Cromossomo X
Mamíferos: fêmeas XX e machos XY
compensação de dose nas fêmeas
inativação de um dos cromossomos X durante
o desenvolvimento inicial.
Inativação do X
• Três “ondas” de inativação:
– Trofoectoderme
– Endoderme primitiva do blastocisto
Tecidos
extraembrionários
Inativação sujeita ao impriting, exclusiva do X paterno (Xp)
– Células do epiblasto originadas da massa de células
interna (ICM)
Inativação aleatória (Xp ou Xm)
Xist
•
•
•
•
Responsável pela inativação do X.
RNA não traduzido.
Cobre o cromossomo X in cis.
Causa o silenciamento de genes do
cromossomo X que cobriu.
• Cromossomo X ativo: Xist inativo.
• Cromossomo X inativo: Xist ativo.
Xist
• Em células do tecido embrionário:
– “encapamento” do cromossomo X pelo Xist é
rapidamente seguido de silenciamento gênico.
• Durante o desenvolvimento inicial:
– Expressão do Xist a partir do estágio de duas a
quatro células.
– Expressão apenas de origem paterna.
– Expressão do Xist materno: apenas no estágio
de mórula.
• Primeiros sinais citológicos detectáveis da
inativação do X: apenas no estágio de cinquenta
células.
• Logo após a fertilização: Xm e Xp ativos.
• Estudos com RT-PCR: alguns genes paternos já
possuem transcrição diminuída na embriogênese
inicial.
• Predisposição do X paterno à inativação: devido
à sua passagem pela linhagem geminativa
masculina (vesícula sexual).
Muitas questões não resolvidas a respeito da
iniciação e cinética da inativação do X
Xist e mudanças iniciais na
cromatina do Xp
Metodologia
• Exame do Xp “encapado” com Xist durante
a embriogênese pré-implantação.
• Embriões nos estágios de duas células até
blastocisto.
• Análise direta, sem cultura in vitro.
• Hibridização in situ com RNA fluorescente
(FISH).
• Imunofluorescência.
Detecção de Xist
• Acúmulo de Xist em todos os blastômeros
interfásicos a partir do estágio de quatro
células.
• Estágio de duas células: pequeno sinal de
Xist.
Estado inicial da cromatina no Xp
• Fisch
• Imunofluorescência
H3K9 e H3K27 e
interações com Eed e Enx1
características de
cromossomos X em
inativação
* H3K9 está associada com o Xp durante a
espermatogênese
Estado inicial da cromatina no Xp
• Estágio de quatro a oito células:
– Não há acumulação de H3 metilada em K9 ou
K27.
– Não há acumulação de Eed e Enx1.
• Estágio de 16 células:
– Detecção destes marcadores em alguns blastômeros.
Estado inicial da cromatina no Xp
• Acumulação dos marcadores no Xp tem intervalo
similar
• Enx => metiltransferase de histonas que metila a
K27
• H2A => acumula no mesmo intervalo de tempo
que esses marcadores.
Mudanças principais na cromatina do Xp
começam neste estágio (16 células)
Estado inicial da cromatina no Xp
• Proporção de blastômeros que contêm os
marcadores varia nos estágios de 16 a 32
células.
• Blastocisto: 90% dos blastômeros possuem
os marcadores.
* Metilação na H3K9 começa mais tarde (32
células) => marcador independente
Estado inicial da cromatina no Xp
• Outras análises:
– hipoacetilação da H3K9
– hipometilação da H3K4
eventos iniciais na inativação do
X em células de tecidos
embrionários
•4 células: nenhum sinal destas modificações
•8 células: detectados em alguns blastômeros
•32 células: mais de 90% dos blastômeros
ocorrem após o “empacotamento” pelo
Xist mas antes dos outros marcadores
Xist e atividade transcricional do Xp
Metodologia
• Análise do silenciamento do Xp em nível
transcricional em células únicas.
• Anticorpo (H5): reconhece a forma
elongadora da RNA PolII (presente em
cromatina transcricionalmente ativa).
• Em células ES em diferenciação: exclusão
da RNA PolII do cromossomo X logo após
o empacotamento pelo Xist.
Atividade transcricional do Xp
• Em embriões na pré-implantação:
• 2 células: não há exclusão da RNA polII.
•4 células:
primeiros sinais de
exclusão.
•32 células: quase 100% de
exclusão.
Atividade transcricional do Xp
• Confirmação do silenciamento transcricional de
Xp:
• RNA FISH para detectar transcritos do gene
Chic1/Brx do cromossomo X.
• 2 células: dois sinais de transcrição, um adjacente
ao Xist em alguns embriões.
• 8 células: um sinal dentro do domínio do Xist
em alguns blastômeros.
•16 células: sinal não é mais visto em mais de um
blastômero.
Atividade transcricional do Xp
• Início da inativação da transcrição do Xp:
– Estágio de quatro a oito células
• Inativação do Xp:
– No estágio de 32 células atinge a grande
maioria dos blastômeros
Inativação do X começa bem antes da
diferenciação celular
Blastômeros contêm o Xp inativo
• Exclusão de Pol II
• Modificação de histonas
• Associação de Eed/ Enx1
Blastômeros contêm o Xp inativo
• Presença de RNA Xist
• Presença de Eed e Enx1
Inativação de Xp no ICM
• Imunocirurgia: retirada do trofoectoderma
• Blastocistos no início:
–
–
–
–
–
–
Presença de RNA Xist
Exclusão de RNA Pol II
Hipoacetilação na H3K9
Hipometilação na H3K4
Metilação na H3K9 e K27
Acumulação de Eed e Enx1
Inativação de Xp no ICM
Blastocisto no início
• Acumulação de Eed e Enx1
Inativação de Xp no ICM
Blastocisto no início
• Metilação na K27
Inativação de Xp no ICM
• Blastocistos tardios:
– RNA xist estava disperso ou ausente
– Ausência de acumulação de Eed e Enx1
– Metilação na H3K27
• Blastocistos no início cultivados por 24hs
– Presença de RNA xist e as características da
mórula e trofoectoderma
• Blastocistos tardios cultivados por 24hs
– Perda de RNA xist, Eed e Enx
Inativação de Xp no ICM
Blastocisto tardio
• Ausência de acumulação de Eed e Enx1
Inativação de Xp no ICM
Blastocisto tardio
• Metilação na H3K27
Inativação de Xp no ICM
Blastocisto em cultura
• Presença de RNA Xist
Inativação de Xp no ICM
Conclusão
Conclusão
Conclusão
• Ciclo dinâmico da inativação de Xp
Xp inativado – reativação – inativação
randômica
Esse estudo propõe que RNA Xist é o único
imprint necessário para levar modificações
na cromatina que levam a inativação
preferencial do Xp.