UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
NEUROCIÊNCIAS
ARIANE SILVA SANTA RITA FERREIRA
Receptor A1 de adenosina: modelagem
molecular por homologia, comparação
bacteriana e docking de ligantes
Orientadora: Drª. Helena Carla Castro Cardoso de
Almeida
NITERÓI
2011
i
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
NEUROCIÊNCIAS
ARIANE SILVA SANTA RITA FERREIRA
Receptor A1 de adenosina: modelagem
molecular por homologia, comparação
bacteriana e docking de ligantes
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE
FEDERAL
FLUMINANSE
VISANDO
A
OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM NEUROCIÊNCIAS.
Orientadora: Drª. Helena Carla Castro Cardoso de
Almeida
NITERÓI
2011
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
iii
ARIANE SILVA SANTA RITA FERREIRA
Receptor A1 de adenosina: modelagem molecular por
homologia, comparação bacteriana e docking de
ligantes
Dissertação de mestrado submetida à
Universidade
Federal
Fluminense
como requisito parcial para obtenção
do grau de mestre em Neurociências
Banca Examinadora
______________________________________________
Dra. Paula Campello Costa Lopes – UFF (Presidente)
______________________________________________
Dra. Monique Araújo de Brito - UFF
______________________________________________
Dr. Cristian Follmer – UFRJ
______________________________________________
Dr. André Fuly – UFF (Revisor e suplente)
iv
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela força de querer continuar a lutar por um
ideal.
Ao Minu por ter tido paciência comigo nos dias mais estressantes.
À minha mãe por ter me socorrido tantas vezes nos momentos
necessários.
À minha orientadora Helena Carla Castro pela paciência e pela
orientação desde a iniciação à pesquisa.
Ao meu amigo Guto por todo ajuda que me deu.
Aos colegas do laboratório por me ajudarem com as minhas
dúvidas.
Aos colaboradores da Faculdade de Farmácia da UFF e da UFRJ e
aos professores da pós em Neurociências.
À professora Ana da Fiocruz.
v
Sumário
Página
Lista de Abreviaturas.............................................................................
IX
Lista de Figuras.....................................................................................
XI
Lista de Tabelas.....................................................................................
XV
Resumo...................................................................................................
XVI
Abstract...................................................................................................
XVII
1. Introdução.........................................................................
1
1.1 – Adenosina e suas características..................................................
1
1.2 – Receptor de adenosina (RA): um receptor acoplado à proteína G....
3
1.2.1 – Receptor de adenosina A1 e A2a: breve visão.......................
6
1.2.1.1 - Receptor de adenosina A1 (RA-A1)..................................
6
1.2.1.2 – Receptor de adenosina A2a (RA-A2a) ............................
8
1.3 – Agonistas e antagonistas: os ligantes dos receptores de
adenosina................................................................................................
10
1.3.1. Receptores de adenosina A1 e A2a: resíduos importantes
para interação com ligantes....................................................................
13
1.4 – Modelagem molecular: uma ferramenta para o estudo de
receptores e ligantes...............................................................................
13
1.4.1 – Modelagem por homologia: abordando os receptores...........
15
1.4.1.1 – Etapas de construção do modelo
16
1.4.1.1.1 – Alinhamento de sequências proteicas........................
16
1.4.1.1.2 – Construção e otimização do modelo 3D.....................
18
1.4.1.1.3 – Validação do modelo 3D............................................
19
1.4.2 – Docking: gerando complexos receptor-ligante........................
21
1.4.2.1 – Interação receptor-ligante..................................................
23
vi
1.4.3 – O receptor de adenosina A1 (RA-A1) e a modelagem por
homologia................................................................................................
25
2. Objetivos............................................................................
30
2.1 – Objetivo geral.................................................................................
30
2.1 – Objetivos específicos.....................................................................
30
3. Material e métodos...........................................................
31
3.1 – Construção dos modelos por homologia.......................................
31
3.2 – Docking das estruturas dos receptores com os ligantes e análise
das interações.........................................................................................
32
3.3 - Cálculo de valor quadrático médio (Root Mean Square – RMS)....
33
3.4 - Mapa de potencial eletrostático (MPE)...........................................
33
4. Resultados.........................................................................
35
4.1 – Alinhamento de sequências, construção e análise dos modelos
do receptor de adenosina A1 (RA-A1)....................................................
35
4.2 – Docking e análise das interações dos complexos formados pelos
modelos do receptor de adenosina A1 (RA-A1).....................................
43
4.2.1 – Construção dos ligantes do tipo agonista (adenosina) e
antagonista (ZM241384).........................................................................
43
4.2.2 - Docking e análise das interações entre a adenosina e os
modelos do RA-A1 (RA-A1)....................................................................
44
4.2.3 - Docking e análise das interações entre a adenosina e a
estrutura cristal do RA-A2a e comparação com o modelo do RA-A1
baseado no RA-A2a................................................................................
46
4.2.4 - Docking e análise das interações entre o antagonista
ZM241385 e o modelo do RA-A1 baseado no RA-A2a e comparação
com o complexo antagonista-molde.......................................................
51
5. Discussão..........................................................................
54
5.1 – Construção e análise dos modelos do receptor de adenosina A1.
55
5.2 – Análise das interações receptor-ligante.........................................
59
vii
5.2.1 – Análise das interações entre os receptores (RA-A2a e os
modelos do RA-A1).................................................................................
59
5.2.2 – Análise das interações entre o ZM241385 e os receptores
RA-A2a e o modelo do RA-A1 baseado no RA-A2a...............................
62
6. Conclusões........................................................................
64
7. Referências bibliográficas...............................................
66
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMP
AMPc
ATP
Asp
Ala
Ǻ
Arg
Asn
bacRho
β2-A
bRho
CHA
Cys
DPCPX
DPMA
DT
Glu
Gly
His
Ile
LE
Leu
LI
LTP
Lys
ME
Met
MI
MMFF
MPE
PDB
PLAc
PLA2
Phe
PKC
Pro
RA
Adenosina monofosfato
Adenosina monofosfato cíclica
Adenosina trifosfato
Ácido aspártico
Alanina
Angstron
Arginina
Asparagina
Bacteriorodopsina
Receptor β2-adrenérico
Rodopsina bovina
N6-cicloexiladenosina
Cisteína
8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina
N-[2-(3,5-dimetoxifenil) etil] adenosina
Domínios transmembranar
Ácido glutâmico
Glicina
Histidina
Isoleucina
Loop extracelular
Leucina
Loop intracelular
Long-term potentiation, Potenciação de Longa Duração
Lisina
Meio extracelular
Metionina
Meio itracelular
Molecular Mechanics Force Field, Campo de Força de Mecânica
Molecular
Mapa de potencial elestrostático
Protein Data Bank, Banco de Dados de Proteínas
Fosfolipase C
Fosfolipase A2
Fenilalanina
Proteína quinase C
Prolina
Receptor de adenosina
RAPG
Receptor acoplada à proteína G
RMN
RMS
SCH58261
Ressonância magnética nuclear
Root mean square (valor quadrático médio)
7-(2-feniletil)-5-amino-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidina
Serina
Ser
ix
SNC
Thr
3D
Trp
Val
ZM241385
UK-432097
Sistema Nervoso Central
Treonina
Tridimensional
Triptofano
Valina
4-(2-[7-amino-2-(2-furil)-[1,2,4]triazolo[2,3-a]-[1,3,5]triazina-5ilamino]etil)fenol
2-(3-[1-(piridina-2-yl)piperidina-4-yl]ureido)etil-6-N-(2,2difeniletil)-5-N-etilcarboxamidoadenosina-2-carboxamida
x
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estrutura química do nucleosídeo adenosina.....................................
1
Figura 2 – Principais vias do metabolismo da adenosina e seu
transporte............................................................................................................
2
Figura 3 - Vias de sinalização dos subtipos de receptores de adenosina..........
4
Figura 4 – Distribuição dos receptores de adenosina de alta afinidade nas
principais regiões do sistema nervoso central (Adaptado de Ribeiro,
2003)...................................................................................................................
7
Figura 5 – Representação esquemática do receptor de adenosina A1 (RA-A1)
na membrana celular, mostrando a distribuição estrutural das alças
extracelulares (LE) e intracelulares (LI), os domínios transmembranares (DT)
e as porção C-terminal e N-terminal nos meios extracelular (ME) e
intracelular (MI)...................................................................................................
8
Figura 6 – Representação esquemática do receptor de adenosina A2a (RAA2a) na membrana celular, mostrando a distribuição estrutural das alças
extracelulares (LE) e intracelulares (LI), os domínios transmembranares (DT)
e as porção C-terminal e N-terminal nos meios extracelular (ME) e
intracelular (MI)...................................................................................................
9
Figura 7 – Estruturas da adenosina, xantina e fármacos que as utilizam como
base estrutural, mostrando as posições de mudanças estruturais.....................
12
Figura 8 - Alinhamento entre as sequências primárias dos receptores
pertencentes à família I dos receptores acoplados à proteína G e da
bacteriorodopsina, mostrando os resíduos de aminoácidos idênticos estão
marcados com (*), os resíduos de aminoácidos similares estão marcados
com (.) e os resíduos de aminoácidos análogos estão marcados com
(:)........................................................................................................................
17
Figura 9 - Estrutura das ligações peptídicas, mostrando os ângulos torcionais
phi (φ) e psi (ψ) da cadeia principal de proteínas (Adaptado de Jakubowski,
2008)...................................................................................................................
20
Figura 10 – Gráfico de Ramachandran para a estrutura cristal do receptor de
adenosina A2a como exemplo da estereoquímica dos aminoácidos de acordo
com a distribuição dos ângulos phi e psi. Em vermelho, regiões favoráveis,
em amarelo e creme, regiões permitidas e em branco, regiões
desfavoráveis......................................................................................................
20
Figura 11 - Comparação das estruturas cristais da bacteriorodopsina (A), da
rodopsina bovina (B) e do receptor β2-adrenérgico (C) com resolução de
3,5Ǻ, 2,40Ǻ e 2,20Ǻ, respectivamente. Os sete domínios transmembranares
xi
estão demarcados pelas caixas revelando ainda a conformação mais aberta
do receptor β2-adrenérgico. As estruturas secundárias são mostradas em
rosa (α-hélices), azul (loops) e verde (folhas β-pregueadas).............................
26
Figura 12 – Alinhamento das sequências primárias dos receptores de
adenosina RA-A1 e RA-A2a (PDB = 3EML) feito no programa ClustalW. Os
resíduos de aminoácidos estão marcados: idênticos com (*), similares com (:)
e análogos com (.)..............................................................................................
28
Figura 13 - Comparação das estruturas original/cristal (verde) e completa
(vermelho) do receptor de adenosina RA-A2a quanto a proporção (%)
aminoácidos em regiões favoráveis, permitidas e desfavoráveis (acima) e
utilizando o gráfico de análise do Verify3D (abaixo)...........................................
32
Figura 14 – Alinhamento múltiplo das sequências primárias do receptor de
adenosina A1 (RA-A1) e das estruturas cristais do receptor de adenosina A2a
(PDB = 3EML), da bacteriorodopsina (PDB = 1BRD), da rodopsina bovina
(PDB = 1U19) e do receptor β2-adrenérgcio (PDB = 2RH1). Os resíduos de
aminoácidos idênticos estão marcados com (*), os resíduos de aminoácidos
similares com (:) e os resíduos de aminoácidos análogos com
(.)........................................................................................................................
36
Figura 15 - Análise dos diferentes modelos do receptor de adenosina A1
(verde) e seus respectivos moldes (A-D, rosa), utilizando o programa
Verify3D. Embaixo, a comparação de todos os modelos baseados no
receptor de adenosina (RA-A2a), bacteriorodopsina (bacRho), rodopsina
bovina (BRho).....................................................................................................
39
Figura 16 - Comparação das estruturas tridimensionais dos modelos do
receptor de adenosina A1 baseados nas estruturas cristais do receptor de
adenosina A2a (RA-A2a), da bacteriorodopsina (bacRho), da rodopsina
bovina (BRho) e do receptor β2-adrenérgico β2
( -A). As estruturas
secundárias dos moldes e dos seus respectivos modelos estão mostradas
em rosa (α-hélices), azul (alças) e verde (folhas β-pregueadas).......................
40
Figura 17 – Comparação entre os mapas de potencial eletrostático dos
moldes e dos modelos do receptor de adenosina A1 (rotação 0º e 180º. Box
amarelo: sítio de ligação. As cargas positivas estão em azul, as negativas em
vermelho e as neutras em branco. RA-A2a e modelo do RA-A1, bacRho e
modelo do RA-A1 (bacRho), BRho e modelo do RA-A1 (BRho) e o receptor
β2-A e modelo do RA-A1 (receptor β2-A)...........................................................
41
Figura 18 – Mapa de potencial eletrostático da conformação mais estável dos
ligantes adenosina (A) e ZM241385 (B), com rotação de 0º a 270º. As cargas
positivas estão em azul, enquanto que as negativas estão em vermelho..........
43
Figura 19 – Corte de 6Ǻ da região de ligação do agonista adenosina nos
modelos dos receptores de adenosina do tipo A1, que mostra os resíduos
considerados importantes por estudos de mutagênese e que só foram
identificados nos modelos de RA-A1 baseado no receptor de adenosina do
tipo A2a (A), na rodopsina bovina (B) e no receptor β2-adrenérgico (C). Os
resíduos que interagem com a adenosina segundo Terán et al., 2004 e
Giordanetto et al., 2003 estão coloridos em lilás. Os resíduos ácidos estão
xii
em vermelho, os básicos em azul, os polares em verdes e os apolares em
amarelo. Na adenosina, em vermelho, o oxigênio; em azul escuro, o
nitrogênio; em branco, o carbono; e em azul claro, o hidrogênio......................
45
Figura 20 – Alinhamento das estruturas 3D dos modelos do RA-A1 baseado
nas estruturas cristais do RA-A2a (verde claro), da rodopsina bovina
(vermelho) e do receptor de β2-adrenérgico (amarelo), mostrando os
resíduos que aparecem em todos os modelos no corte de
Ǻ a6 partir da
adenosina, incluindo os resíduos Ile67, Met82, Val83, Ala84, Cys85, Pro86,
Val87, Ile274 e His278. As estruturas secundárias estão mostradas em rosa
(α-helice), verde escuro (β-pregueada) e azul (alças)........................................
47
Figura 21 – Análise da região de ligação do agonista na estrutura cristal do
RA-A2a. (Esquerda) Resíduos considerados importantes por estudos de
mutagênese para a interação receptor-ligante do RA-A2a. Todos os resíduos
interagem com o antagonista ZM segundo Jaakola et al., 2008. O resíduo
ácido está em vermelho, o polar em verde e o apolar em amarelo. Na
adenosina, o oxigênio está em vermelho,; em azul escuro, o nitrogênio; em
branco, o carbono; e em azul claro, o hidrogênio. (Direita) Tabela de resíduos
do RA-A2a que realizam interação com a adenosina. Em negrito, estão os
resíduos presentes na lista de aminoácidos descritos como importantes para
a interação receptor-agonista (Ben et al., 2010; Giordanetto et al.,2003; Olah
e Stiles, 2000, Rivkees et al., 1999)...................................................................
48
Figura 22– Comparação dos resíduos presentes no sitio de ligação em um
corte de 6Ǻ a partir do ligante (adenosina) nos complexos envolvendo o
modelo do RA-A1 baseado no RA-A2a (esquerda) e a estrutura cristal do RAA2a (direita). Em vermelho, resíduos ácidos; verdes, os polares em e os
apolares em amarelos. Adenosina está colorida por átomos: oxigênio
(vermelho), nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro) e carbono
(branco)..............................................................................................................
.
B
49
Figura 23 – Comparação dos complexos ligante-receptor formados pela
adenosina e pelo modelo do RA-A1 (RA-A2a) (rosa) ou pela estrutura cristal
do RA-A2a (verde) observados em um corte de 6Ǻ a partir da adenosina em
um alinhamento estrutural. A parte superior da figura mostra a localização
dos resíduos de aminoácidos idênticos, similares e distintos citados na parte
inferior. Adenosina está colorida de acordo com os átomos: oxigênio
(vermelho), nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro) e carbono
(branco)..............................................................................................................
