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MARCELO SIVIERI DE ARAÚJO
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE NAS LESÕES ORAIS DE
PARACOCCIDIOIDOMICOSE, POR MEIO DA EXPRESSÃO DE
CITOCINAS DO PERFIL TH2, TH 17 E TREG, DOS RECEPTORES
DO TIPO TOLL, GALECTINA E METALOPROTEINASES DE
MATRIZ
UBERABA, MG
2014
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MARCELO SIVIERI DE ARAÚJO
ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE NAS LESÕES ORAIS DE
PARACOCCIDIOIDOMICOSE, POR MEIO DA EXPRESSÃO DE
CITOCINAS DO PERFIL TH2, TH 17 E TREG, DOS RECEPTORES
DO TIPO TOLL, GALECTINA E METALOPROTEINASES DE
MATRIZ
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade de Federal do
Triângulo Mineiro como exigência para realização
de curso de Doutorado, área de concentração:
Patologia Básica e Experimental.
Orientadora: Prof. Dra. Denise Bertulucci Rocha Rodrigues
Co-orientador: Prof. Dr. Virmondes Rodrigues Júnior
UBERABA, MG
2014
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Àqueles que são o alicerce da minha vida:
Deus....
“Por que Dele, e por meio Dele, e para Ele são todas as coisas.
A Ele, pois a glória eternamente. Amém!”
Romanos, 11.3.
Minha esposa Janeide, mulher virtuosa, exemplo de amor,
fidelidade, força, dignidade, sabedoria, bondade e temor ao Senhor.
Meus filhos Samuel e Mariana, “herança do Senhor”. Fontes de
minha inspiração e força no tempo presente e esperança para o dia
de amanhã.
Meus pais, Carlos e Cecília e meus irmãos, Adriana e Gustavo,
sempre presentes, meu afeto e gratidão.
5
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Denise Bertulucci Rocha Rodrigues e ao Prof. Dr. Virmondes Rodrigues Júnior
pela oportunidade, confiança e amizade em tornar possível esta conquista acadêmica. A
experiência, conhecimento e retidão serão sempre para mim, referências de profissionalismo;
À Profa. Dra. Adriana Gonçalves de Oliveira, Prof. Dr. Alexandre de Paula Rogério; e ao Prof.
Dr. Paulo Roberto da Silva, pela participação e sugestões no meu exame de qualificação;
À Universidade Federal do Triângulo Mineiro e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, pela oportunidade de realizar este curso;
À Universidade de Uberaba pelo uso das dependências do Laboratório de Histopatologia,
Biopatologia e Biologia Molecular na realização de parte da metodologia e análise morfológica
deste trabalho.
À Ms. Polyanna Miranda Alves, Técnica do Laboratório do Cefores/UFTM pela realização dos
ensaios imunohistoquímicos realizados neste trabalho.
À Andréa Cristina da Costa, Técnica do Laboratório de Histopatologia/UNIUBE pela realização
da coloração de Hematoxilina e Eosina, Azul de Toluidina e Picrosírius deste trabalho;
6
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPQ pelo apoio
financeiro.
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RESUMO
Na Paracoccidioidomicose (PCM) os aspectos fisiopatológicos não estão completamente
esclarecidos. O estudo da resposta imune contra a micose tem fornecido subsídios para o
entendimento da história natural da doença e suas manifestações clínicas, contribuindo para o
desenvolvimento de medidas protetoras e de propostas terapêuticas. O objetivo deste estudo foi
avaliar aspectos histopatológicos e imunológicos envolvidos no papel das diferentes respostas
efetoras (Th2 e Th17), respostas regulatórias (Treg), bem como, a correlação entre os TLRs,
Galectinas, Metaloproteinases de Matriz e das proteases citoplasmáticas de mastócitos nesta
micose. Foram analisados 16 fragmentos de biópsia de pacientes com diagnóstico de PCM oral
crônica e o grupo controle foi constituído de 13 de fragmentos de mucosa oral com
características histológicas de normalidade. A detecção dos mastócitos pelo azul de toluidina, a
quantificação da fibrose pelo picrosírius e a expressão de quimase, triptase, IL-10, IL-4, TGF-β,
IL-17, FoxP3, Gal-1,Gal-3,Gal-9, TLR-2, TLR-4, MMP-3 e MMP-9 foram realizados pela
técnica de imunohistoquímica. Nos pacientes com PCM foi observado um aumento significativo
na área de fibrose e no número de células que expressaram IL-10, IL-4, IL-17, FoxP3, Gal-3,
TLR-2, MMP-3 e MMP-9 quando comparados com grupo controle. Não foi encontrada
diferença na expressão do TGF-β, TLR-4, Gal-1 e Gal-9. Já a quantificação de mastócitos, e a
expressão de quimase e triptase o número de células foi significativamente menor na PCM oral
crônica. A análise da expressão das citocinas com o tipo de organização dos granulomas
verificou-se que, houve um aumento significativo da expressão da IL-4 em granulomas não
organizados, não sendo encontrada diferença significativa na expressão das outras citocinas,
TLRs, Gals, e MMPs. As proteínas estudadas parecem ter um papel importante no
desenvolvimento e manutenção das lesões na PCM oral, bem como nos processos de
desenvolvimento e progressão das lesões causadas pelo fungo e pela resposta imune à doença.
Há necessidade de novos estudos em humanos sobre participação destas proteínas no processo
inflamatório, já que muitas destas vêm sendo estudadas apenas em modelos experimentais.
Palavras chave: Citocinas efetoras. Citocinas reguladoras. Galectinas. Metaloproteinases de
matriz. Paracoccidioidomicose. Proteases citoplasmáticas de mastócitos.
like”.
Receptores “Toll-
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ABSTRACT
Although the pathophysiology of Paracoccidioidomycosis (PCM) is not completely understood,
the study of immune response against fungi has provided insight into understanding the natural
course of the disease and its clinical manifestations, hence contributing to the development of
preventive measures and treatment proposals. The aim of this study was to evaluate the
histopathological and immunological aspects involved in the role of different effector and
regulatory responses, as well as the correlation between the TLRs, Galectins, Matrix
Metalloproteinases and cytoplasmic proteases of mast cells in this infection. Sixteen biopsy
specimens with oral lesions of chronic PCM, as well as 13 sections of normal oral mucosa were
analyzed. Histopathological and immunological aspects involved in the role of different effector
and regulatory responses were evaluated. Indirect immunohistochemistry was performed for IL17, IL-10, IL-4, TGF-β, FoxP3, Gal-1, Gal-3, Gal-9, TLR-2, TLR-4, MMP-3 and MMP-9, as
well as for chymase and tryptase. Fibrosis was quantified using Picrosirius. There was a
significant increase in the area of fibrosis and in the number of cells expressing IL-10, IL-4, IL17, FoxP3, Gal-3, TLR-2, MMP-3 and MMP-9 in patients with PCM in comparison with
patients in the group control. There was no difference in the expression of TGF-β, TLR-4, Gal-1
or Gal-9. Cell number was found to be significantly lower in oral chronic PCM after
quantification of mast cells and expression of chymase and tryptase. Analysis of cytokine
expression regarding the type of organization of the granulomas showed that there was a
significant increase in the expression of IL-4 in disorganized granulomas. The proteins studied
herein appear to play an important role in the development and maintenance of oral lesions of
PCM, as well as in the processes of development and progression of lesions caused by the
fungus and by the immune response associated with the disease.
Key words: Effector Cytokines. Galectins. Mast Cells Peptidases. Matrix Metalloproteinases.
Oral Paracoccidioidomycosis. Regulatory Cytokines. Toll-Like Receptors.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: (A) Presença de colágeno em lesões de PCM crônica. Notar a presença de fibras
grossas, com coloração variando do amarelo-alaranjado ao vermelho. Picrosírius-Luz Polarizada
(aumento de 400X). (B) Presença de colágeno no grupo controle, onde se observa a presença de
fibras finas, pouco compactadas, corando do amarelo-esverdeado ao verde, com poucas áreas
amareladas e vermelhas Picrosírius-Luz Polarizada (aumento de 400X). (C a F) Observar
mastócitos imunomarcados para quimase e triptase nos pacientes com PCM crônica quando
comparados com o grupo controle (aumento de 400X) (G): Detalhe de mastócito corado por
Azul de Toluidina (aumento de 1000X)..............................................................................59
Figura 2: (A) Distribuição da densidade de mastócitos nas lesões de PCM crônica oral e no
grupo controle. *Mann-Whitney, P = 0,0005. (B) Distribuição da densidade de Quimase nas
lesões de PCM crônica oral e no grupo controle. *Mann-Whitney, P=0,0097. (C) Distribuição
da densidade de Triptase nas lesões de PCM crônica oral e no grupo controle. *Mann-Whitney,
P = 0,0003. (D) Densidade de colágeno nas lesões de PCM crônica oral e no grupo controle.
*Mann-Whitney, P= 0,04..............................................................................................60
Figura 3: Imunomarcação para IL-10, IL-4, IL-17, FoxP3, TGF-β em biópsias de pacientes
com PCM crônica oral. Notar a presença de numerosos P brasiliensis em células gigantes
multinucleadas e macrófagos (setas amarelas).(A) Expressão de IL-10 com intensa
imunomarcação no citoplasma de células mononucleares e no citoplasma de células
multinucleadas que circundam o P. brasiliensis em granulomas organizados (aumento de
630X). (B) A expressão de IL-4 ocorreu tanto no citoplasma como no núcleo das células do
infiltrado inflamatório (aumento de 630X) (C) A expressão de IL-17 mostrou que a
imunomarcação se apresenta no infiltrado inflamatório, ao redor dos granulomas e próximo ao
P. brasiliensis (aumento de 630X). (D) A expressão de FoxP3 foi intensa em células gigantes e
linfócitos em meio ao infiltrado inflamatório (aumento de 630X). (E) Expressão de TGF-β se
mostrou presente tanto no citoplasma como no núcleo das células do infiltrado inflamatório
(aumento de 630X)........................................................................................................63
Figura 4: Imunomarcação de TLR-2, TLR-4, Gal-3, MMP-3, MMP-9 em biópsias de pacientes
com PCM crônica oral. Notar a presença de numerosos P brasiliensis no interior de células
gigantes multinucleadas, e macrófagos circundados por numerosas células imunomarcadas
(setas amarelas) (A e B) Expressão de TLR-2 e TLR-4 na PCM crônica oral (aumento de
630X). (C) A expressão de Gal-3 foi intensa no citoplasma de células multinucleadas e em meio
ao infiltrado inflamatório, principalmente em macrófagos e linfócitos (aumento de 630X). (D)
Observar a intensa expressão de MMP-3 no citoplasma de células gigantes multinucleadas e de
células presentes no infiltrado inflamatório (aumento de 630X). (E) Na MMP-9 a expressão
10
ocorreu de forma intensa nas mesmas células que a MMP3, mas esta se localizava tanto no
citoplasma quanto no núcleo das células (aumento de 630X).....................................................64
Figure 5: Imunomarcação para IL-4 and IL- 10 em granulomas organizados e não organizados
em pacientes com PCM crônica oral. (A e B) A expressão de IL- 4 em granulomas não
organizados mostrou-se intensa em células gigantes multinucleadas e nas células o infiltrado
inflamatório (aumento de 200X). (C e D) Na IL-10 a expressão foi intensa no citoplasma de
células gigantes multinucleadas, células epitelioides e no infiltrado inflamatório associado ao
granuloma (C) fato que não ocorreu nos granulomas não organizados (D) (aumento de
200X).........................................................................................................................65
Figura 6: Imunomarcação para IL-17, Fox P3 e TGF-β em granulomas organizados e não
organizados em pacientes com PCM crônica oral. (A, B) A expressão de IL- 17 em granulomas
organizados foi escassa e se distribuía em meio a infiltrado inflamatório e em torno do
granuloma, já em granulomas não organizados a imunomarcação se apresentou em forma de
arranjos celulares focais (aumento de 200X). (C, D) A expressão de FoxP3 nos tipos de
granulomas estudados, apresentaram padrão idêntico de marcação, onde esta ocorreu de forma
intensa no citoplasma e núcleo de células multinucleadas, epitelióides e em meio ao infiltrado
inflamatório (aumento de 200X). (E) Notar maior expressão do TGF-β nas células dos
granulomas organizados com moderada marcação no citoplasma (aumento de
200X)..........................................................................................................................67
Figura 7: Imunomarcação para TLR-2 e TLR-4 em granulomas organizados e não organizados
em pacientes com PCM crônica oral. (A, B) A expresssão de TLR-2 foi intensa nas células
gigantes e no infiltrado inflamatório associado tanto ao granuloma organizado como no não
organizado (aumento de 200X). (C, D) No TLR-4 a imunomarcação ocorreu de forma intensa
no citoplasma das células apenas dos granulomas organizados (aumento de
200X).........................................................................................................................68
Figura 8: Imunomarcação para Gal-1, Gal-3, Gal-9, MMP-3 e MMP-9 em granulomas
organizados e não organizados em pacientes com PCM crônica oral. (A, B, C) Gal-1, Gal-3,
Gal-9, apresentaram intensa marcação em todos os casos estudados em granulomas organizados
e não organizados (aumento de 200X). (D, E) A expressão de MMP-3 e MMP-9 foi intensa em
todos os tipos de granulomas estudados (aumento de 200X).................................................69
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Especificação das diluições e produtos utilizados em cada anticorpo.............55
Tabela 2: Expressão in situ de IL-10, IL-4, IL-17, TGF-β, FoxP3, TLR-2, TLR-4, Gal-1, Gal-3,
Gal-9, MMP-3 e MMP-9 na PCM crônica oral................................................61
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LISTA DE ABREVATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS.
<
menor
>
maior
α
alfa
%
por cento
°C
grau centígrado
µl
microlitro
µm
micrometro
I
um em algarismo romano
III
três em algarismo romano
CCR6
CC chemokine receptor 6
CCR7
CC chemokine receptor 7
CCR8
CC chemokine receptor 8
CD25+
Marcador de ativação celular em linfócitos, cadeia α do receptor
de IL-2.
CD4+
Marcador de linfócito Th1/Th2/Th17, co-receptor para a molécula
MHC classe II.
CD8+
Marcador de linfócito T citotóxico, co-receptor para a molécula
MHC classe I.
CD62L
Grupamento de diferenciação 62L
CD103
Grupamento de diferenciação 103
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa
CFA
Antígeno de superfície do Paracoccidioides brasiliensis
CRD
domínio de reconhecimento a carboidratos
DNA
Ácido Desoxiribunucleico
DC
Célula dendríticas
ELISA
Ensaio imunoenzimático de absorção
Fas
Membro da família do TNF expresso na superfície de células T
FoxP3
Forkhead Family of Transcriptional regulator 3
13
g/dia
grama por dia
Gal
Galectina
Gal-1
Galectina 1
Gal-3
Galectina 3
Gal-9
Galectina 9
GM-CSF
Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos
gp43
glicoproteína de 43 kDa - antígeno imuno-dominante produzido
pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis
H2O2
Peróxido de Hidrogênio
HIV+
positivo para o vírus da imunodeficiência humana
HSP60
heat shock protein 60
IFN-γ
Interferon gama
IgA
Imunoglobulina do tipo A
IgE
Imunoglobulina do tipo E
IgG
Imunoglobulina do tipo G
IgG1
Imunoglobulina do tipo G isotipo 1
IgG4
Imunoglobulina do tipo G isotipo 4
IgM
Imunoglobulina do tipo M
IL-1α
Interleucina 1 alfa
IL-1β
Interleucina 1 beta
IL-2
Interleucina 2
IL-4
Interleucina 4
IL-5
Interleucina 5
IL-6
Interleucina 6
IL-7
Interleucina 7
IL-8
Interleucina 8
IL-9
Interleucina 9
IL-10
Interleucina 10
IL-12
Interleucina 12
IL-13
Interleucina 13
IL-17
Interleucina 17
IL-18
Interleucina 18
14
IL-23
Interleucina 23
kDa
Kilodalton
MCP-1
Monocyte chemoattractant protein-1
MCP-5
Monocyte chemoattractant protein-5
MEC
Matriz Extra Celular
MHC
Complexo de Histocompatibilidade Maior
ml
mililitro
mm
milímetro
mm2
milímetro quadrado
MMP
Metaloproteinase de matriz
MMP-1
Metaloproteinase de matriz-1
MMP-2
Metaloproteinase de matriz-2
MMP-3
Metaloproteinase de matriz-3
MMP- 7
Metaloproteinase de matriz-7
MMP-8
Metaloproteinase de matriz-8
MMP-9
Metaloproteinase de matriz-9
MMP-10
Metaloproteinase de matriz-10
MMP-11
Metaloproteinase de matriz-11
MMP-12
Metaloproteinase de matriz-12
MMP-20
Metaloproteinase de matriz-20
MMP-26
Metaloproteinase de matriz-26
MMP-27
Metaloproteinase de matriz-27
MyD88
Myeloid differentiation primary response gene 88
NF-κB
Fator nuclear kappa B
NK
Célula Natural Killer
NO
Óxido Nítrico
PAMP
Pathogen-associated molecular patterns
P. brasiliensis
Paracoccidioides brasiliensis
PBS/BSA
Solução salina em tampão fosfato/Soro albumina bovina
PCM
Paracoccidioidomicose
PCR
Reação em Cadeia de Polimerase
15
pH
Potencial hidrogeniônico
PMN
Polimorfonucleares
PRR
Receptores de reconhecimento padrão
RNAm
Ácido Ribonucleico mensageiro
SP
São Paulo
TCD4+
Linfócito T auxiliar
TCD8+
Linfócito T citotóxico
TGF-β
Fator de Transformação de Crescimento beta
Th0
Linfócito T auxiliar ou Helper classe zero
Th1
Linfócito T auxiliar ou Helper classe um
Th2
Linfócito T auxiliar ou Helper classe dois
Th17
Linfócito T auxiliar ou Helper classe dezessete
Thelper
Linfócito T auxiliar
TLR
Toll Like Receptor
TLR-1
Toll Like Receptor-1
TLR-2
Toll Like Receptor-2
TLR-3
Toll Like Receptor-3
TLR-4
Toll Like Receptor-4
TLR-5
Toll Like Receptor-5
TLR-6
Toll Like Receptor-6
TLR-9
Toll Like Receptor-9
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral alfa
TNF-β
Fator de Necrose Tumoral beta
TRAM
TRIF-like receptor adaptor molecule
Treg
Linfócito T regulador
TRIF
TIR-domain-containing adapter-inducing Interferon-beta
UNIUBE
Universidade de Uberaba
UFTM
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
X
vezes de aumento
χ2
Teste Qui-quadrado
16
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO..................................................................................................17
2
OBJETIVOS.......................................................................................................50
2.1
Objetivo Geral ...................................................................................................50
2.2
Objetivos Específicos.........................................................................................50
3
HIPÓTESE.........................................................................................................51
4
MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................52
4.1
Amostra para Análise Histoquímica, Morfométrica e Imunohistoquímica.............52
4.2
Seleção
do
material
para
Análise
Histoquímica,
Morfométrica,
Imunohistoquímica...............................................................................................................52
4.3
Histoquímica.............................................................................................................53
4.4
Processamento das lâminas para detecção de Mastócitos pelo Azul de
Toluidina................................................................................................................................53
4.5
Processamento das lâminas para quantificação da Fibrose/Colágeno
coradas por Picrosírius.................................................................................................54
4.6
Imunohistoquímica...................................................................................................54
4.7
Estudo Morfométrico........................................................................................56
4.8
Análise estatística...............................................................................................57
5
RESULTADOS..................................................................................................58
6
