial dessa adesina resolvemos
investir na construção de um banco de mutantes não aderentes. Nossa opção por realizar
um banco de mutantes e não clonar o referido gene, baseia-se no fato de que a aderência
de amostras de DEC tem se mostrado um fenótipo multifatorial e muitas vezes
dependente de grandes regiões de DNA cromossômico.
Após a obtenção desse banco de mutantes não aderentes (utilizando o transposon
Mini-Tn10), as amostras resultantes foram analisadas quanto à manutenção de sua
capacidade de multiplicação pela construção de uma curva de crescimento. Esse
cuidado foi tomado com o intuito de avaliar se o fato das bactérias não aderirem às
células HeLa poderia estar relacionado com a perda da sua capacidade de adesão ou
com algum comprometimento com a sua capacidade de replicação ocasionada pela
inserção do transposon em algum gene não propriamente relacionado à aderência da
amostra 1551-2.
Um mutante com capacidade normal de multiplicação foi, então, utilizado para a
absorção de um soro policlonal produzido com a amostra mutada em intimina. Esse
experimento foi conduzido com o objetivo de se evidenciar alguma proteína que
estivesse presente na amostra selvagem, mas não no mutante não aderente, para que,
71
posteriormente, se pudesse averiguar o envolvimento dessa proteína com a adesão
difusa da amostra 1551-2:eae-.
Após realizada a etapa de seleção acima descrita foi selecionado, para a
continuidade deste estudo, o mutante não aderente 143. O soro absorvido com esse
mutante revelou uma banda de aproximadamente 25 kDa que se encontrava presente
tanto na amostra selvagem (1551-2) como na amostra mutada em intimina (1551-2:eae), mas muito reduzida no mutante não aderente 143. Como muitas adesinas são
termorreguladas, fomos averiguar se essa proteína de ~25 kDa também se encontrava
ausente quando a amostra era cultivada a 18ºC, condição onde a adesão da amostra
1551-2:eae- encontra-se totalmente comprometida. Pudemos observar que o soro não foi
capaz de detectar a presença dessa proteína em extrato total da amostra 1551-2 à 18ºC.
Portanto, tem-se aqui duas situações onde a aderência da amostra 1551-2 se encontra
comprometida e em que essa proteína de ~25 kDa, encontra-se diferencialmente
expressa. Esses dados nos levam a acreditar que essa proteína possa desempenhar
importante papel na aderência da amostra 1551-2 às células HeLa em ensaios de 6
horas. Nossa hipótese pode ser reforçada pelo fato do soro absorvido com o mutante não
aderente, e que reconhece a proteína de ~25 kDa em ensaios de immunoblot, ser capaz
de inibir a aderência da amostra 1551-2:eae- em ensaios de inibição de adesão realizado
na presença desse soro.
Até o presente momento, os dados obtidos sugerem que a intimina teria, na amostra
selvagem 1551-2, um papel muito mais importante do que o esperado. Poucos ou quase
que nenhum trabalho da literatura tem dado muito importância ao processo de invasão
observado dentre as EPEC. Consideramos que esse fato não poderia passar
despercebido dentro de nosso estudo uma vez que o que encontramos não foram apenas
algumas bactérias interiorizadas como conseqüência de um evento não muito bem
72
esclarecido (conforme se observa na literatura com amostras de EPEC típicas), mas sim,
um evento extremamente comum em nosso ensaio. É lógico que também foram
observadas bactérias extracelulares, mas que talvez, em ensaios mais prolongados,
pudessem também invadir. O que nos chamou a atenção foi o fato da amostra 15512:eae-, mutada em intimina, não demonstrar qualquer tendência à invasão. Devemos
ressaltar que, com base no descrito na literatura, a mutação que realizamos em nossa
amostra foi direcionada, não provocando alteração em nenhum outro gene que não o da
adesina intimina. Com base nessas informações poderíamos atribuir à intimina a
capacidade da amostra selvagem 1551-2 em invadir as células HeLa? Acreditamos que
para responder essa pergunta mais estudos seriam necessários, mas temos aqui um forte
indicativo de que, se não a única responsável, a intimina tem papel fundamental nos
resultados aqui descritos.
73
Conclusões
A formação do padrão AL6 em uma amostra de aEPEC selecionada é
resultante, na realidade, de um processo de internalização mediado
principalmente pela expressão de intimina.
