Questionário - Proficiência Clínica
Área: Imunohematologia
Rodada: Out/2011
Texto Complementar
APLICAÇÃO DO TESTE DE ANTIGLOBULINA HUMANA = TESTE DE COOMBS DIRETO E INDIRETO
Elaboradora
Margarida de Oliveira Pinho. Bióloga, Responsável pelo Laboratório de Imuno-hematologia e Coordenadora
da equipe técnica do Serviço de Hemoterapia do Instituto Nacional de Câncer - M.S. - RJ. Especialização em
Hemoterapia - Instituto Fernandes Figueira - Fiocruz, Título de Proficiência Técnica em Imuno-hematologia
pela SBHH.
O teste de antiglobulina humana (AGH), foi descrito em 1945 por Coombs e colaboradores. Em 1946 Coombs e colaboradores
descreveram o uso de antiglobulina humana para detectar in vivo a sensibilização de hemácias por anticorpos, tornando possível o
diagnóstico da Doença Hemolítica Perinatal (DHPN). Com a descoberta do teste de AGH, outros anticorpos IgG foram detectados com
seus respectivos antígenos, levando a descorberta e à caracterização de muitos sistemas de grupos sangüíneos.
Coombs produziu soro antiglobulina humana (AGH) injetando soro humano em coelhos. Como resposta imunológica ocorreu a
produção de anticorpo contra a globulina humana, também chamado de soro de Coombs.
O teste de antiglobulina pode ser usado para detectar hemácias sensibilizadas por anticorpos IgG, auto-anticorpos IgG ou
componentes do complemento.
A sensibilização pode ocorrer in vivo ou in vitro.
O uso da antiglobulina humana para detectar a sensibilização de hemácias in vitro é uma técnica de duas fases chamada Teste de
Antiglubulina Indireta (TAI), também conhecida como Teste de Coombs Indireto.
A sensibilização in vivo é detectada por procedimento de uma fase chamada Teste de Antiglobulina Direta (TAD), também conhecida
como Teste de Coombs Direto.
O TAI e o TAD continuam sendo os procedimentos mais comuns e de muita importância nos testes imunohematológicos (sorologia de
grupos sanguíneos).
O Teste de Coombs é baseado no principio de que as globulinas anti-humanas obtidas de espécies não humanas imunizadas ligam-se
a globulinas humanas como IgG ou complemento, livres no soro ou fixas a antígenos em hemácias.
Os principais anticorpos de grupo sanguíneo são IgM (chamados de completos) e IgG (chamados de incompletos).
Os anticorpos IgM se ligam facilmente aos antígenos correspondentes devido a sua estrutura pentâmera que favorece a aglutinação
direta das hemácias suspensas em salina (soro fisiológico).
Os anticorpos IgG são chamados não aglutinantes pois sua estrutura monômera é muito pequena, esses anticorpos são capazes de
sensibilizar as hemácias que tenham antígenos correspondentes mas não promovem a aglutinação diretamente. As hemácias
sensibilizadas por anticorpos IgG necessitam da adição do soro antiglobulina humana para aglutinarem.
Alguns anticorpos de grupo sanguíneo têm a capacidade de ligar complemento à membrana da hemácia.
Reagentes de globulina anti-humana = Soro de Coombs
Antiglobulina Humana Poliespecífica = Soro de Coombs
Poliespecífico - Contém anticorpo IgG e C3d do complemento
humano. Outros anticorpos anticomplemento, tais como antiC3b, anti-C4b ou anti-C4d, também podem estar presentes. A
AGH poliespecifica comercialmente preparada contém pouca
ou nenhuma atividade contra cadeias pesadas de IgA e IgM,
porém, a mistura de soros poliespecíficos podem conter
atividade de anticorpos contra cadeias leves kappa e lambda
comuns a todas as classes de imunoglobulinas com moléculas
IgA ou IgM.
