O emprego de métodos
moleculares para a
identificação de espécies,
híbridos, sexo dos indivíduos e
análise de parentesco
Karina Lucas da Silva Brandão
[email protected]
Identificação molecular
• Espécies
• Indivíduos
• Sexo de organismos
• Identificação de organismos é pré-requisito para todo estudo
de ecologia, biologia, fisiologia, comportamento e para a
conservação de espécies.
- : uso inadequado da técnica
M : marginalmente apropriado ou apropriado sob circunstâncias limitadas
$ : uso apropriado da técnica, mas esta é cara. Indica que outras técnicas provavelmente
podem ser efetivas por muito menos esforço e/ou custo.
+ : método apropriado e efetivo
Hillis, Moritz e Mable. 1996. Molecular Systematics
- : uso inadequado da técnica
M : marginalmente apropriado ou apropriado sob circunstâncias limitadas
$ : uso apropriado da técnica, mas esta é cara. Indica que outras técnicas provavelmente
podem ser efetivas por muito menos esforço e/ou custo.
+ : método apropriado e efetivo
Hillis, Moritz e Mable. 1996. Molecular Systematics
- : uso inadequado da técnica
M : marginalmente apropriado ou apropriado sob circunstâncias limitadas
$ : uso apropriado da técnica, mas esta é cara. Indica que outras técnicas provavelmente
podem ser efetivas por muito menos esforço e/ou custo.
+ : método apropriado e efetivo
Hillis, Moritz e Mable. 1996. Molecular Systematics
Espécies
• A realidade das espécies é chave para a macroevolução
• O conceito de espécie é chave em ecologia, evolução e
biodiversidade
• Não há um conceito de espécie de aplicação e aceitação universal
• Mais de 20 conceitos de espécies
• O mais usado, Conceito Biológico de Espécies, pode não ser o mais
apropriado em determinadas circunstâncias
Conceito Biológico de Espécies
• Indivíduos da mesma espécie são capazes de acasalarem entre
si, deixando descendentes férteis
• Populações fragmentadas, cujos indivíduos nunca se encontram,
não conseguem acasalar entre si
• Duas “espécies” podem acasalar deixando “híbridos” férteis
Conceitos de Espécies
Biológico: Grupos de populações naturais potencialmente intercruzante que são
reprodutivamente isolados de outros grupos
Evolutivo: É uma linhagem de populações ou organismos que mantêm uma
identidade separada de outras linhagens e que tem sua própria tendência
evolutiva
Filogenético: É um “cluster” de organismos que é distinto de outros clusters; o
menor grupo monofilético
Genealógico: grupos exclusivos de organismos em que seus membros estão mais
proximamente relacionados um ao outro do que qualquer organismos fora do
grupo
Reconhecimento: A mais inclusiva população de organismos biparentais que
compartilham um sistema de fertilização comum
Coesão: A mais inclusiva população de organismos com o potencial de coesão
fenotípica
Alguns termos encontrados na literatura
• Espécies ‘crípticas’ (Sibling species): Espécies reprodutivamente isoladas
difíceis de distinguir por características morfológicas
• Espécies irmãs (Sister species): espécies que são filogeneticamente mais
proximamente relacionadas e derivam de um ancestral comum
• Subespécies: populações de uma espécie que são distinguíveis por uma
ou mais características. Em zoologia, subespécies tem distribuição
geográfica diferente e são equivalentes a raças geográficas
• Raça: um termo vago, algumas vezes equivalente a subespécies e outras
vezes a formas geneticamente polimórficas dentro de uma população
Alguns termos encontrados na literatura
• Ecótipo: Usado mais em botânica para designar um fenótipo variante de
uma espécie que está associada com um tipo particular de hábitat; pode
designar subespécies
• Espécie politípica: uma espécie variável geograficamente,
frequentemente dividida em subespécies
Fluxo gênico é reduzido por
vários fatores, mas
principalmente porque a
atividade sexual em cada
planta hospedeira tem uma
diferença de três semanas
Rhagoletis pomonella
Mudança de
hospedeiro
nos últimos
150 anos
Espinheiro (hawthorn)
Maçã (Malus)
Identidade genética média
Relação média entre divergência genética
e isolamento reprodutivo
Subespécies
Populações
geográficas
Semiespécies
Espécies
crípticas
Espécies
não-crípticas
Identificação molecular de espécies
Barcode
Extremidade 5´ da subunidade I do gene da citocromo oxidase – COI
(≈ 650 pb)
Dos espécimes às sequências
Coleta
Espécime
testemunho
Extração DNA
COI
Sequenciamento
Análise
Banco de dados
de barcode
Barcode- Mídia
Global Advances in the Ecology and Management of Golden Apple Snails
Democratizing Taxonomy Conservation in Practice
Scanning Species- John Harvard's Journal
Scanning Species-Science
DNA barcoding a useful tool for taxonomists
(response to DNA barcoding is no substitute for taxonomy)-Nature
Barcoding the Planet-Spotlight on Science
Will DNA Bar Codes Breathe Life into Classification?Science
Handheld DNA Scanners to ID Species Instantly?National Geographic
News
Body doubles: Cryptic species: as we discover more examples of species
that are morphologically indistinguishable, we need to ask why and how
they exist.