50
Figura 24 – Resíduos (A e B) encontrados em um corte de 6Å dos complexos
antagonista-receptor a partir do antagonista ZM241385, que são
considerados importantes, por estudos de mutagênese, para a interação com
o RA-A1 (A) e com o RA-A2a (B) e interações observadas envolvendo outros
resíduos (C). Os resíduos ácidos estão em vermelho, os polares em verde e
os apolares em amarelo. O antagonista está colorido de acordo com os
átomos: oxigênio (vermelho), nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro)
e carbono (branco).............................................................................................
52
Figura 25 – Comparação dos complexos ligante-receptor formados
antagonista ZM241385 e pelo modelo do RA-A1 (RA-A2a) (rosa) ou pela
xiii
estrutura cristal do RA-A2a (verde) observados em um corte de 6Ǻ a partir da
ZM241385 em um alinhamento estrutural. A parte superior da figura mostra a
localização dos resíduos de aminoácidos idênticos, similares e distintos
citados na parte inferior. O ZM241385 está colorido de acordo com os
átomos: oxigênio (vermelho), nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro)
e carbono (branco).............................................................................................
53
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 – Comparação dos valores percentuais de identidade resultantes
do alinhamento múltiplo das sequências primárias dos subtipos de
xiv
receptores de adenosina (RA-A1, RA-A2a, RA-A2b e RA-A3).......................
5
Tabela 2 - Afinidade dos receptores de adenosina pelo ligante endógeno.....
6
Tabela 3 – Algumas doenças nas quais os ligantes dos receptores de
adenosina A1 e A2a (agonistas ou antagonistas) são utilizados como
formas de tratamento......................................................................................
10
Tabela 4 – Resíduos de aminoácidos dos receptores de adenosina RA-A1
e RA-A2a analisados por estudos de mutagênese e seu perfil de
modulação sobre a afinidade..........................................................................
14
Tabela 5 - Comparação dos valores percentuais de identidade resultantes
do alinhamento múltiplo das sequências primárias entre o receptor de
adenosina A1 (RA-A1) e os moldes utilizados, incluindo as estruturas
cristais da bacRho, da BRho, do receptor β2-A e do RA-A2a.........................
35
Tabela 6 – Distribuição dos resíduos de aminoácidos observados no gráfico
de Ramachandran para os modelos do receptor de adenosina A1 (RA-A1)
e para os moldes utilizados (RA-A2a, bacRho, BRho e β2-A)........................
37
Tabela 7 – Comparação dos valores de RMS
Ǻ) resultantes
(
do
alinhamento dos modelos de RA-A1 utilizando como molde o receptor de
adenosina A2a (RA-A2a), a bacteriorodopsina (bacRho), a rodopsina
bovina (BRho) e o receptor β2-adrenérgico (β2-A).........................................
42
Tabela 8 – Resíduos dos modelos de receptor de adenosina A1 que
realizam interações com a adenosina no compexo receptor-ligante. No
corte de 6Ǻ, foram identificados resíduos descritos pela literatura como
importantes para a interação receptor-agonista (em itálico) (Ben et al.,
2010; Giordanetto et al.,2003; Olah e Stiles, 2000, Rivkees et al., 1999) e
resíduos que foram identificados em pelo menos dois modelos.....................
44
RESUMO
A adenosina é um nucleosídeo endógeno, sendo um metabólito
produzido tanto intra quanto extracelularmente. Presente em todos os tecidos e
fluidos corporais, ela desempenha várias funções importantes, tais como
neuromodulação, neuroproteção e envolvido no processo de plasticidade.
xv
Devido a essas funções, os receptores de adenosina (RA-A1, RA-A2a, RA-A2b
e RA-A3) são atualmente alvos terapêuticos para o desenho de ligantes
potentes e seletivos. Entretanto, a estrutura destes receptores ainda não foi
totalmente elucidada experimentalmente, com exceção do RA-A2a. Neste
trabalho, temos como objetivo geral analisar e comparar RA-A1 e RA-A2a nos
diferentes níveis estruturais, incluindo suas interações com possíveis ligantes,
utilizando a modelagem molecular a fim de compreender sua relação estruturaatividade e contribuir para o desenvolvimento de ligantes mais potentes e
seletivos. Assim, construímos os modelos por homologia do RA-A1, utilizando o
programa MODELLER 9.9 além dos programas Verify 3D, Procheck para
validação. Diferentes moldes foram utilizados, incluindo as estruturas cristais
do RA-A2a (código PDB = 3EML), da bacteriorodopsina (PDB = 1BRD), da
rodopsina bovina (PDB = 1U19) e do receptor β2-adrenérgico (PDB = 2RH1). A
construção dos ligantes adenosina (agonista) e ZM241385 (antagonista) foi
feita no Spartan’08 enquanto o docking nos modelos foi realizado no programa
Molegro Virtual Docker. Os resultados sobre a comparação da estrutura
primária revelou uma identidade entre os moldes e o RA-A1, que variou entre 8
e 49%. Apesar do baixo grau de identidade, os modelos construídos se
mostraram estáveis mostrando baixos valores de RMS (0,30-0,78 Å) que
apontam para uma conservação da estrutura 3D. A única exceção foi o modelo
gerado a partir da bacteriorodopsina, que impossibilitou o alinhamento
estrutural e o cálculo do RMS. A distribuição eletrônica também se mostrou
conservada nos modelos contruídos, com exceção dos modelos baseados na
rodopsina bovina e na bacteriorodopsina, que apresentaram maior quantidade
de cargas negativas. Esses dados reforçam a inadequabilidade da
bacteriorodopsina como molde para a construção de modelo para o RA-A1, de
forma análoga ao descrito na literatura para o RA-A2a. Os resultados dos
estudos de docking confirmaram a presença de vários aminoácidos descritos
na literatura como importantes para interação receptor-ligante, incluindo os
resíduos de aminoácidos Glu16, Leu65, Ile69, Cys85, Pro86, Cys169, Thr277 e His278
para o RA-A1 e Thr88, Glu169, Asn181, Phe182, His250, Asn253 e Ile274 para o RAA2a. O estudo também permitiu observar que o tipo de ligante (antagonista ou
agonista) provoca um deslocamento nos resíduos de aminoácidos da estrutura
do receptor, mostrando que determinados aminoácidos são importantes para a
interação específica com o ligante. Contudo as diferenças de afinidade
observadas experimentalmente para o antagonista não foi explicado pelo
modelo construído com base na estrutura cristal do RA-A2a, o que indica a
necessidade de uma análise mais extensiva desse modelo e de suas
interações.
ABSTRACT
Adenosine is an endogenous nucleoside and a metabolite produced both
intra and extracellularly. Present in all tissues and body fluids, it is involved in
several important functions, such as neuromodulation, neuroprotection and
plasticity process. Due to these functions, the adenosine receptors (RA-A1, RAxvi
A2a, A2b and RA-RA-A3) are currently therapeutic targets for designing potent
and selective ligands. However the structure of these receptors has not been
fully elucidated experimentally, except for RA-A2a. In this work, we aim at
analyzing and comparing the adenosine receptors A1 and A2a at different
structural levels, including their interactions with potential ligands using
molecular modeling to understand their structure-activity relationship and
contribute to the development of ligands more potent and selective. Thus, we
built homology models for RA-A1, using the MODELLER 9.9 program besides
the Verify 3D and Procheck programs for validation. Different templates were
used, including the crystal structures of RA-A2a (PDB code = 3EML),
bacteriorhodopsin (PDB = 1BRD), bovine rhodopsin (PDB 1U19 =) and β2adrenergic receptor (PDB = 2RH1). The construction of the ligands, adenosine
(agonist) and ZM241385 (antagonist), was made in Spartan'08 while the
docking in the models was carried out in the program Molegro Virtual Docker.
The results on comparison of primary structure revealed an identity between the
templates and RA-A1, which ranged from 8 to 49%. Despite the low identity
degree, the constructed models were stable showing low RMS values (0.30 to
0.78 Å) that point to the conservation of the 3D structure. The only exception
was the model derived from the bacteriorhodopsin that did not allow the
structural alignment and calculation of RMS. The electronic distribution also
remained conserved in the constructed models, with the exception of models
based on bovine rhodopsin and bacteriorhodopsin, which showed a higher
concentration of negative charges. These findings reinforced the inadequacy of
bacteriorhodopsin as a template for building a model for RA-A1, similar to that
described in the literature for RA-A2a. The results of docking studies confirmed
the presence of various amino acids described in the literature as important for
receptor-ligand interaction, including amino acid residues Glu16, Leu65, Ile69,
Cys85, Pro86, Cys169, Thr277 and His278 for RA-A1 and Thr88, Glu169,
Asn181, Phe182, His250, Asn253 and Ile274 for RA-A2a. The study also
allowed us to observe that the type of ligand (antagonist or agonist) causes a
shift in amino acid residues of the receptor structure, showing that certain amino
acids are important for specific interactions with the ligand. However, the
differences experimentally observed in the affinity of the antagonist was not
explained by the model constructed based on the crystal structure of RA-A2a,
which indicates the need for a more extensive analysis of this model and their
interactions.
xvii
1 – Introdução
1.1 – Adenosina e suas características
A adenosina é um nucleosídeo endógeno composto pela base adenina
(purina) e pela ribose (Baraldi et al., 2008; Jenner et al., 2009; Clementina e
Giuseppe, 2010) (Figura 1). Presente em todos os tecidos e fluídos corporais, a
adenosina é liberada essencialmente por todas as células, incluindo neurônios e
glia (Ribeiro et al., 2003). A concentração desse nucleosídeo pode aumentar
drasticamente quando há um desequilíbrio entre a energia consumida e a energia
fornecida (Schulte e Fredholm, 2003; Martinelli e Tuccinardi, 2008; Baraldi et al.,
2008), sendo esta molécula instável e com meia vida limitada pela deaminação ou
recaptação celular (Baraldi et al., 2008).
H2N
N
N
N
N
O
HO
HO
OH
Figura 1. Estrutura química do nucleosídeo adenosina.
A adenosina é um metabólito que pode ser formado tanto intracelularmente
quanto extracelularmente. A produção intracelular pode ser mediada pela endo-5nucleotidase, que desfosforila a adenosina monofosfato (AMP), ou pela hidrólise
da S-adenosil-homocisteína. Diferentemente, a produção extracelular ocorre por
desfosforilação de AMP extracelular, cuja fonte pode ser a adenosina trifosfato
(ATP), acarretada pela ação da ecto-5’-nucleotidase (Figura 2). Outra fonte de
adenosina extracelular é o monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), que é
liberado para o meio extracelular através de um transportador não específico
dependente de energia. Ainda podemos mencionar a formação de adenosina a
1
partir da hidrólise da S-adenosilhomocisteína (SAH) pela enzima SAH hidrolase.
Essa enzima geraria adenosina e homocisteína a partir da SAH (Martinelli e
Tuccinadi, 2007; Cunha, 2008; Baraldi et al., 2008; Fredholm et al., 2010) (Figura
2).
Figura 2 – Principais vias do metabolismo da adenosina e seu transporte.
Adaptado de Poulsen e Quinn, 1998.
A adenosina atua como neuroprotetor sob condições fisiológicas e
patológicas. O efeito de proteção e reparo está dividido em categorias que inclui
vasodilatação ou angiogênese, proteção contra danos provocados por isquemia e
estímulo da resposta antiinflamatória (Jacobson, 2009; Jenner et al., 2009;
Jacobson e Gao, 2006). Como é um importante neuromodulador, a adenosina
está envolvida em diversas atividades cerebrais, tais como: a) inibição do
neurotransmissor glutamato, possivelmente pela inibição do influxo de Ca2+ présináptico (Franco et al., 2005); b) regulação do sono e do nível de alerta; c) efeitos
locomotores; d) analgesia; e) mediação dos efeitos do etanol e do uso crônico de
fármacos (Fukumitsu et al., 2005; Dort et al., 2009).
A neuromodulação mediada pela adenosina pode ser excitatória ou
inibitória, dependendo do receptor ao qual esse nucleosídeo se liga (Margus et
al., 2009). Além disso, os derivados dessa molécula modulam as diferentes
formas de plasticidade sináptica, incluindo potenciação de longa duração (Long2
term potentiation, LTP) e despotenciação (Mohammad-Zadeh et al., 2009.;
Jacobson, 2009; Schubert et al.2006).
Além desses efeitos sobre o sistema nervoso central (SNC), a adenosina
desempenha outros papéis em uma variedade de tecidos. No sistema cardíaco, a
adenosina pode estimular a vasoconstricção ou a vasodilatação de veias e
artérias, alterando a pressão sanguínea (Givertz, 2009; Silva, 2010). No sistema
imunológico, a adenosina regula a produção de citocinas, a proliferação de
linfócitos T, a produção de moléculas co-estimulatórias positivas, que são
utilizadas para ativação de células imunitárias, protegendo ainda contra a morte
celular induzida por reativação de linfócitos T CD4+ (Silva, 2010; Michael et al.,
2010). Esse nucleosídeo também está relacionado com a inibição da lipólise e
indução da broncoconstrição (Silva, 2010).
A adenosina não pode ser considerada um neurotransmissor clássico
porque não é produzida e liberada por vesículas em resposta a um estímulo
neuronal (Jacobson, 2009; Ribeiro et al., 2003). De forma diferente, este
nucleosídeo é liberado do citoplasma para o espaço extracelular através de um
transportador de nucleosídeo, que também medeia sua recaptação (Cunha, 2008;
Ribeiro et al., 2003) (Figura 2).
1.2 – Receptor de adenosina (RA): um receptor acoplado à proteína G
Os Receptores Acoplados à Proteína G (RAPG) compreendem uma classe
de receptores transmembranares que viabilizam a sinalização intracelular, via
estímulo extracelular, resultando em diversos eventos celulares (Wettschureck e
Offermanns, 2005,Katritch et al., 2010).
Cerca de 800 proteínas transmembranares da família dos RAPG estão
envolvidas em sinalização e regulação no Sistema Nervoso Central (SNC) e em
outros sistemas, sendo esses receptores alvos para quase metade dos fármacos
existentes (Katritch et al., 2010).
Os RAPG de mamíferos podem ser classificados em várias famílias com
base na sua sequência de resíduos de aminoácidos. Dentre as principais estão
incluídas as famílias das moléculas do tipo rodopsina (I), do tipo receptor de
3
secretina (II) e do tipo receptor metabotrópico do neurotransmissor glutamato (III)
(Wettschureck e Offermanns, 2005, Martinelli e Tuccinardi, 2007; Yuzlenco e
Kiéc-Kononowicz, 2009).
Os receptores de adenosina (RA) pertencem à família I, do tipo rodopsina,
e possuem um grande número de aminoácidos altamente conservados em sua
estrutura (Martinelli e Tuccinardi, 2007; Yuzlenco e Kiéc – Kononowicz, 2008).
Eles apresentam quatro subtipos, incluindo A1 (RA-A1), A2a (RA-A2a), A2b (RAA2b) e A3 (RA-A3), sendo essa classificação proposta com base no segundo
mensageiro, na distribuição tecidual e no perfil farmacológico. Segundo a
literatura, adenosina é capaz de estimular a adenil ciclase , enzima que converte
ATP em AMPc, em cortes cerebrais com maior ou menor afinidade, o que gerou
a subclassificação do RA-A2, em RA-A2a e RA-A2b respectivamente (Olah e
Stiles, 2000; Gomes, 2007).
Similar à função e à regulação de outros receptores acoplados à proteína
G, a ativação e a desensibilização dos receptores de adenosina ocorre após a
ligação do agonista. A interação do receptor ativado com a proteína G induz à
produção de segundos mensageiros e a respostas fisiológicas clássicas que
dependem do subtipo de RA envolvido (Jacobson, 2009). Enquanto os receptores
de adenosina A1 e A3 são acoplados à proteína Gi/G0 e medeiam respostas
inibitórias, os receptor A2a e A2b, que sinalizam principalmente via Gs ou G0,
medeiam respostas excitatórias (Fredholm, 2010; Jacobson, 2009) (Figura 3).
4
Figura 3 - Vias de sinalização dos subtipos de receptores de adenosina. RA =
receptor de adenosina.
Todos os RA são membros do RAPG e por isso apresentam uma região
estrutural (motif) típica desta classe, composta de uma única cadeia polipeptídica,
formando sete hélices transmembranares, com o N-terminal extracelular e o Cterminal citosólico. Além disso, apresentam três alças intracelulares e três alças
extracelulares, que contêm resíduos de cisteína que participam da formação de
ligações dissulfeto, influenciando na conformação do receptor (Jacobson e Gao,
2006; Jenner et al., 2009).
