UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
“INFECÇÃO POR Helicobacter pylori EM PACIENTES COM
DOENÇA DE CHAGAS: TIPOS DE LESÕES GÁSTRICAS,
FATORES GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO E FATORES DE
VIRULÊNCIA DA BACTÉRIA”.
FERNANDA MACHADO FONSECA
Uberaba, MG
2013
FERNANDA MACHADO FONSECA
“INFECÇÃO POR Helicobacter pylori EM PACIENTES COM
DOENÇA DE CHAGAS: TIPOS DE LESÕES GÁSTRICAS,
FATORES GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO E FATORES DE
VIRULÊNCIA DA BACTÉRIA”.
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde - Área de concentração:
Patologia Humana, da Universidade Federal
do Triângulo Mineiro como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Gonçalves de Oliveira
Uberaba, MG
2013
ii
iii
Dedico este trabalho...
... Aos meus pais Darlene e Hernane, que são
a minha vida e minha fortaleza. Agradeço
pela
confiança,
amizade,
apoio
incondicional, estímulo, incentivo e por
compreenderem a minha ausência. Com todo
o meu carinho;
... Aos meus irmãos Luiz Henrique e Marcela,
pela amizade, companheirismo e que apesar
da distância estão sempre ao meu lado;
... Ao Kennio por me incentivar sempre, pelo
companheirismo, compreensão e paciência
durante os momentos difíceis durante a
realização deste trabalho;
... Aos meus avós Joaquim, Benedita, Lúcia
(in
memorian)
e
Joanes
pelo
carinho,
estímulo, força e confiança.
iv
v
 Agradeço a Deus, por ter me dado saúde e força para concluir mais esta etapa em
minha vida e que durante os momentos de desânimo me guiou fazendo com que eu
continuasse a persistir nos meus objetivos.
 À Profª Draª Adriana Gonçalves de Oliveira pela orientação, disponibilidade,
respeito, amizade, persistência, convivência e ensinamentos. Agradeço a confiança e
a forma com a qual me recebeu em seu laboratório.
 À Drª. Renata Margarida Etchebehere, Dr. Eduardo Crema, Drª Iracema Saldanha
Junqueira, Dr. Daurin Narciso da Fonseca e Dr. Artur Assunção Araújo, pela imensa
colaboração neste estudo, realizando os exames histopatológicos dos fragmentos de
mucosa gástrica e da endoscopia digestiva alta nos pacientes incluídos. Agradeço
ainda pela convivência e aprendizado no dia-a-dia.
 Ao Prof. Dr. Valdo José Dias da Silva, por fornecer informações clínicas dos
pacientes com a forma cardíaca da doença de Chagas.
 Aos pacientes que gentilmente aceitaram participar deste trabalho e sem os quais, a
realização do mesmo não seria possível.
 À Sônia Caiado pela amizade verdadeira, carinho incondicional, conselhos,
conversas, risadas e palavras de sabedoria.
 À Aline Libério Braga Rodrigues e Jacqueline Batista Souza por terem
acompanhado de perto e participado diretamente em vários momentos, sempre
vi
contribuindo de forma positiva, com incentivo, boa vontade e amizade.
 À Renata Beatriz Silva (“Renatinha”) por ser uma pessoa iluminada, transmitir
tranquilidade e por sempre me acalmar e incentivar com suas palavras de carinho.
 Aos colegas de laboratório pela convivência diária e exemplo de trabalho em
equipe, em especial à Larissa Beatriz Silva, Beatriz Virgínia da Silva e Patrícia
Borges Peixoto.
 À Leila Nunes (in memorian), Miguela Freitas, Celso Tadeu, Luciene Bessa e Sueli
Abrão pelo carinho, amizade construída ao longo destes anos e por tornarem mais
descontraídos os momentos dentro do laboratório.
 Ao pessoal do Laboratório de Pesquisa em Bacteriologia da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG), em especial à Drª Dulciene Maria de Magalhães Queiroz
por aceitar e permitir que visitasse o seu laboratório para aprimorar os
conhecimentos em Microbiologia e ainda pela participação ativa em conjunto com a
Drª Andreia Maria Camargos Rocha durante as confecções de artigos para
publicação.
 Às enfermeiras e funcionários do Serviço de Endoscopia do Ambulatório Maria da
Glória pela contribuição durante as coletas e em especial à Cristina, Stephania, Vera
e Mariângela pela amizade.
vii
Apoio Financeiro
O presente trabalho foi desenvolvido com os recursos financeiros do
Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPQ) e Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).
viii
ix
1
Resumo
2
A maioria dos estudos que avaliaram o estômago de pacientes com doença de Chagas foi realizado
3
antes da descoberta do Helicobacter pylori. Desta forma, a gastrite crônica observada em pacientes
4
chagásicos, principalmente com a forma digestiva, era atribuída ao refluxo duodeno gástrico,
5
hipocloridria e a hipomotilidade resultantes da infecção pelo T. cruzi. Os objetivos deste estudo
6
foram avaliar e comparar as alterações gástricas histológicas e endoscópicas de pacientes
7
chagásicos e não-chagásicos, investigar a presença de polimorfismos nos genes que codificam a IL-
8
1β e IL-1RN e analisar se há diferença entre as amostras de H. pylori de pacientes chagásicos e não-
9
chagásicos em relação aos fatores de virulência da bactéria. Foram obtidos por biópsia fragmentos
10
de mucosa gástrica de pacientes chagásicos e não-chagásicos para análise histopatológica e extração
11
de DNA para análise dos polimorfismos e pesquisa dos fatores de virulência. Uma amostra de
12
sangue foi obtida para realização da sorologia para T. cruzi e H. pylori. A infecção pelo H. pylori
13
foi detectada pela histologia, PCR, sorologia e teste respiratório. Sessenta e quatro (34,8%)
14
pacientes chagásicos e 120 (65,2%) não-chagásicos foram incluídos no estudo. A prevalência de
15
gastrite foi similar entre chagásicos (92,2%) e não-chagásicos (85%) assim como a presença de
16
úlcera gástrica (9,4% versus 8,3%), atrofia (10,9% versus 10,8% no antro; 12,5% versus 5% no
17
corpo), metaplasia intestinal (10,9% versus 5% no antro; 6,2% versus 2,5% no corpo) e esofagite
18
(17,2% versus 8,3%). A gastrite crônica foi associada à infecção pelo H. pylori (P<0,001)
19
independentemente da doença de Chagas e outras co-variáveis de acordo com a análise
20
multivariada. A prevalência de polimorfismos nos genes da IL-1β e IL-1RN foi similar em pacientes
21
chagásicos e não-chagásicos assim como os fatores de virulência estudados. No entanto, pacientes
22
chagásicos estavam mais frequentemente infectados (50%) por amostras de H. pylori cagA-
23
positivas com maior número de repetições EPIYA-C do que os não-chagásicos (25%) (P=0.01). Os
24
resultados do presente estudo demonstraram que a co-infecção pelo H. pylori e o T. cruzi é
25
frequente e que a gastrite crônica está associada a infecção pelo H. pylori mesmo nos pacientes com
26
doença de Chagas. Não foi encontrada associação entre os fatores de virulência estudados e as
1
amostras que infectam pacientes chagásicos e não-chagásicos. Adicionalmente, nenhum dos
2
polimorfismos nos genes das citocinas pesquisadas parece predispor a co-infecção H. pylori/T.
