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INVESTIGAÇÃO DE ALVOS DA TIROSINA FOSFATASE DUALDUSP3 NA RESPOSTA AOS DANOS NO DNA
Mônica H. M. Nascimento1 (IC)*, Fábio L. Forti2 (PQ). * [email protected]
1 Universidade Federal do ABC, Centro de Ciências Naturais e Humanas, Santo André/SP
2 Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo/SP
Protein tyrosine phosphatases (PTPs) regulate signaling and other biochemical processes through dephosphorylation of
proteins at the tyrosine residue. Disruption of the functioning of tyrosine phosphatases may lead to serious diseases and disorders.
Based on the literature known up to now and preliminar results, the following experiments were performed: 1) Western blot for
proteins VHR (interest), Cyclin B1, and Actin (controls) to verify the stability and expression during the cell cycle, 2) Laser Scanning
Microscopy (Fluorescence Confocal) to determine the expression and localization of proteins VHR, pJNK, pATF2, and pH2AX 3)
Theoretical research using bioinformatics tools looking at structural features of proteins that may be possible targets of VHR by
analogy to known substrates, mainly based on alignment of proteins and post-translational modifications as phosphorylation,
associated with experimental evidences. The results show that VHR is a protein stable to degradation and highly expressed during the
cell cycle, which quickly migrates to the nucleus of human cervix carcinoma cervix cells (HeLa), after receiving gamma radiation, and
co-localizes with the phosphorylated forms of Histone 2AX (pH2AX) and the transcription factor ATF2 (pATF2). Moreover, in cells
irradiated by ultraviolet light type C, VHR is on DNA damaged by mutation or other chemical modification co-localizing with
phospho-JNK and pATF2. The theoretical investigation resulted in a list of probable protein substrates of VHR with more than 30
potential candidates exhibiting the TXY motif with high probability of phosphorylation by VHR in the two known residues, but
experimental validation is under way.
I. INTRODUÇÃO
A
fosforilação do aminoácido tirosina é um mecanismo
fundamental para importantes aspectos da fisiologia dos
eucariotos, assim como para a saúde humana. Este mecanismo
esta presente na comunicação, proliferação e diferenciação
celular, em processos como regulação de transcrição de genes,
processamento de RNAm e transporte de moléculas para
dentro ou fora das células. Anormalidades em seu
funcionamento podem provocar muitas doenças hereditárias
ou adquiridas desde câncer até imunodeficiências [1]. O grupo
fosfato ou fosforil é removido dos resíduos tirosil por uma
família de enzimas conhecida como proteínas tirosina
fosfatases (PTPs), que apresentam funções ímpares em
prevenir a transformação celular maligna, em limitar a
transdução de sinal intracelular e em manter a homeostase
normal das células [2]. As PTPs utilizam um mecanismo
catalítico à base de cisteína partilhada com uma ampla família
de hidrolases, incluindo fosfatases especificas para
fosfolipídios e RNA. Uma exceção a esta regra é a subfamília
PTPase de fosfatases duais específicas (DSPs ou DUSPs), que
prontamente desfosforilam resíduos de fosfotirosina e
fosfotreonina. A maioria das DUSPs é específica para
proteínas quinase ativadas por mitógenos como ERK, JNK, e
p38, que são ativadas por uma dupla fosforilação da tirosina e
treonina no motivo Thr-X-Tyr. Assim, essas DUSPs são
muitas vezes referidas como MAP quinase fosfatases ou
MKPs. A primeira DUSP a ser clonada foi a proteína VH1 a
partir do vírus Vaccinia; uma enzima relacionada foi
encontrada posteriormente em células de mamíferos e
denominada VHR ou DUSP3. Ambos VH1 e VHR diferem de
outras DUSPs, pois são muito menores, só 19 e 21 KDa,
respectivamente. VH1 tem sido relatada a desfosforilar tanto
MAP quinase e Stat1, enquanto VHR parece ser específica
para Erk e Jnk [4]. Embora a função fisiológica de VHR ainda
pareça pouco esclarecida, sua estrutura já foi cristalizada[3] e
estudos recentes mostram que VHR inibe a apoptose em
células de câncer de próstata e é super-expressa neste tipo de
câncer [5], bem como em câncer de cervix humano e sua
expressão, reduzida ou totalmente eliminada, causa um
bloqueio do ciclo celular e indução de senescência [7].