A identidade entre a estrutura primária dos receptores de adenosina varia
entre 37 e 57%, o que é considerado um alto grau de conservação para
sequência de aminoácidos (Tabela 1) (Jacobson, 2009).
Tabela 1 – Comparação dos valores percentuais de identidade resultantes do
alinhamento múltiplo das sequências primárias dos subtipos de receptores de
adenosina (RA-A1, RA-A2a, RA-A2b e RA-A3).
Identidade (%)*
Receptores de adenosina
RA-A1
RA-A2a
RA-A2b
RA-A3
RA-A1
100
49
45
48
RA-A2a
49
100
57
41
RA-A2b
45
57
100
37
RA-A3
48
41
37
100
*
Dado obtido através do programa
www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/].
ClustalW2
–
Multiple
Sequence
Alignment.
[Disponível
em:
A região C-terminal de RA-A1, RA-A2b e RA-A3 possui resíduos de
cisteína conservados, que serve aparentemente como sítio para palmitação e
permite a formação de uma quarta alça intracelular (Olah e Stiles, 2000). O RAA2a possui a região C-terminal mais longa, contendo mais de 120 resíduos de
aminoácidos e que atua como um sítio de ligação para proteínas acessórias
(Jacobson, 2009).
Contudo, apesar do alto grau de identidade, esses receptores apresentam
diferença quanto à afinidade pela adenosina endógena. O RA-A1 e o RA-A2a
5
possuem mais afinidade pela adenosina endógena do que RA-A3 e RA-A2a
(Tabela 2) (Dunwiddie e Masino, 2001; Ciruela et al., 2006; Jacobson, 2009;
Clementina e Giuseppe, 2010).
Tabela 2 - Afinidade dos receptores de adenosina pelo ligante endógeno.
Receptores
Afinidade pela adenosina (nM)
RA-A1
70
RA-A2a
150
RA-A2b
5100
RA-A3
6500
Adaptado de Dunwiddie e Masino, 2001
No SNC, os principais receptores para a adenosina são RA-A1 e RA-A2a,
sendo
que,
as
menores
concentrações
de
adenosina
estimularão
preferencialmente RA-A1 (Boison, 2008; Gomes, 2007; Ciruela et al., 2006; Olah
e Stiles, 2000). RA-A1 e RA-A2a são responsáveis por mediar a regulação do
sono e o nível de alerta, neuroproteção, regulação da susceptibilidade à
apreensão, efeitos locomotores, analgesia, mediação dos efeitos do etanol e uso
crônico de fármacos (Fukumitsu et al., 2005).
Por sua importância no SNC, esses receptores têm sido avaliados em
diferentes áreas, incluindo a biologia celular, a bioinformática, a neuroquímica, a
neurofarmacologia e a neurofisiologia (Cunha et al., 1997; Fukumitsu et al., 2005;
Yang et al., 2009). Apesar de estar em menor concentração que o RA-A1, o RAA2a é o único que possui, atualmente, a estrutura tridimensional (3D) depositada
no banco de dados de proteínas (Protein Data Bank, PDB), código 3EML, o que
limita os estudos de relação estrutura-atividade para estes receptores (Jaakola et
al., 2008).
6
1.2.1 – Receptor de adenosina A1 e A2a: breve visão
1.2.1.1 - Receptor de adenosina A1 (RA-A1)
O
receptor
de
adenosina
A1
(RA-A1)
está
presente
no
SNC,
particularmente em sinapses glutamatérgicas no hipocampo, no córtex, no
cerebelo (Hargus et al., 2009; Lopes et al., 2002; Ochiishi et al., 1999) e no corno
dorsal da medula espinhal (Ribeiro et al., 2003) (Figura 4).
Esse receptor possui uma alta afinidade pela adenosina, sendo
responsável por efeitos inibitórios mediados pela adenosina na transmissão
sináptica e excitabilidade neuronal. Quando acoplado à proteína Gi/G0, esse
receptor reduz a atividade da adenil ciclase, diminui os níveis de AMPc, aumenta
a condutância do potássio (K+) e diminui transientemente a condutância de cálcio
(Ca2+) (Jockers et al., 1994; Ochiishi et al., 1999; Ribeiro et al., 2003). Como
resultado, ocorre a liberação de vários neurotransmissores, tais como glutamato,
dopamina, serotonina e acetilcolina (Jenner et al., 2009; Zizzo et al., 2009;
Boison, 2008; Lopes et al., 2002).
Figura 4 – Distribuição dos receptores de adenosina de alta afinidade nas
principais regiões do sistema nervoso central (Adaptado de Ribeiro, 2003).
7
Para exercer sua função, o RA-A1 apresenta alças extra e intracelulares,
domínios transmembranares, uma porção N-terminal e uma porção C-terminal
distribuidos na membrana celular de forma a permitir a sinalização (Figura 5).
Além da adenil ciclase, a estrutura do RA-A1 permite a utilização de outros
efetores, tais como fosfolipase A2 (PLA2), a fosfolipase C (PLAc) e a guanilil
ciclase (Boison, 2008; Fukumitsu et al., 2005; Poulsen e Quinn, 1998).
LE
N-terminal
LE
LE
ME
DT
MI
LI
LI
LI
C-terminal
Figura 5 – Representação esquemática do receptor de adenosina A1 (RA-A1) na
membrana celular, mostrando a distribuição estrutural das alças extracelulares
(LE) e intracelulares (LI), os domínios transmembranares (DT) e as porção Cterminal e N-terminal nos meios extracelular (ME) e intracelular (MI).
1.2.1.2 – Receptor de adenosina A2a (RA-A2a)
Os receptores de adenosina A2a (RA-A2a) apresentam diferenças
estruturais significativas quando comparados aos RA-A1, como o tamanho na
região do C-terminal e a quantidade de resíduos apolares presentes nas alças
extras e intracelulares, que estão em maior proporção em relação aos outros tipos
de aminoácidos para ambos os receptores (Figura 6) (Tuccinardi et al., 2006).
8
N-terminal
LE
LE
LE
ME
DT
MI
LI
LI
LI
C-terminal
Figura 6 – Representação esquemática do receptor de adenosina A2a (RA-A2a)
na membrana celular, mostrando a distribuição estrutural das alças extracelulares
(LE) e intracelulares (LI), os domínios transmembranares (DT) e as porção Cterminal e N-terminal nos meios extracelular (ME) e intracelular (MI).
Os RA-A2a são expressos em áreas com alta inervação GABAérgica, tais
como o estriado (Boison, 2008) e hipocampo, assim como em terminais nervosos
glutamatérgicos (Figura 4) (Hargus et al., 2009; Lopes et al., 2002). Esses
receptores também são encontrados no núcleo accumbes e no bulbo olfatório
(Gillespie et al., 2009; Latini et al., 1996) (Figura 4).
A via de sinalização do RA-A2a causa ativação da adenil ciclase,
estimulando a formação de AMPc, induz a formação de inositol trifosfato para
elevar os níveis intracelulares de Ca2+ e ativa a proteína quinase C (PKC)
(Jacobson e Gao, 2006). Assim, esse receptor é responsável por mediar ações
excitatórias pré-sinápticas.
9
1.3 – Agonistas e antagonistas: os ligantes dos receptores de adenosina
A identificação de um grande número de funções mediadas pela adenosina
apontam os receptores de adenosina como alvos terapêuticos para tratamento de
diferentes doenças e seus ligantes como possíveis fármacos (Tabela 3) (Poulsen
e Quinn, 1998). Esse potencial foi reforçado com a descoberta de mais subtipos
de receptores na última década e com a determinacao dos efeitos terapêuticos de
agonistas e antagonistas (Tabela 3).
Tabela 3 – Algumas doenças nas quais os ligantes dos receptores de adenosina
A1 e A2a (agonistas ou antagonistas) são utilizados como formas de tratamento.
Doenças tratadas pelo uso de ligante de RA
Receptor
Agonista
A1
A2a
Epilepsia,
cardíaca,
arritmia, dor.
proteção
derrame,
Desordens
do
sono,
imunossupressão, artrite
reumatoide,
derrame,
hipertensão,
trombose,
desordens respiratórias.
Antagonista
Asma, diabetes,
falência renal,
desordens cognitivas
Doença de Parkinson,
derrame,
câncer,
neurodegeneração,
doença de Huntington.
Devido à ampla distribuição dos receptores de adenosina nos tipos
celulares, a existência de quatro subtipos diferentes e a variabilidade de respostas
fisiológicas, uma proposta de tratamento exige agonistas e antagonistas que
sejam seletivos em sua ação para ter valor terapêutico (Poulsen e Quinn, 1998). A
utilização de fármacos em camundongos com deleções em receptores de
adenosina tem possibilitado delinear um número de processos fisiológicos e
patofisiológicos, onde um ou mais desses receptores estão envolvidos (Tabela 3)
(Jacobson e Gao, 2006; Fredholm, 2010).
10
Com a descoberta dos subtipos dos RA, alguns fármacos, que eram
considerados seletivos para RA-A1 e RA-A2a, foram posteriormente identificados
como não seletivos, devido à sua afinidade pelos subtipos RA-A2b e RA-A3. Essa
situação aumenta a necessidade de novos compostos seletivos para os subtipos
dos receptores recentemente descobertos (Klotz, 2000).
A adenosina é a base estrutural de quase todos os agonistas conhecidos
para os RA, com exceção da classe dos derivados da piridina-3,5-dicarbonitrila,
que demonstra uma seletividade variada pelos subtipos de receptores (Jacobson,
2009; Klotz, 2000).
A literatura descreve três sítios na adenosina que podem ser modificados
para aumentar a afinidade a um subtipo específico do receptor, sem comprometer
a atividade agonista, incluindo a posição 5’ da ribose e 2’ e as posições N6 da
purina. Os compostos N6-cicloexiladenosina (CHA) e N-[2-(3,5-dimetoxifenil) etil]
adenosina (DPMA) derivam das substituições na posição N6 e na posição 2’,
respectivamente (Figura 7)( Sheardown e Knutsen, 1996; Klotz, 2000; Jacobson e
Gao, 2006).
A principal abordagem para a descoberta de antagonistas do receptor de
adenosina tem sido a modificação de xantinas, tais como a cafeína e a teofilina
(Figura 7). Antagonistas seletivos para o receptor de adenosina RA-A1 tem sido
oriundos da modificação de xantinas, incluindo muitos derivados contendo 8-aril e
8-cicloalquil, como, por exemplo, o 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina (DPCPX)
(Figura 7). Em relação ao receptor de adenosina A2a, 4-(2-[7-Amino-2-(2-furil)[1,2,4]triazolo[2,3-a]-[1,3,5]triazin-5-ilamino]etil)fenol (ZM241385) e 7-(2-feniletil)-5amino-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo [1,5-c]pirimidina (SCH58261) são
antagonistas seletivos, embora o ZM241385 também se ligue ao RA-A2b com
afinidade intermediária (Jacobson e Gao, 2006) (Figura 7).
11
Figura 7 – Estruturas da adenosina, xantina e fármacos que as utilizam como
base estrutural, mostrando as posições de mudanças estruturais. CHA = N6cicloexiladenosina, DPMA = N-[2-(3,5-dimetoxifenil) etil] adenosina, DPCPX = 8ciclopentil-1,3-dipropilxantina, SCH58261 = 7-(2-feniletil)-5-amino-2-(2-furil)pirazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c] pirimidina, ZM241385 = 4-(2-[7-Amino-2-(2furil)-[1,2,4]triazolo[2,3-a]-[1,3,5]triazin-5-ilamino]etil)fenol.
12
1.3.1. Receptores de adenosina A1 e A2a: resíduos importantes para
interação com ligantes
Nos receptores de adenosina, tanto os domínios transmembranares,
quanto às regiões extracelulares desempenham um papel importante na
composição do sítio de ligação de fármacos (Olah e Stiles, 2000).
Os resíduos de aminoácidos presentes em RA-A1 e RA-A2a importantes
para a interação com os fármacos têm sido identificados por estudos de
mutagêne revelando o papel de alguns resíduos para a interação de ligantes ao
RA-A2a, incluindo Phe182, Asn253, Ile274, Ser281, His250, Ser277 e His278
(Sherbiny et al., 2009; Ben et al., 2010).
Desde 1996, pesquisas envolvendo mutagênese têm identificado resíduos
dos RA envolvidos direta ou indiretamente na interação com os ligantes ou que
desempenhando uma função alostérica. Foi observado que o Glu16 e Thr277
(RA-A1) e o Glu13 (RA-A2a) são críticos para os agonistas, incluindo ainda os
resíduos conservados Cys80 e Cys169 (Rivkees et al., 1999; Olah e Stiles, 2000;
Giordanetto et al.,2003; Ben et al., 2010). Outros resíduos que têm sido descritos
na literatura e que modulam a afinidade do RA-A1 e do RA-A2a estão descritos
na Tabela 4 (Ben et al., 2010; Giordanetto et al., 2003; Olah e Stiles, 2000;
Rivkees et al., 1999).
1.4 – Modelagem molecular: uma ferramenta para o estudo rde receptores e
ligantes
A modelagem molecular envolve métodos teóricos, matemáticos e técnicas
computacionais que permitem, em ambiente computacional (in silico), criar ou
simular o comportamento de moléculas, descrever e prever estruturas
moleculares, propriedades do estado de transição, equilíbrio de reações,
propriedades termodinâmicas, dentre outras (Brito, 2007). Estudos da área de
modelagem comparativa podem envolver vários estágios, incluindo: a seleção de
um molde/template que descreva interações inter e intramoleculares de um
sistema, realização de cálculos e simulações com análise dos resultados e
13
validação da estrutura final que irá permitir usar ou rejeitar o modelo obtido (Brito,
2007).
Tabela 4 – Resíduos de aminoácidos dos receptores de adenosina RA-A1 e RAA2a analisados por estudos de mutagênese e seu perfil de modulação sobre a
afinidade.
Ligante
Agonista
Efeito na
afinidade
RA-A1
RA-A2a
Aumento
Gly14, Asp55
Gly89, His250, Ser281
Glu16, Pro25, Leu65,
Glu13, Val84, Thr88,
Ile69, Cys85, Pro86,
Glu151, Glu169, Asn181,
Leu88, Thr91, Ser94,
Phe182, His250, Asn253,
Cys169, Asn254,
Phe257, Ile274, Ser277,
Thr277, His278
His278, Ser281
-
Gly89, Glu161, Ser281
Glu16, Cys80, Val87,
Thr88, Glu151, Glu169,
Redução
Leu88, Thr91, Gly92,
Phe182, His250,
ou perda
Ser94, Cys169, Asn251,
Asn253, Phe257, Ile274,
Asn254, Thr277, His278
His278, Ser281
Redução
ou perda
Aumento
Antagonista
A modelagem molecular é usada nas áreas de química computacional,
biologia computacional e ciências para o estudo de sistemas moleculares, que
variam desde pequenos sistemas químicos até grandes moléculas biológicas, tais
como ácidos nucléicos e proteínas. A modelagem molecular reduz a
complexidade dos sistemas, permitindo que muito mais partículas (átomos) sejam
consideradas durante as simulações (Leach, 2001). A base da modelagem
molecular está em relacionar todas as propriedades moleculares importantes, ou
14
seja, estabilidade, reatividade e propriedades eletrônicas com a estrutura
molecular (Coelho et al., 1999).
Os métodos de modelagem molecular são usualmente utilizados para
investigar a estrutura, a dinâmica e a termodinâmica de sistemas inorgânicos,
biológicos e poliméricos, além de abrangerem estudos de minimização de
energia, análise conformacional, simulações de dinâmica molecular, entre outros.
Os tipos de atividades biológicas de macromoléculas que têm sido investigados
usando a modelagem molecular incluem o enovelamento e estabilidade protéica,
a
catálise
enzimática,
mudanças
conformacionais
associadas
à
função
biomolecular e reconhecimento molecular de proteínas, de DNA e de complexos
membranares.
Na
última
década,
o
avanço
no
desenvolvimento
de
recursos
computacionais, em termos de equipamentos (hardware) e programas (software),
possibilitou uma maior aplicação da modelagem molecular em problemas de
interesse biológico. Atualmente, esse campo encontra-se muito mais acessível
para os pesquisadores, devido ao grande número de programas de química
computacional disponíveis para auxiliar na pesquisa científica (Leach, 2001).
