Preparação automática e on-line de padrões e amostras na
determinação de glicerina livre e total em biodiesel em
conformidade com os métodos ASTM D6584 e EN 14105
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Autores: Danilo Pierone , Andrea Caruso , Massimo Santoro
Nova Analítica, São Paulo, SP, Br; 2Termo Fisher Scientific, Milan, Italy
e-mail para contato: [email protected]
Resumo
A determinação de glicerina livre e total em biodiesel ...................................................................
segundo os métodos ASTM D6584 e EN 14105 requer ....................................................................
a execução de várias operações manuais na preparação ....................................................................
de soluções de calibração e a adição de agentes ...................................................................
derivatizantes na amostra antes da análise por ............................................................
cromatografia gasosa. Essas etapas dos métodos .................................................................
executadas manualmente são consideradas críticas ....................................................................
porque são demoradas e sujeitas a erros. Este trabalho .....................................................................
descreve a automação completa da preparação das .....................................................................
soluções de calibração e amostras e da determinação de glicerina livre e total.................................
em biodiesel, através do emprego de um amostrador automático programado para executar
as etapas de preparação em uma sequencia, antes da injeção no cromatógrafo a gás. São
apresentados resultados que comprovam a alta precisão na preparação das soluções e a
inexistência de contaminação cruzada. Uma redução dos volumes consumidos de padrões,
solventes e do agente de derivatização é um benefício adicional deste sistema automático on-line.
Palavras-chave: biodiesel, glicerina livre, glicerina total, automação, cromatografia gasosa.
Abstract
Following methods EN14105 and ASTM D6584 for the determination of free and
total glycerin in biodiesel requires the chemist to perform several manual operations while
preparing standards or when adding derivatizing agents in the sample prior to GC analysis.
These manual sample preparation steps are usually considered critical, time consuming and
prone to human errors. This work describes the full automation of the calibration solutions
and samples preparation and analysis of free and total glycerin in biodiesel achieved through
an autosampler programmed to perform the sample preparation steps in a sequence, before
sample injection into the gas chromatograph. Data will be presented showing the high
precision sample handling and no cross-contamination. A reduction of standards, solvents
and derivatizing agent volumes is a further benefit of this on-line automated system.
Keywords: biodiesel, free glycerin, total glycerin, automation, gas chromatography.
1. Introdução
O biodiesel é composto por ésteres metílicos ou etílicos de ácidos graxos de óleos
vegetais ou gordura animal. O processo mais usual de produção de biodiesel é a reação de
transesterificação dos triglicerídeos, cujo produto pode conter as matérias-primas não
reagidas (triglicerídeos e álcool), traços de glicerina, que é um subproduto separado do
biodiesel durante o processo de fabricação, e traços de mono e diglicerídeos formados como
intermediários da reação. ..............................................................................................................
Para ser comercializado, o biodiesel deve atender às especificações definidas em
normas oficiais que indicam as características do produto a serem controladas e seus
respectivos valores aceitos. A qualidade do biodiesel B100 é avaliada, entre outras
características, pelos seus conteúdos de glicerina livre e total, determinados segundo as
normas EN 14105 e ASTM D65841,2. Essas normas definem a análise da amostra por
cromatografia em fase gasosa (GC), após derivatização com N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) para converter os grupos –OH em grupos –OSi(Me)3.
A quantificação é feita pelo emprego de dois padrões internos: 1,2,4-butanotriol e tricaprina,
para a determinação de glicerina e de mono, di e triglicerídeos, respectivamente. O conteúdo
de glicerina combinada na amostra, para determinação da glicerina total, é calculado pela
aplicação de fatores de conversão médios aos mono, di e triglicerídeos.
Os métodos ASTM D6584 e EN 14105 implicam na preparação de várias soluções
de padrões para a construção das curvas analíticas e na adição do agente de derivatização nas
amostras antes da análise por GC. O tempo necessário para preparar manualmente um único
conjunto de soluções de calibração varia em média entre 1h e 1:30h. A preparação de cada
amostra envolve de três a sete pipetagens e o tempo de derivatização limita o número de
amostras que podem ser preparadas em paralelo por um analista. Este procedimento feito
manualmente é demorado e sujeito a erros. .................................................................................
Este trabalho descreve um procedimento de determinação de glicerina livre e total em
biodiesel com o emprego de um amostrador automático para GC e GC-MS que executa todas
as etapas de preparação das soluções de calibração e das amostras, além da injeção no
cromatógrafo..................................................................................................................................
2. Materiais e métodos
2.1. Padrões e Reagentes ........................................................................................................
2.1.1. Soluções preparadas previamente: ...............................................................................
Soluções estoque de glicerina (500 µg/mL) e de mono, di e triglicérides (5000 µg/mL
cada solução) em piridina. Estas soluções serão usadas pelo amostrador automático
TriPlus RSH na preparação das soluções de calibração. ......................................................