DISCUSSÃO......................................................................................................70
7
CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................77
8
CONCLUSÃO...................................................................................................80
REFERÊNCIAS.................................................................................................81
ANEXO...............................................................................................................99
17
1 INTRODUÇÃO
Adolpho Lutz, em 1908 observando lesões encontradas na boca de alguns
pacientes foi o primeiro a isolar e cultivar o microrganismo, descrevendo pela primeira
vez as principais considerações sobre o fungo causador da Paracoccidioidomicose
(PCM). Está micose também ficou conhecida como blastomicose brasileira,
blastomicose sul americana e moléstia de Lutz (ARAÚJO, 1999; MARQUES, 2008).
O termo PCM foi instituído em 1971 na reunião de micologistas das Américas,
em Medellin, e persiste até hoje como nomenclatura oficial (PALMEIRO et al., 2005).
Em 1912, Afonso Esplendore classificou seu agente etiológico dentro de um gênero já
existente na micologia, o Zymonema, denominado então Zymonema brasiliensis
(PALMEIRO; QUERUBINI; YURGEL, 2005). Posteriormente em 1930, Floriano
Paulo de Almeida criou o novo gênero, Paracoccidioides, e nomiou Paracoccidioides
brasiliensis (MARTINEZ, 2009).
O Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente etiológico para a
PCM, sendo um microrganismo dimórfico termal que, em sua forma saprófita, vive
livre na natureza em plantas, no solo e na água (ARAÚJO, 1999; ABREU E SILVA et
al., 2013).
Lacaz et al.(1994) observaram que o fungo quando mantido em cultura a uma
temperatura de aproximadamente 25ºC era encontrado na sua fase de micélio, e suas
colônias tinham uma aparência que variava de uma forma algodoada a um micélio
hialino septado.
Santos et al.(2003) citaram que as condições ambientais de preferência para a
sobrevivência desse fungo, são os lugares onde a temperatura fique em torno de 10 a
28ºC, com chuvas entre 500 e 2.500 mm/ano, e de clima temperado a quente,
moderadamente úmido, com floresta e altitude variando entre 47 e 1300m.
Villalba (1998) descreveu que o fungo cresce a 37°C na forma de levedura,
medindo de 5 a 25 m de diâmetro, com parede dupla e múltiplos brotamentos, e à
temperatura ambiente mostra-se na forma de finos filamentos septados dando origem ao
micélio.
Lacaz et al.(1994) relatam que nos tecidos atingidos o fungo é encontrado em
forma de leveduras arredondadas com uma parede celular espessa e birrefringente, e
podem ser encontrados isolados ou em grupamentos. Em torno da levedura principal
18
medindo de 2 a 10 µm existem brotamentos (únicos ou múltiplos) unidos por pontes
citoplasmáticas, assemelhando-se a uma roda de leme de navio.
O habitat e a ecologia do P. brasiliensis permanecem ainda pouco esclarecidos.
Sendo aceito que o fungo tem preferencia por vida em solo úmido, rico em proteínas,
preferencialmente em solos cercados por rios, lagos e pântanos, com mínima variação
de temperatura (SILVA-VERGARA et al.,1998; FONSECA; PARDAL; SEVERO,
1999; RESTREPO; MCEWEN; CASTAÑEDA, 2001).
A PCM é mais frequentemente registrada nas regiões tropicais e subtropical,
ficando restrita ao continente americano, principalmente a América do Sul, sendo o
Brasil o país com maior número de pacientes com a doença. No Brasil as regiões
endêmicas para a PCM são: São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006; GONDAK et al.,
2012; MARQUES, 2013).
Há grande dificuldade na obtenção de dados precisos sobre a incidência da
PCM no Brasil. Como a micose não é uma doença de notificação compulsória, os dados
sobre a prevalência, incidência e mortalidade são obtidos a partir de estudos sobre séries
de casos (SHIKANAI- YASUDA et al., 2006).
No Brasil dentre todas as doenças crônicas de ordem infecciosa ou parasitária,
a PCM ocupa um lugar de destaque, onde o Paraná é o Estado com o maior número de
óbitos nas regiões sul e sudeste do país (FORNAJEIRO et al., 2005).
Dados recentes sobre a incidência e prevalência da doença, destacam os relatos
de casos autóctones no Estado do Ceará e o elevado número de casos em determinadas
áreas do Estado do Maranhão. Foi encontrada a alta incidência de 10.8 casos por
100.000 habitantes no período de 1997 a 2007, passando assim, o Nordeste brasileiro a
ser considerado como região endêmica. (FAÇANHA et al., 2011; MATOS et al., 2012)
Estima-se que nas zonas endêmicas a taxa de mortalidade anual pela PCM seja
de 1,45 casos por milhão de habitantes (COUTINHO et al., 2002). A PCM pode ser
considerada a oitava maior causa de mortalidade entre as doenças infecciosas crônicas,
estando acima da leishmaniose (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006).
Belissimo-Rodrigues; Machado; Martinez (2011), em um levantamento de 1000
casos de PCM na região de Ribeirão Preto-SP no período de 1960 a 1990, encontrou
uma incidência de 1,6 a 3,7 novos casos a cada 100.000 habitantes, onde havia uma
proporção de 6:1 homens/mulheres, predomínio da forma crônica da doença em adultos
19
(74,6%), 93,5 % dos pacientes apresentavam história de vida rural, altas taxas de
tabagismo (64,7%) e etilismo crônico (37,2%), co-infecção pela Tuberculose (8,3%),
4,2% eram HIV+.
No Brasil a taxa de mortalidade por PCM em um milhão de habitantes foi de
1,45 casos entre os anos de 1980 a 1995 e de 0,9 a 1,0 entre os anos de 1996 a 2006,
sugerindo assim que essa micose é destaque entre as doenças crônicas mais comuns no
Brasil (OLIVEIRA et al., 2005; SHIKANAI-YASUDA et al., 2006).
De 1980 até meados dos anos 90 no Brasil, 3.181 pacientes diagnosticados com
PCM chegaram ao óbito. Observa-se que, 84,75% dos óbitos eram em pacientes do sexo
masculino (562 homens para cada 100 mulheres), onde a faixa etária mais afetada foi
entre os 30 e 60 anos de idade (ARAÚJO, 1999; COUTINHO, 2002).
A maioria dos pacientes com PCM exerceram algum tipo de atividade agrícola
nas suas primeiras décadas de vida, sendo assim, profissões com relação ao manejo de
solo, que pode estar contaminado com o fungo, ou se estes possuem hábitos de fazer
higiene bucal com gravetos, se alimentar com as mãos sujas de terra, ou até mesmo o
hábito de fazer a higiene íntima com folhas de vegetais, tais hábitos tornam maior o
fator de risco para a aquisição da doença (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006).
Os indivíduos mais afetados pela micose são os do gênero masculino, com uma
relação de homens 25:1 mulher com a doença (GIRARD et al., 2012; AZENHA et al.,
2012).
O fato dos homens serem mais afetados que as mulheres pode estar relacionado
ao estrógeno que atua inibindo a transformação do micélio ou conídia em levedura, ou
ao fator sócio econômico, uma vez que as mulheres estão mais ligadas aos afazeres
domésticos enquanto os homens estão mais predispostos a entrar em contato com o
solo, local onde o fungo se encontra (NEVILLE et al., 2009).
O P.brasiliensis não é um fungo que infecta exclusivamente o homem. Este vem
sendo detectado em diferentes espécies animais, como tatus, guaxinins, preás, porco
espinhos, furões e em cães. (DE FARIAS et al., 2011; RICHINI-PEREIRA et al., 2008).
Não foram ainda apresentados relatos de transmissão de uma pessoa para outra,
assim como também ainda não ficou comprovada a transmissão congênita dessa doença
(GONDAK et al., 2012).
Na PCM é observada a associação do tabagismo e do alcoolismo. Santos et al.,
(2003) realizaram um estudo, onde foi observado que a chance de adoecer entre os
20
pacientes era 14 vezes maior para os fumantes e 3,6 vezes maior entres os que bebiam
acima de 50g/dia de álcool, porém foi constatado que o álcool por si só não é um fator
de risco, mas coadjuvante ao tabagismo.
Na infância a PCM atinge de forma uniforme ambos os sexos. A infecção
adquirida na primeira ou segunda década de vida é mais incomum, onde apenas 10%
dos infectados desenvolvem as manifestações clínicas da doença, essa evolução da fase
latente para doença se dá com mais frequência em pessoas entre os 30 e 50 anos por
reativação do foco endógeno latente (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006).
A PCM é classificada de acordo com sua história natural e condições clínicas
do paciente nas formas aguda ou subaguda e crônica. As manifestações clínicas
dependem da virulência da cepa infectante do P.brasiliensis, do grau e do tipo de
resposta imunológica desencadeada, dos tecidos infectados e, especificamente, de
características intrínsecas do seu hospedeiro (GONDAK et al., 2012).
A Classificação clínica da PCM pode ser apresentada da seguinte forma,
segundo Fortes et al.(2011):
1. Paracoccidioidomicose infecção
2. Paracoccidioidomicose doença
2.1. Forma Aguda
2.1.1. Moderada
2.1.2. Grave
2.2. Forma Crônica
2.2.1. Unifocal Leve, Moderada, Grave
2.2.2. Multifocal Leve, Moderada, Grave
3. Paracoccidioidomicose associada à imunossupressão
4. Forma residual (sequela)
A forma aguda ou subaguda (tipo juvenil) é observada em indivíduos jovens de
ambos os sexos. Em geral, desenvolve-se a partir de lesão primária pulmonar não
detectada que progride rapidamente com disseminação linfática e teratogênica para
órgãos do sistema monocítico-macrofágico, como baço, fígado, linfonodos, ossos e
medula óssea, levando a deterioração importante da condição clínica do paciente. Altos
títulos de anticorpos específicos e depressão grave da imunidade celular são comumente
observados (FORTES et al., 2011).
Os índices de letalidade associados à PCM estão particularmente associados à
forma aguda ou subaguda. A forma crônica, também denominada “do adulto”, é a mais
21
comum na prática clínica. Desenvolve-se a partir do complexo primário pulmonar ou da
reativação de foco quiescente pulmonar ou metastático. A maior parte dos casos tem
início nos pulmões e progride lentamente. Geralmente, é observada em adultos do sexo
masculino com mais de 30 anos de idade. Apresenta quadro clínico de duração
prolongada, normalmente acima de seis meses de história clínica, e se expressa
frequentemente pelo comprometimento pulmonar e tegumentar (cutâneo e/ou mucoso)
(ARAÚJO et al., 2001; ABREU E SILVA et al., 2013).
As lesões podem permanecer localizadas (subtipo clínico unifocal) ou se
disseminar para vários órgãos e sistemas (multifocal), com gravidade variável
(FORTES et al., 2011).
O P. brasiliensis penetra no corpo através do contato direito do paciente com o
fungo, podendo causar assim linfoadenopatia intensa, lesões ulceradas, dentre outras
alterações no local da inoculação (OLIVEIRA et al., 2005; MARQUES, 2013).
O ser humano ao inalar o fungo este atinge os alvéolos pulmonares, iniciando
uma infecção na forma sub-clínica. Essa infecção poderá se disseminar para os outros
órgãos do corpo pela via linfo-hematogênica. Depois da inalação, o sítio primário da
doença são os pulmões, secundariamente esta poderá instalar-se em outros órgãos,
dando origem as lesões em mucosas, linfonodos, pele e até nas adrenais (GIRARDI et
al., 2012).
Com a instalação do fungo nos pulmões podem surgir os primeiros sintomas,
como a tosse seca e posteriormente dispneia ao esforço. A inflamação nos pulmões pode
permanecer sem sinal clínico e radiograficamente invisível por vários anos, podendo ser
encontrado o fungo no escarro do paciente ou em material necrótico pulmonar. Tais
sinais e sintomas definem o pulmão como alvo primário do P. brasilienses (ARAÚJO,
1999).
O fato de a mucosa da boca apresentar manifestações clínicas da PCM se dá
provavelmente pelo fato dessa mucosa sofrer com poucas variações de temperatura
além de ter uma riqueza de proteínas, fornecendo assim substratos que favoreçam a vida
do fungo (ARAÚJO et al., 2001).
A disseminação da doença e sua gravidade estão relacionadas a fatores
inerentes ao próprio fungo, como virulência e composição antigênica, condições
ambientais e principalmente fatores ligados ao hospedeiro (VILLALBA, 1998;
FORTES et al., 2011).
22
A capacidade de invasão do fungo no hospedeiro depende de mecanismos
adaptativos que devem resistir à alta temperatura corporal e ao ataque dos fagócitos. No
P. brasiliensis, a transformação da forma micelial para levedura é essencial para iniciar
a patogenicidade (MONTENEGRO; FRANCO, 1994; FORTES et al., 2011).
A diversidade na virulência do fungo pode até certo ponto explicar a grande
variedade de manifestações clínicas da doença, sendo esta, desvendada por técnicas
citoquímicas que relacionaram a presença de -1-3-glucana na parede celular do fungo,
enquanto que, fungos mutantes com -galactomanana perdem seu poder patogênico
(CABRAL, 1995; VILLALBA, 1998; GIRARDI et al., 2012; ABREU E SILVA et al.,
2013).
Para a Odontologia, a PCM constitui-se de importante doença, já que a mucosa
bucal fornece importante substrato à vida saprófita do fungo, onde se admite que a boca
favoreça a sua manifestação, envolvendo também as regiões da cabeça e pescoço, pele
facial, mucosa nasal e oral (TOLENTINO et al., 2010).
Lutz em 1908 descreve pela primeira vez o envolvimento oral da doença e
apresenta em seu trabalho, o relato de dois casos de uma micose pseudococcidióidica
em pacientes do sexo masculino (ARAÚJO, 1999).
As lesões no primeiro paciente avaliado por Lutz se encontravam na bochecha
direita, como pequenas vegetações, onde este se apresentava com péssima condição
bucal. Após as extrações dentais, ocorreu uma tumefação no gânglio linfático submaxilar direito. Dois anos depois, este paciente retornou com infiltração superficial e
espessamento difuso na mucosa interna do lábio e bochecha direita, coincidindo com
áreas de contato com os dentes. No segundo paciente, as lesões envolveram o véu
paladar e úvula, com aspecto de excrescências papilomatosas, com os lábios
apresentando-se entumecidos, e como outros sintomas, havia diarréia, roquidão e
dificuldade de fonação. Histologicamente foram encontrados tubérculos com
pseudococcídios inclusos em células gigantes (ARAÚJO, 1999).
Carini (1908) relata o caso de paciente com endurecimento na abóbada palatina
com um ano de evolução. Esta lesão se apresentava com pontos de exsudato fibrinoso
amarelo, com saliências mamilares que se estendiam aos pilares anteriores e à úvula.
Feita a remoção cirúrgica da úvula e a partir dos achados histológicos, ficou evidente
que estes coincidiam com os relatos de Lutz, sendo ainda ressaltada neste artigo, a
importância da participação dos colegas dentistas no diagnóstico precoce da doença
(ARAÚJO, 1999).
23
Splendore (1910) ressalta a coincidência de seus achados com os de Lutz e
Carini. As lesões orais encontradas eram vegetações papilomatosas com infiltrações
duras e achatadas na base da língua, abóbada palatina, pilares, úvula, gengiva e lábios.
Um dos casos iniciou-se na gengiva e os outros dois na comissura labial. Os pacientes
tinham entre 30 a 50 anos, de condições sociais modestas, com grande secreção salivar e
dificuldade na deglutição (ARAÚJO, 1999).
Motta (1935) descreve de maneira pormenorizada as ulcerações localizadas nas
mucosas dos lábios, gengivas, língua e principalmente amígdalas, onde estas se
estendem, propagando-se para as mucosas nasal e faríngea, chegando até a laringe,
disseminando-se em curto período de tempo por via linfática, dando características de
tumefações ganglionares no pescoço. Estas ulcerações de base endurecida e granulosa
são acompanhadas por abundante sialorreia, sangramento fácil, apresentando drenagem
de substância branco-amarelada. Muitas vezes, lesões cutâneas iniciais, podem ocultar
lesões mucosas, pelo fato da anamnese e exame clínico serem realizados de forma
deficiente (ARAÚJO, 1999).
Motta; Pupo (1936) realizaram importante caracterização clínica das lesões
orais, onde denominaram as formas mucosas do granuloma paracoccidiódico, como
“estomatite ulcerosa moriforme”, pela semelhança do processo úlcero-infiltrativo com
finas granulações do fruto da amoreira. As lesões eram encontradas na gengiva,
assoalho da boca, lábios, bochechas, palato mole, úvula, pilares e língua, acompanhados
de abundante salivação, reação dolorosa à mastigação e deglutição, obrigando o uso de
alimentos líquidos, podendo também evoluir para a laringe faringe e nariz, modificando
a voz e provocando acessos de tosse. As lesões da língua e laringe eram passíveis de
simular “processos neoplásicos iniciais” (ARAÚJO, 1999).
Em 1937, Motta demonstra que, as lesões da micose podem ser isoladas ou
múltiplas, com ulcerações de forma e tamanhos variados, bordos irregulares, pouco
profundas, sendo que, no assoalho delas são distinguíveis pequenas e numerosas
granulações vermelhas. Normalmente após o ataque da mucosa buco-faríngea ou das
amígdalas, em curto espaço de tempo, ocorre a infecção ganglionar traduzida por
adenopatias cervicais supraclavículares e axilares (ARAÚJO, 1999).
Bogliolo (1946) analisou a presença do fungo em dentes cariados, no
pressuposto de elucidar qual a porta de entrada do fungo no organismo. Ao examinar
histológicamente o granuloma apical de um molar extraído de paciente doente, este
constatou a presença de poucas células esféricas do fungo dentro do granuloma. Assim
24
sendo, concluiu que existia a possibilidade de localização peridental apical da doença,
indicando que em certas formas, com aparências primitivamente linfáticas, o agente
causal penetrasse no organismo através de dentes cariados, sendo que posteriormente,
tal possibilidade veio a ser descartada (ARAÚJO, 1999).
Sposto et al., (1994) relacionam as lesões bucais como secundárias ao
envolvimento pulmonar. Os fatos que levaram os autores a esta conclusão se baseiam
nas evidências de que, 80% dos casos da doença demostram sinais de envolvimento
pulmonar (ARAÚJO, 1999).
Mackinnon et al., (1959) ao inocularem 200 ratos por meio de diversas vias, a
inoculação intranasal, produziu repetidas brocoalveolites e disseminação pela via
linfática, seguida pela via hematogênica. Este autor, também observou que, as lesões em
mucosa oral apareceram tardiamente quando os ratos eram inoculados por via nasal ou
intra-venosa. Inoculações experimentais em mucosa e pele têm demonstrado apenas a
produção de granulomas localizados (ARAÚJO, 1999). Brito et al. (1973), demostraram
que o P. brasiliensis é capaz de penetrar em células epiteliais (ARAÚJO, 1999). Uribe
et al. (1987) acreditam que, por serem carreados pelos PMN neutrófilos, os fungos
podem ser eliminados do organismo através do epitélio (ARAÚJO, 1999).
Mc Even et al. (1987) em um experimento que contou com a inoculação intranasal de ratos adultos com conídias, comprovaram inúmeros casos de broncoalveolites,
predominantemente neutrofílica e macrofágica durante os seis primeiros dias de
infecção. Metade destes ratos apresentaram lesões extra pulmonares localizadas em
linfonodos, fígado e baço, após 20 semanas da infecção (ARAÚJO; 1999).
As manifestações bucais na PCM são muito importantes, uma vez que 30 a
50% destas ocorrem como queixa principal. Tais manifestações afetam principalmente,
os lábios, bochechas, soalho da boca, língua e faringe, podendo invadir várias áreas
simultaneamente, como lesões inflamatórias granulomatosas crônicas e progressivas
(SPOSTO et al., 1993; NEVILLE et al., 2009; TOLENTINO et al., 2010; BRAZÃOSILVA et al., 2010; AZENHA et al., 2012; ABREU E SILVA et al., 2013).
Fonseca (1963) demostra que, o periodonto constitui importante elemento na
patogenia da PCM, favorecendo sua penetração no organismo. Acredita que o próprio
paciente promova a inoculação do fungo nos tecidos periodontais, já alterados, por meio
de fustigamento gengival com vegetais. Demonstra também, que a localização
periodontal nem sempre traduz clinicamente o aparecimento da gengivite ulcerosa
moriforme. Ressalta ainda, que a localização do fungo nos tecidos periodontais,