Os estudos nessa área têm contribuído de forma decisiva para elucidar
interações intra/inter moleculares, mecanismos de reações químicas e estrutura e
função de proteínas difíceis de serem purificadas em grande escala, o que
dificulta a determinação estrutural de forma experimental clássica (ex.:
cristalografia) (Figueiredo et al., 2005).
1.4.1 – Modelagem por homologia: abordando os receptores
Apesar do progresso na determinação experimental de estruturas por
cristalografia de raio-X e ressonância magnética nuclear (RMN), o número de
estruturas de proteínas caracterizadas experimentalmente é menor quando
comparado ao número de sequências de proteínas descritas de forma contínua
na literatura (Koop e Schwede, 2005; Nayeem et al., 2006).
Assim, vários métodos computacionais para predizer estruturas 3D têm
sido desenvolvidos, variando de métodos ab initio, que prevê estruturas sem
15
conhecimento prévio das mesmas; à modelagem comparativa, que utiliza
informações experimentais de estruturas já determinadas. Como as estruturas
tridimensionais (3D) das proteínas são mais conservadas do que as suas
sequências, a estrutura conhecida experimentalmente de uma proteína pode ser
usada como molde (template) para gerar um modelo para outras proteínas da
mesma família (Hillisch et al., 2004; Nayeem et al., 2006).
A modelagem por homologia tem se mostrado como um método preciso e
capaz de construir modelos 3D de forma confiável, que podem ser utilizados, por
exemplo, no desenho de novos fármacos (Filho e Alencastro, 2003; Hillisch et al.,
2004; Koop e Schwede, 2005).
Para construir um modelo por homologia são necessárias basicamente três
etapas:
1ª: Seleção de um molde que apresente um certo grau de similaridade
determinado a partir de alinhamentos das sequencias primárias;
2ª: Construção da proteína alvo utilizando a estrutura 3D do molde.
3ª: Avaliação (validação) da qualidade do modelo construído.
Assim, o modelo por homologia representará a estrutura 3D da proteína
alvo, cuja estrutura original é desconhecida, construída a partir de dados de
coordenadas de raios-X ou RMN de proteínas semelhantes ou usando técnicas
de alinhamento (Sant’Anna, 2002).
1.4.1.1 – Etapas de Construção do Modelo
1.4.1.1.1 - Alinhamento de sequências proteicas
O alinhamento de sequências auxilia na predição e na construção de
modelos por homologia. As sequências são alinhadas e a qualidade do
alinhamento é avaliada e pontuada considerando as regiões conservadas e a
identidade dos resíduos de aminoácidos (Gibas e Jambeck, 2001). Uma das
regiões conservadas presente nos subtipos de receptores de adenosina é a
sequência Asp-Arg-Tyr, existindo ainda outras que são conservadas em todos os
receptores pertencentes à família I dos RAPG (Yuzlenko e Kiec-Kononowicz,
2009) (Figura 8).
16
17
Quando resíduos de aminoácidos são idênticos são mais altamente
pontuados pelos programas de alinhamento do que os similares que conservam
apenas as propriedades químicas, como os aminoácidos ácidos,
e do que
aqueles que conservam as propriedades eletrônicas como ser carregado (positivo
ou negativamente) (Gibas e Jambeck, 2001).
Sequências homólogas apresentam uma relação evolutiva entre elas.
Contudo, certas sequências apresentam inserções ou deleções de aminoácidos,
dando origem a espaços vazios – os gaps – no alinhamento o que indica a
necessidade de adição ou retirada de alças na estrutura (Abreu, 2008, apud
Gibas e Jambeck, 2001).
As proteínas que apresentam funções relacionadas são, por vezes,
semelhantes tanto na sequência primária, quanto na estrutura terciária.
Entretanto, a estrutura primária pode se modificar mais rapidamente do que a
estrutura 3D durante a evolução (Santos 2002). A estrutura de proteínas
homólogas são, geralmente, conservadas, uma vez que a estrutura ancestral
comum é, por vezes, imprescindível para a função específica da cada uma das
proteínas daquela família (Santos 2002).
1.4.1.1.2 – Construção e otimização do modelo 3D
Um dos primeiros passos para a construção de um modelo por homologia é
determinar o molde, o que necessita de uma busca no banco de dados de
proteínas (Protein Data Bank, PDB) com comparação das sequências das
estruturas existentes com a sequência da proteína a ser modelada (Filho e
Alencastro, 2003).
A qualidade do modelo geralmente depende do nível de identidade entre a
sequência da proteína com estrutura conhecida e da proteína a ser modelada. Se
a identidade for maior que 30%, usualmente pressupõe-se uma homologia que
determinaria
um
ancestral
comum.
Portanto,
essas
proteínas
seriam
evolutivamente relacionadas, podendo apresentar uma estrutura 3D conservada e
similar. Contudo, se a sequência de identidade for menor que 15%, a estrutura
modelada, segundo a literatura, torna-se questionável. Se o valor estiver entre
18
15% e 30%, métodos mais sofisticados capazes de reconhecer a homologia e
predizer o enovelamento devem ser utilizados (Abreu 2008; Hillisch et al., 2004;
Filho e Alencastro, 2003).
Os modelos que possuem sequência de identidade entre 30% e 50%
facilitam a predição baseada na estrutura de alvos terapêuticos e uma identidade
maior que 50%, permite a construção de um modelo geralmente útil para o
planejamento de fármacos e predição de sítios de interações (Hillisch et al., 2004;
Filho e Alencastro, 2003).
Uma das vantagens dos modelos por homologia é que podem ser
rapidamente gerados, devendo, contudo, a construção e a avaliação dos modelos
serem cuidadosas, uma vez que existem insucessos descritos na literatura
(Hillisch et al., 2004).
Os modelos gerados por homologia precisam ser otimizados para se
aproximar à forma da estrutura estável real. O objetivo da otimização da
geometria é encontrar o mínimo de energia mais próximo à geometria de partida,
o que pode ser atingido por meio de cálculos de mecânica molecular (Sant’Anna,
2002).
Na mecânica molecular, e energia é calculada por comparação entre
ângulos e distância de ligação entre átomos que compõem a molécula. Nesse
cálculo, apenas o núcleo dos átomos é considerado, o que torna possível estudar
biomacromoléculas e sistemas que contenham mais de 10.000 átomos (Abreu,
2008; Carvalho et al., 2003).
1.4.1.1.3 – Validação do modelo 3D
No processo de modelagem por homologia de uma proteína, a última
etapa consiste na validação do modelo, uma análise da confiabilidade da
estrutura construída. Essa é uma etapa complexa, pois a qualidade do modelo
depende de várias propriedades, em diferentes níveis de organização estrutural
(Fersht, 1998).
A distribuição dos ângulos torcionais da cadeia principal – phi (φ) e psi (ψ) –
é um indicador importante da qualidade estereoquímica da proteína. Os ângulos
19
φ e Ψ referem-se a rotações de duas unidades rígidas dos peptídeos em torno do
carbono alfa (Cα). O ângulo ψ é o ângulo de torção da ligação Cα – N e o ângulo
φ é o ângulo de torção da ligaçãoα C
– carbono da carbonila (CO) (Filho e
Alencastro, 2003; Branden e Tooze, 1991) (Figura 9).
Figura 9 – Estrutura das ligações peptídicas, mostrando os ângulos torcionais phi
(φ) e psi (ψ) da cadeia principal de proteínas (Adaptado de Jakubowski, 2008)
A distribuição dos ângulos φ e ψ pode ser examinada através do gráfico de
Ramachandran. Esse gráfico é separado em regiões identificadas por cores
incluindo as regiões favoráveis (vermelha), permitidas (amarela e creme) e
desfavoráveis (branca), no qual resíduos de aminoácidos que apresentam
problemas estereoquímicos geralmente se localizam (Figura 10).
Figura 10 - Gráfico de Ramachandran para a estrutura cristal do receptor de
adenosina A2a como exemplo da estereoquímica dos aminoácidos de acordo
com a distribuição dos ângulos phi e psi. Em vermelho, regiões favoráveis, em
amarelo e creme, regiões permitidas e em branco, regiões desfavoráveis.
20
Além do gráfico de Ramachandran, existem outras formas de avaliar um
modelo, tais como, a análise da superfície da proteína e da compatibilidade entre
a estrutura 3D do modelo e sua própria sequência de aminoácidos usando o
programa Profile 3D. O método baseia-se no fato de que proteínas com estrutura
3D adequadas possuem pontuações (scores) maiores do que modelos com
estrutura 3D inadequada. Além disso, o método avalia o score 3D–1D para cada
aminoácido, que deve apresentar, preferencialmente, valores maiores que zero
(Lüthy, et al., 1992; Abreu, 2008).
1.4.2 - Docking: gerando complexos receptor-ligante
A
utilização
de
métodos
computacionais
para
o
processo
de
reconhecimento molecular receptor-ligante tem sido motivada devido à redução
de tempo e dos altos custos envolvidos no desenvolvimento experimental de
novos fármacos (Morgon e Coutinho, 2007; Huguenin, 2009).
O Docking ou ancoramento molecular é um processo computacional de
busca por um ligante capaz de se encaixar geometricamente e energeticamente
ao sítio de uma proteína. Essa técnica pode ser realizada de forma manual ou
automática (Huguenin, 2009).
No docking manual, o composto é posicionado no sítio de ligação de
acordo com modelos comparativos de outros compostos análogos. No docking
automático, o composto é posicionado por meio de programas computacionais,
que utilizam algoritmos de busca para localizar as orientações mais estáveis, ou
seja, de menor energia (Huguenin, 2009).
Entender como os ligantes interagem com os diferentes tipos de proteínas
é importante não só para a área de planejamento de fármacos ou produtos
biotecnológicos (indústrias farmacêuticas), mas também para indústrias que
produzem alimentos funcionais, que podem fornecer benefícios para a saúde
(Vaqué et al., 2008).
Em um docking proteína-ligante, as coordenadas individuais da proteína e
do ligante são usadas para prever as coordenadas do complexo. Hoje, existem
vários programas que fazem docking de ligantes, como o Molegro Virtual Docker
21
(MVD) e o AutoDock. Esses programas apresentam características em comum,
incluindo o uso de um algoritmo que faz uma busca de todas as possíveis
coordenadas para um complexo, sugerindo um candidato de estruturas 3D, e uma
função de pontuação (score) que pontua todos os candidatos e classifica-os de
acordo com a energia de interação intermolecular.
Apesar dessas semelhanças, os programas de docking diferem uns dos
outros na forma como o algoritmo de busca funciona e/ou na pontuação para os
diferentes tipos de interações intermoleculares e sobreposições estéricas que
considera para obter o score (Vaqué et al., 2008).
Ao observar as coordenadas do complexo proteína-ligante, diferentes
graus de flexibilidade molecular podem ser considerados. Dentre eles estão os
algoritmos mais simples que consideram o receptor e o ligante como corpos
rígidos, sendo assim, não há grau de liberdade em torno de qualquer ponto de
rotação. Atualmente essa técnica é utilizada apenas para docking proteínaproteína (B-Rao et al., 2009; Vaqué et al., 2008).
Recentemente, a abordagem utilizada pela maioria dos programas
considera que o receptor é rígido e o ligante, flexível. No entanto, tem sido
questionado que o receptor não pode ser considerado um corpo rígido e que a
sua flexibilidade também deve ser considerada. Esse tipo de abordagem está
presente em alguns programas de docking mais recentes (B-Rao et al., 2009;
Vaqué et al., 2008).
Para que uma ferramenta de docking seja útil, é necessário que ela seja
capaz de gerar um conjunto grande e diversificado de ligantes. Existem dois tipos
principais de algoritmos que permitem que os programas de docking pesquisem o
espaço conformacional do ligante para obtenção de suas representações
estruturais. Ambos apresentam vantagens e desvantagens, sendo a escolha
orientada, geralmente, pela experiência prévia (Vaqué et al., 2008).
Uma vez que o conjunto de conformações do ligante, no complexo, tenha
sido predito, a sua afinidade de ligação para o receptor deve ser avaliada. Isso é
feito por meio do score, que avalia os resultados da pesquisa, o ligante ideal a ser
escolhido é aquele que apresenta o maior valor. Dessa forma, podemos concluir
22
que a função de pontuação é crítica nos protocolos de docking e que auxilia na
escolha do melhor ligante (Spallarossa et al., 2009; Vaqué et al., 2008; Pham e
Jain, 2008).
Além do score, para que os programas de docking sejam ferramentas úteis
na descoberta de fármacos, precisão e velocidade são fatores importantes
(Brooijmans e Kuntz, 2003). A comparação da capacidade de previsão e os
resultados gerados por programas de docking proteína-ligante constituem uma
área atualmente de intenso investimento (Vaqué et al., 2008).
1.4.2.1– Interação receptor – ligante
Para entender o mecanismo de ação dos fármacos, faz-se necessário
conpreender as forças de interação que permitem que o fármaco se ligue ao
receptor. As interações envolvidas na formação do complexo receptor-ligante são
aquelas comuns entre moléculas orgânicas, tais como, ligações de hidrogênio,
interações
eletrostáticas
(iônicas),
interações
dipolo-dipolo,
interações
hidrofóbicas e interações de van der Waals, além da possibilidade da existência
de ligações covalentes. Essas interações só são possíveis quando as superfícies
moleculares estão próximas, sendo a força da interação dependente da distância
(Silverman, 1992; Santos, 2002).
As ligações covalentes são de alta energia e dificilmente clivadas em
processos não enzimáticos. Dessa forma, as ligações covalentes envolvidas no
complexo receptor-ligante raramente são desfeitas e levam a uma inibição
irreversível com inativação do sítio alvo (Abreu, 2008).
Em pH fisiológico, a cadeia lateral dos resíduos de aminoácidos básicos
torna-se protonada, gerando um ambiente catiônico. Em relação aos aminoácidos
ácidos, as cadeias laterais encontram-se desprotonadas, caracterizando sítios
aniônicos. Dessa forma, os grupamentos dos ligantes e receptores contendo
cargas opostas são mutuamente atraídos de forma complementar (Santos, 2002;
Silverman, 1992). As interações iônicas que ocorrem entre grupamentos com
cargas opostas são mais fortes que as ligações de hidrogênio, porém, mais fracas
que as ligações covalentes (Abreu, 2008 apud Murray et al., 2006).
23
A interação dipolo-dipolo é mais fraca que a interação iônica e envolve a
atração entre dipolos permanentes. A diferença de eletronegatividade dos átomos
do receptor e do ligante (C – X, onde X é um átomo eletronegativo) produz uma
distribuição assimétrica de elétrons (Silverman, 1992).
A ligação de hidrogênio é uma forma de interação dipolo-dipolo formada
entre um átomo de hidrogênio ligado a um átomo eletronegativo (X) e a outro
átomo eletronegativo contendo um par de elétrons livres (Y), X
.......
H
.......
Y onde
X e Y podem ser átomos de nitrogênio, oxigênio ou flúor. Esse é o tipo de
interação mais importante nos sistemas biológicos, sendo responsável pela
formação da estrutura secundária em proteínas α( -hélice e folha β -pregueada) e
ácidos nucléicos (hélice de DNA). A ligação de hidrogênio torna-se importante
para o encaixe do fármaco no sítio da macromolécula alvo (Santos, 2002;
Silverman, 1992).
As interações hidrofóbicas ocorrem entre grupamentos apolares. Essa
interação minimiza as ligações energeticamente desfavoráveis que são formadas
na associação. Podemos observar esse tipo de interação entre os lipídios das
membranas biológicas e entre as cadeias hidrofóbicas presentes no ligante e no
sítio de ligação do receptor (Abreu, 2008; Santos, 2002; Silverman, 1992).
As interações de van der Waals são as interações mais fracas
energeticamente e ocorrem em função de uma polarização transitória (dipolo
instantâneo ou dipolo induzido) de ligações de baixa polaridade ou apolares, tais
como as ligações carbono-carbono e carbono-hidrogênio. Mesmo sendo
caracterizadas como uma interação fraca, a interação de van der Waals é
importante para o reconhecimento molecular do ligante pelo sítio de ligação do
receptor (Abreu, 2008, apud Silverman, 1992).
Interessantemente, fármacos que interagem por ligações fracas são, por
vezes, mais seletivos do que aqueles que interagem por ligações de alta energia.