3
cruzi.
4
5
Palavras-chave: H. pylori, co-infecção, doença de Chagas.
xi
xii
1
Abstract
2
Most studies that have evaluated the stomach of patients with Chagas disease were
3
performed before the discovery of Helicobacter pylori. Thus, the chronic gastritis
4
commonly seen in chagasic patients, most often in those with the digestive form, had
5
been formerly attributed to biliary duodenal-gastric reflux as well as to hypomotility
6
and hypochlorhydria, resulting in injury to the enteric nervous system caused by T. cruzi
7
infection. The aim of this study was to compare the gastric histological and endoscopic
8
features of chagasic and non-chagasic patients, evaluate the presence of polymorphisms
9
in the genes encoding the IL-1β and IL-1RN, analyze whether there are differences in
10
samples of H. pylori from chagasic and non-chagasic patients and also in relation to
11
virulence factors of the bacterium. Gastric biopsy samples were taken prospectively
12
from patients who underwent endoscopy for histological analysis and DNA extraction to
13
polymorphism analysis and research of virulence factors. H. pylori infection was
14
assessed by histology, PCR for the 16S rRNA gene, serology and the
15
test. Patients were considered H. pylori-negative when all diagnostic tests were
16
negative. A blood sample was obtained from each patient for the serological diagnosis
17
of Chagas disease and for the detection of anti-H. pylori IgG. Sixty-four (34.8%)
18
chagasic patients (with digestive, cardiac, cardiodigestive or indeterminate form) and
19
120 (65.2%) non-chagasic patients were evaluated. The prevalence of chronic gastritis
20
was similar among chagasic (92.2%) and non-chagasic (85.0%) patients as were gastric
21
ulcer (9.4% versus 8.3%), atrophy (10.9% versus 10.8% in antrum; 12.5% versus 5% in
22
corpus), intestinal metaplasia (10.9% versus 5% in antrum; 6.2% versus 2.5% in corpus)
23
and esophagitis (17.2% versus 8.3%). Chronic gastritis and active gastritis were
24
associated to H. pylori infection (P<0.001) independently of Chagas disease and the
25
other co-variables that were evaluated. The prevalence of IL-1β and IL-1RN
13
C-urea breath
xiii
1
polymorphisms were similar in chagasic and non-chagasic group as well as the
2
virulence factors evaluated. However, the patients with Chagas disease were more
3
frequently infected (50%) with H. pylori cagA-positive samples with an increased
4
number of EPIYA-C motifs than non-chagasic patients (25%) (P=0,01). This study
5
demonstrated that co-infection H. pylori/T. cruzi is common and the chronic gastritis is
6
associated to H. pylori infection even in patients with Chagas disease. No association
7
was found in relation the virulence factors and the H. pylori samples obtained from
8
chagasic and non-chagasic patients. Additionally, none of the polymorphisms in
9
cytokine genes studied seems to predispose the co-infection H. pylori/T. cruzi.
10
11
Key-words: H. pylori, co-infection, Chagas disease.
xiv
SUMÁRIO
Dedicatória ...................................................................................................................
iii
Agradecimentos ............................................................................................................
v
Resumo ..................................................................................................
ix
Abstract ................................................................................................
xii
Lista de siglas e abreviaturas ........................................................................................
17
Lista de Tabelas ............................................................................................................
19
Lista de Figuras ............................................................................................................
21
1. Introdução ................................................................................................................
22
2. Justificativa ...............................................................................................................
31
3. Objetivo ....................................................................................................................
33
3.1 Objetivos específicos ................................................................................... 34
4. Metodologia ..............................................................................................................
35
4.1 Pacientes e amostras biológicas ..................................................................
36
4.2 Sorologia para H. pylori e T. cruzi .............................................................
37
4.3 Colheita de fragmentos da mucosa gástrica …...........................................
37
4.3.1 Estudo histopatológico ............................................................................
38
4.4 Diagnóstico de úlcera e esofagite ...............................................................
39
4.5 Teste respiratório com uréia marcada com 13C ..........................................
39
4.6 Extração de DNA ......................................................................................
39
4.6.1 Amplificação do gene 16S rRNA ............................................................
40
4.7 Pesquisa dos fatores de virulência cagA, vacA, babA2 e iceA ..................
40
4.7.1 Amplificação dos genes vacA, babA2 and iceA ....................................
41
4.7.2 Amplificação do gene cagA gene e da região 3´ variável do gene cagA.. 41
4.8- Pesquisa dos polimorfismos nos genes que codificam a IL-1β e IL-1RN.
44
4.8.1 Detecção dos polimorfismos ...................................................................
44
4.9 Critérios de positividade e negatividade para o H.pylori ...........................
46
4.10 Análise Estatística ....................................................................................
46
5. Resultados ................................................................................................................
47
5.1 Análise histopatológica e endoscópica gástrica .........................................
48
15
5.2 Polimorfismos da IL-1β, IL-1RN e pesquisa dos fatores de virulência......
55
5.2.1 Pesquisa dos polimorfismos .....................................................................
56
5.2.2 Fatores de virulência cagA, vacA, babA2 e iceA....................................
62
6. Discussão ..................................................................................................................
73
7. Conclusões ...............................................................................................................
86
Referências ...................................................................................................................