O fato de que uma mutação não-polar, no gene eae de uma amostra de
aEPEC analisada neste estudo (1551-2), não aboliu por completo a adesão
dessa amostra às células HeLa, reforça a idéia de que novas adesinas devem
contribuir para a patogênese de amostras de aEPEC isoladas em nosso meio.
74
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94
Anexos
1. Meios de Cultura, Soluções e Reagentes
Os meios de cultura, sais e açúcares utilizados, quando não especificados, foram
de procedência Difco (Difco laboratories, Michigan, EUA), Merck (Merck Chemical,
New Jersey, EUA) e Synth (Labsysnth S. A., Diadema, SP). Os demais reagentes
utilizados foram provenientes da Sigma (Sigma-Aldrich Chemical, Missouri, EUA),
Invitrogen (Life Tecnologies Ic, Gaithenesburg MD, EUA), Amersham (Amersham
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), tendo sido preparados conforme
especificações dos fabricantes.
Os meios de cultura, obtidos sob a forma desidratada foram preparados com
água destilada e purificada pelo sistema Mili-Q (Milipore Inc., Massachusetts, EUA) e
autoclavados a 121ºC por 15 minutos. Foram utilizados os meios ágar MacConkey, ágar
nutriente e o caldo de soja tripticase (TSB – Triptic Soy Broth – Difco Laboratories,
Michigan, EUA).
1.1 Caldo Luria Bertani (LB)
Triptona
10 g
Extrato de levedura
5g
Cloreto de Sódio
10 g
Água bidestilada q.s.p.
100 mL
Todos os elementos foram adicionados à água destilada e o meio esterilizado,
em autoclave a 121ºC por 15 minutos. Para a preparação de LB ágar, foi adicionado à
solução acima 2% de bacto agar (Difco).
95
2. Soluções e meios de cultura utilizados para os testes de adesão em células
HeLa
2.1 Solução tampão salina Fosfato (PBS)
NaCl
136,9 mM
KCl
2,7 mM
Na2HPO4
8,1 mM
KH2PO4
1,5 mM
Os sais foram dissolvidos em água destilada e a solução foi autoclavada a 121ºC
durante 15 minutos. Para a solução salina fosfato com pH 7,2, o pH foi ajustado com
ácido clorídrico.
2.2 Dulbecco´s Modified Eagle Médium (DMEM)
O meio foi dissolvido em água bidestilada, conforme recomendações do
fabricante. O pH foi ajustado para 7,0 com uma solução de bicarbonato de sódio a 7,5%;
o meio foi acrescido de 10% ou 2% de soro fetal bovino (SFB), conforme a
necessidade. Em seguida, o meio foi filtrado em membranas de acetato de celulose com
poros de 0,22 μm (sistema de filtração Millipore Corporation, EUA) e armazenado a
4ºC.
2.3 Solução estoque de D-manose
A solução de D-manose foi preparada em água bidestilada na concentração final
de 10% e esterilizada em vapor fluente por 1 hora. A solução foi armazenada a 4ºC até o
momento do uso.
96
2.4 Solução tampão de S∅rënsen
Solução A
KH2PO4
0,64 g
Água bidestilada q.s.p.
70 mL
Solução B
Na2HPO4
2,36 g
Água bidestilada q.s.p.
250 mL
Para a solução final foi adicionado 69,6 mL da solução A em 230,4 mL da
solução B. Essa solução foi armazenada a 4ºC até o momento do uso.
2.5 Solução corante de May-Grünwald
Após dissolução total de 0,2g do corante em 100 mL de metanol (p.a.), em
banho-maria a 65ºC, a solução foi filtrada em papel de filtro comum e armazenada à
temperatura ambiente. No momento do uso, foi diluída na proporção 1:2 (v/v) em
tampão de Sφrënsen.
2.6 Solução corante de Giemsa
A solução comercial foi diluída no momento do uso na proporção 1:3 (v/v) em
tampão de Sφrënsen.
3. Soluções e Reagentes utilizados no teste de FAS
3.1 Solução de formadeído a 3%
O formadeído (Merck) foi diluído em PBS no momento do uso
97
3.2 Solução de Triton X-100 a 1%
Triton X-100 (Sigma) foi diluído em PBS esterilizado, no momento do uso.