Isso acontece porque as ligações fracas exigem um encaixe mais preciso do
ligante no sítio de ligação do receptor (Silverman, 1992 apud Abreu, 2008).
24
1.4.3 – O receptor de adenosina A1 (RA-A1) e a modelagem por homologia
Até recentemente, não havia, na literatura, dados de cristalografia ou RMN
sobre a estrutura 3D dos receptores de adenosina. A relação estrutura/função só
era possível até então através da modelagem por homologia, utilizando métodos
computacionais para construir os modelos 3D (Ben et al., 2010). Entretanto, a
determinação de estruturas 3D de receptores são especialmente mais difíceis por
serem proteínas inseridas em membrana. A cristalização desse tipo de proteína é
difícil por causa da natureza anfipática da sua superfície e devido à baixa
concentração nos tecidos. Essas dificuldades, por vezes, inviabilizam os
experimentos de difração de raio-X e a determinação da estrutura por ressonância
magnética nuclear (RMN) (Sherbiny et al., 2009; Ben et al., 2010).
Inicialmente, para descrever as características estruturais dos receptores
de adenosina usando ferramentas computacionais, utilizavam-se aproximações
baseadas em proteínas e ligantes já conhecidos, comparando-os e sobrepondoos na tentativa de maximizar a predição das interações receptor-ligante (Ben et
al., 2010).
Em
1975,
Henderson
e
Unwin
relataram
a estrutura
cristal da
bacteriorodopsina (bacRho), uma bomba de prótons da Halobacterium salinarium
(H. halobium), que possui 7 domínios transmembranares formados por α-hélices e
origina a classificação da primeira família dos RAPG (Ben et al., 2010) (Figura
11). Assim, os primeiros modelos por homologia dos receptores de adenosina
foram baseados na bacRho, mesmo com a ausência de similaridade funcional e
baixa similaridade de sequência (Ben et al., 2010; Rivkers et al., 1999).
A construção do modelo do receptor de adenosina através da bacRho
ocorreu através da mutação dos aminoácidos para corresponder aos resíduos dos
receptores de adenosina, sendo a estrutura otimizada através da rotação das
hélices, de minimização de energia e de dinâmica molecular (Ben et al., 2010).
O primeiro modelo do receptor de adenosina A1 (canino) foi publicado por
Ijezerman et al em 1992, usando a bacRho como molde e revelando a
importância dos resíduos de His251 e His278 para afinidade dos ligantes (Ben et
al., 2010, apud IJzerman et al., 1992). O modelo canino foi utilizado para docking,
25
mas apresentava limitações devido à baixa similaridade com a bacRho (Ben et al.,
2010, apud IJzerman et al., 1992).
Figura 11 – Comparação das estruturas cristais da bacteriorodopsina (A), da
rodopsina bovina (B) e do receptor β2-adrenérgico (C) com resolução de 3,5
Ǻ,
2,40Ǻ e 2,20Ǻ, respectivamente. Os sete domínios transmembranares estão
demarcados pelas caixas revelando ainda a conformação mais aberta do receptor
β2-adrenérgico. As estruturas secundárias são mostradas em rosa
α ( -hélices),
azul (loops) e verde (folhas β-pregueadas).
A
primeira
evidência
da
estrutura
dos
RAPG
com
7
domínios
transmembranares surgiu em 1993, com o trabalho do grupo de Henderson, que
relatou um mapa de projeção eletrônica da rodopsina visual, uma cromoproteína
da retina, que atua via proteína G (Ben et al., 2010, apud, Henderson et al., 1975).
Estudos de mutagênese em 1994 mostraram a importância do resíduo 277,
uma treonina no RA-A1 de humanos, no reconhecimento e na interação com a
porção da ribose e da adenosina. Nesse mesmo ano, o RA-A2a foi construído
pelo mesmo método utilizado para o RA-A1 (Ben et al., 2010, apud IJzerman et
al.,1994).
Muitos modelos de receptor de adenosina foram publicados com base nas
características gerais da rodopsina (mapa de densidade eletrônica de baixa
26
resolução) e do modelo de RAPG da família da rodopsina proposto por Baldwin
(Ben et al., 2010).
Em 2000, foi publicado o cristal da rodopsina bovina (BRho) (código PDB =
1F88), que representou um marco para os estudos computacionais dos
receptores de adenosina, pois mostrou, de fato, a estrutura com 7 domínios
transmembranares dos receptores RAPG e forneceu um molde mais fiel para a
modelagem molecular comparativa dos receptores de adenosina (Figura 11)
(Martinelli e Tuccinardi, 2008; Ben et al., 2010).
A BRho apresenta características importantes, tais como, uma ligação
dissulfeto conservada na maioria dos RAPG, presença de loops intra e
extracelulares, além do domínio N-terminal (Ben et al., 2010). Depois do relato
sobre esta estrutura cristal, outros surgiram envolvendo difração de raio-X e RMN
e que foram utilizados para modelar os receptores de adenosina (RA).
Em comparação com a bacRho, a BRho possui maior identidade com a
sequência dos RA (14% contra 8% da bacRho), o que permitiria uma melhor
predição destes receptores. Os modelos de RA produzidos a partir da BRho
puderam ser utilizados para evidenciar o papel dos resíduos da segunda alça
extracelular na ligação de compostos, possibilitando estudos de docking e
desenho de fármacos (Ben et al., 2010).
Alguns modelos do RA-A1 foram construídos a partir do alinhamento da
BRho com outros subtipos de RA, construção dos domínios transmembranares a
partir da mutação dos resíduos e refinados com ferramentas de mecânica
molecular (Ben et al., 2010).
Em 2008 foram relatados as estruturas dos receptores β2-adrenérgico (β2A) humano e β1-adrenérgico de peru. Para a construção do receptorβ2 -A, foi
introduzido um segmento da lisozima T4 na região da terceira alça intracelular, o
que
facilitou
a
nucleação
do
cristal.
Esse
cristal
apresenta
hélices
transmembranares conservadas, confirmando uma região comum dos RAPG
classe A (Ben et al., 2010).
O receptor β2-A apresenta uma conformação mais aberta em relação à
BRho, em particular, na região extracelular do sítio de ligação dos ligantes (Figura
11). Outra diferença observada entre esses receptores é a presença de duas
27
ligações dissulfeto na segunda alça extracelular e um segmento
α
-hélice extra,
presente no receptor β2-A (Ben et al., 2010).
Em 2008 foi publicado finalmente o cristal do receptor de adenosina A2a,
que apresenta alta similaridade com os outros três subtipos (RA-A1, RA-A2b, RAA3). O alinhamento feito com as sequências primárias do receptor A2a (PDB =
3EML) e do RA-A1 mostrou um valor de identidade igual a 48% (Figura 12).
RA-A2a DYKDDDDAMGQPVGAPPIMGSSVYITVELAIAVLAILGNVLVCWAVWLNSNLQNVTNYFV 60
RA-A1 --------MPPSISAF----QAAYIGIEVLIALVSVPGNVLVIWAVKVNQALRDATFCFI 48
* .:.*
.:.** :*: **:::: ***** *** :*. *::.* *:
RA-A2a VSLAAADIAVGVLAIPFAITISTGFCAACHGCLFIACFVLVLTQSSIFSLLAIAIDRYIA120
RA-A1 VSLAVADVAVGALVIPLAILINIGPQTYFHTCLMVACPVLILTQSSILALLAIAVDRYLR108
****.**:***.*.**:** *. * : * **::** **:******::*****:***:
RA-A2a IRIPLRYNGLVTGTRAKGIIAICWVLSFAIGLTPMLGWNNCGQPKEGKNHSQGCGEGQVA180
RA-A1 VKIPLRYKMVVTPRRAAVAIAGCWILSFVVGLTPMFGWNNLSAVERAWAANGSMGEPVIK168
::*****: :** **
** **:***.:*****:**** . :..
. . ** :
RA-A2a CLFEDVVPMNYMVYFNFFACVLVPLLLMLGVYLRIFLAARRQLNIFEMLRIDEGLRLKIY240
RA-A1 CEFEKVISMEYMVYFNFFVWVLPPLLLMVLIYLEVFYLIRKQLN----------------212
* **.*:.*:********. ** *****: :**.:*
*:***
RA-A2a KDTEGYYTIGIGHLLTKSPSLNAAKSELDKAIGRNTNGVITKDEAEKLFNQDVDAAVRG 300
RA-A1 ------------------KKVSASSGDPQKYYG---------------------------227
.:.*:..: :* *
RA-A2a LRNAKLKPVYDSLDAVRRAALINMVFQMGETGVAGFTNSLRMLQQKRWDEAAVNLAKSRW360
RA-A1 -----------------------------------------------------------RA-A2a YNQTPNRAKRVITTFRTGTWDAYRSTLQKEVHAAKSLAIIVGLFALCWLPLHIINCFTFF420
RA-A1 ----------------------------KELKIAKSLALILFLFALSWLPLHILNCITLF 259
**:: *****:*: ****.******:**:*:*
RA-A2a CPDCSHAPLWLMYLAIVLSHTNSVVNPFIYAYRIREFRQTFRKIIRSHVLRQQEPFKA--478
RA-A1 CPSC-HKPSILTYIAIFLTHGNSAMNPIVYAFRIQKFRVTFLKIWNDHFRCQPAPPIDED318
**.* * * * *:**.*:* **.:**::**:**::** ** ** ..*. * *
RA-A2a -------A1
LPEERPDD 326
Figura 12 - Alinhamento das sequências primárias dos receptores de adenosina
RA-A1 e RA-A2a (PDB = 3EML) feito no programa ClustalW. Os resíduos de
aminoácidos estão marcados: idênticos com (*), similares com (:) e análogos com
(.).
28
A estrutura do RA-A2a confirma parcialmente as características mostradas
pelos cristais do receptor β2-A, com
uma conformação mais aberta ao nível
extracelular e a segunda alça extracelular voltada para o meio extracelular (Ben et
al., 2010), Além disso, o RA-A2a apresenta três ligações dissulfeto.
Para a construção de modelos de RA-A1 baseados na estrutura cristal
disponível de RA-A2a, algumas características precisam ser consideradas,
incluindo a presença dos resíduos Cys80, Cys169 e Cys269, Cys263 no RA-A1,
alinhados de forma a sugerir a presença de apenas duas ligações dissulfeto,
diferente do A2a, que apresenta três destas ligações. A conformação do RA-A2a
também é importante, visto que esse RA foi co-cristalizado com o antagonista
ZM241385 e com moléculas de água, fornecendo uma rede de ligações de
hidrogênio que mantém o complexo receptor-ZM241385 (Ben et al., 2010; Jaakola
et al., 2008). Segundo Ben e colaboradores, estudos de redocking realizados com
o cristal do RA-A2a ou modelos baseados no A2a não mostram resultados
similares quanto às interações (receptor-ZM2413185), devido à ausência das
moléculas de água (Ben et al., 2010).
O fato de não existirem modelos do RA-A1 disponíveis em banco de dados
gera uma dificuldade nos estudos in silico para o desenho de novos fármacos
ligantes deste RA. Devido a sua grande importância no SNC, a modelagem por
homologia torna-se uma ferramenta importante para a realização de estudos
estruturais, de relação estrutura-atividade e de interações com ligantes com esse
receptor que permitam uma maior compreensão da atividade deste receptor.
29
2 – Objetivos
2.1 – Objetivo geral
Analisar e comparar estruturalmente os receptores de adenosina A1 e A2a
in silico, incluindo suas interações com ligantes através da construção de
diferentes modelos, a fim de contribuir para a compreensão de suas estruturas e
para o desenvolvimento de novos ligantes mais potentes e seletivos.
2.1 – Objetivos específicos
- Analisar a estrutura tridimensional do receptor de adenosina RA-A1 a
partir da construção e comparação de modelos por homologia, utilizando como
moldes as estruturas cristais do receptor de adenosina A2a (RA-A2a), da
bacteriorodopsina (bacRho), da rodopsina bovina (BRho) e do receptor β2adrenérgico (β2-A).
- Comparar os modelos de RA-A1 com seus moldes e com o receptor
cristalizado de A2a, considerando sua conformação e distribuição de carga,
através do cálculo do valor quadrático médio (Root Mean Square – RMS) e do
mapa de potencial eletrostático respectivamente.
- Analisar as interações do modelo do receptor de adenosina A1 construído
a partir do cristal do RA-A2a com o agonista (adenosina) e com o antagonista
(ZM241385) através dos estudos de docking, identificando os resíduos envolvidos
na interação ligante-receptor e comparando-os com aqueles observados no molde
(RA-A2a).
30
3 - Material e métodos
3.1 – Construção dos modelos por homologia
A construção dos modelos por homologia do receptor de adenosina A1
(RA-A1) iniciou-se com a seleção de proteínas moldes (templates), baseada na
similaridade da sequência primária e/ou da funcionalidade. As sequências FASTA
foram obtidas do servidor Swiss Prot (http://swissmodel.expasy.org/) e os códigos
utilizados foram P02945 (bacRho), P02699 (BRho), P07550 (β2-A), P30542 (RAA1) e P29274 (RA-A2a). Após essa avaliação, foi feita uma busca no banco de
dados de estruturas de proteínas PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) (Altschul et al.,
1990), sendo selecionadas as estruturas cristalográficas da bacteriorodopsina
(PDB = 1BRD), da rodopsina bovina (PDB = BRho), do receptor β2-A (PDB =
BRho) e do receptor de adenosina A2a (PDB = 3EML).
Na análise das estruturas selecionadas, o cristal do RA-A2a não
apresentava alguns resíduos pertencentes à segunda alça extracelular, o que foi
completado por homologia, antes da utilização como molde. Após a análise prévia
e inclusão dos aminoácidos, o receptor foi validado utilizando os programas
Prochek e Verify 3D e o alinhamento das estruturas (original e completa) e o
cálculo do RMS foram realizados. Os resultados da validação foram bons,
permitindo que a estrutura do receptor completo pudesse ser utilizada como
molde para o RA-A1 (Figura 13).
Os modelos de RA-A1 foram construídos utilizando os moldes no programa
MODELLER 9.9 (Sali et al., 2011), onde a energia da estrutura é minimizada no
mesmo ambiente. Após a construção, utilizando as estruturas cristais do RA-A2a,
bacRho, BRho e β2-A, os modelos foram validados pela análise do gráfico de
Ramachandran e pela análise do score 3D-1D, usando os programas Procheck e
Verify-3D, respectivamente, ambos disponíveis no servidor NIH MBI Laboratory
for Structural Genomics and Proteomics (http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/).
31
Estrutura do
RA-A2a
Resíduos nas regiões da molécula(%)
Favoráveis Permitidas
Desfavoráveis
Original (PDB = 3EML)
92,6
7,4
0
Completo
93,1
6,9
0
RMS
(Ǻ)
0,08
Figura 13 – Comparação das estruturas original/cristal (verde) e completa
(vermelho) do receptor de adenosina RA-A2a quanto a proporção (%)
aminoácidos em regiões favoráveis, permitidas e desfavoráveis (acima) e
utilizando o gráfico de análise do Verify3D (abaixo).
3.2 – Docking das estruturas dos receptores com os ligantes e análise das
interações
As estruturas tridimensionais dos ligantes (agonista - adenosina e
antagonista
-
ZM241583)
foram
construídas
no
programa
Spartan’08
(Wavefunction Inc. Irvine, CA, 2000) e submetidas à análise conformacional
sistemática, utilizando as opções padrões e o campo de força MMFF disponível
no programa Spartan. As estruturas escolhidas para o docking foram aquelas que
apresentaram a conformação de menor energia.
O Molegro Virtual Docker (MVD) foi o programa utilizado para o docking,
sendo necessário testá-lo antes de iniciar o encaixe dos ligantes nos modelos.
Para isso, realizamos o redocking (re-encaixe) do ZM241385 ao receptor A2a
completo, sendo as interações observadas comparadas às da estrutura cristal
original (PDB = 3EML). As interações apresentadas entre o ligante e a estrutura
32
completa do RA-A2a foram semelhantes àquelas da estrutura cristal, indicando
que o programa MDV poderia ser utilizado para moléculas em questão.
Os complexos formados pelo ligante e as estruturas dos receptores de
adenosina (modelos do receptor A1 e cristal do receptor A2a) foram construídos
usando docking automático no programa Molegro Virtual Docker 4.3.0 (Molegro
Bioinformatics Solution, 2011), considerando as estruturas dos receptores rígidas
e dos ligantes flexíveis.