25
depende do estado reacional do sistema retículo histiocitário, pois, na carência de uma
resposta efetiva, promoverá a distribuição difusa do fungo facilitada por mecanismos
inibitórios criados pelo fungo, acarretando uma invasão profunda e destrutiva sobre o
osso alveolar e o periodonto de sustentação. Suas conclusões levaram-no a criar uma
forma anátomo-clínica, denominada de “periodontite oculta paracoccidióidica”. Os
casos examinados por ele induziram-no ao diagnóstico de periodontite (ausência de
lesões com aspecto ulceroso moriforme), e ao exame físico, o diagnóstico diferencial
entre periodontopatias relacionadas à presença do P. brasileinsis, e às de outra natureza,
não foi possível de ser confirmado. Sendo confirmada a presença do fungo por meio de
exame histopatológico na gengiva marginal, entre os feixes de fibras dento-alveolares,
pericemento, região inter-radicular e periapical, mesmo em pacientes tratados durante
longo tempo (ARAÚJO, 1999).
Lauand et al., (1975) estudaram as formas clínicas da PCM oral, relacionando
o tecido periodontal como sendo o de maior receptividade para o desenvolvimento e
reprodução do parasita, encontrando-o no periodonto de pacientes sem qualquer
manifestação clínica da doença, mas sugerem que a contaminação hipoteticamente
tenha-se originado a partir da inalação do fungo (ARAÚJO, 1999).
Villalba (1998); Brasão-Silva et al. (2010) e Azenha et al. (2012) consideram
que os tecidos gengivais estão constantemente envolvidos com a doença, devido a
constantes injúrias causadas pela placa bacteriana e traumatismos, que alteram a
permeabilidade dos vasos, sendo possível também, a inoculação do fungo em feridas
bucais por meio de escarro contaminado, podendo todos estes fatos facilitar a instalação
e disseminação do fungo.
Tommasi; Fonseca, (1974) descrevem as lesões bucais com características de
estomatite ulcerada moriforme, de aspecto erosivo, cor esbranquiçada, com superfície
finamente granulosa, salpicada por pontilhado hemorrágico, infiltrada e algumas vezes
ulcerada. Caracterizaram também, a sialorreia, macroqueilite, prurido, ardor e dor
durante a mastigação e deglutição, dentes cariados, gengivas hemorrágicas,
deslocamento e retração gengival, quedas espontâneas de dentes e não cicatrização de
feridas exodônticas, como eventos clínicos importantes na caracterização clínica da
doença (ARAÚJO, 1999).
Há várias formas de se diagnosticar a PCM, onde o diagnóstico conclusivo
deverá ocorrer à demonstração do agente etiológico em espécimes obtidos do paciente,
por meio de escarro, pus, raspados de lesão (citologia esfoliativa) e biópsia. Podendo-se
26
optar pela cultura ou inoculação do fungo em animais de laboratório (BRAZÃO-SILVA
et al., 2010; ARAÚJO et al. 2001; ARAÚJO, 1999; VILLALBA, 1998; LACAZ et al.,
1994). Testes serológicos são utilizados como uma ferramenta de diagnóstico em
pacientes sem doença oral ou cutânea clinicamente detectável, onde os fungos são
difíceis para visualizar ou cultivar o fungo, especialmente em lesões profundas (SILVA
et al., 2003). Técnicas como o ELISA são frequentemente usadas para monitoramento
da gravidade da doença, tratamento e acompanhamento dos doentes com a micose (DEL
NEGRO et al., 2000; ABREU E SILVA et al., 2013).
Métodos como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e imunohistoquímica
são aplicadas quando sorologia e histopatologia são inconclusivas durante o diagnóstico
da PCM (ALMEIDA; JACKS; SCULLY, 2003). A técnica de PCR em tempo real para
a detecção de DNA do P. brasiliensis em amostras de cultura e sorológicas, tem-se
mostrado muito sensível e específica para um diagnóstico rápido de PCM, além de
servir como uma ferramenta de diagnóstico a ser usada para monitorar a resposta ao
tratamento dos pacientes (BUITRAGO et al., 2009).
Lesões orais de PCM são microscopicamente caracterizadas pela formação de
granulomas, constituído por arranjo nodular de células epitelioides e células gigantes
multinucleadas do tipo Langhans e do tipo corpo estranho, e na área central um
exsudato inflamatório rico em linfócitos, plasmócitos e eosinófilos, acompanhado de
necrose e fibrose de intensidade variável (KAMINAGAKURA et al., 2007; ABREU E
SILVA et al., 2013).
Na PCM é frequente a ocorrência de distúrbios imunorregulatórios,
manifestando-se com graus variados, exibindo depressão da imunidade mediada por
células, ativação deficiente de leucócitos polimorfonucleares e macrófagos, ativação
policlonal de linfócitos B e títulos elevados de anticorpos da classe IgG.
(ALCÂNTARA, 2002; CALICH et al., 2008a).
Os mecanismos envolvidos na imunodepressão da PCM permanecem ainda não
totalmente esclarecidos. Como fatores envolvidos, podem ser citados: a atuação de
imunocomplexos circulantes, geração de células T supressoras, redução de linfócitos T
CD4+, efeito supressor de substâncias derivadas do fungo, níveis alterados de citocinas,
e presença de fatores inibidores séricos (MUSATTI et al., 1976; MOK; GREER, 1977;
27
FRANCO, 1987; MOTA et al., 1988; JIMENEZ-FINKEL; MURPHY, 1988; BAVA et
al., 1991, ALCÂNTARA, 2002; CALICH et al., 2008a).
O substrato inflamatório na PCM é caracterizado pela presença de uma reação
inflamatória granulomatosa e supurativa, com destaque para a formação do granuloma
paracoccidiódico. Como vários tipos celulares estão envolvidos na inflamação
granulomatosa da PCM, há a necessidade de existir um meio de comunicação entre
estas células, que é realizado por mediadores moleculares denominados de citocinas.
Estas dirigem todas as etapas da resposta inflamatória e do reparo tecidual
(ALCÂNTARA, 2002).
Com base nos diferentes padrões de citocinas produzidas, os linfócitos TCD4+
podem ser agrupados em diferentes subtipos: células T auxiliares tipo 1 (Th1) produzem
predominantemente IL-2, IFN-γ e TNF-β e, células Th2 sintetizam IL-4, IL-5, IL-9, IL10 e IL-13. Os fenótipos Th1 e Th2 parecem representar estágios finais na maturação de
linfócitos T auxiliares, com estágio precursor denominado de Th0, no qual são
produzidas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 e IFN-γ (MOSMANN; COFFMAN, 1989;
CLERICI; SHERER, 1992; COX; LIEW, 1993; CALICH et al., 2008a).
A imunorregulação na PCM está associada a padrões de resposta imune regulada
por células T Helper do Tipo Th1, Th2 e células T regulatórias CD4+ CD25+ (Treg)
(FORTES et al., 2011).
Em pacientes saudáveis, as citocinas produzidas pelos subtipos Th1 e Th2
inibem a proliferação e/ou função um do outro. Dessa maneira, IFN-γ, produzido por
linfócitos Th1, amplifica o desenvolvimento Th1 e inibe a proliferação de linfócitos Th2
(FITCH et al., 1993; JARRY et al., 2008). Já a IL-10 produzida por linfócitos Th2,
bloqueia a ativação de células Th1 (FIORENTINO; BOND; MOSMANN, 1989;
JARRY et al., 2008).
Em um grande número de doenças infecciosas ou parasitárias, o padrão de
resposta Th1 está relacionado à proteção e o Th2 a suscetibilidade (LOKSLEY;
SCOTT, 1981). Na PCM experimental, animais resistentes à infecção pelo P
brasiliensis, há o desvio da resposta imune para o padrão de ativação do tipo Th1 com
desenvolvimento e manutenção das reações de hipersensibilidade tardia, ativação
eficiente de macrófagos e baixos níveis de produção de anticorpos específicos. Nos
animais susceptíveis, ocorre o desenvolvimento de um padrão predominantemente do
tipo Th2, com ativação deficiente de macrófagos, depressão das reações de
28
hipersensibilidade tardia, produção de altos títulos de anticorpos específicos e ativação
policlonal de linfócitos B (MURPHY et al., 1994; ALCÂNTARA, 2002).
Já é conhecido que indivíduos saudáveis que entram em contato com o
P.brasiliensis podem resolver a infecção no local do inoculo a partir de uma eficiente
resposta imune inata e do desenvolvimento do padrão de resposta Th1, com formação
de granulomas organizados (BENARD, 2008).
Na PCM, as formas clínicas ocorrem pela incapacidade de desenvolvimento de
resposta efetiva Th1, levando à formação deficiente de granulomas organizados. Nesses
casos, poderá ocorrer o desvio para outros padrões de respostas imunológicas, como a
Th2, resultando em uma ineficiente ação imunológica capaz de conter a propagação da
infecção (PAGLIARI; SOTTO, 2003).
Um fato marcante da depressão da resposta imune celular em pacientes com a
PCM ativa é a diminuição da síntese de citocinas de padrão Th1 como IL-2, IFN-γ e IL12, e aumento dos níveis de IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β, o que corresponde a resposta de
padrão Th2, não sendo esta capaz de ser protetora ao hospedeiro (CALICH; KASHINO
et al., 1998; BENARD et al., 2001).
A produção de altos títulos de anticorpos das classes IgG, IgA e IgE, associadas
ao predomínio de citocinas supressoras como IL-4, IL-5 e TGF-β, além da intensa
eosinofilia, estão presentes no granuloma paracoccidiódico. Demonstrando que a
resposta imune humoral contra o fungo na PCM não é efetiva, e reforça o fato de a
resposta Th2 ser incapaz de proteger o hospedeiro do P. brasiliensis (DEFAVIERI,
1999; MAMONI et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2002).
Na forma crônica da PCM, os pacientes apresentam resposta imune
intermediária entre o padrão Th1 e Th2. Indivíduos com a PCM infecção que vivem em
áreas endêmicas, mas que não desenvolvem a doença apresentam padrão Th1,
suprimindo a replicação fúngica e mantendo um equilíbrio entre o hospedeiro e o
parasita; além disso, pacientes com a forma aguda/subaguda desenvolvem resposta Th2
(MAMONI; BLOTTA, 2005; MORAES-VASCONCELOS et al., 2005).
Células T regulatórias com fenótipo CD4+ CD25+ (Treg) são importantes no
controle da resposta imune. A ausência destas células está associada à exacerbação da
resposta inflamatória e, consequentemente, ao desenvolvimento de doenças autoimunes.
Por outro lado, a ativação excessiva pode estar associada à susceptibilidade, aos
patógenos (FERREIRA; OLIVEIRA; MARIA, 2010).
29
Pacientes com PCM crônica apresentam níveis elevados de células com fenótipo
característico de células Tregs (CD4+ CD25+), tanto no sangue periférico quanto nas
lesões, sugerindo que estas células possam controlar a resposta imune local e sistêmica
(FERREIRA; OLIVEIRA; MARIA, 2010).
Kurokawa e colaboradores em 2007 demonstram que citocinas como IL-1b, IL6, IL-8, IL-10, IL-12 e TNF-α, são expressas na PCM, e sugerem que
monócitos/macrófagos são importantes fontes desses peptídeos capazes de promover
resposta inflamatória sistêmica.
Sintomas como febre, anorexia, perda de peso e dano tecidual, comumente
associadas às formas moderadas e graves de PCM podem estar relacionados à produção
sistêmica de TNF-α (PARISE-FORTES et al., 2000; PERAÇOLI et al., 2003).
Distúrbios metabólicos como febre, elevação da proteína C reativa, astenia e
perda de peso, observados em pacientes com quadros mais graves de PCM, estão
relacionados às citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-8 e TNF-α. Estas citocinas
parecem estar relacionadas à exacerbação da resposta imune, resultando em dano
tecidual (KUROKAWA et al., 2007).
Entretanto, citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 e o TGF-β, possivelmente
exercem a função de controlar e modular a resposta inflamatória sistêmica em pacientes
com PCM ativa (KUROKAWA et al., 2007).
A interação dos componentes da parede do fungo com os receptores do sistema
imune do hospedeiro induz a produção de citocinas, que atuam estimulando os
mecanismos celulares de defesa contra o fungo, levando a sua eliminação e regulando a
intensidade da resposta granulomatosa, impedindo a lesão tecidual (FORTES et al.,
2011).
Por outro lado, o envolvimento de citocinas durante o confronto entre o fungo e
as células fagocitárias pode promover o crescimento do fungo nos tecidos do hospedeiro
levando a progressão da doença (SIQUEIRA et al., 2009). Mas, se torna fundamental a
ocorrência de um equilíbrio entre os sinais pró e anti-inflamatórios para o sucesso e
equilíbrio das interações entre o hospedeiro e o fungo (FORTES et al., 2011).
O P. brasiliensis sintetiza antígenos metabólicos que interagem com o sistema
imune do hospedeiro, provocando uma resposta imunológica altamente complexa e
multifatorial. Onde o estabelecimento da doença, sua disseminação e gravidade
dependem de fatores inerentes ao próprio fungo (BENARD, 2008). A interação entre
mecanismos específicos e inespecíficos de defesa na determinação da resistência ao P.
30
brasiliensis vem sendo apresentada em estudos clínicos e experimentais (MENDESGIANNINI; MORAES; RICCI, 1990; CALICH et al., 2008a).
A patogenicidade do P. brasiliensis demonstra uma complexa estrutura
antigênica. O principal componente antigênico do P. brasiliensis é uma glicoproteína de
superfície da parede fúngica com 43 KDa (gp43), um antígeno imunodominante
associado ao fator de virulência e/ou escape, pelo qual, o fungo evade os mecanismos de
defesa do hospedeiro e se instala nos tecidos. Onde a glicoproteína gp43 apresenta
efeitos proteolíticos sobre colágeno, elastina e caseína (ABREU E SILVA, 2013).
Para a instalação do fungo nos tecidos, a digestão de proteínas estruturais parece
ter papel importante (MENDES-GIANNINI; MORAES; RICCI, 1990). A ativação das
proteínas do sistema-complemento e atividade microbicida das células natural killer
(NK) e dos fagócitos, constituem uma forma significativa no combate aos fungos
patogênicos, por meio da imunidade inata (CALVI et al., 2003).
Várias células desempenham papel central na resistência ao P. brasiliensis,
dentre elas se destacam as células NK, neutrófilos, monócitos e macrófagos. A
participação destas células na reação inflamatória e na atividade fungicida são induzidas
pelo fungo e por citocinas produzidas pelas células durante sua interação com os
fagócitos (PAGLIARI et al., 2010a).
As funções imunológicas dos mastócitos são atualmente consideradas muito
mais amplas. Estas incluem áreas como: a regulação da resposta imune inata e
adaptativa, imunidade protetora contra vírus, micróbios, parasitas que desencadeiam
doenças, autoimunidade, promoção de uma maior proteção contra o Câncer, tolerância à
rejeição de enxertos, cicatrização de feridas, angiogênese, doenças cardiovasculares,
diabetes, obesidade e outras (RODEWALD; FEYERABEND; 2012).
Os mastócitos podem atuar como um feedback negativo no mecanismo da
resposta imune na inflamação do tipo granulomatosa, e a ação direta da histamina nos
linfócitos T pode inibir a produção de IFN-γ, suprimindo desta forma a atividade das
células T frente aos antígenos (BATISTA; SOARES; LARA, 2005; MICHAILIDOU;
MARKOPOULOS; ANTONIADES, 2008).
Originalmente, os mastócitos foram divididos fenotipicamente em dois tipos de
acordo com as proteases neutras citoplasmáticas: os que contêm triptase e os que
possuem triptase e quimase. Os mastócitos que contém triptase e um pouco ou nenhuma
quimase são mais encontrados nas mucosas, principalmente das vias aéreas e trato
31
gastrintestinal (CAUGHEY, 2007). Os mastócitos que contém triptase, quimase,
carboxipeptidase e catepsina G estão presentes nos tecidos conjuntivos da pele,
peritônio, tecidos perivasculares e nas membranas sinoviais. Porém, outro subtipo tem
sido identificado, com mastócitos contendo quimase e carboxipeptidase (FILIPPIS et
al., 2008) ou mastócitos contendo quimase e catepsina G (METCALFE, 2008), podendo
ser encontradas estas células em diferentes localizações.
A triptase, juntamente com TNF-α e histamina, pode ativar as células do
endotélio a expressar moléculas de adesão que vão recrutar outras células inflamatórias
(LINDSTEDT; KOVANEN, 2004). Além disso, estimula a formação de MCP-1,
proteína quimiotática de monócitos produzida pelas células endoteliais e de IL-8,
potente quimiotático de neutrófilos (KINOSHITA et al., 2005).
Pouco se sabe sobre a interação dos mastócitos com as citocinas e elementos
inflamatórios secretados em lesões orais da PCM.
Mastócitos têm sido observados em infiltrados inflamatórios de granulomas na
PCM, sugerindo um importante papel nessas lesões (KAMINAGAKURA et al., 2007).
Segundo Pagliari et al. (2006c), os mastócitos participam da resposta imune
contra o P. brasiliensis em lesões de pele, com a formação de granulomas
desorganizados e expressão de citocinas do padrão Th2, onde estas células poderiam
ser uma fonte de IL-10, contribuindo para uma resposta imune pouco eficaz contra o
fungo.
A IL-10 foi identificada em 1989, sendo inicialmente denominada de Fator
inibitório da síntese de citocinas, por ser produzida pelas células Th2 que inibiam a
produção de citocinas das células Th1 (O´GARRA et al., 2008; CHEN; LIU, 2009;
HEDRICH; BREAM, 2010).
Produzida tanto por células da imunidade inata como da adquirida, a IL-10, é
secretada por monócitos, macrófagos, células NK, células dendríticas (DCs),
eosinófilos, células B, células TCD8+, células Tregs, células Th1 e células Th17
(O´GARRA et al., 2008; HEDRICH; BREAM, 2010).
A IL-10 tanto pode ter um papel regulador, inibindo danos ao hospedeiro em
função da resposta imune ao patógeno, como pode aumentar certas funções da resposta
32
imune para ajudar a erradicar o patógeno (O´GARRA et al., 2008). Outro papel
importante é a de limitar a resposta imune contra microrganismos e evitar dano ao
hospedeiro (KUHN et al., 1993; SELLON et al., 1998; JARRY et al., 2008).
Com propriedades anti-inflamatórias bastante amplas, a IL-10, participa na
inativação de macrófagos, DCs, na diminuição da expressão de citocinas próinflamatórias como: IL-1α e β, IL-6, IL-12, IL-18 E TNF-α e de quimiocinas (MCP-1,
MCP-5, RANTES, IL-8), além da repressão da expressão de antígenos do Complexo
Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe II e das moléculas co-estimulatórias
B7-1/B7-2 (COSTA, 2010).
Em contraste as funções supressivas, a IL-10 pode ter efeitos positivos na
resposta imune, incluindo o aumento direto se sua produção por células TCD4+
regulatórias, a estimulação de mastócitos, a estimulação gênica em fagócitos, a
promoção da diferenciação e migração de células TCD8+ citotóxicas, a ativação de
células B por estimulação das moléculas de MHC de classe II e IgA, como também, a
diferenciação e crescimento de queratinócitos e o aumento da produção de IFN-γ por
células NK (O´GARRA; VIEIRA, 2007; COUPER; BLOUNT; RILEY, 2008;
HEDRICH; BREAM, 2010; MAYNARD, WEAVER, 2008).
Devido aos efeitos anti-inflamatórios e imunossupressivos, a IL-10 tem atraído
muita atenção quanto ao seu potencial em aplicações clínicas. A principal preocupação
na manipulação clínica dos níveis de IL-10 é seu papel crítico na homeostase
imunológica, pois a longa aplicação desta citocina pode causar imunodeficiência,
enquanto que o uso contínuo de anti IL-10, pode levar a reações hiperimunes (PETSKA
et al., 2004). A manipulação adequada da IL-10, pode ser uma arma potente na terapia
imune, podendo promover um tratamento adequado para muitas doenças de natureza
neoplásica, auto-imune ou alérgicas (COSTA, 2010).
A susceptibilidade na PCM e sua progressão estão ligadas a resposta Th2, com a
produção de IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β e produção de citocinas reguladoras (CALICH;
KASHINO, 1998).
Na PCM pulmonar experimental, a ligação de diferentes receptores a células
dendríticas (DCs) pode facilitar a produção de um perfil específico de citocinas
(FERREIRA et al., 2007). Sendo demonstrado que a ligação de DCs a um receptor de
33
dectin-1 em conjunto com TLR-2 pode induzir a produção de IL-10 em ratos
susceptíveis a doença (NETEA et al., 2004).
O P. brasiliensis em ratos susceptíveis à doença, induz nas DCs a elevação da
produção de IL-10, mediada por dectin-1 e TLR-2, com mínima produção de IL-12,
facilitando que ocorra a supressão da imunidade do hospedeiro. Assim, a supressão
inicial desencadeada pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, pode facilitar o fungo