Soluções de butanotriol (1000 μg/mL) e de tricaprina (8000 μg/mL), adotados como
padrões internos. ..................................................................................................................
2.1.2. N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA), reagente derivatizante.
2.1.3. n-Heptano grau HPLC, empregado para interromper a reação de derivatização.
2.2. Instrumentação ................................................................................................................
2.2.1. Cromatógrafo a gás modular TRACE 1310 (Thermo Fisher Scientific) com injetor
PTV (injetor com programação de temperatura) e detector FID (detector por ionização
em chama). ...........................................................................................................................
2.2.2. Amostrador automático TriPlus RSH (Thermo Fisher Scientific) que, através de
uma sequência pré-compilada de operações (Prep Cycle Biodiesel), executa
automaticamente a preparação das soluções de calibração e das amostras. O TriPlus
RSH utiliza até seis seringas diferentes, que são trocadas automaticamente de acordo
com os métodos programados, sem a intervenção de um analista. Um Vortexer embutido
no TriPlus RSH agita vigorosamente os vials para a homogeneização das soluções de
padrões e amostras. ..............................................................................................................
2.2.3. Coluna capilar metálica TraceGOLD TG-5MT (Thermo Fisher Scientific)
(15 m x 0,25 mm x 0,1 μm), com temperatura máxima de aquecimento igual a 430°C e
pré-coluna capilar de sílica desativada e sem fase estacionária (2 m x 0,53 mm).
Tabela 1 - Condições cromatográficas adotadas na determinação de glicerina livre e total em biodiesel.
2.3. Preparação da Instrumentação
2.3.1. Itens necessários na configuração do TriPlus RSH: ...................................................
Estação de troca automática de seringas, com três seringas: 100 µL para os reagentes,
10 mL para n-heptano e 10 µL para as injeções no cromatógrafo. Estação de solventes
com três frascos contendo n-heptano. Estação de lavagem com um frasco de solvente e
outro para descarte.Vortexer para homogeneização. ............................................................
2.3.2. Preparação do TriPlus RSH para as análises: ..............................................................
Colocar na bandeja os vials de 10 mL vazios para as soluções de calibração e os vials
com 100 mg de amostras de biodiesel. A pesagem da amostra é a única etapa manual
deste procedimento analítico. Colocar as soluções de padrões e os solventes de lavagem
na bandeja de 15 vials de 10 mL, conforme Figura 1-(A) para ASTM D6584 e 1-(B) para
EN14105. .............................................................................................................................
(A)
(B)
Figura 1 – Distribuição dos vials de padrões e de solvente de lavagem na bandeja para 15 vials.
(A) para execução do método ASTM 6584; (B) para EN14105.
2.4. Etapas realizadas pelo TriPlus RSH segundo o método ASTM D6584
2.4.1. Preparação de cinco soluções de calibração: ............................................................
O TriPlus RSH transfere os volumes especificados na Tabela 2 diretamente para os vials
vazios de 10 mL. Adiciona 100 μL do agente derivatizante MSTFA e agita para
homogeneização. Após um período de 15-20 min, o TriPlus RSH adiciona 8 mL de
n-heptano em cada vial e agita. ...........................................................................................
2.4.2. Preparação das amostras: ..........................................................................................
O TriPlus RSH adiciona 100 μL de cada um dos dois padrões internos e 100 μL de
MSTFA em cada vial com amostra e agita para homogeneização. Após um período de
15-20 min, o TriPlus RSH adiciona 8 mL de n-heptano em cada vial e agita. A execução
de cada etapa leva em conta o tempo de derivatização necessário tanto para as amostras
quanto para os padrões. .......................................................................................................
Tabela 2 – Volumes (µL) das soluções estoque de padrões adicionados pelo TriPlus RSH em vials
de 10 mL para a preparação de cinco soluções de calibração conforme o método ASTM D6584.
2.5. Etapas realizadas pelo TriPlus RSH segundo o método EN 14105:...............................
2.5.1. Preparação de quatro soluções de calibração: ............................................................
O TriPlus RSH transfere os volumes especificados na Tabela 3 diretamente para os
vials vazios de 10 mL previamente fechados. Adiciona 150 μL do agente derivatizante
MSTFA e agita para homogeneização. Após um período de 15-20 min, o TriPlus RSH
adiciona 8 mL de n-heptano em cada vial e agita. ...............................................................
Tabela 3 – Volumes (µL) adicionados pelo TriPlus RSH em vials de 10 mL para a preparação de quatro
soluções de calibração conforme o método EN 14105.
2.5.2. Preparação das amostras: ...................................................................................................
O TriPlus RSH adiciona 80 μL de butanotriol (padrão interno), 200 μL da mistura de
padrões de mono, di e triglicerideos, 200 μL de piridina e 200 μL de MSTFA nos vials
das amostras e agita para homogeneização. Após um período de 15-20 min, o TriPlus
RSH adiciona 8 mL de n-heptano em cada vial e agita. A execução de cada etapa leva
em conta o tempo de derivatização necessário tanto para as amostras quanto para os padrões.