Para analisar as interações entre os ligantes e os receptores foi feito um
corte de 6Ǻ a partir das pontas dos ligantes. Os programas Swiss -PdbViewer
v.4.0.1
(Guex
et
al.,
2008)
e
PDBsum
(http://www.ebi.ac.uk/thornton-
srv/databases/pdbsum/) foram utilizados para analise dos resíduos em contato e
os tipos de interações.
3.3– Cálculo de valor quadrático médio (Root Mean Square – RMS)
Após a minimização de energia, os modelos foram sobrepostos e alinhados,
usando apenas os carbonos α (Cα) da estrutura referente a cadeia protéica
principal, sendo o valor de RMS calculado utilizando o programa SwissPdbViewer v.4.0.1 (Guex et al., 2008). Os modelos e seus respectivos moldes
também foram sobrepostos e alinhados para calcular o valor do RMS.
3.4- Mapa de potencial eletrostático (MPE)
Para comparar as estruturas minimizadas dos modelos e moldes quanto à
distribuição das cargas, o MPE foi determinado usando-se o programa Swiss-Pdb
Viewer v.4.0.1. Para isso, utilizou-se o método computacional de Coulomb,
considerando somente resíduos carregados e a constante dielétrica do solvente
(80.000), valor padrão do programa. Nos mapas, as regiões carregadas
negativamente, positivamente ou neutras foram representadas respectivamente
pelas cores vermelha, azul e branca.
Além do MPE dos modelos e dos moldes, os ligantes utilizados no docking
também tiveram sua distribuição de cargas analisadas no programa Spartan’08,
33
usando o campo de força MMFF (Molecular Mechanics Force Field, Campo de
Força de Mecânica Molecular).
34
4 – Resultados
4.1 – Alinhamento de sequências, construção e análise dos modelos do
receptor de adenosina A1 (RA-A1)
Para a análise da estrutura primária do RA-A1 e dos moldes, foi feito um
alinhamento múltiplo das sequências primarias dessas estruturas 3D, utilizando o
programa ClustalW. Esse alinhamento resultou nos valores de identidade que
revelam uma similaridade sequencial em que o melhor molde para a modelagem
do RA-A1 seria a estrutura cristal do RA-A2a (Tabela 5 e Figura 14).
Tabela 5 - Comparação dos valores percentuais de identidade resultantes do
alinhamento múltiplo das sequências primárias entre o receptor de adenosina A1
(RA-A1) e os moldes utilizados, incluindo as estruturas cristais da bacRho, da
BRho, do receptor β2-A e do RA-A2a.
Molde (código PDB)
Identidade com RA-A1(%)*
bacRho (1BRD)
8
BRho (BRho)
14
β2 – A (BRho)
24
RA-A2a (3EML)
48
*
Valores obtidos a partir do alinhamento múltiplo das sequências FASTA dos cristais com a sequência
FASTA do RA-A1.
O alinhamento das sequências primárias do RA-A1 com o RA-A2a, a
bacteriorodopsina, a rodopsina bovina e o receptor β2-A revelou uma variação
entre 8 e 48% de identidade (Tabela 5).
Ao observarmos o resultado do alinhamento, podemos perceber que
alguns resíduos são altamente conservados em todas as sequências, como
descritos na literatura, com destaque para a cisteína, cuja importância envolve a
formação de ligações dissulfeto intracadeia, que estabiliza a estrutura dessas
proteínas.
35
36
Os modelos do receptor de adenosina A1 foram construídos a partir de
cristais selecionados a partir do banco de dados de proteínas (Protein Data Bank,
PDB) como descrito na seção de material e métodos.
As estruturas cristais do receptor A2a (PDB = 3EML), da bacteriorodopsina
(PDB = 1BRD), da rodopsina bovina (PDB = BRho) e do receptor β2-adrenérgico
(PDB = 1RH1) foram escolhidas tendo em vista que possuem algum nível de
similaridade com o receptor de adenosina e/ou que já foram relatadas como
moldes para construção de modelos, o que permite a comparação estrutural e
análise dos moldes e modelos gerados.
Depois de construídos, os modelos foram validados pela análise do gráfico
de Ramachandran, usando o programa Procheck (Laskowski et al., 1993) (Tabela
6).
Tabela 6 – Distribuição dos resíduos de aminoácidos observados no gráfico de
Ramachandran para os modelos do receptor de adenosina A1 (RA-A1) e para os
moldes utilizados (RA-A2a, bacRho, BRho e β2-A).
Resíduos (%)
Estruturas
Moldes
Modelos
RA-A2a
Regiões
favoráveis
92,8
Regiões
permitidas
7,2
Regiões
desfavoráveis
0
bacRho
96,6
3,4
0
BRho
79,2
19,6
1,2
β2-A
94,6
5,3
0
RA-A1 (RA-A2a)
94,9
5,2
0
RA-A1 (bacRho)
92,1
7,8
0
RA-A1(BRho)
89,3
10,4
0,3
RA-A1 (β2-A)
93,2
6,8
0
A análise dos valores obtidos demonstra que os modelos apresentam uma
boa estereoquímica, uma vez que cerca de 89,3 – 94,9% dos resíduos adotam
ângulos de torção ψ e φ semelhantes aos moldes. Dentre os modelos construídos,
37
aquele que utilizou a rodopsina bovina como molde apresentou apenas um
resíduo, na região desfavorável (0,3%) e que não faz parte do sítio de ligação do
agonista, o que provavelmente não deve comprometer a análise da interação com
o ligante.
Além do gráfico de Ramachandran, o programa Verify 3D também foi
utilizado para validação dos modelos (Figura 15). O programa Verify 3D avalia a
compatibilidade entre a estrutura tridimensional de uma proteína e a sua própria
sequência de aminoácidos, além de estabelecer um score total relacionado à
qualidade do modelo (Lüthy et al., 1992). Os valores apresentados pelos modelos
do RA-A1 foram maiores que zero e semelhantes aos obtidos para os moldes em
sua maioria, com exceção do modelo baseado na bacteriorodopsina, que
apresentou uma diferença maior de scores negativos (Figura 15). Contudo, os
resíduos envolvidos não são descritos como importantes para a interação
receptor-ligante.
De forma interessante, alguns modelos apresentaram valores ainda
maiores que o próprio molde utilizado (Figura 15). A análise do score dos
resíduos individualmente mostra valores apropriados para todos os modelos.
A análise da estrutura tridimensional dos modelos incluindo suas estruturas
secundárias mostra uma conservação das sete alças transmembranares em
todos os model. Contudo, essas alças no modelo da bacteriorodopsina são mais
curtas que as dos outros modelos (Figura 16).
De forma interessante, para nenhum dos modelos foi gerado uma região
enovelada do C-terminal, apesar de presente nos receptores de adenosina A2a e
β2-adrenérgico (Figura 16). O alinhamento estrutural dos modelos mostrou um
desvio de RMS pequeno que variou entre 1,28Ǻ, e confirmando
2,11
a
conservação estrutural (Tabela 7).
A distribuição de cargas na estrutura tridimensional dos modelos foi
avaliada através da análise dos mapas de potencial eletrostático. O perfil de
distribuição de cargas foi semelhante entre os diferentes modelos construídos
para
RA-A1,
com
uma
maior
distribuição
de
cargas
positivas
(azul),
caracterizando um perfil mais básico (Figura 17).
38
39
Figura 16 - Comparação das estruturas tridimensionais dos modelos do receptor
de adenosina A1 baseados nas estruturas cristais do receptor de adenosina A2a
(RA-A2a), da bacteriorodopsina (bacRho), da rodopsina bovina (BRho) e do
receptor β2-adrenérgico (β2-A). As estruturas secundárias dos moldes e dos seus
respectivos modelos estão mostradas em rosaα ( -hélices), azul (alças) e verde
(folhas β-pregueadas).
40
41
Tabela 7 – Comparação dos valores de RMS (Ǻ) resultantes do alinhamento dos
modelos de RA-A1 utilizando como molde o receptor de adenosina A2a (RA-A2a),
a bacteriorodopsina (bacRho), a rodopsina bovina (BRho) e o receptor β2adrenérgico (β2-A).
Modelos
Estruturas
RA-A2a
RA-A1 RA-A1
(A2a) (bacRho)
0,30
---
RA-A1
(BRho)
1,53
Moldes
RA-A1
RA-A2a bacRho BRho
(β2-A)
1,32
0,0
1,87
1,71
β2-A
0,79
bacRho
1,84
---
1,84
1,84
1,87
0,0
2,13
1,15
BRho
1,64
---
0,78
1,61
1,71
2,13
0,0
1,62
β2-A
1,33
---
1,58
0,78
0,79
1,15
1,62
0
RA-A1 (A2a)
0,0
2,02
1,56
1,28
0,30
1,84
1,64
1,33
Modelos RA-A1 (bacRho)
2,02
0,0
2,11
2,10
---
---
---
---
de RA-A1 RA-A1 (BRho)
1,56
2,11
0,0
1,60
1,53
1,84
0,78
1,58
RA-A1 (β2-A)
1,28
2,10
1,60
0,0
1,32
1,84
1,61
0,78
Moldes
Os modelos baseados no RA-A2a e no receptor β2-A apresentam
distribuição de cargas semelhantes aos moldes, em contraste como os modelos
baseados na bacteriorodopsina e na rodopsina bovina. Na maioria dos modelos, a
região próxima ao sítio de ligação apresenta uma grande quantidade de cargas
positivas e neutras, favorecendo possíveis interações eletrostáticas e ligações de
hidrogênio, bem como interações hidrofóbicas entre resíduos neutros e apolares.
Um ponto interessante a ressaltar é o fato de que a região do sítio de
ligação, no modelo baseado na bacRho, apresenta apenas cargas positivas,
diferente dos outros modelos que apresentam cargas positivas, negativas e
resíduos neutros (Figura 17).
42
4.2 – Docking e análise das interações dos complexos formados pelos
modelos do receptor de adenosina A1 (RA-A1)
4.2.1 – Construção dos ligantes do tipo agonista (adenosina) e antagonista
(ZM241384)
Para realizar os estudos de docking foram escolhidos os ligantes
adenosina como agonista e o ZM241385 como antagonista (Figura 18).
B
A
Figura 18 – Mapa de potencial eletrostático da conformação mais estável dos
ligantes adenosina (A) e ZM241385 (B), com rotação de 0º a 270º. As cargas
positivas estão em azul, enquanto que as negativas estão em vermelho.
Esses
ligantes
foram
construídos
e
submetidos
a
uma
análise
conformacional para obtenção da conformação de menor energia, como descrito
na seção de material e métodos. A análise do mapa de potencial eletrostático dos
ligantes mostra uma distribuição de cargas que aponta diferentes regiões
carregadas passíveis de interações com os receptores (Figura 18).
43
4.2.2 - Docking e análise das interações entre a adenosina e os modelos do
receptor de adenosina A1 (RA-A1)
Os modelos do RA-A1 recém construídos foram utilizados para a
realização do docking da adenosina (agonista endógeno). Um corte de 6Ǻ a partir
da adenosina foi realizado para análise das estruturas sendo possível observar
em todos os modelos, resíduos interagindo com o ligante em uma rede de
interações (Tabela 8 e Figura 19). Entretanto, os resíduos considerados
importantes em estudos de mutagênese para a interação receptor-ligante não
foram encontrados no modelo construído com base na bacRho (Tabela 8).
Tabela 8 – Resíduos dos modelos de receptor de adenosina A1 que realizam
interações com a adenosina no compexo receptor-ligante. No corte de 6Ǻ, foram
identificados resíduos descritos pela literatura como importantes para a interação
receptor-agonista (em itálico) (Ben et al., 2010; Giordanetto et al.,2003; Olah e
Stiles, 2000, Rivkees et al., 1999) e resíduos que foram identificados em pelo
menos dois modelos.
Resíduos de aminoácidos dos modelos RA-A1 baseados em
Interação
A2a
bacRho
Ligação de
hidrogênio
Val62, Ile69,
Val83,Phe171
Hidrofóbica
Leu65, Ala66 Trp146, Pro191,
Ala84, Glu170 Pro192, Leu195,
Phe241, Phe243
Ile274, His278
van der
Waals
Tyr12, Glu16,
Leu61, Ile67,
Leu68, Asn70,
Ile71, Gly72,
Pro73, Met82,
Cys85, Pro86,
Val87,Cys169,
Glu170,Glu172
Thr270,Tyr271
Thr277
Thr75, Tyr76
His78, Thr79,
Ile128, Ala129,
Glu130, Met143,
Trp188, Val 189,
Leu190, Leu193,
Leu194, Met196,
Phe242, Leu245,
Thr257, Pro261,
Lys265
BRho
β2-A
Cys80, Val83
Val152
Ile69, Asn70,
Gln74
Ala60, Pro64
Ala84, Cys85
Val87, Arg154
Trp156, Ala158,
Ile274,Phe275,
His278,
Ala66, Gly72
Thr79, Met82
Ile274, His278
Gln9, Ile67,
Thr79, Leu81,
Leu61, Val62,
Met82, Val83,
Ile63, Ile67,
Pro86, Leu88,
Leu68, His78,
Leu149, Ser150, Leu81, Val83,
Ala151, Glu153, Ala84, Cys85,
Arg154, Ala155, Pro86, Val87,
Ala157, Asn159, Thr270, Phe275
Thr270, Tyr271
44
B
A
A
Phe275
His 278
Glu16
His 278
a
Ile274
a
Ile274
Thr277
Leu65
a
Val87
a
Val87
Pro86
Cys169
Ile69
Pro86
Cys85
Cys80
Cys85
Leu88
Cys169
Leu65
C
Ile69
Cys85
Pro86
His 278
a
Val87
Figura 19 – Corte de 6Ǻ da região de ligação do agonista adenosina nos modelos
dos receptores de adenosina do tipo A1, que mostra os resíduos considerados
importantes por estudos de mutagênese e que só foram identificados nos
modelos de RA-A1 baseado no receptor de adenosina do tipo A2a (A), na
rodopsina bovina (B) e no receptor β2-adrenérgico (C). Os resíduos que
interagem com a adenosina segundo Terán et al., 2004 e Giordanetto et al., 2003
estão coloridos em lilás. Os resíduos ácidos estão em vermelho, os básicos em
azul, os polares em verdes e os apolares em amarelo. Na adenosina, em
vermelho, o oxigênio; em azul escuro, o nitrogênio; em branco, o carbono; e em
azul claro, o hidrogênio.
a
Resíduos encontrados interagindo com a adenosina nos trabalho de Terán et al., 2004, Giordanetto et al.,
2003 e Yuzlenco e Kiec-Kononowicz, 2007.
45
O modelo baseado na bacteriorodopsina apresenta um tamanho menor das
α-hélices, o que imputou ao ligante um local de ligação com uma profundidade
maior no receptor, diferente dos demais modelos. A conformação das alças e a
distribuição de cargas, que não apresentou o mesmo padrão, quando comparada
aos outros modelos, também pode influenciar as interações.
O alinhamento estrutural dos modelos RA-A1 baseados na estrutura cristal
do RA-A2a, da BRho e do receptor β2-A revelou resíduos comuns presentes na
região do corte de 6Ǻ (Figura 20 e Tabela 8). Com esse alinhamento podemos
observar que nove resíduos de aminoácidos estão presentes em todos os
modelos em questão, incluindo Ile67, Ala84, Cys85, Pro86, Val87, Ile174 e
His278. Observando a Figura 20, notamos ainda que os resíduos Val83, Ala84,
Cys85 e Ile67 dos modelos não se alinham de forma idêntica, indicando
diferenças na conformação da estrutura 3D desses modelos.
4.2.3 - Docking e análise das interações entre a adenosina e a estrutura
cristal do RA-A2a e comparação com o modelo do RA-A1 baseado no RAA2a
O docking do agonista com a estrutura cristal do RA-A2a também foi
realizado e a análise das interações em um corte de Ǻ6 a partir da adenosina
mostrou também alguns aminoácidos considerados importantes em estudos de
mutagênese para a interação receptor-ligante (Figura 21).
Ao comparar os resíduos encontrados no corte Ǻ
de dos
6 complexos
ligante-receptor formado pela adenosina e pelas estruturas cristais do RA-A2a e
do modelo RA-A1 (RA-A2a), podemos perceber que a maioria dos aminoácidos
encontrados são apolares, o que favorece as interações hidrofóbicas entre o
receptor e o ligante (Figura 21 e 22).
