01/04/2015
ELETROFORESE E CROMATOGRAFIA
Métodos Instrumentais
Farmacêuticos
Plano de Aula
-Princípios da separação de moléculas
-Eletroforese: princípios, classificação e mecanismos de separação
FENÔMENOS DE SUPERFÍCIE
-Cromatografia:
princípios,
classificação
e
mecanismos
de
separação
Eletroforese e Cromatografia
Profª Juliana Schmidt
Farmácia 2014
ELETROFORESE E CROMATOGRAFIA
Métodos analíticos instrumentais para separação de
substâncias presentes em uma mistura, baseados
Bibliografia
nas diferentes propriedades físico-químicas e nas
BACCAN, Nivaldo (Et. al.) Quimica analitica quantitativa elementar. 3. ed.
rev., ampl. e reestrut. Sao Paulo: E. Blucher, 2003-2005. 308 p. ISBN 85212-0011-0
forças de interação intermolecular presentes no
sistema
HARRIS, Daniel C. Análise química quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro:
LTC, 2005. 876 p. ISBN 8521614233.
HOLLER, F. James; SKOOG, Douglas A; CROUCH, Stanley R. Princípios
de análise instrumental. 6. ed. Porto Alegre: Bookman, 2009. 1055 p. ISBN
9788577804603 (enc.).
CROMATOGRAFIA E ELETROFORESE
Eletroforese
Eletroforese
Processo que consiste na separação dos componentes de um
sistema através da aplicação de um campo elétrico
Processo que consiste na separação dos componentes de
um sistema através da aplicação de um campo elétrico
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Eletroforese
Eletroforese
• Gel de agarose
Aplicação da amostra em suporte sólido:
•É um polissacarídeo; forma uma rede
que segura as moléculas durante a
migração.
Membranas de acetato de celulose
Gel de agarose
Gel de amido
Gel de poliacrilamida, entre outros.
• Diferentes concentrações de gel permitem
a criação de diferentes gradientes de
separação.
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Eletroforese
Eletroforese
Concentração do gel
• Gel de poliacrilamida
A concentração do gel
definirá o tamanho dos
poros a serem
atravessados pelas
moléculas em migração.
Geis muito concentrados
oferecerão maior
resistência à migração
das moléculas.
Acrilamida e Bisacrilamida.
A acrilamida é uma molécula
linear, a bisacrilamida é em
forma de "T".
Formam estrutura em rede
• Diferentes concentrações de gel permitem a criação de diferentes
gradientes de separação.
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Eletroforese
Eletroforese
Contato com tampão
onde ocorre geração de
diferença de potencial
(campo elétrico)
Gerado
por
fonte
ajustada por voltagem
(mVolts),
corrente
(ampéres) ou potencia
(Watts)
polo positivo e polo
negativo
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Eletroforese
Eletroforese
As moléculas são separadas umas das outras conforme o
tamanho, a carga elétrica e a forma.
As moléculas são separadas
umas das outras conforme o
tamanho, a carga elétrica e
a forma.
Moléculas grandes migram
lentamente, enquanto
moléculas pequenas
movem-se rapidamente.
Moléculas grandes migram lentamente, enquanto
moléculas pequenas movem-se rapidamente.
Eletroforese
Eletroforese horizontal e vertical
Os principais tipos de eletroforese são:
Eletroforese capilar
Eletroforese em gel
Eletroforese 2D
Eletroforese 2D
As moléculas são separadas
As moléculas são separadas
inicialmente por um
processo de focalização
isoelétrica e depois por
uma eletroforese
inicialmente por um
processo de focalização
isoelétrica e depois por
uma eletroforese
convencional
convencional
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Eletroforese Capilar
Eletroforese Capilar
•Neste sistema capilares são colocados em um suporte e,
sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo
submetido à varredura do feixe de laser.
•Os fragmentos de DNA, marcados emitem fluorescência,
que é filtrada e detectada por um fotomultiplicador
Eletroforese
ELETROFORESE DE DNA
Permite:
Identificação
Quantificação
Purificação
ELETROFORESE DE DNA
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
- aminoácidos como eletrólitos
Proteínas séricas:
- Albumina
- Globulinas (α1, α2, β, δ)
http://www.youtube.com/watch?v=9f2VSyVhsGI&feature=fvwrel
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ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
Hemoglobina
Hemoglobina S
- Hemoglobinopatia estrutural
* substituição do ácido glutâmico pela valina
- Hemoglobina anormais
- Carga elétrica
- Ponto isoelétrico
- Indivíduos homozigotos (SS)
- Anemia hemolítica congênita
( anemia falciforme)
- Hemoglobina S
- Hemoglobina C
- Indivíduos heterozigotos (AS)
- Traço falcêmico
- Geralmente assintomáticos
- Talassemia Beta
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CROMATOGRAFIA
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
Histórico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico
russo Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas
recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados.