Antiglobulina Humana Monoespecífica = Soro de Coombs
Monoespecífico - Reagentes AGH monoespecificos contêm
apenas uma especificidade de anticorpos. A antiglobulina
humana anti-IgG que é o mais usado ou anticorpos específicos
para componentes do complemento, como exemplo o C3b ou
C3d.
Anti-IgG = Soro de Coombs anti-IgG
Reagentes rotulados anti-IgG, não contêm nenhuma atividade
anticomplemento.
O anti IgG pode conter especificidade anti-cadeia leve e,
portanto, reagir também com células sensibilizadas com IgM e
IgA.
Anti-complemento - Reagentes anti-complemento como antiC3b-C3d. são reativos apenas contra os componentes de
complemento designados e não contém nenhuma atividade
contra imunoglubulinas humanas.
Teste de Antiglobulina Direto (TAD)
O TAD, também conhecido como Teste de Coombs Direto é
um método simples que permite detectar a sensibilização das
hemácias por anticorpos IgG e ou fração de complemento in
vivo.
Método em tubo - Preparar uma suspensão de hemácias à 5%
em solução salina, transferir para outro tubo uma gota da
suspensão de hemácias e lavar três vezes com solução salina.
Após a lavagem pingar duas gotas do soro antiglobulina
humana (preferencialmente poliespecífico), ou de acordo com
a rotina estabelecida pelo serviço, homogeneizar, centrifugar e
ler observando a presença ou ausência de aglutinação.
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Resultados Negativos (TAD): pingar uma gota de suspensão
de hemácias sensibilizadas (reagente comercial - hemácias
previamente sensibilizadas e utilizadas na rotina para
validação dos testes com antiglobulina humana pelo método
em tubo), homogeneizar, centrifugar e fazer a leitura. O
resultado deste controle tem que ser positivo (presença de
aglutinação), para que o teste seja validado. Se o resultado do
controle for negativo o teste é inválido, portanto deve ser
repetido.
Resultados Positivos (TAD): indica presença de anticorpos na
superfície da hemácia (sensibilização in vivo). Devem ser
avaliados e relacionados com o diagnóstico do paciente, com a
terapia medicamentosa do momento e com a história
transfusional. Nos pacientes que apresentam resultado positivo
é importante investigar sinais de hemólise in vivo, transfusão
de sangue recente, fazer um teste de antiglobulina indireta
(TAI) para investigar anticorpos no soro do paciente, verificar
uso de medicamento e que medicamento está usando, verificar
se recebeu transfusão de componentes plasmáticos ABO
incompatível e outros fatores que possam ser relevantes para
o diagnóstico associado ao resultado encontrado.
O Teste de Antiglobulina Direto (TAD) está indicado para
investigação de:
1.
Anemias Hemolíticas Autoimunes;
2.
Anemias Hemolíticas Induzidas por Drogas;
3.
Doença Hemolítica Perinatal;
4.
Reações Hemolíticas Transfusionais;
5.
Transfusão de sangue ou componentes contendo plasma
ABO-incompatível;
6.
E outras situações mais específicas que são detectadas
após criteriosa avaliação clínica para identificar a causa
do TAD positivo.
As amostras de sangue para realização do TAD devem ser
colhidas em EDTA e o teste deve ser feito o mais rápido
possível. A amostra não deve ir para geladeira antes do
resultado final, evitando que anticorpos presentes no plasma
sejam adsorvidos às hemácias resultando em resultados falsos
negativos.
A amostra com resultado de TAD positiva, deve ser submetida
ao procedimento de eluição, que consiste em remover os
anticorpos que estão causando a sensibilização na membrana
da hemácia. A eluição pode ser feita por diversas técnicas.
antiglobulina, se poliespecífica ou monoespecífica, deve ser
definida pelo Serviço de acordo com as características dos
pacientes atendidos no serviço.
Resultados Negativos (TAI): pingar uma gota de suspensão
hemácias previamente sensibilizadas (reagente comercial)
usadas na rotina para validação dos testes com antiglobulina
humana (Teste de Coombs) pelo método em tubo,
homogeneizar, centrifugar e fazer a leitura. O resultado deste
controle tem que ser positivo (presença de aglutinação), para
que o teste seja válido. Se o resultado do controle for negativo
invalida o teste, portanto, deve ser repetido.