88
16
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Ala: Alanina
BabA: blood group antigen-binding adhesin
CagA: citotoxin antigen associated
13
C: carbono 13
ºC: graus Celsius
CEP: Comitê de Ética em Pesquisa
DNA: ácido desoxirribonucleico
DP: Desvio Padrão
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EPIYA: Glutamina-Prolina-Isoleucina-Tirosina-Alanina (Glu-Pro-Ile-Tir-Ala)
et al: E colaboradores
Glu: Ácido Glutâmico
H. pylori: Helicobacter pylori
Hp: Helicobacter pylori
IBP: Inibidor de bomba de prótons
iceA: induced by contact with epithelium
IgG: Imunoglobulina G
IL: Interleucina
Ile: Isoleucina
kDa: Quilodalton
LPB: Laboratório de Pesquisa em Bacteriologia
LPS: Lipopolissacarídeos
MALT: Mucosa-associated lymphoid tissue
MG: Minas Gerais
17
MgCl2:
mM: milimolar
µL: Microlitro
mg: Miligrama
mL: Mililitro
ng: nanograma
NCTC: National Collection of Type Cultures
pb: Pares de bases
PCR: Reação em cadeia da polimerase
pH: Potencial de hidrogênio iônico
PMN: células polimorfonucleares
pmol: Picomol
Pro: Prolina
SNP: Polimorfismo de um único nucleotídeo
SPC: Serviço de Patologia clínica
SPSS: Statistical Package for the Social Sciences
T. cruzi: Trypanosoma cruzi
Th: células T helper
TNF: Fator de necrose tumoral
Tyr: Tirosina
U: unidades
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais
UFTM: Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Vac A: vacuolating citotoxin gene
WS: Wartin Starry
18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Primers e condições de amplificação da PCR ....................................
43
Tabela 2.
Condições de amplificação de PCR para IL-1β e IL-1RN ..................
45
Tabela 3.
Características da população de chagásicos e não-chagásicos ...........
48
Tabela 4.
Características clínicas, gástricas histológicas e endoscópicas de
pacientes chagásicos e não-chagásicos ............................................... 50
Tabela 5.
Variáveis associadas à gastrite crônica e gastrite crônica ativa na
análise multivariada ............................................................................
Tabela 6.
Classificação
da
infiltração
de
células
mononucleares
51
e
polimorfonucleares nas regiões do antro e corpo gástrico de
pacientes chagásicos e não-chagásicos de acordo com o status da
infecção por H. pylori .........................................................................
Tabela 7.
53
Características clínicas, histológicas gástricas e endoscópicas de
pacientes chagásicos com a forma digestiva e outras formas clínicas. 55
Tabela 8.
Distribuição dos polimorfismos da IL-1β-31, IL-1β-511 e IL-1RN
em pacientes chagásicos e não-chagásicos .........................................
Tabela 9.
56
Distribuição dos genótipos dos polimorfismos da IL-1β-31, IL-1β511 e IL-1RN em pacientes chagásicos de acordo com a forma
clínica da doença ................................................................................
Tabela 10.
57
Distribuição dos genótipos da IL1L1e IL-1RN em
pacientes co-infectados por H. pylori/T.cruzi e em pacientes
controles H. pylori-positivos ..............................................................
Tabela 11.
58
Distribuição dos genótipos da IL-1β em pacientes chagásicos e nãochagásicos com gastrite ....................................................................
59
19
Tabela 12.
Distribuição dos genótipos da IL-1β-31 e IL-1β-511 em pacientes
chagásicos e não-chagásicos com atrofia ..........................................
Tabela 13.
Distribuição dos genótipos da IL-1β em pacientes chagásicos e nãochagásicos com metaplasia ................................................................
Tabela 14.
62
Frequência dos genótipos vacA, cagA, iceA e babA2 em pacientes
H. pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos ...............................
Tabela 16.
61
Frequência dos alelos polimórficos da IL-1β em pacientes
chagásicos e não-chagásicos com atrofia e metaplasia intestinal ......
Tabela 15.
60
63
Frequência dos genótipos cagA, iceA e babA2 em pacientes
chagásicos H. pylori-positivos de acordo com a forma clínica da
doença de Chagas .............................................................................
Tabela 17.
66
Prevalência dos genótipos cagA, vacA, iceA e babA2 em pacientes
H. pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos de acordo com
diferentes manifestações gástricas ....................................................
Tabela 18.
68
Distribuição dos genótipos EPIYA de amostras cagA-positivas de
pacientes H. pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos ................ 69
Tabela 19.
Número de sítios EPIYA-C na proteína CagA em pacientes H.
pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos ....................................
Tabela 20.
71
Distribuição do número de sítios de EPIYA-C em pacientes H.
pylori-positivos de acordo com diferentes manifestações gástricas ...
72
20
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Distribuição da frequência dos alelos do gene vacA em pacientes
65
chagásicos H. pylori-positivos de acordo com as formas clínicas da
doença de Chagas.
Figura 2.
Eletroforese de amostras representativas dos diferentes sítios EPIYA
70
da proteína CagA observados em pacientes H. pylori-positivos
chagásicos e não-chagásicos.
21
22
1
1. INTRODUÇÃO
2
3
A bactéria Helicobacter pylori (H. pylori) foi isolada pela primeira, em 1982, a
4
partir de fragmentos de mucosa gástrica de pacientes com gastrite (MARSHALL E
5
WARREN, 1984). Estudos subsequentes confirmaram a hipótese inicial de que a
6
bactéria estaria associada à gastrite crônica e à úlcera péptica (MEGRAUD E
7
LAMOULIATTE, 1992; BLASER, 1995). Posteriormente, a infecção pelo H. pylori
8
também foi associada ao linfoma gástrico do tipo MALT e, em 1994, o microrganismo
9
foi considerado pela Organização Mundial de Saúde como um fator essencial na
10
patogênese do carcinoma gástrico (WHO, 1994).
11
Não obstante muitos aspectos da epidemiologia da infecção pelo H. pylori ainda
12
não tenham sido esclarecidos, há evidências de que a aquisição ocorre geralmente na
13
infância, na idade pré-escolar, geralmente pela via oral-oral ou fecal-oral, persistindo
14
por toda a vida do indivíduo (LEE, 1994; CAVE, 1996; ROCHA et al., 2003). Sabe-se,
15
atualmente, que cerca de metade da população mundial apresenta a bactéria no
16
estômago. Nos países em desenvolvimento, estudos mostram que aproximadamente
17
80% a 90% da população encontram-se infectada pelo H. pylori (BLASER, 1993;
18
BLASER E PARSONNET, 1994).
19
A infecção pelo H. pylori está sempre associada à presença de gastrite sendo
20
observadas alterações tais como aumento das células de defesa no local, diminuição e
21
perda das microvilosidades, edema intracelular, diminuição do muco e achatamento das
22
células da mucosa gástrica. Por outro lado, as doenças graves associadas à infecção tais
23
como úlcera péptica e a gastrite atrófica, que pode evoluir para o câncer gástrico,
24
ocorrem apenas em cerca de 10-20% dos indivíduos H. pylori positivos. Uma série de
25
estudos tem demonstrado que a gênese destas doenças é multifatorial dependendo das
26
características de virulência da bactéria e da resposta imune do hospedeiro (ISRAEL E
23
1
PEEK, 2001).