Nature
Scanner für alles Lebendige-Der Spiegel
A Species in a Second: Promise of DNA 'Bar Codes' The New York Times
The Power and Perils of ‘Molecular Taxonomy’: a Case Study of Eyeless
and Endangered Cicurina (Araneae: Dictynidae) from Texas Caves Molecular Ecology
DNA Bar Codes: Life under the Scanner-Science News
Compiling a Catalog of Life of Earth-Popular Science
DNA Barcoders Nab New Species –Science
"Barcode Me“-New Scientist
ScienceScope - Gift Lifts plan to Bar-Code Life -Science
Taxonomy, DNA, and the Bar Code of Life-BioScience
Counting Angels with DNA -Nature
Dados em segundos a minutos
Centavos por amostra
Link com bancos de referência
Um GPS taxonômico
Útil para não especialistas
COI Barcode
• Amplamente distribuído em todos os animais aeróbicos
• Iniciadores (Primers) universais
• Variabilidade interespecífica (entre espécies) maior do
que intra-específica (dentro da espécie): limite de
separação de espécies
COI Barcode
• Pode permitir não apenas o reconhecimento de espécies
conhecidas mas o descobrimento de novas espécies
(crípticas)
• Limite para definir espécies: a diferença entre espécies
deve ser pelo menos 10x maior do que a diferença
dentro da espécie
Hebert et al 2004. 10 species in one... Proc. Natl. Acad. Sci. USA 41: 14812
Astraptes fulgerator (Hesperiidae)
Foi citado 508 vezes no WofS
COI Barcode
• Muitas críticas!
• Não inclui organismos anaeróbicos
• Em plantas e algas o mtDNA não tem a mesma
variabilidade encontrada no mtDNA animal
• Região muito curta – não inclui toda a variabilidade dos
organismos
Arte/VEJA
Noemy Seraphim
Delimitando espécies: Contribuição de marcadores morfológicos e moleculares para a compreensão do
gênero Hermeuptychia Forster (Nymphalidae; Satyrinae; Euptychiina)
•
Todas as listas/estudos do Brasil ➛ Hermeuptychia hermes
•
Três registros diferentes publicados:
•
H. calixta (Brown e Mielke 1967 - DF)
•
H. cucullina (Anken 1995 - PR)
•
H. harmonia e H. fallax (Emery et al 2006 - GO)
Pontos de coleta
‘Barcoding’ 189 indivíduos de 45
localidades em quatro países
10 grupos
8 nomes
H. sosybius
H. sp2
H. maimoune
H. hermes
H. sp1
H. atalanta
H. pimpla
H. harmonia
H. fallax
H. gisella
Dados
concatenados
Barcode
N
2%
2%
N
distância genética
intraespecífica
distância genética
interespecífica
Investigações forenses
Investigações forenses
Benecke 1998. Forensic Science International 98: 157.