3.3 Solução de isoticianato de faloidina marcado com fluoresceína a 5 μg/mL
A solução foi preparada dissolvendo-se 100 μg de isotiocianato de faloidina
(Sigma) em 2 mL de PBS esterilizado. O armazenamento foi em alíquotas, em tubos
escuros, à temperatura de -20ºC. No momento do uso, após o descongelamento, a
alíquota foi diluída em PBS, obtendo-se uma concentração final de 5 μg/mL.
4. Soluções usadas na eletroforese de proteínas em SDS-PAGE
4.1 Tampão de Amostra (5x)
Tris-HCl a 1 M (pH6,8)
60 mM
Glicerol
25%
SDS a 10%
2%
2-mercaptoetanol
14,4 mM
Azul de Bromofenol
0,1%
Água destilada q.s.p.
10 mL
A solução foi mantida a 4ºC
4.2 Solução de Acrilamida bis-Acrilamida
Acrilamida
30 g
N,N, - metilenobisacrilamida
0,8 g
Água destilada q.s.p.
100 mL
A solução foi filtrada em papel de filtro e armazenada em frasco escuro à 4ºC.
98
4.3 Gel de Empacotamento
Acrilamida
870 μL
Tris-HCl 1 M (pH6,8)
660 μL
SDS a 10%
52 μL
Persulfato de amônio
52 μL
TEMED
5 μL
Água destilada
3,57 mL
4.4 Gel de Corrida a 12%
Acrilamida
4,0 mL
Tris-HCl 1M (pH8,8)
1,3 mL
SDS a 10%
100 μL
Persulfato de amônio
100 μL
TEMED
4 μL
Água destilada q.s.p.
4,5 mL
4.5 Tampão de Eletroforese
Trisma base (Sigma)
25 mM
Glicina pH 8,3 (Sigma)
250 mM
Os componentes foram dissolvidos em 200 mL de água destilada. No momento
da corrida, foi utilizado o tampão diluído 10 vezes adicionado de SDS para uma
concentração final de 1%.
99
5. Soluções para Immuno-blot
5.1 Tampão de Transferência
Trisma base
8,7 g
Glicina
43,2 g
Metanol
600 mL
Água destilada q.s.p.
3000 mL
Os componentes do tampão foram dissolvidos em água e a solução conservada à
4ºC.
5.2 Tampão de Bloqueio
Soroalbumina bovina (BSA)
3%
A soroalbumina foi dissolvida em tampão Tris e conservada à 4ºC.
5.3 Tampão Tris
Tris-HCl a 1 M pH 7,3
10,0 mL
BSA (Sigma)
1,0 g
Tween-20 (Synth)
0,5 mL
NaCl
9,0g
Água destilada q.s.p.
1000 mL
Os componentes foram dissolvidos em água e o tampão resultante conservado a
4ºC.
100
6. Soluções utilizadas para a realização da Microscopia Eletrônica de
Transmissão e Imunomarcação
6.1 Solução Fixadora
Solução de aldeído glutárico a 1,5% (Sigma), paraformaldeído a 1% (Sigma) em
solução fosfato a 0,1 M pH 7,3.
6.2 Solução de tampão cacodilato de sódio a 0,4 M pH 7,2
O cacodilato de sódio foi dissolvido em água bidestilada e o pH ajustado com
HCl a 0,2 M. A solução final foi conservada a 4ºC.
Para as lavagens, durante o processamento do material para microscopia
eletrônica, esta solução foi utilizada na concentração de 0,1 M.
6.3 Tetróxido de ósmio a 4%
O tetróxido de ósmio (EMS – Electron Microscopy Sciences, Enc., USA) é
vendido na forma de cristal embalado em ampolas contendo 1 g. A ampola foi
cuidadosamente lavada externamente para a eliminação total da gordura e sujeira.
Dentro da capela, a ampola foi colocada em um frasco escuro contendo 25 mL de água
destilada e foi quebrada com um bastão de vidro. A preparação foi homogeneizada e
mantida à temperatura ambiente, durante 24 horas, a fim de permitir a dissolução
completa dos cristais. Após este período, a solução foi armazenada a 4ºC. No momento
do uso, esta solução foi diluída a 1% em tampão cacodilato de sadio a 0,1% (anexo 6.2)
101
6.4 Acetato de uranila aquosa a 2%
No preparo desta solução, 2 g de acetato de uranila foram dissolvidos em 100
mL de água destilada. A solução foi filtrada e armazenada, em frasco escuro, à
temperatura ambiente.