O alinhamento estrutural dos complexos formados pela adenosina e pelo
modelo do RA-A1 (RA-A2a) ou pela estrutura cristal do RA-A2a foi realizado para
verificar a presença de resíduos idênticos (Figura 23). Na análise do corte de 6Ǻ a
partir da adenosina do complexo ligante-receptor, foram encontrados resíduos de
aminoácidos idênticos, similares e distintos (Figura 23).
.
46
Ile67
Ile67
Val83
Ile67
Val83
Ala84
Met82
Val83
Ile274
Ala84
Ala84
Cys85
His278
Val87
Cys85
Pro86
Figura 20 – Alinhamento das estruturas 3D dos modelos do RA-A1 baseado nas
estruturas cristais do RA-A2a (verde claro), da rodopsina bovina (vermelho) e do
receptor de β2-adrenérgico (amarelo), mostrando os resíduos que aparecem em
todos os modelos no corte deǺ6 a partir da adenosina, incluindo os resíduos
Ile67, Met82, Val83, Ala84, Cys85, Pro86, Val87, Ile274 e His278. As estruturas
secundárias estão mostradas em rosa (α-helice), verde escuro (β-pregueada) e
azul (alças).
47
Interações
Resíduos de
aminoácidos
Ligação de
hidrogênio
Ile66, Phe168,
Asn253 e Tyr271
Interação
hidrofóbica
Ser67, Leu167, Glu169, Leu
249, Met270, Ile274
van der
Waals
Ala63, Thr65, Thr68, Gly69,
Ala81, Val84, Cys166, Leu167,
Met174, Met177, Ile252,
His264, Leu267, Ser 277
a
Ile274
a
Glu169
a
Val84
a
Asn253
Figura 21 – Análise da região de ligação do agonista na estrutura cristal do RAA2a. (Esquerda) Resíduos considerados importantes por estudos de mutagênese
para a interação receptor-ligante do RA-A2a. Todos os resíduos interagem com o
antagonista ZM segundo Jaakola et al., 2008. O resíduo ácido está em vermelho,
o polar em verde e o apolar em amarelo. Na adenosina, o oxigênio está em
vermelho,; em azul escuro, o nitrogênio; em branco, o carbono; e em azul claro, o
hidrogênio. (Direita) Tabela de resíduos do RA-A2a que realizam interação com a
adenosina. Em negrito, estão os resíduos presentes na lista de aminoácidos
descritos como importantes para a interação receptor-agonista (Ben et al., 2010;
Giordanetto et al.,2003; Olah e Stiles, 2000, Rivkees et al., 1999).
a
Resíduos encontrados interagindo com um agonista seletivo 2-(3-[1-(pyridin-2-yl)piperidin-4-yl]ureido)ethyl6-N-(2,2-diphenylethyl)-5-N-ethylcarboxamidoadenosine-2-carboxamide (UK-432097) do RA-A2a no trabalho
Xu et al., 2011.
48
Figura 22– Comparação dos resíduos presentes no sitio de ligação em um corte de 6Ǻ a partir do ligante (adenosina) nos
complexos envolvendo o modelo do RA-A1 baseado no RA-A2a (esquerda) e a estrutura cristal do RA-A2a (direita). Em
vermelho, resíduos ácidos; verdes, os polares em e os apolares em amarelos. Adenosina está colorida por átomos:
oxigênio (vermelho), nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro) e carbono (branco).
49
Glu169
Glu172
Leu167
Glu170
Phe168
Phe171
Cys166
Cys169
Gly69
Glu72
Ile66
Ile69
Adenosina
Met270
Thr270
Thr68
Ile71
Val84
Val87
Tyr271
Tyr271
Ser277
Thr277
Thr65
Leu68
Ser67
Asn70
Ile274
Ile274
Receptores
Resíduos
Idênticos
RA-A2a
RA-A1 (A2a)
Tyr271, Ile274, Ala63, Ile66, Tyr271, Ile274, Ala66, Ile69,
Ala84, Val87, Phe171,
Ala81, Val84, Phe168,
Glu172, Cys169
Glu169, Cys166
Similares
Ser67, Ser277
Asn70, Thr277
Distintos
Thr65, Thr68, Gly69,
Leu167, Met270
Leu68, Ile71, Glu72, Glu170,
Thr270
Figura 23 – Comparação dos complexos ligante-receptor formados pela
adenosina e pelo modelo do RA-A1 (RA-A2a) (rosa) ou pela estrutura cristal do
RA-A2a (verde) observados em um corte deǺ 6a partir da adenosina em um
alinhamento estrutural. A parte superior da figura mostra a localização dos
resíduos de aminoácidos idênticos, similares e distintos citados na parte inferior.
Adenosina está colorida de acordo com os átomos: oxigênio (vermelho),
nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro) e carbono (branco).
50
4.2.4 - Docking e análise das interações entre o antagonista ZM241385 e o
modelo do RA-A1 baseado na estrutura cristal do RA-A2a e comparação
com o complexo antagonista - molde
O composto ZM241385 é um antagonista do receptor de adenosina A2a,
sendo escolhido para a análise porque foi cristalizado junto com a estrutura do
RA-A2a, o que facilita o estudo comparativo das interações receptor-ligante entre
RA-A2a e RA-A1 e porque apresenta diferença de afinidade entre os receptores
RA-A2a e o RA-A1 (Jaakola et al., 2008). Este antagonista apresenta afinidade
maior pelo RA-A2a (Ki = 1 nM) do que pelo RA-A1 (Ki = 255 nM) o que poderia
gerar uma diferença estrutural detectável (Ongini et al., 1999).
A análise dos complexos e das interações entre o ligante ZM241385 e o
modelo RA-A1 (RA-A2a) ou a estrutura cristal do RA-A2a foi realizada. Em um
corte de Ǻ
6 a partir do antagonista foram encontrados alguns resíduos de
aminoácidos considerados importantes para a interação receptor-ligante por
estudos de mutagênese (Figura 24) (Ben et al., 2010; Giordanetto et al.,2003;
Olah e Stiles, 2000, Rivkees et al., 1999). Além disso, podemos observar nesse
corte que há predominância de resíduos apolares (Figura 24), com o resíduo
Ile274 dos dois receptores envolvido com o ligante.
Observando a figura 25, podemos perceber que, em um corte deǺ 6a
partir do ZM241385, foram encontrados aminoácidos idênticos, similares e
distintos compondo a região das estruturas do modelo do RA-A1 (RA-A2a) e da
estrutura cristal do RA-A2a.
Na comparação das interações dos ligantes (agonista - adenosina e
antagonista - ZM241385), percebe-se que alguns resíduos se repetem na
interação do agonista e do antagonista: a) idênticos – ILe66/Ile69, Ala81/Ala84,
Val84/Val87, Cys166/Cys169, Phe168/Phe171, Glu169/Glu172, Tyr271/Tyr271 e
Ile274/Ile274; b) similar – Ser67/Asn70 e c) distintos – Leu167/Glu170 e
Met270/Thr270.
51
52
Tyr271
Tyr271
Ile274
Ile274
Val84
Val87
Met270
Thr270
Leu267
Ser267
Ser67
Asn70
His264
His264
Phe168
Phe171
Glu169
Glu172
Ala81
Ala84
Ile66
Ile69
Cys166
Cys169
Leu167
Glu170
Receptores
Resíduos
RA-A2a
RA-A1 (A2a)
Ile66, Ala81, Val84, Cys166, Ile69, Ala84, Val87, Cys169,
Idênticos
Phe168, Glu169, His264,
Phe171, Glu172, His264,
Tyr271, Ile274
Tyr271, Ile274
Similar
Ser67
Asn70
Distintos
Leu167, Leu267, Met270
Glu170, Ser267, Thr270
Figura 25 – Comparação dos complexos ligante-receptor formados antagonista
ZM241385 e pelo modelo do RA-A1 (RA-A2a) (rosa) ou pela estrutura cristal do
RA-A2a (verde) observados em um corte deǺ6a partir da ZM241385 em um
alinhamento estrutural. A parte superior da figura mostra a localização dos
resíduos de aminoácidos idênticos, similares e distintos citados na parte inferior.
O ZM241385 está colorido de acordo com os átomos: oxigênio (vermelho),
nitrogênio (azul escuro), hidrogênio (azul claro) e carbono (branco).
53
5 – Discussão
O receptor de adenosina A1 (RA-A1) desempenha diversas funções no
sistema nervoso central (SNC), estando relacionado a quadros clínicos, tais
como, epilepsia e desordens cognitivas (Jacobson e Gao, 2006; Fredholm, 2010).
Dentre os subtipos do receptor de adenosina, o subtipo A1 (RA-A1) é o que
apresenta a maior afinidade pelo agonista endógeno, a adenosina (Clementina e
Giuseppe, 2010; Jacobson, 2009; Ciruela et al., 2006; Dunwiddie e Masino, 2001).
Devido ao grande número de funções mediadas pela adenosina, os
receptores de adenosina se tornaram importantes alvos para o tratamento de
doenças. Entretanto, a ampla distribuição desses receptores nos diferentes tipos
celulares, a existência de quatro subtipos e a variabilidade de respostas
fisiológicas requer agonistas e antagonistas que apresentem um grau de
seletividade significativo (Poulsen e Quinn, 1998).
O desenvolvimento de novos fármacos ainda apresenta um alto custo e
requer um tempo considerável. Dessa forma, a utilização de métodos
computacionais para o processo de reconhecimento molecular receptor-ligante
passou a ser uma área de interesse, pois pode proporcionar uma redução no
tempo e no custo da produção de novos fármacos (Morgon e Coutinho, 2007;
Huguenin, 2009).
Existem vários métodos computacionais capazes de predizer estruturas
tridimensionais, desde aqueles que prevêem estruturas protéicas sem utilizar
bases estruturais experimentalmente determinadas (ab initio), quanto àquelas que
utilizam informações experimentais de estruturas já determinadas (modelagem
comparativa). Como as estruturas 3D das proteínas são mais conservadas do que
as suas sequências, a estrutura conhecida experimentalmente de uma proteína
pode ser usada como molde para gerar um modelo para outras proteínas da
mesma família (Hillisch et al., 2004; Nayeem et al., 2006).
A modelagem comparativa ou por homologia tem se mostrado como um
método capaz de construir modelos 3D de forma confiável, que podem ser
54
posteriormente utilizados, por exemplo, para desenhar fármacos (Koop e
Schwede, 2005).
Neste trabalho, foram construídos quatro modelos do receptor de
adenosina do tipo A1 (RA-A1), utilizando diferentes moldes estruturais definidos
experimentalmente, incluindo as estruturas cristais do receptor de adenosina do
tipo A2a (RA-A2a), da bacteriorodopsina (bacRho), da rodopsina bovina (BRho) e
do receptor de β2-adrenérgico (β2 -A) visando a comparação dos seus padrões
estruturais e seu comportamento frente a ligantes.
Assim, após a construção dos modelos, esses foram utilizados em um
estudo de docking, no qual foram usados os ligantes adenosina (agonista) e
ZM241385 (antagonista). Os mesmos ligantes foram utilizados para a realização
do docking com a estrutura cristal do receptor de adenosina A2a (RA-A2a), a fim
de comparar as interações entre os ligantes e os diferentes receptores.
5.1 – Construção e análise dos modelos do receptor de adenosina A1
Os modelos do receptor de adenosina A1 (RA-A1) foram construídos a
partir das estruturas cristais do receptor A2a, da bacteriorodopsina, da rodopsina
bovina e do receptor β2-adrenérgico.
A bacteriorodopsina foi utilizada para a construção do modelo, apesar da
baixa identidade (bacRho = 8%), pois é descrita na literatura como a primeira
estrutura cristal a ser utilizada com molde dos receptores de adenosina. As
estruturas cristais da rodopsina bovina e do receptor β2-adrenérgico também
apresentaram uma baixa identidade com o RA-A1 (BRho = 14% e β2-A = 24%),
mas foram utilizados para permitir a comparação das estruturas geradas. A
estrutura tridimensional do receptor de adenosina A2a também foi utilizada, sendo
considerada um bom molde, tendo em vista que apresenta 49% de identidade
sequencial.
Com base nos resultados dos cálculos do RMS, que foi determinado para
comparar os moldes e seus respectivos modelos, podemos inferir a conservação
da estrutura tridimensional dos modelos de forma geral. A única exceção foi o
modelo baseado na bacteriorodopsina, cuja estrutura 3D é tão diferente do molde,
55
que impossibilitou o alinhamento das estruturas e o cálculo do RMS direto apesar
de se observar a presença das 7α -hélices transmembranares. Este dado reforça
que a modelagem por homologia não impõe o enovelamento do molde, mesmo
quando a margem de identidade é baixa e aponta que modelos do tipo rodopsina
devem ser cuidadosamente analisados, pois tendem apresentar diferenças
estruturais que não devem ser ignoradas. Essa observação é análoga a existente
na literatura para o receptor RA-A2a, que contraindicou o uso da rodopsina como
molde para a modelagem comparativa deste subtipo de receptor desde que foi
relatado a estrutura do receptor β2-adrenérgico (Yuzlenko and Kieć-Kononowicz,
2009).
O RMS entre os moldes variou entre 1,28 e 2,11
Ǻ, sendo o menor valor
observado entre os modelos baseados na estrutura cristal do RA-A2a e do
receptor β2-A e o maior valor, entre os modelos baseados na bacRho e na BRho.
De forma interessante, os valores dos RMS apresentados entre as estruturas
cristais do RA-A2a e do receptor β2-A e entre a bacRho e a BRho seguem o
mesmo padrão dos modelos, cujos valores são, respectivamente, 0,79Ǻ e 2,13Ǻ.
Outro parâmetro importante observado neste trabalho foi o mapa de
potencial eletrostático (MPE), que mostra a diferença entre as estruturas quanto à
distribuição de cargas. Com relação à semelhança entre a distribuição de cargas
entre os modelos e seus respectivos moldes, os modelos baseados no RA-A2a e
no receptor β2-A apresentam uma distribuição de cargas semelhantes, com maior
proporção de cargas positivas aparentemente seguindo a funcionalidade destas
moléculas. Os modelos baseados na bacRho e no BRho apresentam uma
distribuição de cargas diferentes dos respectivos moldes, que possuem uma
distribuição de cargas negativas maior quando comparada com os outros
modelos.
A característica básica (carga positiva) dos modelos de forma geral é
justificada, uma vez que se trata de um receptor de membrana, inserido portanto
em um ambiente rico em cargas negativas devido à composição fosfolipídica da
mesma. Sendo assim, as cargas positivas estabilizam o receptor na membrana
permitindo e mantendo sua inserção nesta estrutura celular (Bogdanov et al,
2009).
56
Ainda em relação à distribuição de cargas, podemos perceber que o
modelo do RA-A1 construído a partir da bacteriorodopsina apresenta, na região
do sítio de ligação, uma maior quantidade de cargas positivas, diferente dos
outros modelos, que apresentam cargas positivas, negativas e resíduos neutros.
Novamente esses dados corroboram a orientação de análise criteriosa para a
escolha desse molde como base estrutural para o modelo do RA-A1.
Para validar os modelos construídos utilizamos os programas Prochek e
Verify 3D. Os gráficos de Ramachandran gerados pelo Prochek, para a maioria
dos modelos, apresentaram mais de 90% dos resíduos em regiões favoráveis,
sendo que apenas o modelo baseado na BRho apresentou uma porcentagem
abaixo de 90% (89,3%). Segundo a literatura, esse valor torna-se aceitável uma
vez que o próprio molde apresenta apenas 79,2% dos resíduos em regiões
favoráveis. Esse mesmo modelo apresenta um resíduo (Val187) na região
desfavorável, mas distante do sítio de ligação do receptor aos ligantes, o que
provavelmente não compromete a interação dos ligantes com essa molécula.
Assim como o modelo baseado na BRho apresenta uma maior
porcentagem de resíduos na região favorável em relação ao molde, o modelo
baseado no RA-A2a, com 94,9% dos resíduos nessa região, também apresenta
um valor maior que o seu molde (92,8%). Com relação aos gráficos montados
com os valores obtidos no Verify 3D, apenas o modelo baseado na bacRho
apresentou uma maior quantidade de valores negativos em relação ao molde,
reforçando a diferença provavelmente significativa entre a bacRho e o receptor
humano já indicada pela baixa identidade. Ambas as validações mostraram os
modelos com valores aceitáveis segundo a literatura (Santos, 2002).
