Nucleotidasa
Para a determinação de 5'-nucleotidase em soro
SIGNIFICADO CLÍNICO
A 5'-nucleotidase (5'-ribonucleótido fosfohidrolase,
E.C.3.1.3.5.) é uma enzima amplamente distribuída em
tecidos e órgãos, entre os quáis encontra-se o fígado.
Um aumento de 5'-nucleotidase em soro corresponde ao
incremento de síntese provocado em forma específica pela
colestase, sendo que esta enzima não responde a outros mecanismos de indução enzimática (álcool, drogas). Encontramse valores aumentados em pacientes com doença hepatobiliar
com obstrução biliar intra-hepática ou extra-hepática, carcinoma hepático, cirrose biliar e mieloma múltiplo.
Os seus níveis são paralelos àqueles da fosfatase alcalina,
mas não está comprometida no metabolismo ósseo nem no
da mucosa intestinal.
A determinação tem utilidade na diferenciação entre a icterícia obstrutiva e a hepatocelular e entre a doença hepática
e a óssea.
FUNDAMENTOS DO MÉTODO
A 5'-nucleotidase catalisa a desfosforilação de adenosina-5'monofostato (AMP), com máxima atividade a pH 7,5. Neste
pH, o AMP também é hidrolisado não especificamente pelas
fosfatases alcalinas (ALP) presentes na amostra, segundo:
AMP + H2O
5'-nucleotidase
(e ALP)
adenosina + Pi
A 5'-nucleotidase é inibida em forma seletiva pelos íons
Ni2+. A diferença da medida entre o fosfato (Pi) liberado na
presença e ausência de Ni2+ (determinando pela reação
colorimétrica de Fosfatemia de Wiener lab.) é proporcional
à atividade de 5'-nucleotidase.
REAGENTES FORNECIDOS
A. Reagente A: frascos contendo denosina-5'-monofostato.
Uma vez reconstituído cada frasco contém 1 mmol/l de AMP.
B. Reagente B: tampão Veronal 40 mmol/l, pH 7,5 contendo
Mg2+, 10 mmol/l.
C. Reagente C: cloreto de níquel 130 mmol/l.
REAGENTES NÃO FORNECIDOS
- Fosfatemia da Wiener lab.
- Água destilada.
INSTRUÇÕES DE USO
Reagente A; preparação: adicionar 2,5 ml de Reagente
B a um frasco de Reagente A. Misturar por inversão até
dissolução completa.
Reagente B: pronto para uso.
Reagente C: pronto para uso.
PRECAUÇÕES
Os reagentes são para uso diagnóstico "in vitro".
Utilizar os reagentes observando as precauções habituais
de trabalho no laboratório de análises clínicas.
Todos os reagentes e as amostras devem ser descartadas
conforme à regulação local vigente.
ESTABILIDADE E INSTRUÇÕES DE
ARMAZENAMENTO
Reagentes Fornecidos: são estáveis sob refrigeração (210oC) até a data do vencimento indicada na embalagem.
Reagente A reconstituído: estável por 30 dias sob refrigeração (2-10oC) e ao abrigo da luz.
INDÍCIOS DE INSTABILIDADE OU DETERIORAÇÃO
DOS REAGENTES
Uma coloração amarelada do Reagente A dessecado é
indício de deterioração do mesmo. Conservar perfeitamente
tampado e ao abrigo da umidade.
AMOSTRA
Soro
a) Coleta: obter soro livre de hemólise.
b) Aditivos: não são necessários.
c) Substâncias interferentes conhecidas: referência
bibliográfica de Young para efeitos de drogas neste método.
d) Estabilidade e instruções de armazenamento: caso de
não se realizar o ensaio na hora o soro pode ser conservado
durante 2 dias sob refrigeração (2-10oC) ou uma semana
congelado (-20oC).
MATERIAL NECESSÁRIO (não fornecido)
- Espectrofotômetro ou fotocolorímetro.
- Tubos ou cubetas espectrofotométricas.
- Micropipetas e pipetas.
- Banho Maria a 37oC.
- Relógio ou timer.
CONDIÇÕES DE REAÇÃO
- Comprimento de onda: 620-650 nm em espectrofotômetro
ou em fotocolorímetro com filtro vermelho (620-700 nm).
