ASPECTOS MOLECULARES,
CELULARES E TECIDUAIS EM
MODELOS DE DOENÇAS
METABÓLICAS EM FÊMEAS
Eliana Hiromi Akamine
Departamento de Fisiologia e Biofísica – ICB – USP
setembro/2006
ÓXIDO NÍTRICO, ESPÉCIES REATIVAS
DO OXIGÊNIO E PROSTANÓIDES NA
VASODILATAÇÃO DEPENDENTE DO
ENDOTÉLIO DE RATAS DIABÉTICAS
AGONISTA
-
R
R
-
EDRF
EDCF
-
Diabetes
EDHF PGI2
NO
EDHF PGI2
NO
O2-
Célula Endotelial
TXA2
AA
+
PGF2
PGH2
-
+
Diabetes
Diabetes
RT
K+
Adenilato Guanilato
Ciclase
Ciclase
+
K
ATP
Célula do Músculo
Liso Vascular
GTP
GMPc
AMPc
Ca2+
Relaxamento
De Vriese. Br J Pharmacol, 130:963-974, 2000
Contração
DIFERENÇAS SEXUAIS NO DIABETES MELLITUS
As alterações vasculares do diabetes mellitus são mais
acentuadas em fêmeas:
- BARRETT-CONNER et al., 1991; BELL, 1994; PINNA et al., 2001;
MAYHAN et al., 2002; MARRA et al., 2002; CHAN et al., 2003; DABELEA
et al., 2003; THE DECODE STUDY GROUP, 2003; TOLEDO et al., 2003.
OBJETIVOS
Avaliar o envolvimento do sistema do óxido
nítrico, espécies reativas do oxigênio e da via da
ciclooxigenase na disfunção vascular de ratas
diabéticas.
Verificar o efeito do tratamento crônico com
insulina na disfunção vascular nesse modelo.
INDUÇÃO DO DIABETES
Animais: ratas Wistar, 8-10 semanas
Indução do diabetes: aloxana, 40 mg/kg, i.v.
Foram utilizadas ratas diabéticas com níveis
glicêmicos acima de 200 mg/dl
Tratamento com insulina: 2 UI/animal/dia, durante
12 dias, via subcutânea
RESULTADOS
Características gerais
Controle
Diabética
Insulina
67,5±3,9
12,4±5,3**
39,5±6,1††
Glicemia (mg/dl)
87,2±2,3
429,7±27,2§
Insulina (ng/ml)
1,5±0,3
0,2±0,07||
0,3±0,06||
Glicosúria (mg/dl)
negativo
900,0±66,7
522,2±101,1‡
Útero/100g (mg)
37,7±1,6
24,3±2,5***
41,2±2,9
Estradiol (pg/ml)
26,3±7,9
24,1±4,8
23,9±3,2
Progesterona (ng/ml)
26,0±3,5
10,5±1,4*
19,1±1,9
Ganho de peso (g)
após 4h
114,3±20,0
após 15h
492,4±33,9§
Microscopia intravital
20.2
% aumento diâmetro inicial
acetilcolina
10
8
6
4
2
0
*
11
10
Controle Diabética
10
8
6
4
2
0
10
Diabética
+ insulina
bradicinina
*
09
09
09
Controle Diabética Diabética
+ insulina
histamina
8
6
4
2
0
**
09
Controle
Akamine et al. J Vasc Res, 43:309-320, 2006
07
09
Diabética Diabética
+ insulina
INSULINA
DIABETES
?
?
NOS
pmol/min/mg proteína
Atividade NOS
80
60
**
40
**
20
0
Controle Diabética Diabética
+ insulina
eNOS/GADPH
Expressão eNOS
GADPH
eNOS
1,5
1
0,5
0
04
04
04
Controle Diabética Diabética
+ insulina
DIABETES
BH4 ?
Atividade - NOS
Expressão - NOS
% aumento diâmetro inicial
acetilcolina
10
8
6
4
2
0
**
11
09
09
Controle
Diabética
Diabética
após BH4
bradicinina
8
6
4
2
0
***
09
09
09
Controle
Diabética
Diabética
após BH4
histamina
8
6
4
2
0
***
09
Controle
08
08
Diabética Diabética
após BH4
BH4
L-arginina + O2
BH4
O 2-
NOS
?
L-citrulina + NO
?
?