Com relação à estrutura secundária dos modelos, observamos que àqueles
baseados na bacRho, na BRho e no receptor β2-A apresentam uma conformação
mais aberta na região das 7 α -hélices transmembranares quando comparados ao
modelo construído a partir do RA-A2a. Isso poderia ter implicações nos estudos
de docking, pois com um espaço maior disponível, aumenta a chance do ligante
realizar interações com resíduos de aminoácidos que ele provavelmente não
realizaria em uma situação real.
57
Outro ponto a ressaltar é em relação ao tamanho dasα -hélices, que se
mantém conservado em quase todos os modelos do RA-A1, com exceção do
construído a partir da bacRho, cujas α-hélices são menores em relação aos outros
modelos. Também podemos observar que não há uma conservação entre as
folhas β-pregueadas, que estão presentes em quase todos os modelos, exceto
naquele baseado no receptor β2-A. Nos outros modelos, as folhas β-pregueadas
não se encontram na mesma posição, o que poderia causar alguma alteração na
interação-receptor ligante.
Como não existem modelos do RA-A1 disponíveis em bancos de dados, os
resultados, quanto à estrutura dos modelos, não puderam ser diretamente
comparados Apenas dois modelos dos receptores de adenosina, incluindo a do
receptor de adenosina A3 e do receptor de adenosina A2a estão descritos na
literatura para estes subtipos de receptor (Kim et al., 2003).
Kim e colaboradores descrevem a construção da modelo 3D do RA-A1
utilizando a BRho como molde (Kim et al., 2003). O cálculo do RMS, obtido a
partir do alinhamento da estrutura do modelo RA-A2a e a estrutura utilizada como
molde (BRho), mostra uma conservação da estrutura com valores de RMS
(1,34Ǻ) próximos ao observado quando se alinha esse modelo com a estrutura
cristal do RA-A2a descrita na literatura (1,51Ǻ). Isso revela que a estrutura do
modelo não é muito diferente da estrutura cristal do RA-A2a, podendo-se
perceber na análise das estruturas a conservação das sete
α -hélices, das alças
intra e extracelular e do sítio de interação com os ligantes, apresentando uma
diferença na porção c-terminal, que está presente no estrutura cristal, mas não
está presente no modelo do RA-A2a. Esses resultados reforçam o fato de que a
modelagem por homologia tem sua funcionalidade, permitindo que os modelos
gerados a partir dessa técnica podem ser utilizados na análise de interações entre
ligantes e para a construção de novos fármacos.
A identidade entre os RA-A2a e a BRho é igual a 16%, um valor tão baixo
quanto o apresentado para o RA-A1 (14%). Apesar disso, a estrutura do modelo
do RA-A2a baseado na BRho é semelhante à estrutura cristal do RA-A2a
posteriormente relatada, podendo-se concluir que a modelagem por homologia é
58
uma ferramenta capaz de predizer uma estrutura mesmo que o molde apresente
baixa identidade de sequência.
Ainda que a BRho tenha sido utilizada por muito tempo como molde para
os receptores de adenosina, o ideal relatado pela literatura ainda é a utilização de
moldes com maior identidade e similaridade funcional. No caso do RA-A1, a
melhor opção seria o RA-A2a, cuja identidade é de 49% e trata-se de um receptor
com a mesma funcionalidade, diferente da BRho, que é uma cromoproteína ou do
receptor β2-adrenérgico que interage com outro agonista, a adrenalina.
5.2 – Análise das interações receptor-ligante
5.2.1 – Análise das interações da adenosina com os receptores (RA-A2a e os
modelos do RA-A1)
Estudos de mutagênese descritos na literatura mostram a importância de
alguns resíduos para a interação receptor-ligante no receptor de adenosina A1,
incluindo os resíduos Phe182, His250, Asn253, Ile274, Ser277, His278 e Ser281
para o RA-A2a; e os resíduos Glu16, Cys80, Pro86, Val87, Leu88, Cys169,
Thr277, His278 (Ben et al., 2010; Giordanetto et al.,2003; Olah e Stiles, 2000,
Rivkees et al., 1999).
Para verificar se tais resíduos aparecem interagindo próximos ao sítio de
ligação nos modelos, realizamos um estudo de docking, no qual foram escolhidos
como ligantes a adenosina (agonista) e o ZM241385 (antagonista). Esse
antagonista foi selecionado tendo em vista que ele está presente na estrutura do
cristal do RA-A2a, o que facilita a comparação entre os complexos gerados com o
cristal do RA-A2a e com o modelo do RA-A1 (RA-A2a) e sua seletividade pelo
RA-A2a.
A comparação dos complexos foi feita apenas entre a estrutura cristal de
RA-A2a e o modelo do RA-A1 baseado em RA-A2a, uma vez que esse modelo
parece ser o mais adequado, devido principalmente à similaridade entre o modelo
e o seu molde.
59
Para a análise das interações, foi feito um corte deǺ6a partir do lig
ante
que revelou que, com relação aos modelos, quase todos apresentaram resíduos
descritos como importantes para a interação receptor-ligante. A única exceção foi
o modelo baseado na bacRho, que não apresentou nenhum resíduo considerado
importante, o que indica uma estrutura diferente das demais como já esperado.
Esse modelo apresenta α-helices mais curtas e uma estrutura mais aberta do que
as outras resultando em uma dificuldade de estabilizar o ligante no sítio de ligação
do receptor, similar ao observado para o modelo de RA-A2a construído com base
na rodopsina bovina (BRho) (Ben et al., 2010; Giordanetto et al.,2003; Olah e
Stiles, 2000).
Os resultados obtidos a partir da análise das interações foram comparados
aos disponíveis na literatura. No trabalho realizado por Yuzlenco e KiecKononowicz (2007), o estudo de docking feito com antagonistas revelou a
participação dos resíduos Thr270, Ala273, Ile274, Thr277, His278 e Tyr288 na
formação do sítio de ligação, similar ao observado com os nossos modelos. Outro
resultado semelhante foi o da interação hidrofóbica existente entre o resíduo
Val87 com o anel da adenina presente no trabalho de Terán et al., 2004. Além
disso, o resíduo Ile274 aparece no corte deǺ 6feito a partir da adenosina em
todos os modelos do RA-A1 realizando uma interação hidrofóbica. Esse resultado
é semelhante ao apontado por Giordanetto et al., 2003, que cita a interação desse
resíduo com a porção adenina do agonista endógeno. Dentre todos os modelos
do RA-A1, apenas o modelo baseado no BRho não apresenta essa interação com
a porção adenina, indicando que a rodopsina bovina não é a melhor opção para a
geração de modelos para o RA-A1 de forma similar ao descrito para RA-A2a
(Yuzlenko e Kieć-Kononowicz 1999).
Dentre os resíduos importantes descritos por mutagênese, os modelos do
RA-A1 baseados na BRho, no receptor β2-A e no RA-A2a apresentaram, em
comum, os resíduos Cys85, Pro86, Val87, Ile274 e His278. Resultados
semelhantes são descritos nos trabalhos de Yuzlenko & Kiec-Kononowicz, 2008;
Terán et al., 2004 e Giordanetto et al., 2003. Além desses resíduos, os modelos
também apresentam outros importantes para a interação receptor-ligante: Glu16,
60
Leu65, Ile69, Cys 80, Leu 88, Cys 169 e Thr277 apontados por Ben et al., 2010;
Giordanetto et al.,2003; Olah e Stiles, 2000 e Rivkees et al., 1999.
Em todos os modelos, o resíduo His278 é capaz de realizar uma interação
hidrofóbica, sendo esse resíduo considerado importante tanto para a interação
com agonistas, quanto para antagonistas (Yuzlenko e Kiec-Kononowicz, 2008).
Ao observar o número de resíduos importantes para a interação receptor-ligante,
podemos perceber que o modelo baseado no RA-A2a apresenta a maior
participação resíduos quando comparado aos outros modelos.
Os modelos RA-A1 baseados nos RA-A2a, na BRho e no receptor β2-A
foram alinhados neste trabalho, revelando nove resíduos de aminoácidos
presentes em todos os modelos em questão (Ile67, Ala84, Cys85, Pro86, Val87,
Ile174 e His278). Nesse alinhamento, notamos que os resíduos Val83, Ala84,
Cys85 e Ile67 dos modelos não estão completamente alinhados, indicando uma
diferença conformacional na estrutura tridimensional desses modelos, o que pode
indicar uma diferença na análise de interações com antagonistas.
Para analisar as interações existentes entre a adenosina e o receptor A2a
foi feito um corte de
Ǻ a6 partir do ligante. Nesse corte, três resíduos
considerados importantes para a interação receptor-ligante estavam presentes
(Glu169, Asn253 e Ile274). De forma importante, os dois primeiros também são
observados interagindo com o antagonista ZM241385 (Jaakola et al., 2008).
Os resultados obtidos neste trabalho também são semelhantes aos do
trabalho de Xu et al. (2011), que mostra, no sítio de ligação do agonista seletivo
UK-432097, os resíduos de aminoácidos Val84, Phe168, Glu169, Trp246, Leu249,
His250, Asn253, His264, Met270, Tyr271, Ile274 e His278. Dentre esses
aminoácidos, apenas os resíduos Trp256, His250 e His278 não são observados
no corte de Ǻ
6 feito neste trabalho a partir da adenosina. Outro resultado
semelhante ao trabalho de Xu et al. (2011) foi em relação ao tipo de interação
encontrada entre o receptor e o agonista, os resíduos de aminoácidos Val84,
Leu249, Met270 e Ile274 que realizam interações hidrofóbicas enquanto os
resíduos de aminoácidos Asn253 e Tyr271 realizam ligação de hidrogênio.
Ao compararmos os resíduos encontrados no corte de Ǻ6 dos complexos
formados pela adenosina e a estrutura cristal do RA-A2a ou o modelo do RA-A1
61
baseado no RA-A2a, podemos perceber que a maioria dos aminoácidos
encontrados são apolares. Esse perfil também é observado nos outros modelos
do RA-A1 definindo esta caracterítica como importante característica a ser
considerada durante a racionalização de novos ligantes.
Para verificar a presença de resíduos idênticos entre o RA-A2a e o seu
respectivo modelo do RA-A1 foi feito o alinhamento estrutural dos receptores. No
corte de 6Ǻ a partir da adenosina, foram encontrados resíduos de aminoácidos
idênticos (Ala63/Ala66, Ile66/Ile69, Ala81/Ala84, Val84/Val87, Cys166/Cys169,
Glu169/Glu172, Phe168/Phe171, Tyr271/Tyr271 e Ile274/Ile274), similares
(Ser67/Asn70
e
Ser277/Thr277)
e
distintos
(Thr65/Leu68,
Thr68/Ile71,
Gly69/Glu72, Leu167/Glu170 e Met270/Thr270), definindo, talvez, os idênticos
como aqueles que conservam a reatividade independente do modelo. Dentre
esses resíduos de aminoácidos, alguns são descritos na literatura como
importantes para a ligação do agonista, tais como Ile69, Cys169, Ile274 e Thr277
em RA-A1 e Ile274 em RA-A2a.
5.2.2 – Análise das interações entre o ZM241385 e os receptores RA-A2a e o
modelo do RA-A1 baseado em RA-A2a
O ZM241385 é um antagonista seletivo do RA-A2a, que apresenta uma
afinidade de 1 nM para o RA-A2a e de 255 nM para o RA-A1 (Ongini et al, 1999).
O estudo de docking do antagonista ZM241385 foi realizado utilizando
apenas a estrutura cristal do RA-A2a e o modelo do RA-A1 baseado no RA-A2a,
que apresenta o maior grau de identidade. A análise das interações entre os
receptores e o ZM foi realizada a partir de um corte de 6Ǻ do antagonista. Alguns
dos resíduos considerados importantes, por estudos de mutagênese, para a
interação receptor-antagonista foram encontrados incluindo Glu16, Leu65, Ile69,
Cys85, Cys169, Thr277 e His278 para o modelo de RA-A1 e Val88, Glu169,
His250 e Ile274 para RA-A2a (Ben et al., 2010; Giordanetto et al.,2003; Olah e
Stiles, 2000 e Rivkees et al., 1999).
Para verificar a presença de resíduos idênticos foi feito o alinhamento
estrutural do RA-A2a e do modelo do RA-A1 baseado no RA-A2a, sendo
62
observada a presença de aminoácidos idênticos (Ala66/Ile69, Ala81/Ala84,
Val84/Val87, Cys166/Cys169, Phe168/Phe171, Tyr271/Tyr271, Ile274/Ile274), um
similar (Ser67/Asn70) e alguns distintos (Leu167/Glu170, Leu267/Ser267,
Met270/Thr270).
Ao compararmos os resultados da análise da interação com o agonista e
com o antagonista, notamos que há uma mudança conformacional no receptor.
Dentre essas mudanças podemos citar a que resulta na presença do resíduos
Pro73 e Pro64, que são vistos no corte de 6Ǻ a partir do agonista, mas não no
antagonista. Em relação ao antagonista, no corte deǺ6a partir do ZM241385,
podemos observar a presença dos resíduos His264, Lys265, Pro266, Ser267 e
Ile268 que não são vistos no corte deǺ6a partir da
adenosina provavelmente
devido ao maior volume ocupado pelo ZM241385.
Os resultados obtidos a partir do estudo de docking são semelhantes aos
resultados descritos na literatura e comprovam a importância de determinados
resíduos para a interação receptor-ligante. Entretanto, os dados do docking com o
antagonista não conseguiram revelar o motivo de forma explicita sobre a
seletividade de ZM241385. Sabendo que as moléculas de água são componentes
importantes para interações com receptores e que esta pode estar auxiliando na
definição das características de seletividade do ZM241385, este resultado aponta
a necessidade de realizar os estudos de docking na presença de moléculas de
água para viabilizar estas interações e observar se novas pontos de ligação com
o receptor são geradas pela presença da mesma.
63
6- Conclusões
1) Quanto a análise da estrutura tridimensional do receptor de adenosina RA-A1 a
partir da construção e comparação de modelos por homologia, utilizando como
moldes as estruturas cristais do receptor de adenosina A2a (RA-A2a), da
bacteriorodopsina (bacRho), da rodopsina bovina (BRho) e do receptor β2adrenérgico (β2-A), concluímos que:
- Os modelos construídos apresentam a conservação das sete α-hélices
transmembanares, com diferenças na disposição das alças intra e extracelulares
e nas regiòes das estruturas β-pregueadas.
- Os modelos baseados na estrutura cristal da bacteriorodopsina, da
rodopsina bovina e do receptor β2-adrenérgico possuem uma conformação mais
aberta na região próxima ao sítio de ligação de fármacos, o que poder ter
implicações no estudo de docking de ligantes.
- No modelo construído a partir da bacteriorodopsina, nota-se que o
tamanho das α-hélices é menor quando comparado às dos outros modelos,
deslocando o sítio de ligação do agonista. Assim a bacteriorodopsina não é um
bom molde para a construção de modelos para o receptor de adenosina A1
devido a baixa identidade existente entre as sequências primárias entre ela e o
receptores RA.
2) Quanto a comparação dos modelos de RA-A1 com seus moldes e com o
receptor cristalizado de A2a, considerando sua conformação e distribuição de
carga , através do cálculo do valor quadrático médio (Root Mean Square – RMS)
e do mapa de potencial eletrostático respectivamente , podemos concluir que:
- A partir do cálculo do RMS e do mapa de potencial eletrostático,
observamos que os modelos se assemelham aos respectivos moldes, mas a
distribuição de cargas varia, mais significativamente no caso da bacteriorodopsina
e da rodopsina bovina, que apresentam uma quantidade maior de cargas
negativas provavelmente por causa da diferente funcionalidade.
64
3) Quanto a analise das interações do modelo do receptor de adenosina A1
construído a partir do cristal do RA-A2a com o agonista (adenosina) e com o
antagonista (ZM241385) através dos estudos de docking.
- A partir dos estudos de docking foi possível confirmar a presença de
resíduos importantes na interação receptor-ligante descritos por estudos de
mutagênese, incluindo os resíduos de aminoácidos Glu16, Leu65, Ile69, Cys85,
Pro86, Cys169, Thr277 e His278 para o RA-A1 e os resíduos de aminoácidos
Thr88, Glu16 9, Asn181, Phe182, His250, Asn253 e Ile274 para o RA-A2a.
65
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