de se estabelecer no hospedeiro, levando-o a infecção (FERREIRA et al., 2007).
A expressão de citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e TGF-β em linfonodos
de pacientes com a forma aguda da doença, está associada ao mecanismo pelo qual o
fungo evade a resposta imune do hospedeiro, contribuindo para a forma disseminada da
PCM (NEWORAL et al., 2003; JARRY et al., 2008).
A detecção de imunomarcação para IL-10 e IL-5 em granulomas desorganizados
na PCM pode ser traduzida como uma resposta imune ineficaz na contenção da infecção
fúngica (NEWORAL et al., 2003; PAGLIARI et al., 2006c).
O IFN-γ e a produção de IL -10 estão envolvidos na resolução ou disseminação
da PCM em ratos e em humanos (CANO et al., 1998; CALICH; KASHINO,1998).
Na PCM humana, a IL-10 aparece para executar uma função reguladora no
processo de apoptose, evitando assim, a perda de células reativas durante a infecção
pelo P. brasiliensis (CACERE et al., 2002).
Em células estimuladas por antígenos do P. brasiliensis que secretaram a IL-10
in vitro foram detectados níveis elevados desta citocina em pacientes com PCM
(BENARD et al., 2001; KARHAWI; COLOMBO; SALOMÃO, 2000).
Nota-se que a IL-10 é uma importante citocina imunoregulatória na PCM,
interferindo no balanço Th1/ Th2, além de inibir a síntese de Óxido Nítrico (NO)
estimulada por IFN-γ (CANO et al., 1998).Fato este, que resulta na diminuição da
resistência a patógenos, uma vez que mecanismos dependentes de NO são empregados
por macrófagos murinos para destruir as leveduras de P. brasiliensis (GONZALES et
al., 2000).
Costa em 2010 demonstra que a IL-10 é a citocina que exacerba a PCM e sua
ausência resulta no controle da infecção pulmonar experimental pelo P. brasiliensis.
Sua ausência propicia a ativação precoce do sistema imune, por meio da síntese precoce
de anticorpos e a expressão de marcadores de ativação em linfócitos TCD4 + e TCD8+ de
memória ou ativados.
34
Estudos in vitro demonstram que a IL-10 inibe a atividade fungicida de
macrófagos contra o P. brasiliensis ativados por IFN-γ ou TNF-α, onde a supressão foi
associada à redução da liberação de NO e H2O2, passando a representar um mecanismo
de escape do fungo à resposta imune do hospedeiro (MOREIRA; DIAS-MELICIO;
SOARES, 2010).
A ausência de IL-10 na PCM experimental exerce efeitos benéficos,
proporcionando o controle microbiológico sem que ocorram danos teciduais
significativos, devido à produção descontrolada de citocinas pró-inflamatórias. Podendo
este mecanismo ser usado como futuras tentativas imuno terapêuticas para a PCM
(COSTA, 2010).
Costa et al. (2013) demonstraram que a IL-10 produz um efeito prejudicial na
PCM pulmonar experimental, devido a seu efeito supressivo sobre a imunidade inata e
adaptativa, resultando em infecção progressiva e mortalidade precoce de hospedeiros
infectados. Mas, a ausência de IL-10 conduziu a efeitos benéficos na PCM pulmonar,
uma vez que permitiu o controle da doença sem causar consequente dano tecidual,
havendo uma significativa maior produção de citocinas pró-inflamatórias.
Em um estudo com pacientes de PCM que receberam tratamento para a micose,
a presença de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de células, sugere que a regulação
da resposta imune persiste, mesmo após meses ou anos da conclusão do tratamento
(SADASHIRO et al., 2007).
A interleucina-4 (IL-4) foi descoberta em 1982 (Paul, 1991). Inicialmente ela
recebeu a denominação de fator de crescimento de células B devido a sua habilidade de
induzir a proliferação de linfócitos B em camundongos estimulados com anticorpos
anti-IgM. Posteriormente, foi observado que esta molécula era capaz de induzir a síntese
de moléculas de MHC de classe II e aumentar a responsividade a anticorpos anti-IgM, e
então, passou a ser chamada de fator estimulatório de células B. Esta última designação
foi substituída por IL-4 devido a sua ação pleiotrópica e pelo fato dela poder agir em
outras células que não os linfócitos B (PAUL, 1991).
A IL-4 tem importante efeito na ativação do linfócito B coordenando a mudança
de isotipos de Imunoglobulina para IgG1, IgG4 e IgE (PAUL, 1991) além de exibir
efeitos moduladores sobre a produção de IFN-γ (DAMLE; DOYLE, 1989). A principal
função fisiológica dessa citocina, é regular as reações imunes mediadas pela IgE e por
mastócitos/esosinófilos (VERSELLI et al., 1989).
35
Funcionalmente, IL-4 é mais conhecida por definir o fenótipo Th2 de linfócitos e
por regular da proliferação celular, apoptose e expressão de vários genes em vários tipos
de células, incluindo linfócitos, macrófagos e fibroblastos, bem como de células
epiteliais e endoteliais (LUZINA et al., 2012).
As principais fontes de IL-4 são os linfócitos TCD4, especificamente Th2,
mastócitos, eosinófilos e basófilos ativados. É uma citocina pleiotrópica que afeta
células de múltiplas linhagens (ARAI et al., 1989; BANCHEREAU et al., 1994;
NELMS et al., 1999; LUZINA et al., 2012).
A IL-4 diminui a atividade dos linfócitos Th1, inibindo a produção de IL-1, IL6, TNF-α e IFN-γ de células T ativadas, bloqueando assim, a atividade dos macrófagos
(ESSNER et al., 1989; DAMLE; DOYLE, 1989). Apresenta ainda, um efeito forte sobre
a proliferação dos fibroblastos na formação de fibrose (GILLERY et al.,1992).
A IL-4 pode exercer um papel deletério na infecção pulmonar causada pelo P.
brasiliensis. A deficiência de IL-4, no entanto, resulta no aumento das reações
inflamatórias nos pulmões, com números elevados de células PMNs presentes nos
espaços alveolares em uma fase precoce da infecção (PINA et al., 2004).
Uma característica evidente em camundongos infectados pelo P. brasiliensis
deficientes em IL-4, é a presença de processo inflamatório pulmonar menos grave, com
a presença de granulomas bem-organizados contendo fungos em seu interior,
circundados por pequeno número de leucócitos (GONZALES et al., 2000). Esta
resposta inflamatória desenvolvidas em camundongos deficientes em IL-4 parece ser
altamente eficiente em evitar o crescimento dos fungos fora da lesão, além de preservar
o tecido pulmonar (CANO et al., 1998).
A ausência de IL-4 não altera o padrão de citocinas nos pulmões de
camundongos deficientes a esta citocina, mas conduz a um aumento da carga de fungos,
sendo esta situação, considerada fator protetor na infecção pulmonar pelo P. brasiliensis
em camundongos. Seu efeito pode ser visto após 48 h de inoculação fúngica, devido a
maior habilidade dos fagócitos em matar o fungo (PINA et al., 2004; CALICH; VAZ;
BURGER, 1998).
Indivíduos com PCM com ausência de sintomas ou sinais de doença,
demonstram altos níveis de proliferação de linfócitos quando estimulados por antígenos
36
de P. brasiliensis e altos níveis de IFN-γ, em contrapartida exibem baixos níveis de IL4, IL-5 e IL-10 (OLIVEIRA et al., 2002; SADASHIRO et al., 2007).
Na PCM em pacientes já tratados os níveis de IL-4 detectados em cultura de
células são baixos. A IL-4 foi detectada em cultura de células de pacientes com PCM
ativa, após estimulação com antígeno do fungo, sendo fortemente detectadas em
pacientes com a forma aguda da doença (OLIVEIRA et al., 2002). Além disso, altos
níveis de expressão de RNAm de IL-4 foram observados em pacientes com a forma
aguda e crônica de PCM até 24 horas após estímulo antigênico, sugerindo que a IL-4
tem um papel na resposta Th2 frente à doença (MAMONI; BLOTTA, 2005).
Baixos níveis de IL-4 ou falha para detectar esta citocina nos sobrenadantes de
cultura de células de pacientes tratados podem estar relacionados com a ausência ou
níveis baixos de anticorpos, já que esta citocina tem sido associada com a presença de
anticorpos IgG4 na fase ativa da doença. A presença da IL-4 na cultura de células de
pacientes curados sugere que, mesmo após um longo período de tratamento, a resposta
imune não está restaurada em alguns pacientes (SADASHIRO et al., 2007).
Bozzi et al. (2009) sugerem que em pacientes com PCM pode ocorrer uma
variação nas funções dos gens promotores de IL-4. Esta variação ocasiona uma secreção
duas vezes maior de IL-4 nestes doentes, influenciando assim, o comportamento desta
citocina durante a doença.
Na PCM experimental em camundongos, Cavassani et al. (2011) demonstraram
que antígenos liberados na superfície do P. brasiliensis (CFA) tem efeitos
imunomoduladores durante o curso da doença. Neste estudo, a severidade da doença foi
atribuída à amplificação da produção de IL-4 influenciada pela presença de CFAs,
aumentando a severidade da doença nos pulmões.
O TGF- é uma família de moléculas intimamente relacionadas, codificadas por
genes distintos, comumente designadas TGF-1, TGF-2, TGF-3. As células do
sistema imune sintetizam principalmente TGF-1. O TGF-1 nativo é uma proteína
homodimérica de, aproximadamente, 28 kDa (PALLADINO et al., 1990). É uma
citocina de múltiplas funções, envolvida na diferenciação tecidual, na embriogênese,
nos processos de cicatrização e na hematopoiese (ROBERTS et al., 1990; RODRIGUES
JR; SILVA; CAMPOS NETO, 1998).
37
O TGF-β pode inibir a atividade de células do sistema imunológico mediando a
imunossupressão, inibindo a secreção de IL-2 por linfócitos T, a proliferação linfócitos
B e a ativação de macrófagos. Participa como uma citocina que promove a replicação in
vitro e a sobrevivência da Leishmania dentro de macrófagos, sendo um importante fator
para determinar in vivo a susceptibilidade à infecção experimental de camundongos com
espécies de Leishmania que causam as infecções cutânea e mucocutânea em seres
humanos (RODRIGUES JR; SILVA; CAMPOS NETO, 1998).
O TGF- tem papel central no desenvolvimento da fibrose em várias condições
de inflamações crônicas (BORDER; NOBLE, 1994), uma vez que, promove a
quimiotaxia de fibroblasto, estimula produção de colágeno e fibronectina, além de inibir
a degradação de colágeno. Ele também induz a expressão de α-actina em músculos lisos
e em fibroblastos que é considerado ser um importante fator responsável pela formação
de miofibroblasto (HAUTMANN; ADAM; OWENS, 1999; SHIOJIMA et al., 1999).
Em modelos experimentais, a maior expressão de TGF- especificamente no coração,
resulta em hipertrofia e fibrose (ROSENKRANZ et al., 2002). A neutralização do TGF por anticorpos anti-TGF- resultou em redução de fibrose em ratos hipertensos
(KUWAHARA et al., 2002).
A expressão de TGF-β em pacientes com lesões cutâneas de PCM, não
demonstraram diferenças significativas que comprovem o envolvimento direto desta
citocina supressora com a resposta granulomatosa apresentada nesta micose (SILVA et
al., 2013).
A relação direta do TGF-β na morte do P brasiliensis em modelos
experimentais, não foi encontrada, e a influência desta citocina na atividade fungicida
do IFN-γ e TNF-α secretados por macrófagos ativados parece não existir (MOREIRA;
DIAS-MELICIO; SOARES, 2010).
O TGF-β e a IL-10 parecem mediar por meio do contato célula–célula, a
ativação de células T reguladoras (CD4+ CD25+) contribuindo para a imunossupressão
durante a PCM infecção (FERREIRA; OLIVEIRA; MARIA, 2010).
Linfócitos T CD4+ produtores de IL-17 foram identificados como sendo uma
subpopulação com origem distinta dos linfócitos Th1 e Th2, sendo denominados de
Th17 (PINA et al., 2006; HARRINGTON; MANGAN; WEAVER, 2006). Essas células
38
foram identificadas por apresentar um papel de grande importância em doenças
autoimunes como a esclerose múltipla, a artrite reumatóide e as doenças inflamatórias
intestinais (HARRINGTON et al., 2005; PARK et al., 2005).
De maneira geral as células Th17 se diferenciam na presença de TGF-β e IL-6,
sendo que outras citocinas inflamatórias como IL-1β e TNF-α podem ter efeitos
adicionais (ACOSTA-RODRIGUEZ et al., 2007; YANG et al., 2008; ROMAGNANI,
2008; SANTARLASCI et al., 2009; ZHOU; CHONG; LITTMAN, 2009).
Apesar de terem sido inicialmente descritas na resposta imunológica em doenças
autoimunes, a participação de células Th17 também tem sido descrita tanto na
resistência como na suscetibilidade a doenças infecciosas causadas por bactérias,
protozoários e fungos (MATSUZAKI; UMEMURA, 2007; MIYAZAKI et al., 2010).
Na tuberculose pulmonar humana, foi demonstrada uma diminuição da quantidade de
células Th17 na circulação periférica em comparação ao observado em indivíduos
saudáveis, situação revertida após o tratamento efetivo (SCRIBA et al., 2008; CURTIS;
WAY, 2009).
A participação das células Th17 na resposta imunológica a doenças causadas por
fungos já foi apresentada, e a IL-17 foi apontada como uma das principais citocinas que
promovem a resistência a esses agentes patogênicos (ROMANI, 2011; HUANG et al.,
2004).
Nas formas mucocutâneas da PCM, a presença de TGF-β nas áreas de fibrose,
sugere que esta citocina esta envolvida no processo de cicatrização através da
estimulação da proliferação de fibroblastos, como também exerce funções reparadora e
reguladora das lesões, modulando a resposta inflamatória, reduzindo a destruição
tecidual e contribuindo para o reparo e menor intensidade da sequela tecidual
(PARISE-FORTES et al., 2006).
A implantação do P. brasiliensis nos tecidos do hospedeiro de forma eficaz
depende de características do fungo, como virulência da cepa infectante e volume do
inoculo e, principalmente, do ambiente de citocinas produzidas durante o confronto
entre o fungo e as células fagocitárias. Onde o fungo pode induzir precocemente a
síntese de citocinas com atividade supressora ou anti-inflamatória, como o TGF-β e IL10, resultando na supressão da resposta macrofágica, permitindo assim, a instalação e
39
reprodução do fungo nos tecidos e a disseminação do mesmo para vários órgãos e
sistemas (BENARD, 2008).
A IL-17 secretada pelas células Th17 (MIOSSEC, 2009; CHEVREL;
GARNERO; MIOSSEC, 2002; HARRINGTON; MANGAN; WEAVER, 2006) e o
TGF-β produzido entre outras, por células T reguladoras (Treg) tem efeitos opostos na
modulação do processo inflamatório, embora não exerçam efeitos inibitórios mútuos
(ANNUZIATO et al., 2008; MAITRA et al., 2009). O TGF-β na presença da IL-6 pode
contribuir para o aparecimento da resposta Th17 (MIOSSEC, 2009; JONG;
SUDDASON, LORD, 2010; AFZALI et al., 2010).
No modelo experimental da infecção causada pelo Pneumocystis jiroveci
(carinii), a produção de IL-17 e IL-23, foi apontada como sendo importante na resposta
protetora (RUDNER et al., 2007). Na infecção experimental por Histoplasma
capsulatum, Heninger et al. (2006) relataram a presença de células produtoras de IFN-γ
e IL-17 no granuloma formado em resposta ao fungo, e que a IL-17 é necessária para a
sua formação. Na infecção pelo Cryptococcus neoformans, a presença de IL-23, e
consequentemente de IL-17, foi relacionada à resistência à doença por meio da indução
de citocinas inflamatórias como IL-1 e IL-6 (KLEINSCHEK et al., 2006).
Em relação à infecção por Candida albicans, existem trabalhos com resultados
contraditórios, sendo que alguns apontam para a participação dessas células na
resistência, e outros na suscetibilidade à infecção (CURTIS; WAY, 2009; ZELANTE et
al., 2007; EYERICH et al., 2008). Em um trabalho publicado por Zelante et al. (2007),
os autores também verificaram que a IL-17 pode influenciar na suscetibilidade à
infecção por C. albicans e Aspergillus fumigatus, e que nas duas infecções esta citocina
induz o aumento da atividade inflamatória na resposta inicial, que em última instância
resulta em uma resposta celular deficiente, e em uma atividade fungicida de neutrófilos
bastante reduzida.
Em trabalho realizado por Roussel et al. (2010), foi demonstrado que a IL-17
apresenta-se como potente ativadora do endotélio in vivo, promovendo o recrutamento
de neutrófilos para locais inflamatórios. As células endoteliais expressam receptores
para IL-17 respondem de maneira rápida quando estimuladas com a citocina,
produzindo moléculas quimiotrativas para neutrófilos além de moléculas de adesão
envolvidas no extravasamento de leucócitos. A IL-17, desse modo, participa ativamente
40
na migração de leucócitos (principalmente de neutrófilos) tanto in vivo quanto em testes
in vitro.
A participação de células produtoras de IL-17 (Th17) na resposta imunológica a
infecções fúngicas está relacionada à contenção desses patógenos, sobretudo por sua
função como citocina pró-inflamatória, atuando na ativação e migração de neutrófilos
(FEINEN et al., 2010).
Pagliari et al. (2011a) e Paião (2012), demonstraram o papel da IL-17 e de
citocinas relacionadas às células Th17 na PCM, onde foi observado que as amostras
analisadas exibiam grande número de células produtoras dessa citocina.
Em lesões orais de PCM, as células mononucleares expressam IL-7
frequentemente nas paredes dos vasos, contribuindo para a lesão tecidual e induzindo a
elevada expressão de moléculas de adesão (PAGLIARI et al., 2011a).
A resposta Th17 parece ser importante para a contenção da PCM, uma vez que
predomina nas formas mais brandas e localizadas, exercendo um papel semelhante
àquele observado em outras infecções fúngicas, induzindo uma resposta inflamatória
local e ativando células do sistema imunológico inato (CONTI et al., 2009; GAFFEN,
2008).
Apesar de ser importante para a resposta imunológica contra o P brasileiensis,
induzindo uma resposta inflamatória local e ativando células do sistema imunológico
inato, a IL-17 por outro lado, pode apresentar um papel deletério, gerando uma resposta
inflamatória intensa que estaria envolvida na destruição tecidual, principalmente na
forma crônica da doença (PAIÃO, 2012).
As Tregs representam uma subpopulação de linfócitos T caracterizados pela
expressão da molécula CD25+ e do fator nuclear FoxP3. Induzem a supressão das
células T efetoras, bloqueando a ativação e a função destes linfócitos, sendo assim
importantes no controle da resposta imunológica a Ag próprios e não próprios
(CAMPBELL; ZIEGLER, 2007; SOJKA; HUANG; FOWELL, 2008).
São descritas pelo menos dois tipos de Tregs: naturais e adaptativas
(BACCHETTA; GAMBINERI; RONCAROLO, 2007) As chamadas Tregs naturais
expressam constitutivamente o receptor de cadeia α da IL-2, sendo assim denominadas
CD4+CD25+ (YAGI et al., 2004). São produzidas naturalmente nos corpúsculos de
Hassal no timo como uma subpopulação de células T funcionalmente distintas e
41
maduras, e representam 5 a 10% das células T CD4+ periféricas (SAKAGUCHI,
2005b).
Outros receptores de superfície descritos nas Tregs são: CD27, Fas, CD62L; e os
receptores de quimiocina CCR6, CCR7, CCR8 e CD103, o que permite a migração das
Tregs até o local de inflamação (BACCHETTA; GAMBINERI; RONCAROLO, 2007;
GUPTA; SHANG; SUN, 2008). Entretanto, como nenhum destes marcadores é
exclusivo desta subpopulação celular, uma vez que refletem também o estado de
ativação do linfócito T (GUPTA; SHANG; SUN, 2008), a descoberta do fator de
transcrição FoxP3, crucial no desenvolvimento e função das Tregs, permitiu caracterizar
melhor estas células (YAGI et al., 2004).
As Tregs denominadas adaptativas, por sua vez são geradas na periferia após
uma variedade de estímulos antigênicos ou em condições ditas tolerogênicas
(BACCHETTA; GAMBINERI; RONCAROLO, 2007; TAAMS et al., 2006). Estas
células exercem sua função através da liberação de citocinas inibitórias como IL-10 e
TGF-β (JONULEIT; SCHMITT, 2003; SAKAGUCHI, 2006 a).
As proteínas FOX (forkhead box) são componentes de uma família de fatores de
transcrição (COFFER; BURGERING, 2004). Estas proteínas têm um domínio ligante
de DNA altamente preservado denominado forkhead/winged-helix, o qual recebeu este
nome devido à forma de dupla-asa, semelhante a uma borboleta (TORGERSON;
OCHS, 2007; COFFER; BURGERING, 2004). O fator FoxP3 é membro da subfamília
P das proteínas Fox e assim como os demais fatores de transcrição, é composto por três
domínios (repressor, central e ligante de DNA ou forkhead (CAMPBELL; ZIEGLER,
