Crescimento em meio mínimo (marcação 13C e 15N)
Solução Salina 5xM9 (1L)
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15g KH2PO4
30g Na2HPO4
2.5g NaCl
Esta solução deve ser diluida para 1x.
Também é usada como solução de
lavagem de células.
Autoclavar/Esterilizar
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Material: Frascos de centrifuga e pontas de P5000
Soluções: MgSO4.7H2O e CaCl2 (devem ser preparadas em excesso), solução salina M9
e água
Meio Marcado 15N e 13C (500ml)
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100ml solução M9 – 150ml
Filtrar as soluções de glucose, MnCl2.4H2O
1g/L NH4Cl (concentração total na solução) – 1.5g
e FeSO4.7H2O e conservar em recipientes
1ml MgSO4.7H2O ( 1M) – 3ml
estéreis.
500µl CaCl2 (0.1M) – 1,5ml
10ml glucose(0.1g/ml) – 1.5g
A solução de ferro deve ser preparada e
50µl MnCl2.4H2O (50 mM) – 150µl
filtrada imediatamente antes de usar
100µl (50mM) – 300µl
mistura de vitaminas (100x menor que o volume total) – 15ml
água estéril para prefazer o volume
Procedimento – realizado à chama (as células querem-se vivas!!)
1- Preparar pré-inóculo de Rpal+pDB182+pET32h+amp+kn
2- Crescer as células em meio rico (LB+amp+kn) e induzir o primeiro plasmídio (O.D 0.6–
0.7) deixar crescer até O.D 1.0 – 1.2 (O.D de indução do segundo plasmídeo).
3- Recolher as células.
4- Lavar com solução salina (¼ do volume do meio rico). Esta lavagem tem como objectivo
remover o meio rico e deve ser feita com ressuspensões suaves de modo a não
comprometer a viabilidade das células.
5- Recolher as células.
6- Lavar com solução salina.
7- Recolher as células
8- Ressuspender o pellet em meio marcado (¼ do volume LB) pela mesma ordem que
estão listados adicionando no final amp+kn (1000x menor que o volume total) – 1,5ml
cada
9- Incubar a 37oC durante 1h (para que as células se habituem ao meio mínimo)
10- Induzir o segundo plasmidio – 1mM/L IPTG e deixar a incubar durante 3h a 37oC 150 180rpm. Em meio mínimo, o aumento da oxigenação melhora o desempenho
metabólico da células (E.Coli microorganismo aeróbio).