DIABETES
INSULINA
Basal
Estimulada
BH4 -
Controle Diabética
Diabética
+ insulina
Controle Diabética
Diabética
+ insulina
BH4 +
índice de fluorescência
Basal
Acetilcolina Bradicinina
Histamina
14
12
10
2
0
BH4
†
‡
‡
6
4
†
†
8
‡
**
-
+
Controle
-
+
Diabética
-
+
-
+
Diabética + insulina
INSULINA
?
BH4
NOS
L-arginina + O2
? O2
L-citrulina + NO
DIABETES
?
?
BH4
Diabética
% núcleos marcados
Controle
70
60
50
40
30
20
10
0
Diabética
+ insulina
Diabética + BH4
*
08
08
15
C
D
D+
insulina
06
08
D+
D+
BH4 L-NAME
Diabética
+ L-NAME
BH4
NOS
L-arginina + O2
O 2L-citrulina + NO
?
vasodilatação
% aumento diâmetro inicial
acetilcolina
8
6
4
2
0
*
09
09
09
Controle
Diabética
Diabética
após MnTMPyP
bradicinina
8
6
4
2
0
*
09
09
09
Controle
Diabética
Diabética
após MnTMPyP
histamina
8
6
4
2
0
*
11
Controle
11
11
Diabética Diabética
após MnTMPyP
BH4
NOS
L-arginina + O2
O2
-
L-citrulina + NO
SOD ?
H2O2
Atividade Cu/Zn SOD
*
U/ml
0,6
0,4
0,2
0
07
08
07
Controle Diabética Diabética
+ insulina
Cu/Zn SOD/GADPH
Expressão Cu/Zn SOD
GADPH
Cu/Zn SOD
1,6
1,2
0,8
0,4
0
04
04
04
Controle Diabética Diabética
+ insulina
DIABETES
?
COX
?
Vasodilatação
acetilcolina
% aumento diâmetro inicial
8
6
4
2
0
*
12
12
12
12
C
C+
diclofenaco
D
D+
diclofenaco
bradicinina
10
8
6
4
2
0
*
10
10
11
12
C
C+
diclofenaco
D
D+
diclofenaco
histamina
8
6
4
2
0
**
09
09
09
09
C
C+
diclofenaco
D
D+
diclofenaco
Akamine et al. J Vasc Res, 43:401- 410, 2006
DIABETES
?
Prostanóides
?
Vasodilatação
Registro típico da reatividade do leito arteriolar perfundido
mmHg
100
50
0
1:43:20
1:45:00
1:46:40
Noradrenalina – 10-5 M
1:48:20
1:50:00
1:51:40
1:53:20
60 l de acetilcolina 10-5 M
Reatividade - acetilcolina
PGF2
Basal
Acetilcolina
PGF2 (pg/ml)
350
†††*
280
210
140
70
0
05
07
05
05
C
D
C
D
TXA2
Basal
Acetilcolina
TXA2 (pg/ml)
120
90
60
*
*
30
0
06
06
05
06
C
D
C
D
Prostaciclina
Prostaciclina (pg/ml)
Basal
Acetilcolina
2000
1600
†*
1200
800
400
0
05
06
06
06
C
D
C
D
DIABETES
O 2-
?
COX
PGF2 / TXA2 / prostaciclina
Diabética
% núcleos marcados
Controle
70
60
50
40
30
20
10
0
Diabética + diclofenaco
*
08
08
12
C
D
D+
diclofenaco
DIABETES
?
ONOONO
+
O 2-
COX
PGF2 / TXA2 / prostaciclina
Expressão de proteínas contendo nitrotirosina
Controle
Diabética
50kDa
30kDa
Densidade óptica
20kDa
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
04
04
Controle
Diabética
Diabetes
BH4
NOS
L-arginina + O2
H2O2
O 2-
+
L-citrulina +
+
HO
BH4
ONOO-
NO
SOD
2
2
O2-
BH2
COX
PGF2 / TXA2 / prostaciclina
Vasodilatação
AGRADECIMENTOS
Zuleica B. Fortes
Carla Roberta O. Carvalho
Dorothy Nigro
Luciene Maria Ribeiro
Maria Helena C. Carvalho
Anderson Carlos Marçal
Rita de Cássia A. Tostes
Maria Aparecida de Oliveira
Anna Elisa Tiyeko Urakawa
Sônia Maria R. Leite
Cristóforo Scavone
Elisa M. Kawamoto
Luiz Roberto G. Britto
Silvana Bordin
Luciana Chagas Caperuto
Luciana Rossoni
Camila Venceslau
Ana Paula Davel
Renata Koba