Desenvolvimento e agrotransformação de endófitos expressando o
gene repórter DsRed para ensaios de controle biológico de Phyllosticta
citricarpa
Juliana Bernardim Wobeto
PIBIT/CNPq
Chirlei Glienke/ Camila da Costa Senkiv
De modo a esclarecer a epidemiologia da doença
Mancha Preta dos Citrus e os processos pelo quais o
fungo Phyllosticta citricarpa infecta plantas cítricas,
pretende-se determinar os processos de infecção e
colonização da P. citricarpa, e compará-lo com o
realizado pelo fungo endofítico P. capitalensis, o qual
coloniza de forma assintomática. Desenvolveu-se,
portanto, método de agrotransformação para
obtenção de endófitos contendo o gene DsRed e
caracterizou-se linhagens transformadas com gfp, de
P. capitalensis.
A bactéria Agrobacterium tumefaciens, contendo o
gene DsRed, foi mantida em co-cultivo com o fungo
P. capitalensis. Transferidos para um meio seletivo,
apenas os transformantes emergem do meio. Devese determinar a estabilidade mitótica destes
transformantes, cultivando-os em meio seletivo por
três gerações. Fez-se análise por microscopia de
epifluorescência e crescimento micelial, bem como
PCR para detecção do gene repórter.
FIGUEIREDO, J. G.; GOULIN, E. H.; TANAKA, F.; KAVACORDEIRO, V.; GALLI-TERASAWA, L.; STAATS, C.;
SCHARANK, A.; GLIENKE, C. Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of Guignardia
citricarpa. Journal of Microbiology Methods. 80(2),
p.143-147, 2010.
Na determinação do protocolo de Agrotransformação, seguiu-se a
metodologia descrita por Figueiredo et. al (2010). Avaliou-se
diferentes variáveis quanto ao tempo e condições de co-cultivo
bactéria + fungo, bem como melhores condições e tempo
necessário para esporulação dos fungos. Quanto à caracterização
dos transformantes de P. capitalensis, foram avaliadas 11 colônias
fúngicas por PCR, quanto à presença do gene gfp, a fim de se
obter a linhagem com características morfológicas e fisiológicas
mais semelhantes à linhagem selvagem para os estudos futuros
de controle biológico. Destas, apenas 4 ainda expressavam a
proteína verde fluorescente. Quanto à avaliação morfológica, o
crescimento inicial das linhagens foi semelhante, entretanto após
10 dias foi possível observar melhor crescimento do
transformante LGMF02/T11.
Fig. 1 - Microscopia de
epifluorescência do
transformante
LGMF02/T11
Uma linhagem de P. capitalensis, transformada com o gene gfp
– LGMF02/T11- foi determinada a mais próxima à selvagem
quanto às características morfológicas e fisiológicas, sendo,
portanto, a mais indicada para estudos de controle biológico.
Como perspectiva para futuros trabalhos, pretende-se utilizar o
protocolo de agrotransformação desenvolvido, e ao obter
transformantes, permitir a distinção entre o processo de
infecção e colonização de P. citricarpa e o endofítico.