3. Resultados ................................................................................................................................
3.1. Método ASTM D6584 .........................................................................................................
..........................................................................................................
Dois exemplos de cromatogramas obtidos através do método ASTM D6584 estão
apresentados na Figura 2, na qual (a) corresponde a uma amostra de biodiesel e (b) a
uma solução de calibração.
Figura 2 – Cromatogramas obtidos através do método ASTM D6584: (a) amostra de biodiesel;
(b) solução de calibração.
Na Tabela 4 estão apresentados os resultados de glicerina livre, combinada e total
obtidos na análise de doze amostras de biodiesel e expressos como porcentagem em massa.
Tabela 4 – Resultados de glicerina livre, combinada e total em amostras de biodiesel, expressos como % em
massa e obtidos através do método ASTM D6584.
O método ASTM D6584 estabelece alguns critérios de aceitabilidade dos
resultados e um deles é a linearidade. As curvas analíticas preparadas pelo TriPlus RSH
para glicerina, mono, di e triglicerídeos apresentam coeficientes de correlação > ou = 0,99
(Figura 3) conforme necessário para atender a esse método.
Figura 3 - Curvas analíticas preparadas pelo TriPlus RSH pelo método ASTM D6584.
Outros critérios de aceitação dos resultados são repetibilidade (r) e
reprodutibilidade (R). ........................................................................................................
Para a repetibilidade o método afirma que: “A diferença entre corridas sucessivas
obtidas pelo mesmo operador com a mesma aparelhagem, sob condições de operação
constantes sobre uma amostra idêntica poderá exceder o valor calculado de r uma vez
em vinte.” ...........................................................................................................................
Para a reprodutibilidade o método afirma que: “A diferença entre os resultados de
duas corridas independentes, obtidas por operadores diferentes, trabalhando em
laboratórios diferentes, nas condições de operação do método, sobre uma amostra
idêntica poderá exceder o valor calculado de R uma vez em vinte.” ...............................
A repetibilidade dos resultados de glicerina livre e total obtidos pelo método
ASTM D6584 está apresentada na Figura 4. Todas as amostras testadas atenderam ao
critério de precisão do método. ...........................................................................................
Figura 4 – Valores de repetibilidade (r) e da diferença entre os resultados de duas corridas independentes
() para glicerina livre e total, pelo método ASTM D6584.
3.2.Resultados obtidos para o método EN 14105 ..............................................................
O cromatograma de uma amostra de biodiesel obtido pelo método EN 14105 está
apresentado na Figura 2. As regiões destacadas neste cromatograma indicam as janelas
de eluição da glicerina, mono, di e triglicerídeos. Os picos mais intensos nessas regiões
são dos padrões internos.
Figura 5 – Cromatograma de uma amostra de biodiesel obtido pelo método EN 14105.
Na Tabela 5 estão apresentados os resultados de glicerina livre e total obtidos
na análise de treze amostras de biodiesel e expressos como porcentagem em massa.
Tabela 5 - Resultados de glicerina livre e total em amostras de biodiesel expressos como % em
massa e obtidos através do método EN 14105.
A Figura 6 apresenta uma curva analítica para glicerina preparada pelo
TriPlus RSH segundo o método EN 14105, a qual demonstra a grande linearidade
alcançada.
Figura 6 – Curva analítica preparada pelo TriPlus RSH para a glicerina, pelo método EN 14105.
A repetibilidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos na determinação de
glicerina livre e total em vinte amostras de biodiesel atenderam aos critérios de precisão
do método EN 14105 (Figuras 7 e 8).
Figura 7 – Valores de repetibilidade (r) e da diferença entre os resultados de duas corridas independentes
 para glicerina livre e total, pelo método EN 14105.
Figura 8 – Valores de reprodutibilidade (R) e da diferença entre os resultados de duas corridas
independentes  para glicerina livre e total, pelo método EN 14105.
4. Conclusão ......................................................................................................................
Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que o emprego do amostrador
robotizado TriPlus RSH é eficiente na automação dos procedimentos analíticos de
determinação de glicerina livre e total em biodiesel segundo os métodos ASTM D6584 e
EN14105. O TriPlus RSH garante alta precisão na manipulação das soluções e amostras,
sem ocorrência de contaminação cruzada. Uma redução dos volumes utilizados de
padrões, solventes e do agente derivatizante, e uma economia de tempo e espaço do
laboratório foram vantagens adicionais observadas com o emprego do amostrador
automático TriPlus RSH. .....................................................................................................
5. Referências .....................................................................................................................
(1) EN 14105: Fat and oil derivatives – Fatty Acid Methyl Esters (FAME) Determination of free and total glycerol and mono-, di-, tri-glyceride content.
(2) ASTM D6584: Standard Test Method for Determination of Free and Total Glycerin
in B-100 Biodiesel Methyl Esters by Gas Chromatography.