• RAPD (randomly amplified polymorphic DNAs) para identificar
larvas de Diptera em corpos humanos
• Determinar a espécie, pois cada espécie de mosca
invade corpos em fases diferentes pós-morte
• Mostrar se o corpo foi removido
• Dos 11 marcadores RAPD usados, um sozinho foi
suficiente para resolver o problema de identificação
PCR-RFLP (restriction fragment length
polymorphisms) do COI e da região controle
do mtDNA
Cochliomyia hominivorax
Cochliomyia macellaria
Litjens et al. (2001). Medical and Veterinary Entomology 15:183
Caça ilegal
• É um problema global que ocorre por várias
razões:
• Patas de ursos, bexiga e bile são usados na medicina
chinesa
• Elefantes são mortos por causa do seu marfim
Caça ilegal
• Marcadores moleculares podem ser usados para
identificar restos de caça
• Ligar uma caça ilegal ao caçador
Qual a espécie da carne moída apreendida?
Sequências do gene mtDNA citocromo b para
identificar espécie
Tapirus terrestris
Sanches et al. (2011) Conservation Genetetics Resource 3:189–193
Quantos indivíduos foram abatidos?
Marcadores microssatélites
Tapirus terrestris
-
Nove locos
-
Todos indicaram a presença de um único indivíduo
Sanches et al. (2011) Conservation Genetetics Resource 3:189–193
Híbridos
• Organismos híbridos são resultado de cruzamento de duas espécies
separadas
• Zonas de hibridização são formadas onde essas espécies se
encontram
• Permitem estudar os mecanismos evolutivos (efeitos de seleção,
especiação...)
• Muitas apresentam seleção contra os híbridos
• “Filtro seletivo”, que permite introgressão somente de alelos
seletivamente vantajosos entre espécies.
Zona de hibridização primária
Seleção natural altera a frequência de alelos
in situ em populações mais ou menos
contínuas. A variação clinal acompanha uma
variação ambiental (ou de pressão seletiva).
Zona de hibridização secundária
Duas populações anteriormente alopátricas
que se tornaram geneticamente
diferenciadas expandem sua distribuição e se
encontram (contato secundário)
Zona de hibridização na Europa
Bombina bombina
- Baixa altitude
- Poças rasas e permanentes
- Ovos menores
- Tempo de desenvolvimento da
larva menor
Bombina variegata
- Alta altitude
- Poças rasas e temporárias
- Ovos maiores
- Tempo de
desenvolvimento da larva
maior
Szymura & Barton (1986) Evolution 40: 1141-1159
Alozimas
Szymura & Barton (1986) Evolution 40: 1141-1159
12 locos microssatélites para acessar a origem do conjunto gênico de cada espécie
Mavárez et al (2006) Nature Letters 441: 868-971
Hibridização entre o lince canadense e o bobcat?
2 locos microssatélites
Lynx canadensis
Lynx rufus
Schawartz et al 2004. Conservation Genetics 5: 349–355, 2004
Sexo
• Determinar o sexo dos organismos pode ser importante em análises
de estrutura populacional, comportamento ou distribuição, e em
programas de reprodução em cativeiro
Caracterização das populações:
Sequenciamento do gene
determinante da testis SRY (147
pb) obtido de tecido coletado com
Hyperoodon ampullatus
o uso de arpão
Sexo
Marcadores moleculares para determinação de sexo não são universais e precisam
ser desenvolvidos independentemente para diferentes classes de organismos
Em aves ratitas:
ZZ
ZW
CHD1W
CHD1Z
Análise de parentesco
Métodos de análise de parentesco
• Exclusão: usa a incompatibilidade entre pais e prole para rejeitar
uma hipótese de parentesco
• Testes de atribuição por verossimilhança: determina o pai mais
provável dentro de um conjunto de possíveis pais
• Reconstrução parental: usa genótipos multilocos dos pais e da prole
para reconstruir os genótipos dos pais desconhecidos
• Análise de probabilidade de parentesco total: estima padrões de
parentesco usando modelagem
10 locos microssatélites
129 adultos, representando 5–9 famílias
anualmente, de 2004–2007, na Finlândia.
84.6% (22/26) dos filhotes e 93.8% (75/80) dos
ninhos eram cria dos seus pais sociais
Picoides tridactylus
Li et al. (2009) PLoS ONE 4: e7895
RAPD
Dominante
Obrigada!
http://www.bioinfoguy.net/EcologiaMolecular/