2
A capacidade de persistência e adaptação do H. pylori ao ambiente gástrico se
3
deve a alguns fatores de virulência comuns a todas as amostras. Dentre esses fatores
4
está a enzima urease capaz de converter a uréia presente em condições fisiológicas no
5
suco gástrico em amônia, promovendo a alcalinização do ambiente gástrico e
6
protegendo a bactéria dos efeitos deletérios da acidez estomacal (WEEKES et al.,
7
2001). Além disso, para atravessar a camada de muco e estabelecer o contato íntimo
8
com o epitélio, o microrganismo conta com a morfologia em forma de espiral, flagelos
9
e a produção de lipases e proteases que degradam a camada de muco e facilitam sua
10
progressão (JENKS E KUSTERS, 2000). Outras enzimas sintetizadas pela bactéria tais
11
como superóxido dismutase, catalase e arginase conferem proteção contra a atividade
12
lítica de macrófagos e neutrófilos, impedindo uma resposta eficaz do hospedeiro
13
(HAZELL et al., 1991).
14
Alguns fatores de virulência são identificados somente em algumas amostras e
15
parecem estar relacionados ao surgimento das doenças mais graves associadas à
16
infecção. Dentre esses fatores, devem ser ressaltadas a citotoxina vacuolizante (VacA) e
17
a ilha de patogenicidade cag, onde estão localizados vários genes de virulência, entre
18
eles o cagA. As amostras de H. pylori que expressam a proteína CagA (codificada pelo
19
gene cagA) e a citotoxina vacuolizante são denominadas tipo I e aquelas que não
20
expressam estas proteínas são agrupadas no tipo II (XIANG et al., 1995). Amostras do
21
tipo I induzem maior dano à mucosa gástrica e são mais frequentemente isoladas de
22
pacientes com úlcera péptica e carcinoma gástrico (YAMAOKA et al., 1996;
23
CRABTREE, 1996; COVACCI et al., 1997; QUEIROZ et al., 1998, QUEIROZ et al.,
24
2000). Recentemente foram descritos sítios de fosforilação na proteína CagA
25
denominados EPIYA. Devido à frequente recombinação homóloga na região 3 'do gene
24
1
cag, a região de repetição da EPIYA-CagA é altamente divergente entre as espécies de
2
H. pylori CagA positivas e é composta de várias combinações de quatro segmentos
3
discretos denominados EPIYA-A,-B,-C e-D. Número aumentado do sítio EPIYA C tem
4
sido associado com fenômenos celulares que predispõe à oncogênese gástrica (NAITO
5
et al., 2006).
6
Atualmente, pouco se sabe ainda sobre o gene iceA, induzido pelo contato com
7
as células epiteliais gástricas, e sua relação com o desenvolvimento da doença gástrica.
8
Foi relatado que o alelo iceA1 está relacionada com o desenvolvimento da úlcera
9
péptica em populações dos Estados Unidos (PEEK et al., 1998), da Holanda (VAN
10
DOORN et al., 1998) e gastrite erosiva no Brasil (RAMIS et al., 2010), enquanto que
11
o alelo iceA2 tem sido associado com a presença de gastrite enematosa (RAMIS et al.,
12
2010) úlcera e câncer gástrico (ASHOUR et al., 2001) na população brasileira.
13
Outro marcador de virulência da bactéria é o gene babA2 que codifica a
14
proteína BabA. Esta proteína é uma molécula de adesão de 75 kDa que medeia a
15
ligação do H. pylori com os antígenos sanguíneos do grupo b de Lewis com células do
16
epitélio gástrico humano. Três alelos bab foram identificados, no entanto, apenas o
17
produto do gene babA2 é necessário para a atividade de ligação aos antígenos de Lewis
18
b (PEEK et al., 1998). A influência da babA2 sobre a colonização bacteriana e sobre a
19
resposta inflamatória é ainda mal compreendido.
20
Os fatores ligados ao hospedeiro podem determinar a resposta imune e
21
inflamatória à infecção que por sua vez pode contribuir para definir o desfecho em
22
doença ou não. Dentre os fatores genéticos, os polimorfismos em regiões promotoras
23
de genes que codificam interleucinas (IL) afetando a transcrição gênica e assim
24
variação na produção das mesmas, são candidatos atraentes como fatores de risco
25
relacionados ao hospedeiro, pois podem influenciar a resposta imune. Os
25
1
polimorfismos até então descritos, na sua maioria, são de um único nucleotídeo (SNP)
2
ou são microssatélites. Eventualmente, pode ocorrer adição ou deleção de nucleotídeos.
3
Recentemente, genótipos do gene IL-1β (-31T/C, -511C/T) e IL-1RN (alelo2), que
4
supostamente aumentam a produção de IL-1β, têm sido associados a um risco
5
aumentado para desenvolvimento de hipocloridria, lesões graves da mucosa gástrica e
6
carcinoma gástrico (EL-OMAR et al., 2000; MACHADO et al., 2001; ROCHA et al.,
7
2005). A IL-1β é uma citocina pró-inflamatória com funções múltiplas. No estômago,
8
além de induzir inflamação, atua diretamente na célula parietal inibindo a secreção
9
ácida e, também, tem ação inibitória na secreção de pepsinogênio (BEALES E
10
CALAM, 1998). Na vigência de infecção pelo H. pylori há aumento dos níveis de IL-
11
1β na mucosa gástrica.
12
Assim, indivíduos H. pylori-positivos carreadores dos alelos associados com
13
maior produção de IL-1β teriam uma ampliação das lesões da mucosa, não apenas em
14
decorrência de aumento da inflamação, como também, pela ação anti-secretora da IL-
15
1β. A alcalinização do corpo gástrico criaria condição favorável para a colonização do
16
H. pylori nessa região que habitualmente é menos colonizada em decorrência da acidez
17
que controla negativamente a densidade bacteriana. O grau de inflamação do corpo
18
gástrico tenderia, assim, a aumentar levando a atrofia, com destruição das células
19
parietais, perpetuando a situação e aumentando o risco de carcinogênese.
20
Apesar de alguns estudos terem evidenciado uma alta prevalência de H. pylori
21
em pacientes com doença de Chagas crônica (BARBOSA et al., 1993; OLIVEIRA et
22
al., 1997; NASCIMENTO et al., 2002, FONSECA et al., 2012), os fatores que
23
predispõem os chagásicos a desenvolverem a infecção por essa bactéria ainda não são
24
conhecidos e nem as alterações da resposta imune que possam ocorrer na vigência de
25
co-infecção por esses importantes patógenos.