II. OBJETIVOS
Este trabalho pretende investigar o envolvimento da
fosfatase dual atípica DUSP3/VHR nos focos de reparo de
DNA após lesão causada por radiações ionizantes (gama e luz
ultravioleta) em linhagens celulares humanas transformadas
(carcinoma de cervix, HeLa).
III. MÉTODOS
Baseando-se em dados da literatura conhecidos até o
momento, foram realizados experimentos de: 1) Western Blot
para as proteínas VHR (interesse), Actina e Ciclina (controle)
para verificação da estabilidade e expressão ao longo do ciclo
celular; 2) microscopia confocal de fluorescência para a
determinação da expressão e localização das proteínas VHR,
pJNK, pATF2 e pH2AX, e 3) investigação teórica das
características estruturais de proteínas que podem ser possíveis
alvos de VHR por analogia a substratos conhecidos, utilizando
ferramentas de bioinformática principalmente baseadas em
alinhamento de proteínas e modificação pós-traducional por
fosforilação, associadas a comprovação experimental.
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados experimentais obtidos até o momento
mostram que VHR é uma proteína estável à degradação e de
alta expressão ao longo do ciclo celular, que migra
rapidamente para o núcleo de células de carcinoma de cervix
2
(HeLa) humanas, após receberem radiação ionizante, e
encontra-se em focos de DNA danificado por quebra na duplafita, colocalizando-se com Histonas 2AX e com o fator de
transcrição ATF2 fosforilados. Além disso, após irradiação
das células com luz ultravioleta tipo C, VHR encontra-se em
focos de DNA lesado por provável mutação e ou modificação
química, colocalizando-se com JNK e ATF2 fosforilados. A
investigação teórica computacional resultou numa lista
considerável de substratos protéicos da DUSP3 com mais de
30 possíveis candidatos que possuem o motivo TXY com alta
probabilidade de fosforilação em um dos dois resíduos
sabidamente alvos de desfosforilação por VHR. Partes da
seqüência destas proteínas foram analisadas através de um
alinhamento teórico e os resultados estão sendo comparados,
utilizando um programa de alinhamento de seqüência múltipla
de proteínas e DNA, o Clustal W [6].
V. CONCLUSÃO
A proteína tirosina fosfatase dual atípica DUSP3/VHR se
encontra nos focos de resposta ao DNA lesado por radiações
ionizantes gama e UVC na linhagem celular humana HeLa e
se colocaliza com uma proteína indicadora de reparo de DNA,
Mre11, identificada graças a investigação teórica de possíveis
alvos por homologia estrutural. Estes experimentos estão
sendo repetidos em outra linhagem tumoral humana de
melanoma não-metastático (MeWo), que possui o sistema de
reparo de DNA da proteína p53 normal, e os resultados têm
demonstrado, embora não tão claramente como em linhagens
de HeLa, a colocalização de VHR com as proteínas analisadas,
confirmando assim os experimentos já realizados. Pretende-se
também investigar outras proteínas nucleares encontradas em
focos de reparo de DNA, levantadas a partir desta investigação
teórica, e dados preliminares confirmam a colocalização de
VHR com outras proteínas de reparo levantando uma função
até agora totalmente desconhecida desta tirosina fosfatase dual
na manutenção da integridade genômica de células tumorais.
VI . AGRADECIMENTOS
A Deus, que por sua presença, luz e força sempre me
abençoa e capacita para tudo aquilo que Ele me destina.
Ao meu Orientador Prof. Dr. Fábio Luís Forti pelo
ensinamento e dedicação ao meu trabalho.
Ao Prof. Dr Hugo Armelin do Depto de Bioquímica do IQUSP, pela concessão de seu laboratório para a realização dos
experimentos.
Aos meus queridos familiares e amigos pelo apoio e
incentivo e por acreditarem em meu sucesso.
A Universidade Federal do ABC pela oportunidade de
aprendizado.
A CNPq pela bolsa concedida e a Fapesp pelo projeto
concedido.
VII . REFERÊNCIAS
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