éter de
petróleo
mistura de
pigmentos
CaCO3
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CROMATOGRAFIA
pigmentos
separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
CROMATOGRAFIA
Princípio Básico
Analogia
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de
abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.
Fase estacionária
Analitos
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.
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Princípios Básicos da Cromatografia
CROMATOGRAFIA
Analogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária
pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de
eluição de componentes da mistura.
A separação depende da interação dos componentes da
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas
duas fases é influenciada por diferentes forças
intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e
específicos efeitos de afinidade e solubilidade.
A identificação se dá mediante a comparação da
interação de padrões com as fases estacionárias.
A quantificação é feita também pela comparação com
padrões de concentrações conhecidas, através de curvas
analíticas.
Fase estacionária
Analitos
Classificação das técnicas Cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográfico
• Em Coluna
• Cromatografia Líquida (CL)
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Planar
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
• Cromatografia em Papel (CP)
Classificação das técnicas Cromatográficas
• De acordo com a Fase Móvel (FM)
• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
• Utilização de Líquido
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
• Utilização de Gás Pressurizado
• Cromatografia Supercrítica (CSC)
Classificação das técnicas Cromatográficas
Mecanismos de separação
• De acordo com a Fase Estacionária (FE)
• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas
• De acordo com o modo de separação
•
•
•
•
•
Por Adsorção
Por Partição
Por Troca Iônica
Por Exclusão
Por Afinidade
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
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Classificação das técnicas Cromatográficas
Classificação das técnicas Cromatográficas
• De acordo com a Polaridade da Fase Estacionária (FE)
Técnica
Planar
Coluna
• Fase normal FE polar
• Fase reversa FE apolar
FM
Líquido
FE
Líq
Tipo de
cromato-cromato
grafia
Cromatografia em papel - CP
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944
Sól
Gás
Líq
Sól
CP CCD CGL CGS
Líquido
Líq
Sól
CLL CLS
Troca
Iônica
Afinidade
Fase
Ligada
CTI
CB
CLFL
Exclusão
CE
Cromatografia em papel - CP
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra
Aplica-se na separação e identificação de compostos polares
hidrossolúveis.
Separação
Fase móvel
É uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido)
sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro).
Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo
de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma
mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia em papel - CP
•
•
•
•
•
•
Princípio: partição (solubilidade)
Quantidade de amostra necessária 10-3 a 10-6 g
Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
F.M. - Sistema de solventes
F.E. - Água retida na celulose (papel Whatman)
Métodos de detecção: físico-químicos
Cromatografia em Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber,
mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960.
O processo de separação está fundamentado, principalmente,
no fenômeno de adsorção.
• Análise qualitativa: Rf (fator de retenção)
problema : reprodutibilidade
• Análise quantitativa: densitômetro, extração dos solutos
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Cromatografia em Camada Delgada - CCD
Cromatografia em Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos
• Princípio: Adsorção (polaridade)
Rf =
• Método rápido (20-40 min.)
• Uso de diversos agentes cromogênicos
• Maior sensibilidade que C.P.
(10-9
g)
• Grande gama de compostos pode ser analisada
s
c
• Método simples e barato
• F.M. - sistema de solventes
b
ΔSmancha
ΔSsolvente
Rfa =
a
s
Rfb =
b
s
Rfc =
c
s
• F.E - Adsorventes (sílica, alumína, celite, amido)
a
• Métodos de detecção: físico-químicos
Cromatografia em Camada Delgada - CCD
https://www.youtube.com/watch?v=CmHFVxT
xkGs
Cromatografia em Camada Delgada - CCD
ANÁLISE QUALITATIVA
Cromatografia
Bi-dimensional
-Comparação com valores de Rf
tabelados
- Comparação com padrão eluído em
conjunto
- Extração e aplicação de métodos
instrumentais
Exemplo:
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie A
A
Após
Eluição
B
Amostra
Para se certificar da presença, eluir em outros solventes
Cromatografia em Camada Delgada - CCD
Solvente 1
Solvente 2
Questões sobre Cromatografia e Eletroforese
1) Diferencie os tipos de cromatografia de acordo com a
Ponto máximo de deslocamento da fase móvel
fase móvel ,a fase estacionária, o sistema cromatográfico
e o mecanismo de separação.
2) Explique os princípios básicos do método cromatográfico.
3) Explique como a cromatografia permite identificar e quantificar
Ponto de aplicação das amostras
Amostras
A
B
C
substâncias presentes numa mistura.
4) Diferencie a cromatografia em papel da CCD.
5) Explique como ocorre a separação de componentes de uma
1. Qual das amostras apresentou maior afinidade pela fase
estacionária e qual apresentou menor?
2. Qual amostra apresentou maior e menor fator de retenção?
mistura usando a técnica de eletroforese.
6) Diferencie os tipos de eletroforese: em gel, capilar, horizontal,
vertical e 2D.
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