26
1
A doença de Chagas é uma enfermidade crônica que afeta cerca de 9 a 11
2
milhões de pessoas em toda a América Latina, cujo agente etiológico é o Trypanosoma
3
cruzi (T. cruzi), transmitido principalmente pela via vetorial (SCHOFIELD et al., 2006).
4
No Brasil, cerca de 3 a 5 milhões de pessoas se encontram infectadas e por este motivo,
5
a doença ainda é considerada um grave problema de saúde pública (PRATA, 2001). A
6
evolução clínica da doença é altamente variável. Após a contaminação, o indivíduo
7
desenvolve a fase aguda da doença com duração média entre 3 a 8 semanas, que se
8
caracteriza pelo alto parasitismo. Nos indivíduos não tratados, instala-se a fase crônica,
9
de longa duração, caracterizada por baixa parasitemia e pela presença de reposta imune
10
anti-T. cruzi com grande diversidade de manifestações clínicas (PRATA, 1999; PRATA,
11
2001). Nessa fase crônica da doença, distinguem-se diferentes formas anatomoclínicas,
12
dentre elas, a forma indeterminada, cardíaca, digestiva e mista.
13
Atualmente, acredita-se que a resposta imune dirigida contra o T. cruzi ou
14
contra componentes do próprio hospedeiro possa desempenhar um papel importante na
15
patogênese das formas crônicas da doença de Chagas. A fase crônica geralmente se
16
instala pela forma indeterminada, cuja duração é indefinida, podendo persistir por toda
17
a vida em 40 a 50% dos casos. O indivíduo nesse caso é assintomático e apresenta
18
sorologia e exames parasitológicos para T. cruzi positivos, sendo normais o exame
19
clínico, eletrocardiográfico e os exames radiológicos do coração, esôfago e cólon. No
20
entanto, esses indivíduos podem apresentar um grau de denervação autonômica maior
21
que os indivíduos do mesmo grupo etário não chagásico. É a forma clínica mais
22
frequente da doença de Chagas detectada na população das áreas endêmicas e entre
23
doadores de sangue infectados (MACEDO, 1997; FERREIRA et al., 2002).
24
As formas crônicas determinadas geralmente evoluem insidiosamente. No
25
Brasil estima-se que a cardiopatia crônica incida em cerca de 25 a 30% dos infectados
27
1
crônicos e a forma digestiva entre 5 a 10% (FERREIRA et al., 2002). A forma crônica
2
cardíaca é a mais importante da doença de Chagas em seres humanos, justamente pela
3
sua alta morbimortalidade. Nas formas mais graves e progressivas da cardiopatia
4
crônica chagásica, ocorre a morte prematura do paciente (PRATA, 2001). A forma
5
digestiva é representada por alterações da secreção gástrica, motilidade, absorção e, nos
6
casos mais graves, pelo megaesôfago e o megacólon. Em geral, nesses pacientes
7
observa-se uma hipossecreção clóridro-péptica, paralelamente a um estado de gastrite
8
crônica (REZENDE, 1997; FERREIRA et al., 2002).
9
Em relação às alterações fisiológicas gástricas que ocorrem na doença de Chagas
10
crônica, alguns autores têm demonstrado que pacientes com a forma digestiva da
11
doença apresentam diminuição da acidez gástrica associada a altos níveis séricos de
12
gastrina (TRONCON et al., 1984). Com relação aos níveis séricos de pepsinogênio,
13
após a estimulação, estes foram maiores no grupo chagásico do que no controle, o que
14
demonstra que apesar da denervação que ocorre na doença de Chagas crônica, a
15
resposta das células parietais após a estimulação não está comprometida (ROCHA et al.,
16
2009).
17
Alguns autores têm demonstrado uma alta prevalência de infecção pelo H.
18
pylori em pacientes chagásicos com a forma digestiva (BARBOSA et al., 1993;
19
TRONCON et al., 1996) e indeterminada (OLIVEIRA et al., 1997) pela análise
20
histopatológica de fragmentos obtidos do estômago. No entanto, nesses estudos não foi
21
analisada a prevalência da infecção pelo H. pylori em grupos controles, com outras
22
formas clínicas da doença de Chagas e nem mesmo na população não-chagásica.
23
No estudo realizado por OLIVEIRA et al. (1997) foi encontrado,
24
surpreendentemente, um grande número de pacientes chagásicos com úlcera (33%),
25
sendo 4 com úlcera gástrica e 3 com úlcera duodenal e gástrica. Desses 7 pacientes, 5
28
1
não tinham nenhum sintoma dispéptico ou dor. Esses autores estudaram 21 pacientes
2
com doença de Chagas indeterminada, sendo que em 20 foi detectada a presença de H.
3
pylori e de gastrite crônica (95,2%).
4
Recentemente, dois estudos demonstraram uma maior soroprevalência da
5
infecção pelo H. pylori em chagásicos com diferentes formas clínicas da doença,
6
quando comparada com indivíduos não chagásicos. Todavia, não foi observada
7
associação entre infecção pelo H. pylori e as diferentes formas clínicas da doença de
8
Chagas (NASCIMENTO et al., 2002, FONSECA et al., 2012).
9
Os efeitos que uma co-infecção H. pylori/T. cruzi pode provocar na resposta
10
imune e consequentemente nas complicações que podem surgir decorrentes da infecção
11
crônica concomitante por esses dois importantes patógenos, nunca foram estudados e
12
são totalmente desconhecidos. Alguns estudos têm demonstrado que as infecções por
13
outros agentes infecciosos que ocorrem paralelamente à infecção por H. pylori podem
14
modular a resposta imune produzida frente à bactéria e dessa forma, determinar o
15
aparecimento de lesões maior ou de menor gravidade, dependendo do balanço entre as
16
respostas Th1 e Th2 (HOLCOMBE, 1992; FOX et al., 2000; WHARY et al, 2005).
17
DU et al. (2006) demonstraram que a co-infecção por Shistossoma japonicum e
18
H. pylori, na população chinesa, estava associada com uma significante redução dos
19
títulos séricos de IgG anti-H. pylori e com uma probabilidade menor de
20
desenvolvimento da atrofia da região do corpo gástrico. Além disso, esses autores
21
encontraram uma soropositividade para CagA menor nos indivíduos co-infectados
22
quando comparado com aqueles mono-infectados pelo H. pylori. Segundo eles, esses
23
resultados se devem a uma resposta Th2 polarizada que é observada na vigência de
24
uma infecção por helmintos.
25
Alguns autores têm sugerido que a menor taxa de câncer gástrico na África
29
1
apesar da alta prevalência de H. pylori, se deve pelo menos em parte, a essa indução de
2
resposta imune Th2 provocada pela infecção concomitante com helmintos que é
3
altamente frequente nesse continente (HOLCOMBE, 1992; FOX et al., 2000).
