Eduardo João Pereira Junior
Técnicas Citoquímicas Aplicadas à
Embriologia Vegetal
Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise
Docente: Profa. Dra. Maria Tercília V. de Azeredo Oliveira
● FLOR: Ramo modificado que porta os esporófilos (carpelos e estames)
● ANDROCEU (estames): filete(1) + conectivo(3) +antera bilobada(2) → 4
androsporângios ou sacos polínicos(4)
● GINECEU: estigma(1) + estilete(2) + ovário(3) com óvulos (4), (5- saco
embrionário)
● ANDROSPOROGÊNESE E ANDROGAMETOGÊNESE
● Androsporogênese → formação dos andrósporos dentro dos
androsporângios
Lilium
● androgametogênese → desenvolvimento do andrósporo em um
grão de pólen
Lilium
● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
● Ginogametogênese →
formação do ginósporo
no interior do nucelo
(ginosporângio)
Tabebuia pulcherrima
● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
Lilium
● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
● Ginosporogênese → desenvolvimento do ginósporo em um ginófito
(saco embrionário)
● FERTILIZAÇÃO
h
h
sd
sd
Arabidopsis
Técnicas Citoquímicas
● Calose – Solução de azul de anilina
Azul de anilina
K2HPO4
pH
0,005%
0,15M
8,2
● Cora tecidos frescos ou fixados (10-15 min.)
● Elevando-se o pH para 9 ou 10 aumenta a intensidade da coloração
mas diminui sua aplicabilidade como corante vital
● Resultado: A calose emite fluorescência verde/amarela ao ser
observada em microscopia de epi-fluorescência com comprimento de
onda da luz UV em 365 nm.
● Polissacarídeos insolúveis – PAS
● Ótimo protocolo de coloração para identificar polissacarídeos
insolúveis
● Utilizado para secções frescas, secções desparafinizadas, secções
incluídas em glicol metacrilato ou epóxi.
● Grupos aldeídicos do tecido (principalmente se houve fixação com
um aldeído) devem ser tratado com um agente bloqueador, p.ex.
solução saturada de 2,4-dinitrofenil hidrazina em ácido acético 15%
durante 30 min
● Lavar por 30 min. em água corrente
● Oxidar por 10 min. em ácido periódico 1%
● Lavar rapidamente
● Corar com reativo de Shiff
● Resultado: polissacarídeos se coram de púrpura,
os núcleos podem se corar fracamente
● Lignina – Floroglucinol
● Usado freqüentemente com cortes á mão livre
● Gotejar uma a solução de floroglucinol sobre o tecido e incubar por
30 – 60 min
Etanol
HCl
Floroglucinol
100 mL
16 mL
0,1 g
● Resultado: células lignificadas se coram de vermelho. A coloração
não é permanente, o corante se degrada num curto período.
● Amido – IKI (Iodo-Iodeto de Potássio)
● Usado em cortes manuais ou incluídos
● Gotejar uma gota de IKI sobre o tecido e deixar reagindo por 5
min.
Água destilada
Iodeto de Potássio
Iodo
100ml
1g
1g
● Resultado: O corante se intercala na estrutura do amido
resultando numa coloração escura.
● Ácidos graxos, suberina e cutina – Sudan
● Cora cortes frescos e secções incluídas em historresina
Etanol 70%
Sudan IV, Sudan Black
100 mL
0,07 g
● Coloca-se o corte em etanol 50% por poucos segundos, então
adiciona-se o corante
● Incuba-se por 5 – 10 min. com o corante, que dever ser recém
preparado
● Mergulha-se novamente em etanol 50%
● Montar em glicerina
● Resultado: Os lipídios bem como a suberina e
a cutina solubilizam o corante e torna-se
distinguíveis. Sudan Black B pode ser usado
para corar ceras fracamente
● Pectina – Vermelho de Rutênio
● Usado para tecidos fixados ou frescos
● As secções são mergulhadas numa solução preparada
imediatamente antes do uso com de vermelho de rutênio a 0,005%
● Os tecidos são montados em uma solução de glicerina dissolvida
● Resultado: as substâncias pectínicas (lamela média) se coram de
vermelho ou rosa.
● Clarificação de tecidos (Fluido de Herr) – Microscopia de
Normanski
● Método indicado para visualizar células e tecidos delicados como
óvulos e embriões intactos dentro dos óvulos/sementes em estádios
iniciais
● Fixar o material em fluido de Navashin modificado por Randolph
●Dissecar (p. ex.) os ovário e mergulhá-los no fluido de Herr por
pelo menos 24 horas
Ácido Lático
Cloral Hidratado
Fenol
Óleo de Cravo
Xilol
20g
20g
20g
20g
20g
● Montagem: coloque o material sobre uma lâmina escavada com
um pouco da solução de clarificação
● Cobrir com lamínula e observar em microscopia de contraste
interferencial de Normanski
● DNA – 4’-6- Diamino-2-fenilindol (DAPI)
● Dissecção e fixação do tecido por 24 horas em solução de álcool
etílico e ácido acético (3:1).
● Em seguida as peças são infiltradas em historesina e seccionadas
em série em micrótomo
● As secções aderidas em lâminas de vidro são imersas em solução
de 0,25 mg/ml-1 de 4’, 6-diamidino-2- fenilindol (DAPI), em tampão
TRIS 0,05 M, e mantidas na temperatura ambiente e no escuro
● Em seguida, as secções são examinadas em microscópio de epifluorescência
● Resultado: Núcleos emitem fluorescência azul
nps
ns
nce
o
no
o
A
sp
B
C
Obrigado !