REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS E EUCARIOTOS 1 O CICLO CELULAR E A REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS ¾ Como acontece em procariotos? CARACTERÍSTICAS UNIVERSAIS DO MECANISMO DE REPLICAÇÃO DE DNA: ¾ SEMI-CONSERVATIVO ¾ BIDIRECIONAL ¾ SEMI-DESCONTÍNUO 2 MESELSON-STAHL (1958) Modelo de replicação semi-conservativo DEMONSTRAÇÃO DA BIDIRECIONALIDADE DO PROCESSO DE REPLICAÇÃO DO DNA A PARTIR DA ORIGEM DO SV40 3 A BOLHA E AS FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO DO DNA PROCARIOTOS EUCARIOTOS Genoma pequeno e circular Genoma grande e linear Única origem de replicação Múltiplas origem de replicação biderecional biderecional Como são classificadas as enzimas envolvidas na síntese de DNA, chamadas “DNA-polimerases”? 4 TIPOS DE DNA POLIMERASES E SUAS RESPECTIVAS FUNÇÕES DNA POLIMERASE DNA-DEPENDENTE Envolvida em replicação, reparo e recombinação do DNA. Catalisa a adição de um desoxiribonucleotídeo ao terminal 3´ de uma cadeia preexistente, utilizando uma cadeia de DNA complementar como molde . Portanto, depende de uma fita molde e de um primer. DNA POLIMERASE RNA-DEPENDENTE Transcriptase reversa Envolvida na replicação de retrovírus. Descoberta por Temein e Baltimore, em 1970. Não apresenta atividade exonuclease 3´-5´. Além da atividade DNA polimerase RNA dependente, apresenta também as atividades RNAse H e DNA polimerase DNA-dependente. Catalisa a adição de desoxiribonucleotídeos ao terminal 3´ de uma cadeia de DNA preexistente, utilizando uma cadeia de RNA complementar como molde e um primer exógeno específico. Num estágio seguinte, a fita híbrida DNA DNARNA é convertida em DNA-DNA, por ação das atividades RNAse H e DNA polimerase DNAdependente. Portanto, depende de uma fita molde e de um primer. Telomerase Envolvida na manutenção do tamanho dos telômeros. Catalisa a adição de um desoxi-ribonucleotídeo ao terminal 3´ de uma cadeia pré existente, utilizando uma seqüência de RNA complementar interna (grupo prostético) como molde. Portanto, depende apenas de uma fita molde de DNA. Enzima encontrada em células germinativas de eucariotos. PIADA DE BIOLOGISTA MOLECULAR 5 CARACTERÍSTICAS DAS DNA POLIMERASES (parte 1) 1. Não são capazes de iniciar síntese de novo. Precisam de 3’ OH livre fornecido pelo iniciador (primer) 2. Necessidades de íons de Mg2+ 3. Acrescentam nucleotídeos à fita recém sintetizada obedecendo obedece do o pa pareamento ea e to de bases com a fita molde. CARACTERÍSTICAS DAS DNA-POLIMERASES (parte 2) 4. Remoção de nucleotídeos: atividade exonuclease (5’→ 3’) replicação, reparo de mutações atividade exonuclease ((3’→ 5’)) revisão 5’ E i Enzima fi fiell com frequência de erro de ~ 10-5 a 10-6 3’ 6 ATIVIDADES DA DNA POLIMERASE EXONUCLEASE 3’ – 5’ POLIMERASE 5’ – 3’ Figure 5-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) REAÇÃO CATALISADA PELA DNA POLIMERASE PIROPHOSPHATASE Figure 5-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 7 A REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS 8 ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO O SITIO DE INICIO DE REPLICAÇÃO DO DNA, DENOMINADO “ORIGEM DE REPLICAÇÃO” (ori-C). (APRESENTA SEQUENCIAS CONSENSO ESPECÍFICAS) 9 FORMAÇÃO DO COMPLEXO DE INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO 10 DESNATURAÇÃO DO DNA E SÍNTESE DE UMA SEQUÊNCIA INICIADORA DE RNA ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: PROCARIOTOS ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO 11 FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO: 3` ¾ FITA CONTÍNUA ¾ FITA DESCONTÍNUA 5` 3` 3` 5` 3` 5` 5` 5’ 3’ 3` 3` 3` 3` ASSOCIAÇÃO DO DNA COM A DNA POLIMERASE III (gama-loader) (Beta-clamp) 12 O DÍMERO DE DNA POLIMERASE III NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO A REPLICAÇÃO SIMULTÂNEA DAS DUAS FITAS DE DNA PELO DÍMERO DE DNA POLIMERASE III 13 PAPEL DAS “SSDNA-BINDING-PROTEINS” Figure 5-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) SÍNTESE Í DESCONTÍNUA Í DA FITA ATRASADA DE DNA: ¾ papel da DNA-POL I ¾ papel da DNA LIGASE Figure 5-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 14 FORMAÇÃO DO “SUPERCOILING” POSITIVO NA FORQUILHA DE Ç REPLICAÇÃO Figure 5-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Super-helicoidização Super-helicoidização induzida por abertura 15 Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM PROCARIOTOS: PROCARIOTOS ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO 16 SEQUÊNCIAS TERMINADORAS DA REPLICAÇÃO DO DNA RESOLUÇÃO DOS CONCATÂMEROS DE DNA 17 A REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS EUKARYOTIC DNA POLYMERASES: PROPOSAL FOR A REVISED NOMENCLATURE. Peter M. J. Burgers et.al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 47, Issue of November 23, pp. 43487–43490, 2001. GREEK NAME HUGO NAME CLASS α (alpha) POLA B β (beta) POLB X γ (g (gamma)) POLG A δ (delta) POLD1 B ε (epsilon) POLE B ζ (zeta) POLZ B η (eta) POLH Y θ (theta) POLQ A ι (iota) POLI Y κ (kappa) POLK Y λ (lambda) POLL X μ (mu) POLM X ς (sigma) POLS X REV1L Y TDT X PROPOSED MAIN FUNCTION DNA POL1 replication Base excision repair Mitochondri MIP1 al replication DNA POL3 replication DNA POL2 replication Bypass REV3 synthesis Bypass RAD30, XPV synthesis OTHER NAMES mus308, eta DNA repair Bypass synthesis Bypass synthesis Base POL4, beta2 excision repair Nonhomologous end joining Sister TRF4, kappa chromatid cohesion Bypass REV1 synthesis Antigen receptor diversity RAD30B DinB1, theta 18 ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO ORIGENS (19) DE REPLICAÇÃO NO CROMOSSOMO III DE LEVEDURA UMA ORIGEM DE REPLICAÇÃO DE LEVEDURA ORC – origin recognition complex Abf1 – proteina que facilita a ligação de ORC 19 MECANISMO DE INÍCIO DA REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: Única utilização de uma origem de replicação por ciclo celular Cdc6 e Cdt1 - Helicase loading proteins Figure 5-36 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM EUCARIOTOS: EUCARIOTOS ¾ INÍCIO ¾ ALONGAMENTO ¾ TÉRMINO 20 REPLICAÇÃO DO DNA DE SV40: papel de FEN 1 REPLICAÇÃO DO DNA DE SV40 21 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 "for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme y telomerase" Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak REPLICAÇÃO DO TELÔMERO PELA TELOMERASE Figure 5-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 22