4
MITCHELL et al. (2002), por sua vez, observaram que a resposta imune ao H. pylori
5
do tipo Th2 é mais comum na África, enquanto que a resposta Th1 é mais comum na
6
Europa e na Austrália.
7
Pelo exposto, podemos especular que o estudo de doenças que ocorrem
8
concomitante à infecção pelo H. pylori pode ajudar a esclarecer o porquê do
9
desenvolvimento das diferentes manifestações relacionadas à presença desse
10
microrganismo no estômago. O mesmo ocorre no caso da infecção pelo T. cruzi, visto
11
que ainda não se conhecem quais os fatores associados ao aparecimento das diferentes
12
formas clínicas da doença de Chagas. Fatores que alterem a resposta imune a essas
13
infecções ou ainda fatores genéticos do hospedeiro, como os polimorfismos nos genes
14
que codificam as interleucinas envolvidas na resposta inflamatória, podem influenciar
15
no desfecho desfavorável do parasitismo desses patógenos.
30
31
1
2. JUSTIFICATIVA
2
Tanto a infecção pelo H. pylori quanto pelo T. cruzi, altamente prevalentes em
3
determinadas regiões do nosso país, levam a doenças crônicas que podem se complicar
4
ou não. Ambas, geralmente, são adquiridas na infância e podem persistir por toda a
5
vida do indivíduo. Apesar dos vários estudos relacionados aos fatores do hospedeiro e
6
do microrganismo, ainda não é possível predizer quais desses indivíduos infectados
7
irão desenvolver as doenças graves.
8
Atualmente há um interesse crescente nos estudos que envolvem a co-infecção
9
por H. pylori e outros agentes de doenças infecto-parasitárias, visto que determinados
10
agentes podem modular a resposta inflamatória ao H. pylori. Nos casos de co-infecção
11
por H. pylori e parasitas intestinais, por exemplo, o risco de desenvolver carcinoma
12
gástrico é menor que nos indivíduos sem parasitoses intestinais. A doença de Chagas
13
também pode evoluir de forma diferente na presença de outras infecções.
14
Assim, a nossa hipótese é de que a co-infecção H. pylori / T. cruzi possa alterar
15
a resposta do hospedeiro frente a esses patógenos influenciando dessa forma no
16
aparecimento ou na proteção das diferentes manifestações clínicas causadas pela
17
infecção desses importantes patógenos. Essa alteração na resposta imune pode também
18
estar relacionada com a seleção de determinadas amostras de H. pylori, de maior ou
19
menor virulência que, por sua vez, também poderiam estar levar ao aparecimento ou
20
não das doenças mais graves associadas ao H. pylori em indivíduos chagásicos.
32
33
1
3. OBJETIVO
2
O presente projeto teve como objetivo comparar as alterações da mucosa
3
gástrica de pacientes chagásicos e não-chagásicos e os polimorfismos nos genes que
4
codificam as citocinas IL-1β e IL-1RN. Fatores de virulência do H. pylori também
5
foram estudados.
6
7
3.1- Os objetivos específicos foram:
8
9
10
11
12
13
14
1- Verificar quais os tipos lesões gástricas predominam nos pacientes chagásicos
com as diferentes formas clínicas da doença e não-chagásicos;
2- Verificar se a gastrite está associada à infecção por H. pylori mesmo nos
pacientes com doença de Chagas.
3- Investigar se polimorfismos dos genes que codificam as citocinas IL-1
e IL-
1RN estão associados com a co-infecção H. pylori /T. cruzi;
15
4- Avaliar se há diferenças entre as amostras de H. pylori isoladas de indivíduos
16
chagásicos e não-chagásicos, com relação aos fatores de virulência cagA, vacA,
17
babA2 e iceA;
18
5- Avaliar se há diferenças entre a prevalência dos genótipos que podem ocorrer na
19
região variável 3´ do gene cagA (que contém as sequências EPIYA) de amostras
20
de H. pylori obtidas de pacientes chagásicos e não-chagásicos.
34
35
1
4. METODOLOGIA
2
3
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
4
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) e foi desenvolvido no Laboratório de
5
Microbiologia do Departamento de Ciências Biológicas da UFTM em colaboração com o
6
Laboratório de Pesquisa em Bacteriologia (LPB) da Faculdade de Medicina da Universidade
7
Federal de Minas Gerais (UFMG).
8
9
10
4.1- Pacientes e amostras biológicas
11
12
Foram incluídos pacientes adultos chagásicos e não-chagásicos que foram
13
submetidos, por indicação médica, a esofagogastroduodenoscopia diagnóstica no Serviço de
14
Endoscopia Digestiva, do Ambulatório Maria da Glória, da UFTM.
15
Desses
pacientes,
foram
colhidos
fragmentos
do
estômago
para
análise
16
histopatológica e biologia molecular. Os seguintes critérios de exclusão foram utilizados: uso
17
de anticolinérgicos, tratamento prévio para erradicação do H. pylori, gravidez, presença de
18
distúrbios de coagulação, complicações como perfuração e/ou hemorragia gástrica,
19
impedimento anatômico ao exame endoscópico, varizes de esôfago e doença grave
20
concomitante. Adicionalmente, foi coletado de todos os pacientes 5 mL de sangue periférico
21
para realização do diagnóstico sorológico da doença de Chagas e detecção de anticorpos anti-
22
IgG H. pylori. O teste respiratório para diagnóstico da infecção por H. pylori foi realizado e
23
todos os pacientes assinaram o termo de consentimento e responderam a um questionário
24
detalhado para obtenção de dados sócio-demográficos. Os dados clínicos foram obtidos após
25
a revisão dos prontuários médicos dos pacientes.
26
36
1
4.2- Sorologia para H. pylori e T. cruzi
2
A presença de anticorpos IgG específicos para H. pylori foi detectada utilizando um kit
3
comercial de ELISA (Pyloriset EIA-GIII, Orion Diagnostica, Espoo, Finlândia). O antígeno
4
empregado no kit é uma proteína de superfície da amostra referência do H. pylori NCTC
5
11637. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Os pacientes com
6
sorologia positiva foram considerados infectados por H. pylori uma vez que a eliminação
7
espontânea da bactéria sem instituição de uma terapia específica para erradicação da mesma é
8
considerada um evento raro. As concentrações de anticorpos IgG nas amostras de soro foram
9
determinadas pela a interpretação da curva padrão construída de acordo com os valores de
10
absorbância de cada soro calibrador fornecido pelo fabricante. As concentrações dos
11
anticorpos anti-H. pylori foram expressas em U/mL.