6.5 Citrato de chumbo
Nitrato de chumbo
1,33 g
Citrato de sódio
1,76 g
Um volume de 100 mL de água destilada foi fervida e resfriada imediatamente
antes da sua utilização no preparo desta solução.
O nitrato de chumbo e o citrato de sódio inicialmente dissolvidos em 30 mL de
água destilada, em um balão volumétrico. A preparação foi vigorosamente agitada
durante 5 minutos e posteriormente, agitada moderadamente durante mais 30 minutos,
até a dissolução completa dos reagentes e a formação de uma solução leitosa. Uma
solução de NaOH a 1 M, preparada no momento do uso, foi adicionada à preparação,
até que esta se tornasse transparente. Em seguida, adicionou-se um volume de água
destilada suficiente para se completar 50 mL de solução. Esta solução corante foi
mantida no mesmo frasco, em descanso, por pelo menos um dia antes de ser utilizado.
102
7. Soluções utilizadas para a extração de DNA plasmidial (Birnboim &
Doly)
7.1 Solução lítica para extração de DNA plasmidial (Solução I)
Na2EDTA.H2O
10 mM
Tris-HCl
25 mM
Glicose
50 mM
Lisozima
2 mg/mL
A solução foi preparada somente no momento do uso, imersa em banho de gelo.
7.2 Solução de lise alcalina (Solução II)
NaOH
0,2 N
SDS
1%
O SDS foi dissolvido em água bidestilada esterilizada. Após a dissolução, a
solução de NaOH foi acrescentada e o volume final completado com água bidestilada
esterilizada. A solução foi mantida à temperatura ambiente e preparada no momento do
uso.
7.3 Solução de acetato de sódio a 3 M pH 4,8 (Solução III)
O preparo da solução foi feito dissolvendo acetato de sódio anidro (CH3COONa)
em água bidestilada, e o pH foi ajustado com ácido acético glacial. Em seguida, esta
solução foi autoclavada (121ºC durante 15 minutos) e mantida à temperatura ambiente
até o momento do uso.
103
7.4 Solução de acetato de sódio (Solução IV)
Acetato de sódio
0,1 M
Tri-HCl – pH 8,0
0,05 M
O acetato de sódio foi dissolvido em água bidestilada e, após a adição do TrisHCL, o volume foi completado com água bidestilada esterilizada. A solução foi mantida
à temperatura ambiente.
7.5 Solução tampão Tris-EDTA (TE) – pH 8,0 (10x)
Trizma base
100 mM
Na2EDTA
10 mM
Inicialmente o Na2EDTA foi dissolvido a quente com uma parte de água
destilada, adicionando-se, em seguida, Trizma base e ajustando o pH com HCl.
Completar o volume da solução, autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
8. Soluções usadas para Colony-blot
8.1 Solução desnaturante
NaOH
0,5 M
NaCl
1,5 M
8.2 Solução Neutralizante
Tris base
1 M pH 7,0
NaCl
2M
104
8.3 Solução salina padrão com citrato (SSC) 20X pH 7,0
NaCl
3,0 M
Citrato de sódio
0,3 M
Os sais foram dissolvidos em água bidestilada e a solução resultante foi
esterilizada por autoclavação e conservada à temperatura ambiente.
8.4 Solução de Pré-Hibridização
SDS a 10%
0,1%
Solução de Denhardt (Eppendorf, New York, USA)
2x
SSC
5x
A solução foi preparada no momento do uso, sendo os componentes adicionados
à água bidestilada até dissolução completa.
9. Soluções usadas para Southern-blot.
9.1 Solução desnaturante
NaOH
0,5 M
NaCL
1,5 M
9.2 Solução neutralizante
Tris base
1 M pH 7,0
NaCL
2M
105
10. Meio SOC
Triptona
2,0 g
Extrato de levedura
0,5 g
NaCL (1M)
1 mL
KCl (1M)
0,25 mL
Água destilada q.s.p.
100 mL
Na hora do uso adicionar 20 mM de Mg++ e 20 mM de glicose.
106
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