2007; COFFER; BURGERING, 2004).
O gene FoxP3 humano está localizado no braço curto do cromossomo X,
consiste de 11 exons e codifica uma proteína de 431 aminoácidos, também denominada
FoxP3. É expresso predominantemente nas células do timo, baço e linfonodos e
particularmente nas células T CD4+CD25+ (YAGI et al., 2004; TORGERSON, 2007).
A proteína FoxP3 é um fator de transcrição, cuja função é exercida sobre regiões
reguladoras específicas dentro do DNA, aumentando ou suprimindo a transcrição de
genes específicos (MELO; CARVALHO, 2009). Acredita-se que o fator FoxP3 exerça
funções efetora e facilitadora sobre os genes de proteínas chaves na ativação celular,
incluindo a IL-2 e o GM-CSF (TORGERSON, 2007).
Acredita-se que a sinalização nuclear através da FoxP3 nas Tregs, ocorra após a
ligação do antígeno com o receptor de células T, e atuaria na ativação de um co-fator
42
com a função de liberar sinais inibitórios após esta ligação (CAMPBELL; ZIEGLER,
2007).
Sendo a FoxP3 um marcador nuclear, o receptor de IL-7, que é regulado
negativamente pelo FoxP3, tem sido descrito como um marcador de superfície
fidedigno para selecionar as Tregs dentre a subpopulação de linfócitos T, além de
caracterizar aquelas com maior função supressora (LIU et al., 2006; NEDHLOVU et al,
2008).
O estudo das Tregs nas doenças humanas tem aumentado nas últimas décadas
(BACCHETTA; GAMBINERI; RONCAROLO, 2007; TAAMS et al., 2006;
TORGERSON, 2007). São inúmeros trabalhos sobre a possibilidade destas células se
tornarem uma opção terapêutica nas doenças alérgicas, autoimunes, neoplásicas e
infecciosas (SAKAGUCHI et al., 2001c; CHAI et al., 2005; TAAMS et al., 2006;
TORGERSON, 2007; MELO; CARVALHO, 2009).
O TGF-β pode atuar como um potente controlador da resposta imune, a IL-17
tem propriedade de reativar o processo inflamatório, inclusive induzindo uma
inflamação caracterizada pela presença de neutrófilos, podendo contribuir para a
patogênese das lesões. Assim a presença ou a ausência de TGF-β, bem como de
citocinas pró-inflamatórias determina o balanço ou equilíbrio da expressão de FoxP3,
como também, se o perfil de resposta imune será Th17 ou Treg (BETRELLI et al.,
2006; OKUI et al., 2008).
Pagliari e colaboradores em 2011a, avaliaram por meio de ensaio
imunohistoquímico a expressão da IL-17 e do FoxP3 em lesões orais e cutâneas da
PCM humana. Os resultados deste trabalho demonstram haver expressiva presença de
células Treg em lesões orais e cutâneas da PCM, podendo representar um mecanismo
imunorregulatório local na patogênese da PCM.
As células do sistema imune apresentam em sua superfície receptores
responsáveis pelo reconhecimento dos produtos microbianos, conhecidos como
receptores de reconhecimento padrão (“pattern-recognition receptor” - PRR), que são
componentes importantes da imunidade inata (JANEWAY, 1992). Estes receptores
reconhecem padrões moleculares conservados (“pathogen-associated molecular
patterns” – PAMPs), comuns entre grandes grupos de microrganismos (MCINTURF;
MODLIN; KIM, 2005).
Vários PRRs já foram identificados há algum tempo. Entre eles, a família de
receptores “Toll-like” (TLR) foi identificada em humanos e camundongos
43
(MEDZHITOV; PRESTON-HURLBURT; JANEWAY, 1997). A proteína Toll foi
inicialmente descrita nas moscas das frutas, a Drosophilla melanogaster, como um
receptor transmembrana tipo I com um papel importante no desenvolvimento dorsoventral dos embriões dessas moscas. Já a associação de Toll com a defesa
antimicrobiana foi inicialmente observada em Drosophila sp. por Lemaitre et al. (1996).
As moscas deficientes em Toll sucumbiram rapidamente à infecção através de agulhas
contaminadas com uma suspensão contendo conídios de Aspergillus fumigatus.
Em seguida, um homólogo deste receptor Toll (conhecido como “Toll-like
receptor 4”- TLR4) foi demonstrado em mamíferos, estando relacionado à indução da
expressão de genes envolvidos nas respostas inflamatórias (MEDZHITOV; PRESTONHURLBURT; JANEWAY, 1997).
Quando são ativados pelos patógenos os TLRs iniciam uma cascata de
sinalização intracelular que resulta na produção de várias citocinas pró-inflamatórias e
fatores imunomodulatórios podendo inclusive em alguns casos induzir também uma
resposta imune adaptativa (O'NEILL; BOWIE, 2007).
Nos mamíferos os TLRs reconhecem padrões específicos dos componentes
microbianos que são conservados entre os patógenos e não estão presentes nos
mamíferos, percebendo assim, a invasão de vários microrganismos estranhos como
bactérias, fungos, protozoários e vírus (TAKEDA; AKIRA, 2004).
Outros membros da família TLR são essenciais para o reconhecimento de uma
variedade de componentes microbianos (TAKEDA; KAISHO; AKIRA, 2003) como
lipoproteínas
e
peptidoglicanos
(TLR2
em
combinação
com
o
TLR1
e
TLR6)(HIRSCHFELD et al., 2000; ALIPRANTIS et al., 1999; HAJJAR et al., 2001),
flagelina (TLR5), RNA (viral) dupla fita (TLR3) e DNA bacteriano (TLR9). O TLR4
também permite a sinalização em resposta a estímulos inflamatórios não infecciosos
como HSP60 (OHASHI et al., 2000) e peptídeos de fibrinogênio (SMILEY; KING;
HANCOCK, 2001).
Após o reconhecimento dos PAMPs, uma cascata de eventos de sinalização
intracelular é ativada, o que culmina na indução de citocinas pró-inflamatórias como o
TNF-α, IL-6, IL-1 e IL-12 (MIGGIN; O’NEILL, 2006).
A via de sinalização intracelular do TLR4 inicia-se com a interação com uma
proteína adaptadora MyD88 que recruta outras proteínas-quinases levando à ativação do
NF-κB (MEDZHITOV; PRESTON-HURLBURT; JANEWAY,1997). Após a ativação
pelo ligante, o MyD88 recruta membros da família de quinases associadas ao receptor
44
de IL-1 e do fator 6 associado ao receptor de TNF. Estes adaptadores iniciam uma
sequência de reações de fosforilações que levam a ativação do fator de transcrição NFκB, proteino-quinases ativadas por mitógenos e fatores de resposta ao Interferon. O
TLR4 pode se ligar a duas proteínas adaptadoras distintas: o MyD88, que é recrutado
pelo receptor “Toll-/IL-1 levando à produção de citocinas pró-inflamatórias; e o “TIRdomain-containing adapter-inducing Interferon β (TRIF),que é recrutado pelo adaptador
“TRIF-like receptor adaptor molecule” (TRAM) que ativa a produção de Interferons
tipo I bem como de citocinas pró-inflamatórias (WATTS, 2008).
A capacidade dos TLRs de reconhecerem múltiplos alvos em um único agente
infeccioso significa que a contribuição de um único TLR na detecção do patógeno pode
não ser essencial para a proteção. Em muitos casos, dois TLRs diferentes colaboram
entre si, ou com outro co-receptor, havendo um sinergismo entre eles, o que leva a uma
resposta apropriada para o tipo de microrganismo detectado (OZINSKY et al., 2000;
ZAMBONI et al., 2004).
Os TLRs são conhecidos por iniciar a sinalização de eventos que permitem a
expressão de mediadores inflamatórios, incluindo várias citocinas, quimiocinas e
moléculas de adesão celular (BANERJEE; GERONDAKIS, 2007). Juntamente com os
PAMPs, os TLRs são sensíveis a uma grande variedade de moléculas endógenas que
são liberadas devido ao dano celular ou tecidual, podendo provocar a instalação de um
processo inflamatório (WAGNER, 2006). Já foi demonstrado que os TLRs são cruciais
para o reconhecimento de microrganismos patogênicos e a ativação de uma resposta
imune inata, como ocorre em fungos como: Candida albicans, Aspergillus fumigatus, e
Cryptococcus neoformans (KOPP; MEDZHITOV, 2003; VILLAMON et al., 2004;
BRAEDEL et al., 2004).
Durante a PCM, a interação entre moléculas de superfície do parasita e TLRs
presentes na membrana celular das células fagocíticas, induzem a modulação e ativação
da fagocitose por estas células (FORTES et al., 2011). Ferreira e colaboradores em
2007, na PCM pulmonar experimental, encontraram um aumento da expressão do gen
para TLR-2 e TLR-4 e níveis altos de IL-10 após a infecção pelo P. brasiliensis.
Modelos experimentais da PCM sugerem que leveduras do fungo penetram em
macrófagos do hospedeiro através dos receptores TLR2 e TLR4. A interação entre o
TLR e o P. brasiliensis é considerada um mecanismo de escape desenvolvido pelo
fungo para garantir sua sobrevivência dentro das células fagocitárias (CALICH et al.,
2008b).
45
O envolvimento do TLR2, TLR4 e dectin-1 no reconhecimento e internalização
do P.brasiliensis com consequente ativação de neutrófilos, já foi demonstrada. Sabe-se
ainda que, a cepa menos virulenta do fungo foi reconhecida preferencialmente por
TLR2 e detectin-1, com produção balanceada de TNF-α e IL-10. No entanto, a cepa
mais virulenta induziu somente a produção de TNF-α. Sugere-se que a cepa menos
virulenta desencadearia uma resposta mais controlada, menos danosa para o hospedeiro
por meio da indução da produção de IL-10 (BONFIM et al., 2009).
Ênfase tem sido dada a estudos que investigam as propriedades da lectinas
endógenas, denominada de Galectinas (Gals). As Gals pertencem a uma família de
lectinas que mostram alta afinidade para resíduos β-galactosídeos e participam na
migração, adesão e proliferação das células (CVEJIC et al., 2005).
Existem inúmeros tipos de Gals encontradas em mamíferos participando de
diferentes fenômenos biológicos, como interação célula-célula e célula-matriz
extracelular, diferenciação celular, angiogênese, apoptose e inflamação (DUMIC,
DABELIC, FLÖGEL, 2006; BRUSTMANN, 2006). As galectinas vêm sendo isoladas
de várias espécies de vertebrados, sugerindo seu envolvimento nas funções básicas da
célula (HOUZELSTEIN et al., 2004).
As Gals estão divididas em três grupos de acordo com sua estrutura e número de
CRDs (domínio de reconhecimento a carboidratos). Estas podem existir como
monômeros ou homodímeros não covalentes de CRD (Galectinas 1, 2, 5, 7, 11, 13, 14, e
15), como quimeras compostas por um CRD ligado a um domínio diferente de lectina
(Galectina-3), e finalmente como repetições em série de dois CRDs diferentes em única
cadeia polipeptídica (Galectinas 4, 6, 8, 9, e 12) (HIRABAYASHI et al., 2002;
CASTRO, 2009).
As Gals variam em diversos aspectos, sendo um deles, a valência dos domínios
de reconhecimento a carboidratos (AHMAD et al., 2004). Esta característica peculiar
permite formar redes mistas entre estas proteínas e carboidratos multivalentes
(SACCHETTINI et al., 2001).
Todas as Gals são sintetizadas nos ribossomos do citoplasma e desempenham
funções intracelulares que diferem quando presentes no citosol ou no núcleo (LIU et al.,
2002; HSU; LIU, 2004; NORLING; PERRETTI; COOPER, 2009). Estas proteínas não
46
possuem uma sequência sinalizadora clássica que permita sua secreção, mas estas
podem exercer funções extracelulares, autócrinas ou parácrinas, dependendo das
proteínas de superfície presentes na célula (HSU; LIU, 2004; ELOLA et al., 2007;
CASTRO, 2009).
Alguns estudos apontam que as Gals têm um papel importante na ativação dos
mastócitos (CHEN et al., 2009) já outros estudos experimentais, demonstraram que a
Gal-3 pode induzir a apoptose de mastócitos (SUZUKI et al., 2008). As Gals têm
emergido como promissoras na compreensão de inúmeras doenças. Estas se ligam a
proteínas localizadas na superfície de células endoteliais, células-T e em proteínas da
matriz extracelular (BALKWILL, 2004).
As galectinas 1(Gal-1), 3(Gal-3) e 9(Gal-9) estão envolvidas na modulação da
resposta inflamatória em doenças agudas e crônicas, na autoimunidade e no câncer
(NORLING; PERRETTI; COOPER, 2009), bem como, uma variedade de funções
biológicas envolvidas nas respostas imune, inflamatória e tumoral (YANG et al., 2008).
No sistema imune, a Gal-1 é encontrada nos órgãos linfóides (BAUM et al.,
1995), células T (BLASER et al., 1998; FUERTES et al., 2004), macrófagos ativados
(RABINOVICH et al., 1998) e em células endoteliais, onde tem um papel importante na
inflamação (LOTAN et al., 1994, BAUM et al. 1995).
A Gal-1 também está associada na indução de apoptose (FUERTES et al., 2004).
A Gal-3 é expressa em todos os tipos de células do sistema imune, incluindo células
endoteliais, linfócitos, neutrófilos, monócitos, macrófagos mastócitos e células
dendríticas (LOTAN et al., 1994, BAUM et al., 1995). Embora muito se conheça sobre
seus aspectos estruturais e bioquímicos, suas funções biológicas ainda precisam ser
melhor estudadas. No entanto, dependendo da sua localização na célula, a Gal-3 pode
exercer diferentes funções, algumas até mesmo antagônicas (LEE et al., 2006).
A Gal-9 é encontrada em linfócitos T ativados (TASHIRO et al., 1985) e sua
expressão pode ser induzida em outras células, como fibroblastos e células endoteliais,
pela ação do IFN-γ (IMAIZUMI et al., 2002; ASAKURA et al., 2002). A expressão
aumentada de Gal-9 sob estímulo pró-inflamatório sugere uma auto-regulação da
resposta Th1, visto que o IFN-γ é produzido principalmente por esse subtipo de
linfócitos (NORLING; PERRETTI; COOPER, 2009).
47
Na PCM a Gal-3 parece ter um papel protetor e imunorregulador na resposta à
infecção pelo P. brasiliensis (RUAS et al., 2009). A proteção contra o P. brasiliensis,
parece depender de adequada reposta inflamatória e da produção de citocinas, sendo que
a Gal-3 parece ser importante na regulação do balanço Th1/Th2 nesta micose (RUAS et
al., 2009). Nota-se até o momento que o papel das Gal-1, 3 e 9 na modulação do
processo inflamatório de lesões de PCM, vêm sendo estudado, mas em lesões orais
desta micose, estas moléculas ainda merecem mais atenção, necessitando serem
estabelecidas.
As metaloproteinases da matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas envolvidas
com as membranas basais (MB) (NAVARRO et al., 2006), desempenhando papel
central na desagregação excessiva da matriz extracelular (MEC) (STERNLICHT;
WERB, 2009).
As MMPs têm sido associadas com a degradação de quase todos os
componentes da MEC incluindo o colágeno intersticial, a fibronectina, a laminina e a
proteoglicana (NAVARRO et al., 2006; SOUZA et al., 2001) Por possuírem uma
grande variabilidade, elas acabam tendo uma intervenção complexa em várias
fisiopatologias (JOHANSSON et al., 2000).
As MMPs são secretadas na forma de pró-enzimas inativas, denominadas de
zimogênios, que são ativadas no ambiente pericelular dos tecidos por segmentação de
uma parte dos zimogênios denominada pró peptídeo, ou seja, por quebra de uma ligação
de cisteína Zn++ que bloqueia a reatividade do local ativo. Este processo faz com que
os zimogênios (inativos) se tornem MMPs (ativas). Elas constituem uma família de
endopeptidases zinco-dependentes (NAVARRO et al., 2006).
As MMPs são compostas por mais de 26 endopeptidases, tendo estas sequências
homólogas de proteínas e sequências específicas relacionadas à especificidade do
substrato e reconhecimento de outras proteínas. São classificadas em 5 grandes grupos
de acordo com a especificidade do substrato e sua homologia interna: colagenases,
gelatinases, estromelisinas, tipo-membrana e matrililisina (NAVARRO et al., 2006).
Para realizar as funções (normais ou patológicas), as MMPs devem estar
presentes na célula em localização pericelular, na hora e na quantidade certa e devem
ser ativadas ou inibidas de forma adequada (STERNLICHT; WERB, 2001). As
48
principais células que produzem MMPs são os leucócitos polimorfonucleares, os
queratinócitos, os monócitos, os macrófagos, os fibroblastos e as células mesenquimais,
sendo estas proteínas capazes de responder a fatores de crescimento e citocinas como a
Interferon, IL-1, o TNF-α e o TGF-β. Na presença desses fatores, as células produtoras
de MMPs liberam estas proteínas em grânulos específicos de armazenamento para o
meio extra-celular (NAVARRO et al., 2006).
As MMPs são reguladas em níveis transcricionais e pós-transcricionais, podendo
ser também reguladas ao nível da proteína através de seus ativadores, seus inibidores e
sua localização na superfície celular (STERNLICHT; WERB, 2001). Em alguns casos,
um sinal pode coordenadamente regular a expressão de alguns genes de MMP e
diferencialmente regular outros. Além disso, algumas MMPs são expressas em apenas
um pequeno repertório de tipos celulares, por exemplo, a expressão MMP-9 normal é
extremamente limitada aosteoclastos, a macrófagos, as células trofoblásticas, aos
neurônios do hipocampo, à migração de queratinócitos e às margens da cicatrização de
feridas (ELKINGTON; OCKANE; FRIEDLAND, 2005).
Além dos substratos da MEC, as MMPs também podem decompor moléculas de
superfície e outras proteínas pericelulares que não são da matriz, regulando assim o
comportamento das células de várias maneiras (STERNLICHT; WERB, 2001).
A remodelação da MEC está envolvida tanto na fisiologia, como na
embriogênese, e em condições patológicas, como nas doenças inflamatórias
(JOHANSSON et al., 2000). O papel desempenhado pelas MMPs em doenças
inflamatórias não envolve apenas a degradação catabólica da MEC, mas também a
regulamentação das funções celulares críticas, tais como proliferação, diferenciação e
migração de células Elas possuem a capacidade de decompor e regular a atividade
biológica de uma ampla variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento,
citocinas, receptores da superfície celular e inibidores da protease (ELKINGTON;
OCKANE; FRIEDLAND, 2005).
O envolvimento de MMPs em infecções fúngicas tem sido demonstrado em
estudos clínicos e experimentais, com especial atenção para MMP-2 e MMP-9. A
secreção de MMP-9 foi observada na Aspergilose pulmonar, associada a infiltrado de
neutrófilos e a dano tecidual evidente (GIBSON et al., 2003).
49
Altos níveis de MMP-9 foram detectados em meningite e vasculite experimental
induzida por infecção por Coccidioides immitis, sugerindo que, a quebra da barreira
hematoencefálica pode ter sido influenciada pelas MMPs (WILLIAMS et al. 2002).
Nishikaku et al. (2009) estudaram a expressão da MMP-9 na PCM experimental.
Esta foi detectada em lesões que exibiam degradação tecidual, principalmente necrose,
em ratos resistentes à doença, indicando a participação de enzimas proteolíticas, como a
MMP-9. Este estudo sugere que, a presença de MMP-9 nas amostras de ratos
infectados, independentemente de virulência fúngica, indica um papel importante da
MMP-9 na PCM crônica.
Na PCM experimental, a expressão de MMP-9 foi demonstrada em granulomas,
principalmente em células gigantes multinucleadas, macrófagos e linfócitos (HSU et al.
2005; GONZALEZ et al. 2002). No entanto, a habilidade destas células em produzir a
MMP-9 dentro de diferentes padrões imunológicos e inflamatórios já está estabelecido,
existindo a probabilidade de macrófagos e linfócitos serem fontes de MMPs. Além
disso, como alternativa o P brasiliensis pode apresentar receptores capazes de
reconhecer e se unir à MMP-9 secretada pelo hospedeiro. Tal possibilidade pode sugerir
que a MMP-9 na PCM pode contribuir para a disseminação do fungo dentro do tecido
infectado, além de influenciar na organização do padrão de granuloma a ser formado na
doença (NISHIKAKU et al., 2009). Nota-se que em lesões orais da PCM, o
envolvimento das MMPs ainda não está esclarecido.
Considerando o fato de que, pouco ainda se sabe sobre a resposta imune no
sinergismo ou antagonismo do P. brasiliensis em lesões orais de PCM crônica, estudos
in situ que possam avaliar aspectos histopatológicos e imunológicos envolvidos no
papel das diferentes respostas efetoras (Th1, Th2 e Th17), respostas regulatórias (Treg),
bem como, a correlação entre os TLRs, Gals, MMPs e das proteases citoplasmáticas de
mastócitos podem ajudar no maior conhecimento dos mecanismos responsáveis pelas
manifestações clínicas desta micose.
50
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar em biópsias de lesões orais de PCM crônica, os aspectos
histopatológicos e imunológicos envolvidos no papel das diferentes respostas efetoras e
regulatórias, galectinas e metaloproteinases de matriz na interação com o P.
brasiliensis.
2.2 Objetivos Específicos:

Caracterizar
histopatologicamente
os
granulomas
organizados
ou
não
organizados.

Detectar e quantificar a densidade de mastócitos.

Quantificar a porcentagem de fibrose.

Avaliar in situ a expressão de citocinas e marcadores do perfil Th2 (IL-4), Th17
(IL-17) e Treg (IL-10;TGF- β; FoxP3).

Avaliar in situ a expressão dos receptores do tipo Toll (TLR-2 e TLR-4).

Avaliar in situ a expressão das Galectinas 1, 3 e 9.

Avaliar in situ a expressão das Metaloproteinases 3 e 9.
51
3 HIPÓTESE
A interação entre as Citocinas, TLRs, Gals, proteases citoplasmáticas de
mastócitos e MMPs no sinergismo ou antagonismo com fungos, resulta em diferentes
respostas efetoras (Th2 e Th17) e em respostas regulatórias (Treg) que determinam a
resposta final à PCM oral.
52
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostra para Análise Histoquímica, Morfométrica e Imunohistoquímica
A amostra foi constituída de lesões orais obtidas no Serviço de Anatomia
Patológica do Curso de Odontologia da Universidade de Uberaba (UNIUBE) e no
Laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia (PATMED), no período de abril de
2001 a abril de 2011. Após a aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro sob o protocolo n° 2231 CEP/UFTM
(Anexo 1), a seleção dos casos estudados ocorreu a partir da análise de planilha
eletrônica montada no Software Excel, fornecida pela UNIUBE e PATMED. Esta
planilha foi constituída das seguintes informações: código do caso, sexo, raça, idade,
local da lesão e diagnóstico histopatológico.
Os dados fornecidos por meio da planilha eletrônica, não permitiu qualquer
acesso aos dados de identificação dos pacientes, já que os códigos de registro de entrada
no laboratório (código do caso) foram constituídos apenas por algarismos.
4.2
Seleção
do
material
para
Análise
Histoquímica,
Morfométrica,
Imunohistoquímica
Foram selecionados 16 casos de lesões orais de pacientes que tiveram
diagnóstico positivo para PCM crônica, todos do sexo masculino, com idade variando
de 34 a 83 anos. De posse dos números dos casos selecionados para o estudo, os blocos
de parafina foram separados e as lâminas confeccionadas.
Os casos foram agrupados conforme descrito por Kaminagakura et al. (2007),
classificando áreas de cada espécime como granulomas organizados e não organizados.
Como controles, foram selecionados 13 casos de diagnóstico histopatológico de
mucosa oral com características de normalidade encontrados no período em estudo no
Laboratório de Anatomia Patológica do Curso de Odontologia da UNIUBE. Sendo 03
do sexo masculino e 10 do sexo feminino, com idade variando de 12 a 75 anos.
53
Dos 16 casos de PCM oral na forma crônica selecionados para este trabalho,
todos eram do sexo masculino, etnia branca, com idade variando de 34 a 86 anos, onde
as localizações preferenciais das lesões foram: o palato (25%), língua (25%), mucosa
jugal (20%), lábio inferior (20%) e região retromolar (10%).
Para os casos controles que tiveram diagnóstico histopatológico de mucosa oral
com características de normalidade (13 casos), 78,57% eram pacientes do sexo
feminino, 64,28% possuíam etnia branca, com idade mais prevalente, variando entre 12
a 37 anos, onde a localização preferencial foi a região interna do lábio inferior.
4.3 Histoquímica
Os blocos de parafina selecionados foram cortados em micrótomo com cortes
seriados de 5µm de espessura. Na lâmina de número 1 foi realizada a coloração pela
Hematoxilina (solução alcoólica de hematoxilina adicionada a alúmen de potássio e
óxido de mercúrio vermelho) e Eosina (solução aquosa de stock de eosina y e floxina a
1% adicionada a ácido acético glacial e álcool a 95%) (HE) (MICHALANY, 1980), na
lâmina de número 2 foi feita a coloração pelo azul de Toluidina (detecção de
mastócitos) (PAGLIARI et al., 2006c) e na lâmina 3 a coloração de Picrossirius
(MONTES; JUNQUEIRA, 1979). As demais lâminas foram reservadas para
imunohistoquímica e foram todas silanizadas (3-aminopropyltriethoxysilane – Sigma)
antes de seu processamento.
4.4
Processamento das lâminas para detecção de Mastócitos pelo Azul de
Toluidina
As lâminas foram desparafinizadas, lavadas em água destilada, coradas pela
fucsina-laranja G e mergulhadas rapidamente no álcool 60%. Em seguida, foram
coradas pelo azul de toluidina em um rápido mergulho e lavadas rapidamente no álcool
60%. A seguir, diferenciadas em álcool 95% até que o corte se tornou vermelho, onde
foram desidratadas no álcool absoluto e xilol. Por fim, as lâminas foram montadas e
54
observadas no microscópio de luz comum em aumento de 400X (PAGLIARI et al.,
2006; BERBERT et al., 2011).
4.5 Processamento das lâminas para a quantificação da Fibrose/Colágeno coradas
por Picrosírius
Inicialmente as lâminas foram desparafinizadas, lavadas em água destilada e
coradas durante uma hora na solução de Picrosírius (solução aquosa saturada de ácido
pícrico adicionada de 0,1g% de vermelho da Síria F3b, Sirius red F3B-Bayer) à
temperatura ambiente. Em seguida as lâminas foram lavadas em água corrente por 5
minutos e coradas pela Hematoxilina de Harris por 6 minutos. Finalizando as lâminas
foram lavadas em água corrente por 10 minutos, montadas e observadas no microscópio
de luz polarizada com aumento de 400X (MONTES; JUNQUEIRA, 1979;; DA SILVA
et al., 2009; BERBERT et al., 2011; ROLDÃO et al., 2012; RAMALHO et al., 2013).
4.6 Imunohistoquímica
Para determinar e quantificar a expressão in situ da expressão de quimase e triptase;
das citocinas IL-10, IL-4, IL-17, TGF- β; FoxP3; dos receptores do tipo Toll (TLR-2 e
TLR-4); Galectinas (1, 3 e 9) e Metaloproteinases 3 e 9 foi realizada a técnica de
imunohistoquímica direta.
As lâminas foram desparafinizadas em quatro banhos de xilol cada um por 10
minutos, em seguida, passadas por dois banhos de álcool absoluto, um banho de álcool
95%, um banho de álcool 70% com tempo de 5 minutos cada banho, e depois,
mergulhadas por 5 minutos em água ultra pura para a retirada do excesso do álcool.
Para recuperação dos antígenos, as lâminas foram colocadas em Banho Maria a
90°C em ácido cítrico 0.01 molar pH=6,0 onde permaneceram por 30 minutos. Após
esse tempo, as lâminas foram retiradas e permaneceram por 10 minutos, ainda dentro da
solução de ácido cítrico. Para o bloqueio de ligações inespecíficas, após o resfriamento,
as lâminas foram secas uma a uma e, então; acrescentados 100µl de PBS/BSA 2% em
cada corte durante 30 minutos.
Após secar as lâminas uma a uma, o anticorpo primário foi diluído em PBS/BSA
2% de acordo com as especificações de cada anticorpo e colocado nas lâminas,
permanecendo em câmara úmida por 2 horas (Tabela 1). Em seguida as lâminas foram
55
lavadas durante 5 minutos por 4 vezes com PBS e Tween 20, a 0,05%. Após a lavagem,
as lâminas foram imersas na solução de água oxigenada 30% e metanol por 10 minutos
e lavadas novamente, durante 5 minutos, por 4 vezes com PBS e Tween 20, a 0,05%.
Em seguida as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS e Tween 20, a 0,05%
durante 5 min cada, para retirada do excesso do anticorpo primário, e incubadas com
anticorpo secundário conjugado à biotina (Biotinylated Link Universal and
Streptavidin-HRP - Dako, Carpinteria, CA-USA) durante 30 minutos. Posteriormente,
foi retirado o excesso do anticorpo secundário com lavagem em PBS e colocado um
complexo de streptoavidina-biotina que foi incubado por mais 30 minutos em
temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas com tampão PBS e Tween 20, a
0,05%, em seguida, secas e acrescentada a solução reveladora, contendo 1 ml de tampão
Tris-HCl (pH 7,2), 1 comprimido de diaminobenzidina (DAB)(Sigma, St Louis, MOUSA) e 25µl de água oxigenada. A reação foi interrompida lavando-se em água
corrente.
Anticorpo
Diluição
Fabricante
Código
Anticorpo monoclonal anti-IL-10 humano
1:20
R&D*
AF217NA
Anticorpo monoclonal anti-IL-4 humano
1:20
R&D*
MAB304
Anticorpo monoclonal anti-TGF-β humano
1:20
R&D*
MAB240
Anticorpo policlonal anti-IL-17 humano
1:20
R&D*
AF317NA
Anticorpo policlonal anti-FOXP3 humano
1:50
R&D*
AF3240
Anticorpo policlonal anti-Galectin–1 humano
1:50
R&D*
AF1152
Anticorpo policlonal anti-Galectin-3 humano
1:75
R&D*
AF1154
Anticorpo policlonal anti-Galectin–9 humano
1:75
R&D*
AF2045
Anticorpo policlonal anti -TLR-4 humano
1:50
R&D*
AF1478
Anticorpo policlonal Anti-TLR-2 humano
1:200
Sigma Aldrich
PRS3135
Anticorpo policlonal Anti-triptase humano
1:1000
DB+
P581
Anticorpo policlonal Anti-quimase humano
1:250
DB+
R013
R&D* = Minneapolis, MN-USA; DB+ = Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA-USA
Tabela 1- Especificação das diluições e produtos utilizados em cada anticorpo primário
56
Posteriormente, foi realizada a coloração de fundo com hematoxilina e a
montagem das lâminas com Entelan®, e em seguida, a análise morfométrica das células
positivas foi realizada.
*O controle negativo da reação foi feito omitindo-se o anticorpo primário.
*A análise das lâminas foi feita sob microscopia de luz comum.
4.7 Estudo Morfométrico
Para a determinação da densidade de mastócitos utilizando a coloração de Azul
de Toluidina, a avaliação morfométrica foi realizada a partir das imagens dos cortes
histológicos capturados por sistema digital e analisados por meio do software “Image J”
(National Institutes os Health, USA). Dessa forma, cada campo a ser quantificado foi
capturado por meio de um microscópio Zeiss Axioskop 2 (Carl Zeiss, Gottingen,
Germany) equipado com uma câmera digital Axiocam e software AxioVision (Carl
Zeiss, Gottingen, Germany) para digitalização da imagem. Em seguida, utilizando o
software Image J, foi feita inicialmente a captura de uma imagem de uma régua
milimetrada para calibração da medição da área do corte. Após a calibração os
fragmentos foram contornados para obtenção da área de cada corte, sendo esta, expressa
em mm2. Posteriormente os mastócitos foram quantificados em aumento final de 400X
em toda extensão do corte.
Com a área do corte e o número de mastócitos foi calculada a densidade de
mastócitos (número de mastócitos por mm2), onde o número total de mastócitos corados
pelo Azul de Toluidina foi dividido pela área da objetiva do microscópio (0.936 mm2),
multiplicada pelo número de campos contados. A densidade foi então, expressa pelo
número de células por mm2.
A quantificação da fibrose foi realizada na lâmina corada pelo picrosírius
examinada sob luz polarizada, em aumento de 400x. Para esta quantificação, todos os
campos de cada corte foram digitalizados. A morfometria foi feita com o sistema
analisador de imagens semi-automático “Image J” (National Institutes of Health, USA).
Dessa forma, a imagem do campo a ser quantificado foi digitalizada utilizando um
microscópio Zeiss Axioskop 2 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) equipado com uma
câmera digital Axiocam e software AxioVision (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) para
digitalização da imagem. Por esse método, o colágeno mostra-se birrefringente. O
57
colágeno tipo I, presente no tecido cicatricial, produto final quando o tecido se cicatriza
por reparação, apresenta fibras grossas, com coloração variando do amarelo-alaranjado
ao vermelho. E o colágeno tipo III produzido por fibroblastos jovens antes do colágeno
tipo I, apresenta-se formado por fibras finas, pouco compactadas, corando do amareloesverdeado ao verde (MONTES; JUNQUEIRA, 1991, ALMEIDA et al., 1998). A área
de colágeno foi marcada para obter-se o percentual de colágeno por área do campo
analisado.
A avaliação morfométrica para as lâminas de imunohistoquímica, o número de
células marcadas com positividade foi realizada de forma semi-quantitativa, conforme
descrito por Fregnani e colaboradores em 2009; Kellermann e colaboradores em 2008 e
por Henriques e colaboradores em 2011. Esta ocorreu a partir das imagens dos cortes
histológicos capturadas por um microscópio Zeiss Axioskop 2 (Carl Zeiss, Gottingen,
Germany) equipado com uma câmera digital Axiocam e software AxioVision (Carl
Zeiss, Gottingen, Germany) com aumento de 400X. Analisou-se a presença de células
imunomarcadas no tecido conjuntivo de cada corte capturado. Esta foi classificada
como negativa (0), escassa ou < 50% de células imunomarcadas e abundante ou > 50%
de células imunomarcadas. Na análise dos granulomas organizados e não organizados
foi adotada a mesma metodologia descrita no parágrafo anterior, mas foi usado o
aumento de 200X, a fim de melhor visualização e captura da área envolvida com o
granuloma.
4.8 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio do programa Statview (Abacus
Concepts, Berkeley, CA-USA). Variáveis quantitativas foram analisadas quanto à
normalidade e variância dos dados, utilizando os testes de Mann-Whitney e Exato de
Fisher. Variáveis semi-quantitativas foram analisadas pelo teste χ2. Os resultados foram
considerados estatisticamente significativos quando a probabilidade foi menor de 5%
(p<0,05).
58
5 RESULTADOS
O número de mastócitos foi significativamente menor nos pacientes com PCM
quando comparados com o grupo controle (Mann Whitney, p = 0,0005) (Figuras 2A e
1G). A densidade de mastócitos positivos para quimase e triptase foi significativamente
menor nos pacientes com PCM quando comparadas com o grupo controle (Mann
Whitney, p = 0,0097; p = 0,0003 respectivamente) (Figuras 2B e 2C, 1C a 1F). Em
relação à fibrose, foi significativamente maior nos pacientes com PCM quando
comparados com o grupo controle (Mann Whitney, p = 0,04) (Figuras 2D, 1A e 1B).
A expressão in situ da IL-10 e IL-4 foi significativamente maior nas biópsias dos
pacientes com PCM oral na forma crônica, quando comparadas com o grupo controle
(p=0,0001; p=0,0001 respectivamente), sendo que, a imunomarcação variou de escassa
a intensa (Tabela 2). A expressão da IL-10 ocorreu de forma intensa no citoplasma de
células mononucleares e no citoplasma de células gigantes multinucleadas de
granulomas organizados que estavam próximas ao P. brasiliensis (Figura 3 A). E a
imunomarcação da IL-4, a ocorreu tanto no citoplasma e no núcleo das células do
infiltrado inflamatório (Figura 3 B).
A densidade de células positivas para a IL-17 e FoxP3 foi significativamente
maior nas biópsias dos pacientes com PCM oral na forma crônica, quando comparadas
com o grupo controle (p=0,04; p= 0,033 respectivamente) (Tabela 2). A imunomarcação
da IL-17 foi identificada em meio ao infiltrado inflamatório, ao redor dos granulomas e
próximo ao P. brasiliensis (Figura 3 C). Enquanto que a imunomarcação para FoxP3
apresentou-se intensa em células gigantes multinucleadas e linfócitos presentes em
meio ao infiltrado inflamatório (Figura 3 D).
Embora a expressão do TGF-β foi nas amostras testadas, não houve diferença
significativa (p= 0,82) (Tabela 2) (Figura 3 E).
No presente trabalho, a análise da expressão do TLR-2 foi significativamente
maior nas biópsias dos pacientes com PCM quando comparadas com o grupo controle
(p<0,0001) (Tabela 2) e a expressão do TLR4 exibiu uma imunomarcação menos
intensa, porém sem diferença significante (Figuras 4 A e B).
59
60
61
Tabela 2 - Expressão in situ de IL-10, IL-4, IL-17, TGF-β, FoxP3, TLR-2, TLR-4,
Gal-1, Gal-3, Gal-9, MMP-3 e MMP-9 na PCM crônica oral
62
A expressão das Gal-1 não apresentou diferença significativa quando
comparados entre os grupos estudados, visto que as marcações estavam homogêneas
nas biopsias dos pacientes com PCM e nos pacientes do grupo controle (Tabela 2). A
Gal-3 foi significativamente maior nas biópsias dos pacientes com PCM quando
comparadas com o grupo controle (p<0,0001)(Tabela 2). Sua marcação foi intensa no
citoplasma das células multinucleadas e em meio ao infiltrado inflamatório,
principalmente em macrófagos e linfócitos (Figura 4 C). Já a Gal-9 não apresentou
diferença significativa entre os grupos estudados (p=0,35) (Tabela 2).
A expressão para MMP3 e MMP-9 foi significativamente maior nas biópsias dos
pacientes com PCM quando comparadas com o grupo controle (p= 0,020 e p = 0,013
respetivamente) (Tabela 2). A imunomarcação da MMP3 foi intensa no citoplasma de
células gigantes multinucleadas e de células presentes no infiltrado inflamatório.
Enquanto que na MMP9, a marcação ocorreu nas mesmas células de forma intensa, mas
esta se localizava tanto no citoplasma quanto no núcleo das células (Figuras 4 D e E).
Ao comparar as imunomarcações com o tipo granuloma, organizado e não
organizado, verificou-se que a IL-4 foi significativamente maior nos granulomas não
organizados (p=0,003) (Tabela 2) e essa marcação era intensa nas células gigantes e nas
células do infiltrado inflamatório (Figuras 5 A e B).
Nos granulomas organizados a células positivas para IL-10 apresentaram intensa
imunomarcação no citoplasma das células multinucleadas, epitelióides e do infiltrado
inflamatório associado ao granuloma, fato que não ocorreu nos granulomas não
organizados (Figuras 5 C e D). Entretanto não houve diferença significativa entre os
dois grupos (Tabela 2).
A marcação da IL-17 nos granulomas organizados era escassa e se distribuía em
meio a infiltrado PMN em torno do granuloma. Em granulomas não organizados a
imunomarcação se apresentou em forma de arranjos celulares focais (Figuras 6 A e B).
Nos granulomas organizados as células positivas para IL-10 apresentaram
intensa imunomarcação no citoplasma das células multinucleadas, epitelióides e do
infiltrado inflamatório associado ao granuloma, fato que não ocorreu nos granulomas
não organizados (Figuras 5 C e D). Entretanto não houve diferença significativa entre os
dois grupos (Tabela 2).
63
64
65
66
As células imunomarcadas para FoxP3 nos tipos de granulomas estudados,
apresentaram padrão idêntico de marcação, onde esta ocorreu de forma intensa no
citoplasma e núcleo de células multinucleadas, epitelióides e em meio ao infiltrado
inflamatório (Figuras 6 C e D). Já o TGF- β, a imunomarcação ocorreu apenas nas
células dos granulomas organizados com moderada marcação no citoplasma (Figura 6
E).
A imunomarcação para o TLR-2 foi intensa nas células gigantes e no infiltrado
inflamatório associado tanto ao granulomas organizados como não organizados. O
TLR-4 marcou de forma intensa no citoplasma das células apenas dos granulomas