12
O diagnostico sorológico da doença de Chagas foi estabelecido após realização dos
13
testes de ELISA (Chagatest ELISA-WIENER, Argentina), hemaglutinação (Chagatest HAI-
14
WIENER, Argentina) e imunofluorescência (Imuno-Con Chagas-WAMA, Brasil). Todos os
15
pacientes chagásicos apresentaram reações positivas para no mínimo duas reações e os não-
16
chagásicos mostraram reações negativas para os três testes utilizados. Os pacientes chagásicos
17
foram classificados de acordo com a forma clínica da doença baseado nos resultados do
18
eletrocardiograma e raio-X de contraste do esôfago e cólon presentes nos prontuários.
19
Somente os pacientes com dados completos foram incluídos neste estudo.
20
21
4.3- Colheita de fragmentos da mucosa gástrica
22
Fragmentos de mucosa gástrica foram obtidos durante a esofagogastroduodenoscopia
23
com o paciente em jejum de no mínimo 8 horas, após receber anestesia tópica da orofaringe
24
com cloridrato de lidocaína (Xilocaína spray a 10%) e medicação endovenosa adequada para
25
cada paciente. Antecedendo a cada exame, o endoscópio foi lavado vigorosamente com água
26
e sabão e mergulhado em glutaraldeído a 2,0% por 30 minutos.
37
1
Foram colhidos dois fragmentos da pequena curvatura do antro e dois da grande
2
curvatura do corpo gástrico para estudo histopatológico. Um fragmento do antro e outro do
3
corpo foram obtidos para posterior extração de DNA.
4
5
4.3.1- Estudo histopatológico
6
Após a coleta por biópsia, os fragmentos gástricos foram colocados em formol
7
tamponado a 4% e enviados ao Serviço de Patologia Cirúrgica do Hospital de Clínicas da
8
UFTM para serem processados. Os fragmentos fixados em formol foram desidratados em
9
álcool e xilol e a seguir incluídos em parafina. Cortes de 4 µm de espessura foram obtidos e
10
corados pela técnica de hematoxilina-eosina para estudo histopatológico e pelo método WS
11
(Wartin Starry) a base de prata para a pesquisa de Helicobacter (ROCHA et al.,1989).
12
Os achados histológicos da mucosa gástrica foram interpretados de acordo com a
13
classificação de Sidney ligeiramente modificada (DIXON et al., 1996), como descrito a
14
seguir:
15
16
a) Ausência de gastrite - nenhuma alteração do epitélio superficial ou glandular, com
ausência de células inflamatórias na lâmina própria (grau 0);
17
b) Intensidade da gastrite com base na presença de mononucleares na lâmina própria
18
e/ou no epitélio superficial ou glandular, graduada em leve (grau I), moderada (grau II) ou
19
intensa (grau III);
20
c) Intensidade da atividade inflamatória com base na presença de polimorfonucleares na
21
lâmina própria e/ou no epitélio superficial ou glandular, graduada em leve (grau I), moderada
22
(grau II) ou intensa (grau III);
23
24
d) Presença de atrofia gástrica de acordo com a diminuição do número de corpos
glandulares, graduada em leve (grau I), moderada (grau II), intensa (grau III);
25
e) Presença de metaplasia intestinal de acordo com a presença de epitélio com
26
características morfológicas e bioquímicas do epitélio intestinal, graduada em completa (grau
38
1
I) ou incompleta (grau II ou III), de acordo com a presença de enterócitos absorventes.
2
3
4.4- Diagnóstico de Úlcera e esofagite
4
A presença de úlcera foi diagnosticada com base nos achados endoscópicos e
5
classificada de acordo com a localização em úlcera duodenal ou gástrica. A esofagite foi
6
definida como a presença de uma ou mais lesões e foi graduada de acordo com o sistema de
7
classificação de Los Angeles (ARMSTRONG et al., 1996).
8
9
4.5- Teste respiratório com uréia marcada com 13C
10
O teste respiratório foi realizado com uréia marcada com
13
C pela técnica de
11
espectrometria infravermelha (HILDEBRAND E BEGLINGER, 1997; SCHADEWALDT et
12
al., 1997). Após jejum de 6 horas, uma amostra de ar expirado pelo paciente foi colhida em
13
um recipiente apropriado (amostra basal). Em seguida, o paciente ingeriu 200 ml de suco de
14
laranja contendo 75 mg de uréia marcada com
15
nova amostra de ar expirado foi colhida (amostra teste).
16
13
C (Euriso-top, França). Após 30 minutos,
As amostras basal e teste colhidas foram enviadas para o Laboratório de Pesquisa em
13
17
Bacteriologia (LPB) da UFMG para a realização da leitura. No LPB, a concentração de
18
foi determinada empregando-se um detector infravermelho de isótopos (IRIS Analysator,
19
Wagner Analysen Technik, Worspswede, Germany). Um aumento de 5% no teor de
20
amostra teste em relação à amostra basal foi considerado um resultado positivo para H.
21
pylori.
13
C
C da
22
23
4.6- Extração de DNA
24
A extração do DNA foi realizada a partir das amostras de tecido colhida por biópsia da
25
região do antro ou corpo gástrico utilizando-se o kit “QIAamp DNA miniKit” (QIAGEN
26
GMbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as especificações do fabricante. Resumidamente,
39
1
foi adicionado 20µl de solução de proteinase K (20 mg/ml) em tubos tipo ependorfe contendo
2
o fragmento de mucosa gástrica e homogeneizado em vórtex. A essa solução, foram
3
acrescentados 200µl do tampão de lise (Buffer AL) fornecido pelo fabricante, homogeneizado
4
em vórtex, centrifugado e incubado a 56°C por 10 min. A seguir, 200 µl de foram serão
5
adicionados e essa mistura colocada na coluna fornecida pelo kit QIAamp e centrifugada a
6
6000g por 1 min. A coluna foi colocada em outro microtubo coletor de 2 ml, e o filtrado do
7
tubo anterior descartado. O material da coluna foi lavado duas vezes (250 µl cada) com o
8
primeiro tampão (Buffer AW1) e duas com o segundo tampão de lavagem (Buffer AW2)
9
fornecida pelo kit. Finalmente, o DNA foi eluído com 100 µl de tampão AE fornecido pelo
10
kit.
11
12
4.6.1- Amplificação do gene 16S rRNA
13
A presença do DNA do H. pylori foi detectada a partir da amplificação do gene 16S
14
rRNA por PCR utilizando-se primers específicos descritos por RILEY et al. (1996). As
15
amostras que apresentaram um fragmento de 364 pb foram consideradas H. pylori-positivas e
16
foram posteriormente incluídas nas análises dos fatores de virulência da bactéria.