Resultados Positivos (TAI): indica a presença de anticorpo
irregular (tipo IgG) e/ou fração de complemento na amostra teste. Todos os resultados positivos devem ser informados por
escrito:
- Ao médico solicitante (do paciente ou da gestante);
- Ao doador de sangue, juntamente com os resultados de
sorologia;
- Mulher em idade fértil que, independente do Fator Rh, deve
receber esclarecimento para que, em possíveis gestações,
possa informar imediatamente ao médico que vai acompanhar
o pré- natal.
Principais causas de resultados positivos:
- Transfusões de sangue e/ou hemocomponentes;
- Gestação;
O teste de antiglobulina Indireto (TAI) é utilizado para:
- Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) em doadores de
sangue e/ou pacientes, utilizando um conjunto de hemácias
comerciais com perfil antigênico conhecido;
- Prova de compatibilidade (prova cruzada) em teste prétransfusional;
- Titulação de anticorpos tipo IgG;
- Identificação de Anticorpos Irregulares (IAI) utilizando um
painel de hemácias com perfil antigênico conhecido;
Fenotipagem de hemácias utilizando anti-soros comerciais
com especificidade definida.
- Fenotipagem de hemácias utilizando anti-soros comerciais
com especificidade definida.
Teste de Antiglobulina Indireto (TAI)
O TAI, também conhecido como Teste de Coombs Indireto, é
capaz de detectar a presença de anticorpo irregular no soro
(do tipo IgG). É um teste de grande importância para monitorar
principalmente mulheres Rh negativo em período gestacional.
As mulheres Rh negativo tem maior probabilidade de ser
aloimunizadas por gestação. A maioria da população é Rh
positiva (aproximadamente 85%), justificando a alta incidência
de filhos Rh positivo com mães Rh negativo.
Método em tubo - Para realizar este teste é necessário um
conjunto de células (hemácias comerciais em suspensão à
5%) com perfil antigênico conhecido e capaz de detectar a
maioria dos anticorpos de importância clínica.
A técnica consiste em colocar uma ou duas gotas do soro a ser
investigado junto com uma gota da suspensão das hemácias
comerciais (conforme orientação do fabricante). O período de
incubação à 37ºC pode variar conforme reagentes utilizados, é
importante seguir sempre a técnica recomendada na instrução
de uso do fabricante. Após o período de incubação lavar três
vezes com solução salina duas gotas do reagente antiglobulina
humana (conforme instrução do fabricante). O tipo de
Esquema - Mostra as hemácias sensibilizadas por
imunoglubulinas IgG e sendo ligadas pela antiglobulina
humana promovendo a reação de aglutinação.
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Principais fatores que afetam o teste da antiglubulina:
Temperatura - A temperatura ótima para detecção de
anticorpos tipo IgG é de 37ºC, que é também uma temperatura
ótima para ativação de complemento. Os testes de
antiglobulina indireto devem ser incubados à 37ºC.
Tempo de incubação - (1) Hemácias suspensas em salina o
tempo pode variar de 30 a 120 minutos; (2) Usando a técnica
de LISS, o tempo de incubação pode variar de 10 a 150
minutos. Usando LISS, o tempo de incubação não deve
exceder a 40 minutos, a incubação prolongada pode eluir os
anticorpos das hemácias.
6.
Tubos sujos;
7.
Centrifugação excessiva para leitura;
8.
Células poliaglutinantes;
9.
Anticorpo conservante-dependente em reagentes LISS;
10. Anticorpos contaminantes no reagente de globulina antihumana.
Resultados falso - negativos
1.
Lavagem inadequada ou imprópria de células;
2.
Reagente de antiglobulina humana não reativo devido a
neutralização;
Lavagem das células - Para os realizar os TAD e TAI é
necessário lavar as hemácias com salina, no mínimo por três
vezes, antes de adicionar a antiglobulina humana. A lavagem
das hemácias tem como objetivo retirar as globulinas séricas
livres no meio, a lavagem inadequada ocasiona neutralização
da AGH resultando numa reação falso-negativa.