organizados (Figuras 7 A, B, C, D). Não houve diferença significativa entre os grupos
analisados (p=0,362; p=0,503) (Tabela 2).
Para a Gal-1, Gal- 3, Gal-9, MMP3 e MMP-9 não houve diferença significativa
quando comparadas nos granulomas organizados e não organizados, pois essas
moléculas apresentaram intensa marcação em 100% dos casos estudados (Tabela 2).
(Figuras 8 A, B, C, D, E).
67
68
69
70
6 DISCUSSÃO
Os indivíduos mais afetados pela PCM são os do gênero masculino, podendo
este fato ser justificado pela influência do estrógeno que atua inibindo a transformação
do micélio em levedura. Outro fator que pode explicar a prevalência seria a condição
sócio econômica, já que, as mulheres estão mais ligadas aos afazeres domésticos
enquanto o homem está mais predisposto a entrar em contato com o solo, local onde o
fungo se encontra (NEVILLE et al., 2009; GIRARD et al., 2012; AZENHA et al.,
2012). De fato coincidente, na amostra deste estudo, todos os pacientes afetados pela
micose eram do sexo masculino.
Devido ao fato das manifestações bucais na PCM crônica serem a primeira
queixa principal na doença, o reconhecimento dos sinais e sintomas apresentados por
estes pacientes são de grande importância para a Odontologia. As lesões afetam
principalmente, os lábios, bochechas, soalho da boca, língua e faringe, podendo invadir
várias áreas simultaneamente, como lesões inflamatórias granulomatosas crônicas e
progressivas. Nos pacientes com PCM crônica estudados neste trabalho houve
coincidência quanto aos locais onde as lesões se manifestaram, e os locais citados como
mais prevalentes (SPOSTO et al., 1993; NEVILLE et al., 2009; TOLENTINO et al.,
2010; BRAZÃO-SILVA et al., 2010; AZENHA et al., 2012; ABREU E SILVA et al.,
2013).
Os achados histopatológicos encontrados neste trabalho, quando do exame
microscópico dos casos de PCM crônica, demonstram a presença de típicas lesões
granulomatosas. Este tipo de quadro histopatológico é descrito como a principal
característica microscópica em lesões orais de PCM crônica. Tais lesões são
classicamente formadas por arranjo nodular de numerosas células epitelióides e células
gigantes multinucleadas do tipo Langhans e do tipo corpo estranho. Onde um
exuberante exsudato inflamatório rico em linfócitos, plasmócitos e eosinófilos,
acompanhado de necrose e fibrose de intensidade variável podem ser observados
(ALCÂNTARA, 2002). Estas lesões são classificadas como granulomas organizados e
não organizados, além de exibirem áreas com a formação de microabscessos. No
presente
estudo,
esta
classificação
foi
utilizada
em
(KAMINAGAKURA et al., 2007; ABREU E SILVA et al., 2013).
sua
metodologia
71
Estudos a respeito do perfil da resposta imune nas lesões de PCM tem
demonstrado importante envolvimento das diferentes respostas efetoras (Th1, Th2 e
Th17), regulatórias (Treg), como também, a interação entre os TLRs, Gals, proteases
citoplasmáticas de mastócitos e MMPs na resposta final a esta doença. Todas estas
diferentes formas de resposta imune determinam a resistência e os mecanismos
relacionados à imunopatologia desta micose. No presente estudo, constatou-se que
estudos referentes às diferentes respostas efetoras, regulatórias e interação entre os
TLRs, Gals, proteases citoplasmáticas de mastócitos e MMPs em lesões orais da PCM,
são escassos ou inexistentes na literatura.
A compreensão dos vários mecanismos efetores e regulatórios do sistema imune
contra o P. brasiliensis nas lesões orais da PCM é sem dúvida de grande importância. O
conhecimento destes mecanismos possibilitaria um maior entendimento a respeito da
relação parasita-hospedeiro. O reconhecimento das diferentes formas de resposta
apresentadas pelo sistema imune frente à PCM na cavidade oral é fundamental para o
entendimento de como as lesões se desenvolvem, suas manifestações clínicas, e na
realização de condutas seguras e eficazes no diagnóstico e tratamento desta micose na
Odontologia.
A depressão da resposta imune celular em pacientes com a PCM ativa se
caracteriza pela diminuição da síntese de citocinas de padrão Th1 como IL-2, IFN-γ e
IL-12, e aumento dos níveis de IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β que corresponde a resposta de
padrão Th2, não sendo esta capaz de ser protetora ao hospedeiro (CALICH; KASHINO
et al., 1998; BENARD et al., 2001). No presente estudo, as células do substrato
inflamatório desta micose exibiram maior imunomarcação para as citocinas IL-4 e IL10, caracterizando uma resposta de padrão Th2. Este fato justificaria o motivo no qual
os pacientes estudados terem se submetido a uma biópsia, resultando no material
emblocado em parafina utilizado em nosso trabalho. Possivelmente devido a
incapacidade da resposta imune ser protetora, foram formadas as lesões clinicamente
detectáveis de nossa amostra.
A presença de mastócitos em mucosa oral normal é esperada. Dentre suas
principais funções imunológicas podemos destacar a regulação da resposta imune inata
e adaptativa, desenvolvimento de uma imunidade protetora contra vírus, micróbios,
parasitas patogênicos, cicatrização de feridas e angiogênese (RODEWALD;
FEYERABEND; 2012). Em lesões granulomatosas estas células podem influenciar de
72
forma negativa a resposta imune e a ação direta da histamina nos linfócitos T, inibindo a
produção de IFN-γ, suprimindo desta forma a atividade das células T frente aos
patógenos (BATISTA; SOARES; LARA, 2005; MICHAILIDOU; MARKOPOULOS;
ANTONIADES, 2008).
Na mucosa oral dos pacientes com PCM o número de mastócitos
quimase/triptase positivo foi significativamente menor quando comparadas com o grupo
controle. A diminuição de mastócitos na PCM, como a encontrada neste trabalho pode
ser explicada pela presença de mediadores inflamatórios relacionados à formação do
granuloma dentre eles, o TNF-α e a linfotoxina, citocinas sabidamente envolvidas no
processo inflamatório durante a formação do granuloma. É possível que após a
formação do granuloma, o mastócito se desloque desse local ou o padrão de resposta
imune que se estabelece na lesão, contrapõe as citocinas de padrão Th2 as quais
representam os principais ativadores de processos inflamatórios em que o mastócito está
envolvido (KAMINAGAKURA et al., 2007; PAGLIARI et al., 2006c).
No presente estudo, a PCM crônica oral mostrou poucas células triptasepositivas envolvidas no infiltrado inflamatório em granulomas desorganizados. Isso
sugere que, a baixa modulação de quimase e triptase e o aumento da fibrose na PCM,
conforme nossos resultados demonstraram, podem ser uma consequência do processo
inflamatório, induzido pela presença do fungo e também podem estar potencialmente
envolvidas na regulação da resposta imune, já que pouco se sabe sobre a interação
dessas células, das citocinas e elementos inflamatórios por eles secretados em lesões
orais desta micose, ou se a ação direta da histamina nos linfócitos T pode inibir a
produção de IFN-γ, suprimindo desta forma a atividade das células T frente aos
antígenos (BATISTA; SOARES; LARA, 2005; MICHAILIDOU; MARKOPOULOS;
ANTONIADES, 2008).
Na PCM, seu estabelecimento, disseminação e gravidade dependem de fatores
inerentes ao P. brasiliensis e a fatores ligados ao hospedeiro. Onde a interação dos
componentes da parede do fungo com os receptores do sistema imune do hospedeiro,
induz a produção de diferentes respostas efetoras e regulatórias (FORTES et al., 2011;
MENDES-GIANNINI et al., 2008; BENARD, 2008). Estas atuam estimulando os
mecanismos celulares de defesa contra o fungo, levando a sua eliminação e regulando a
intensidade da resposta granulomatosa, impedindo a lesão tecidual (KUROKAWA et
al., 2007; CALVI et al., 2003; SOARES et al., 2001). Por outro lado, o envolvimento do
73
sistema imune durante o confronto contra o fungo pode promover crescimento fúngico
nos tecidos do hospedeiro levando à progressão da doença (PAGLIARI; SOTTO, 2003;
FERREIRA et al., 2010)
Caso o P. brasiliensis induza, de forma precoce a síntese de citocinas que
possuem atividade supressora ou anti-inflamatória como IL-4, IL-10 e TGF-β, será
desenvolvida uma supressão da resposta macrofágica, propiciando a reprodução e
instalação deste nos tecidos, promovendo sua disseminação para vários órgãos e
sistemas (BENARD, 2008). A IL-4, IL-10 e o TGF-β podem modular e controlar a
resposta inflamatória sistêmica em pacientes com PCM crônica que apresentam
atividade da doença, propiciando o crescimento dos fungos nos tecidos e ocasionando a
progressão da doença (CALVI et al., 2003; SOARES et al., 2001; ROMANO et al.,
2002; COSTA et al.; 2013). Desta forma, pode-se sugerir que o aumento na expressão
de IL-4 e IL-10 em lesões orais de PCM crônica, pode estar contribuindo com a
dispersão dos macrófagos na formação do granuloma, deixando o paciente mais
susceptível à infecção.
No presente estudo a imunomarcação da IL-4 foi significativamente maior nas
biópsias dos pacientes que apresentavam granuloma não organizado que os pacientes
com granuloma organizado. Esses resultados sugerem que o ambiente de citocinas
produzidas durante a interação do fungo com as células fagocitárias, podem estar
exercendo grande influência no que diz respeito à implantação do P. brasiliensis nos
tecidos do hospedeiro.
O TGF-β e a IL-10 parecem mediar, por meio do contato célula–célula, a
ativação de células T reguladoras (CD4+ CD25+), contribuindo para a imunossupressão
durante a PCM infecção (FERREIRA; OLIVEIRA; MARIA, 2010). A IL-10 e o TGF-β
foram encontrados em linfonodos de pacientes com PCM na fase aguda da doença, e
possivelmente, estão relacionados ao mecanismo utilizado pelo fungo para escapar da
resposta imune do hospedeiro, sugerindo que essas citocinas podem estar contribuindo
para a evolução da forma disseminada da PCM (CALICH; KASHINO, 1998; BENARD
et al., 2001; KUROKAWA et al., 2007). Nas formas mucocutâneas da PCM, a presença
de TGF-β nas áreas de fibrose, sugere que esta citocina esteja envolvida no processo de
cicatrização através da estimulação da proliferação de fibroblastos, como também,
exerce funções reparadora e reguladora das lesões, modulando a resposta inflamatória,
74
reduzindo a destruição tecidual e contribuindo para o reparo e menor intensidade da
sequela tecidual (KUROKAWA et al., 2007; ANNUZIATO et al.; 2008; MAITRA et
al.; 2009; SILVA et al., 2013).
No presente trabalho a expressão in situ da IL-4 e IL-10 nos pacientes com PCM
crônica oral, foram significativamente maior quando comparados com o grupo controle,
fato este que não ocorreu como o TGF-β. A expressão de citocinas anti-inflamatórias
como a IL-4 e a IL-10 em granulomas desorganizados foi relacionada a mecanismos de
escape utilizados pelo fungo (PAGLIARI; SOTTO, 2003, PAGLIARI et al., 2006c
MOREIRA; DIAS-MELICIO; SOARES, 2010; PAGLIARI et al., 2011a).
A IL-17 é importante para a resposta imunológica contra o P brasileiensis,
induzindo uma resposta inflamatória local e ativando células do sistema imunológico
inato, a IL-17 por outro lado, pode apresentar um papel deletério, gerando uma resposta
inflamatória intensa que estaria envolvida na destruição tecidual, principalmente na
forma crônica da doença (PAIÃO, 2012). Poucos estudos foram encontrados na
literatura sobre IL-17 na PCM humana. Pagliari e colaboradores em 2011(PAGLIARI et
al., 2011) avaliaram por meio de ensaio imunohistoquímico a expressão da IL-17 e do
FoxP3 em lesões orais e cutâneas da PCM humana. Os resultados deste trabalho
demonstram haver expressiva presença de células Treg em lesões orais e cutâneas da
PCM, podendo representar um mecanismo imunoregulatório local na patogênese da
PCM.
Nossos resultados estão de acordo com este achado na literatura, onde a
expressão de FoxP3 foi significativamente maior nas biópsias dos pacientes com PCM
oral comparadas com o grupo controle. O Foxp3 foi identificado como um marcador
molecular para células Treg e sua expressão é essencial para o desenvolvimento e a
função dessa célula. Aparentemente, o Foxp3 age estabelecendo e mantendo o programa
genético da Treg e funciona como um regulador negativo da ativação de células T e
talvez como regulador transcricional de citocinas anti-inflamatórias (CALICH et al.,
2008).
A IL-17 no estudo de Pagliari e colaboradores em 2011 (PAGLIARI et al.,
2011), não teve diferença significativa quando comparado os pacientes com lesões orais
comparadas com as lesões cutâneas. Em doenças infecciosas, o papel da resposta Th17
encontra-se ainda pouco esclarecido. Nas parasitoses, pouco se sabe do papel
desempenhado pela população Th17.
75
Estudos envolvendo pacientes com outras doenças inflamatórias crônicas de pele
e mucosas (ANNUZIATO et al., 2008) suportam a ideia de que, a geração de uma
intensa resposta Th17, estaria associada ao dano tecidual apresentado pelas lesões ativas
cutâneas e mucosas, e não diretamente como um perfil de resistência ou suscetibilidade
à infecção (PAGLIARI et al., 2011). Similarmente, acreditamos que na PCM crônica
oral, esse processo possa estar ocorrendo, onde a expressão da IL-17 encontrada nos
pacientes com PCM possa estar colaborando mais para lesão tecidual que propriamente
na definição de um perfil de resposta imune protetor ou de susceptibilidade.
A IL-17 no presente estudo foi significativamente maior nas biópsias dos
pacientes com PCM oral quando comparadas com o grupo controle, no entanto, essa
imunomarcação não teve diferença significativa quando analisadas nos tipos de
granulomas estudados. Estes resultados sustentam a ideia que a resposta Th17 pode
conter o P. brasiliensis, já esta predomina nas formas mais brandas e localizadas,
exercendo um papel semelhante àquele observado em outras infecções fúngicas,
induzindo uma resposta inflamatória local e ativando células do sistema imunológico
inato (CONTI et al., 2009; GAFFEN, 2008).
Em modelos experimentais, as infecções causadas por fungos mostram o
envolvimento dos TLRs nos mecanismos regulatórios e efetores da resposta
imunológica inata e adaptativa (PAGLIARRI et al., 2011a; CALICH et al;, 2008b). Na
PCM o TLR-2 e TLR-4 aparentemente parecem estar envolvidos tanto na porta de
entrada do fungo dentro dos macrófagos como também podem estar colaborando nos
mecanismos fungicidas através da produção de NO por estas células. Estudos in vivo de
diferentes linhagens de camundongos infectados por via intraperitoneal pelo P.
brasiliensis, demonstraram que camundongos deficientes em TLR-4 são mais
resistentes que os animais controles e que esta resistência está associada a baixos níveis
de NO e de citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e GM-CSF) embora nesse estudo os
autores observaram um aumento na produção de IFN-γ, e uma diminuição de células
Treg nos animais deficientes em TLR-2, mas não nos animais deficientes em TLR-4
(CALICH et al., 2008).
No presente estudo a análise da expressão dos TLRs, o TLR-2 foi
significativamente maior nas biópsias dos pacientes com PCM crônica oral quando
comparadas com o grupo controle. Enquanto o TLR-4 não apresentou diferença
significativa quando comparados entre os grupos estudados. Tais resultados suportam a
76
necessidade de novos estudos sobre participação dos TLRs no processo inflamatório de
lesões orais de PCM crônica humana, já que estes receptores vem sendo estudados
apenas em modelos experimentais.
A expressão de Gal-3 neste trabalho foi significativamente maior nas biópsias
dos pacientes com PCM crônica oral quando comparados com o grupo controle. Na
PCM a Gal-3 parece ter um papel protetor e imunorregulador na resposta à infecção
pelo P. brasiliensis e a proteção contra o P. brasiliensis, parece depender de adequada
reposta inflamatória e da produção de citocinas, sendo que a Gal-3 parece ser
importante na regulação do balanço Th1/Th2 nesta micose (RUAS et al., 2007). Nota-se
até o momento que o papel das Gal-1, 3 e 9 na modulação do processo inflamatório de
lesões de PCM, vêm sendo estudado, mas em lesões orais desta micose, a expressão
destas moléculas ainda merece mais atenção, necessitando mais estudos para se
conhecer o papel destas moléculas na organização do granuloma e na defesa contra o
fungo.
Existe uma carência de estudos na literatura sobre a participação das MMPs na
PCM. A MMP-2 e MMP-9 já foram estudadas na PCM experimental, carecendo de
estudos a MMP-3. A expressão de MMP-9 foi demonstrada em granulomas,
principalmente em células gigantes multinucleadas, macrófagos e linfócitos (HSU et al.,
2005; GONZALEZ et al. 2002). No entanto, a habilidade destas células em produzir a
MMP-9 dentro de diferentes padrões imunológicos e inflamatórios já está estabelecido,
existindo a probabilidade de macrófagos e linfócitos serem fontes de MMPs. Além
disso, como alternativa o P brasiliensis pode apresentar receptores capazes de
reconhecer e se unir à MMP-9 secretada pelo hospedeiro. Tal possibilidade sugere que a
MMP-9 na PCM pode contribuir para a disseminação do fungo dentro do tecido
infectado, além de influenciar na organização do padrão de granuloma a ser formado na
doença (NISHIKAKU et al., 2009). Nossos resultados estão de acordo com estes
achados na literatura, já que a expressão de MMP9 encontrada em nosso estudo
demonstrou intensa imunomarcação desta MMP em células gigantes multinucleadas,
macrófagos e linfócitos nas lesões orais de PCM quando comparadas ao grupo controle.
77
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na PCM a presença de distúrbios imunorregulatorios levam a incapacidade de
uma resposta efetiva Th1, podendo ocorrer o desvio para outros padrões de respostas
imunológicas, como a Th2, resultando em uma ineficiente ação imunológica capaz de
conter a propagação do fungo no hospedeiro. Este fato produz a depressão da resposta
imune celular e a uma diminuição ou maior síntese de citocinas, efetoras, reguladoras,
moléculas sinalizadoras, de células da resposta imune inata e de Metaloproteinases.
O presente trabalho demonstrou que, as proteínas avaliadas parecem ter um
papel importante na resposta imune, no desenvolvimento, progressão e manutenção das
lesões orais de PCM crônica.
Diante dos resultados encontrados neste estudo, podemos destacar:

Na atualidade são escassos na literatura, estudos referentes às diferentes
respostas efetoras, regulatórias e interação entre os TLRs, Gals, proteases
citoplasmáticas de mastócitos e MMPs em lesões orais da PCM.

Um melhor reconhecimento das diferentes formas de resposta
imunológica frente à PCM oral crônica permitirá o desenvolvimento de
estratégias seguras e eficazes no tratamento desta micose na
Odontologia.

A expressão diminuída de quimase e triptase nos mastócitos, e a
presença discreta destas células nos pacientes com PCM, como a
encontrada neste trabalho, pode ser justificada pela presença de
mediadores inflamatórios relacionados à formação do granuloma. Neste
caso, o mastócito influenciado por estes mediadores evade o local da
lesão ou o estabelecimento do padrão de resposta imune no local
contrapõe as citocinas de padrão Th2.

A diferença de expressão de IL-4 na PCM, nos diferentes tipos de
granuloma estudados, com maior imunomarcação nos granulomas não
organizados, parece refletir a influência das citocinas produzidas durante
a interação do P. brasiliensis com as células fagocitárias presentes no
tecido do hospedeiro.
78

No presente trabalho a maior expressão da IL-4 e IL-10 encontrada nos
pacientes com PCM crônica oral, e a fraca imunomarcação de TGF-β
pode ser justificada como uma estratégia ou mecanismo de escape
utilizados pelo fungo na infecção.

A expressão aumentada de IL-17 nos pacientes com PCM oral
encontradas neste estudo, sustentam a ideia que, a resposta Th17 poderia
conter o P. brasiliensis, exercendo um papel indutor de resposta
inflamatória local, ativando células do sistema imunológico.

A presença de uma maior expressão de FoxP3 nos pacientes com PCM
crônica oral, pode ser entendida como um mecanismo imunoregulatório
local na patogênese da PCM.

Neste trabalho, a expressão de TLR-2 foi significativamente maior na
PCM, enquanto a expressão de TLR-4 não apresentou diferença
significativa nos grupos estudados. Tais achados suportam a necessidade
de novos estudos sobre participação dos TLRs no processo inflamatório
de lesões orais de PCM crônica humana, já que até o momento foram
realizados apenas trabalhos experimentais sobre o envolvimento de TLRs
que teorizem os mecanismos regulatórios e efetores da resposta
imunológica inata e adaptativa contra fungos.

O aumento da expressão de Gal-3 nos pacientes com PCM crônica oral
estudados pode ser justificado como sendo um mecanismo utilizado na
regulação do balanço Th1/Th2 nesta micose. Onde o papel protetor e
imunorregulador desta galectina na resposta à infecção pelo P.
brasiliensis dependerá de uma adequada reposta inflamatória e da
produção de citocinas.

A habilidade das células do sistema imune em produzir a MMP-9 dentro
de diferentes padrões imunológicos e inflamatórios se baseia no fato de,
macrófagos e linfócitos serem fontes de MMPs. O P brasiliensis pode
apresentar receptores capazes de reconhecer e se unir à MMP-9 secretada
pelo hospedeiro, contribuindo para a disseminação do fungo dentro do
tecido infectado, além de influenciar na organização do padrão de
granuloma a ser formado na doença. Tais fatos podem justificar a
intensa imunomarcação de MMP9 encontrada em células gigantes
79
multinucleadas, macrófagos e linfócitos nas lesões orais de PCM crônica
deste estudo.
80
8 CONCLUSÃO
Os dados obtidos nesse trabalho nos permitem concluir que houve um aumento
de citocinas com potencial efetor (IL-4, IL-17) e regulador (IL-10) assim como, de
moléculas sinalizadoras relacionadas (FoxP3). O aumento de células expressando TLR2 reflete a participação de células da resposta imune inata, como também, a expressão
das metaloproteinases (MMP3 e MMP9). Desse modo, as proteínas avaliadas parecem
ter um papel importante no desenvolvimento e manutenção das lesões na PCM oral,
bem como nos processos de desenvolvimento e progressão das lesões causadas pelo
fungo e na resposta imune estabelecida nesta doença.
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ANEXO
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