- Temperatura de reação: 37oC
- Tempo de reação: 45 minutos
- Volume de amostra: 20 ul
- Volume final da reação: 3,7 ml
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PROCEDIMENTO
Em dois tubos marcados DT (Desconhecido Total: fosfatase alcalina + 5'-nucleotidase) e DI (Desconhecido
inibido: fosfatase alcalina) colocar:
Reagente A reconstituído
Reagente C
DT
DI
0,2 ml
0,2 ml
-
20 ul
Colocar em banho Maria a 37oC uns minutos. Após
adicionar:
Amostra
20 ul
20 ul
Misturar e incubar exatamente 30 minutos. Após adicionar
os reagentes de Fosfatemia da seguinte maneira:
Reagente A (Fosfatemia)
1 ml
1 ml
Misturar por agitação suavemente. Esperar pelo menos
30 segundos e não mais de 2 minutos. Após adicionar:
Reagente B (Fosfatemia)
1 ml
1 ml
Misturar. Esperar pelo menos 30 segundos e não mais
de 2 minutos. Após adicionar:
Reagente C (Fosfatemia)
1,5 ml
1,5 ml
Misturar por inversão. Após 10 minutos, tirar do banho
e ler em espectrofotômetro entre 620 e 650 nm ou em
fotocolorímetro com filtro vermelho (620 a 700 nm) zerando o aparelho com água destilada.
Fator colorimétrico: enquanto se desenvolve a reação
enzimática, colocar 0,2 ml de água destilada em dois
tubos marcados P (Padrão) e B (Branco de Reagente).
Adicionar 20 ul de Padrão no tubo P. Misturar agitando
suavemente. Colocar ambos os tubos em banho Maria
a 37oC e adicionar os reagentes de Fosfatemia, como é
indicado no PROCEDIMENTO. Ler zerando o aparelho
com o Branco.
- Na hora de adicionar o Reagente C pode produzir-se
turbidez que desaparece durante a reação de cor com os
reagentes de Fosfatemia.
- Contaminações com fosfatos: todo o material de vidro utilizado (incluindo na coleta da amostra) deve estar livre de
fosfatos, íons metálicos e cianetos (venenos enzimáticos).
Deve-se ter muita precaução na limpeza do material que foi
utilizado para reagentes contendo tampão fosfatos na sua
composição. Recomenda-se usar Noión da Wiener lab.
- Ler com muito cuidado as instruções de Fosfatemia da
Wiener lab. antes de utilizar.
DESEMPENHO
a) Reprodutibilidade: processando duplicatas das mesmas
amostras num mesmo dia se obtiveram:
Nível
92,3 U/l
15,3 U/l
D.P.
± 2,94 U/l
± 0,89 U/l
C.V.
3,19 %
5,82 %
b) Faixa dinâmica: a reação é linear até leituras de 1,200 D.O.
Para valores superiores se deve realizar novamente a determinação utilizando 15 minutos de incubação a 37oC (no lugar
dos 30 minutos indicados no PROCEDIMENTO). O resultado
se deve multiplicar por 2.
c) Limite de detecção: em espectrofotômetro, para 0,001 D.O.
a mínima mudança de atividade detectável será de 0,3 U/l.
APRESENTAÇÃO
Kit para 50 determinações (Cód. 1631001).
REFERÊNCIA
- Bergmeyer, H.U. - “Methods of Enzymatic Analysis”, Academic Press Vol. 2 pág. 871, 1965.
- Domecq, R.V. - La Prensa Médica Argentina - 64/13:475
(1977).
- Baginski, E.S. et al - LAB V/2:193 (1978).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",
AACC Press, 4th ed., 2001.
ESTABILIDADE DA MISTURA DE REAÇÃO FINAL
A cor da reação é estável durante 3 horas, pelo que a absorbância deve ser lida nesse período.
CÁLCULO DOS RESULTADOS
O Padrão de Fosfatemia equivale a 43 U/l de 5'-nucleotidase.
5'-nucleotidase (U/l) = fator x (DT - DI)
43 U/l
fator =
P
VALORES DE REFERÊNCIA
Até 15 U/l
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sues próprios valores de referência.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
- Vide Substâncias interferentes conhecidas em AMOSTRA.
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Símbolos
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
P
V
X
Este producto cumple con los requerimientos
previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de
productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
Representante autorizado en la Comunidad
Europea
M
Xn
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro"
Contenido suficiente para <n> ensayos
Elaborado por:
Corrosivo / Caústico
Xi
Irritante
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)

No congelar
F
i
Calibr.
b
Consultar instrucciones de uso
Calibrador
Control
Riesgo biológico
Volumen después de la reconstitución
Cont.
Contenido
g
Número de lote
b
c
h
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
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UR091125