3.
Reagente de antiglobulina humana não adicionado;
4.
Soro em teste não reativo por perda da atividade do
complenmento;
5.
Soro em teste não reativo por perda da atividade do
complenmento;
Uso incorreto do polietilenoglicol (PEG) – (1) É usado como
aditivo para aumentar a captação de anticorpos. Sua ação é
remover a água, concentrando efetivamente o anticorpo. O
reagente (AGH) de escolha deve ser o anti-IgG para evitar
resultados falso - positivos. A utilização do PEG pode causar
agregação de hemácias com resultados falso - positivos
quando centrifugado logo após a incubação. Para evitar
resultados falso - positivos é necessário lavar o teste
imediatamente após a incubação; (2) A performance do PEG é
comparada ao LISS, entretanto, resultados indicam que o PEG
dobra a detecção de anticorpos clinicamente significativos
enquanto diminui os não significativos clinicamente.
6.
Condições de incubação inadequadas no teste de
antiglobulina indireto (TAI);
7.
Concentração da suspensão de hemácias inadequada,
muito alta ou muito baixa;
8.
Centrifugação inadequada, muito forte ou muito fraca;
9.
Leitura inadequada na hora ressuspender o botão de
hemácias para leitura;
Adição da antiglobulina humana - A antiglobulina humana deve
ser acrescentada às hemácias imediatamente após a lavagem,
evitando eluição do anticorpo das hemácias e como
consequência, neutralizando a antiglobulina humana,
resultando em reação falso - negativa. O volume do reagente
adicionado ao teste deve seguir a instrução do fabricante do
reagente.
Centrifugação para leitura - As centrífugas devem ser
calibradas e validadas para diversas necessidades de
centrifugação definidas por cada laboratório. Para
centrifugação de botão de células recomenda-se usar 1.000 de
força centrífuga relativa (FCR), durante vinte segundos. A
centrifugação é fundamental para conclusão dos resultados.
Centrifugação mais alta gera resultados mais sensíveis, porém
dependendo da forma que o botão é ressuspenso, o resultado
pode ser falso - positivo fraco (por ressuspensão inadequada)
ou ter um resultado falso - negativo se a suspensão for
vigorosa. As condições ótimas de centrifugação devem ser
determinadas para cada centrífuga.
Causas de Erros nos Testes de Antiglobulina Humana –
Teste de Coombs
Resultados falsos-positivos
1.
Amostra refrigerada e/ou coaguladas são inadequadas
podem aderir complemento in vitro;
2.
Hemácias com autoaglutinação;
3.
Contaminação bacteriana da amostra, na salina para
lavagem ou pipetas utilizadas para o teste;
4.
Reagente de hemácias utilizadas para
antiglobulina indireta com TAD positivo;
5.
Salina contaminada por metais pesados ou sílica colidal;
testes
Importante:
Todas as reações negativas nos testes de antiglobulina
humana pelo método em tubo devem ser validadas com adição
do reagente de hemácias sensibilizadas com anticorpos IgG.
Após a adição desse reagente o teste deve ser
homogeneizado e centrifugado. Depois da centrifugação fazer
uma nova leitura.
Teste válido: resultado positivo (aglutinação de pelo menos
1+).
Teste inválido: resultado negativo (ausência de aglutinação)
Repetir o teste da AGH.
A causa mais comum de erro é a lavagem inadequada,
reagente AGH não reativos e falha na adição do reagente
AGH.
BIBLIOGRAFIA
•
Resolução - RDC Nº 57, de 16 de dezembro de 2010.
•
Portaria MS nº 1.353, de 13 de junho de 2011.
•
HARMENING, D. Técnicas Modernas em Banco de
Sangue e Transfusão. 4ª ed. Ed. Revinter. . 2006.
•
DANIELS, G. Human Blood Groups. 2ª ed. Blackwell
Science. 2002.
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