17
18
4.7- Pesquisa dos fatores de virulência cagA, vacA, babA2 e iceA
19
Inicialmente, todos os 184 pacientes incluídos no estudo foram submetidos à detecção
20
do gene 16S rRNA para detecção da infecção por H. pylori. Destes, 162 pacientes eram
21
H.pylori-positivos e foram submetidos à pesquisa dos fatores de virulência da bactéria.
22
Considerando os pacientes H.pylori-positivos, 59 eram chagásicos e 103 eram não-
23
chagásicos.
40
1
4.7.1- Amplificação dos genes vacA, babA2 and iceA
2
As amostras H. pylori-positivas foram submetidas à detecção das regiões média (“m”)
3
e sinal (“s”) do gene vacA utilizando os primers descritos por ATHERTON et al. (1995). As
4
amostras foram classificadas como tipo s1 ou s2 e tipo m1 ou m2. O gene babA2 e os subtipos
5
do gene iceA foram detectados de acordo com os primers descritos por GERHARD et al.
6
(1999) e VAN DOORN et al. (1998), respectivamente. Resumidamente, para cada amostra foi
7
preparado um “mix” de PCR contendo aproximadamente 50 ng de DNA, acrescido de 1% de
8
solução de tampão da enzima Taq DNA polymerase (KCl 50 mM e Tris-HCL 10 mM), 1.5
9
mM de MgCl2, 100 mM de cada desoxinucleotídeo, 1.0 U da enzima Taq DNA polimerse
10
(Promega, Madison, Estados Unidos), e 10 pmol de cada primer, em um volume total de
11
solução de 20 µL. Os pares de primers utilizados e as condições de PCR estão apresentados
12
na Tabela 1.
13
14
4.7.2- Amplificação do gene cagA gene e da região 3´ variável do gene cagA
15
O fragmento de 340 pb do gene cagA foi amplificado com primers descritos por
16
KELLY et al. (1994). Todas as amostras cagA positivas foram submetidas à amplificação da
17
região 3’ variável do gene cagA (que contém as sequências EPIYA) utilizando os primers
18
descritos por YAMAOKA et al. (1996). Foi preparado um “mix” de PCR contendo 1% da
19
solução tampão da enzima Taq DNA polimerase (KCl 50 mM and Tris-HCL 10 mM), 1.5 mM
20
de MgCl2, 100 mM de cada desoxinucleotídeo, 1.0 U de Taq DNA polimerase (Promega,
21
Madison, Estados Unidos), 10 pmol de cada primer e 2 µL de DNA, em um volume total de
22
solução de 20 µL. A reação produziu produtos de 500 pb a 850 pb de acordo com o número de
23
repetições de EPIYA-C. A infecção mista também foi detectada por esta metodologia. As
24
condições de PCR estão descritas na Tabela 1.
25
O termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA)
26
foi utilizado para amplificação de todas as reações. Os produtos obtidos foram corados com
41
1
brometo de etídeo e visualizados em gel de agarose 1,5% em um transluminador de luz
2
ultravioleta.
42
Tabela 1. Primers e condições de amplificação da PCR
Gene
16S rRNA
cagA
cagA-Epiya
vacS
vacM
Sequência do primer (5´to 3´)
Temperatura, tempo e ciclos para PCR
H276F: TATGACGGGTATCCGGC
94ºC, 5 min; 34 ciclos (94ºC, 2 s, 53ºC, 2s, 72ºC,
H676R: ATTCCACCTACCTCTCCCA
30s) e 72ºC, 15 min
CAGF: GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG
95ºC, 5 min; 38 ciclos (94ºC, 1min, 55ºC, 1 min,
CAGR: CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA
72ºC, 2 min) e 72ºC, 7 min
CAGF1: ACCCTAGTCGGTAATGGGTTA
95ºC, 5 min; 35 ciclos (95ºC, 1 min, 50ºC, 1 min,
CAGR1: GTAATTGTVTAGTTTCGC
72ºC, 1 min) e 72ºC, 7 min
VA1F: ATGGAAATACAACAAACACAC
95ºC, 5 min, 34 ciclos (95ºC, 1 min, 52ºC, 1 min,
259 (s1)
VA1R: CTGCTTGAATGCGCCAAAC
72ºC, 1 min) e 72ºC, 15 min
286 (s2)
VA4F: GAGCCCCAGGAAACATTG
Tamanho (pb) dos produtos
364
340
500 a 800
630 (m1)
VA4R: CATAACTAGCGCCTTGCAC
95ºC, 1min 30s, 34 ciclos (95ºC, 30s, 56ºC, 1
VA7F: GTAATGTGGTTTCAACACC
min, 72ºC, 1min 30s) e 72ºC, 5 min
352 (m2)
VA7R: TAATGAGATCTTGAGCGCT
babA2
iceA2
Baba2F: AATCCAAAAAGGAGAAAAAGTATGAA
94 ºC, 5min, 30 ciclos (94 ºC, 1 min, 55 ºC, 1
Baba2R:TGTTAGTGATTTCGGTGTAGGACA
min, 72 ºC, 1 min) e 72 ºC, 10 min
IceA1F: GTGTTTTTAACCAAAGTATC
832
247 (A1)
IceA1R: CTATAGCCASTYTCTTTGCA
94ºC, 9 min, 40 ciclos (95ºC, 30s, 50ºC, 45s,
IceA2F: GTTGGGTATATCACAATTTAT
72ºC, 45s) e 72ºC, 5 min
124, 229 ou 334 (A2)
IceA2R: TTRCCCTATTTTCTAGTAGGT
43
1
4.8- Pesquisa dos polimorfismos nos genes que codificam a IL-1β e IL-1RN
2
A extração do DNA para detecção dos polimorfismos foi realizada a partir das
3
amostras de tecido colhida por biópsia da região do antro ou corpo gástrico conforme
4
descrito anteriormente. Todos os 162 pacientes H.pylori-positivos de acordo com o
5
gene 16S rRNA foram submetidos à pesquisa dos polimorfismos. Cinquenta e nove
6
pacientes eram chagásicos e 103 eram não-chagásicos.
7
8
4.8.1- Detecção dos polimorfismos
9
Para a determinação do polimorfismo da base na posição-511 a partir do sítio de
10
início da transcrição do gene da IL-1β foi utilizada a técnica de PCR com os iniciadores
11
(IL-1β-511F e IL-1β-511R) que estão descritos na Tabela 2. A seguir o produto obtido
12
foi digerido com a enzima Ava I (PCR-RFLP), conforme MANSFIELD et al. (1994).
13
Os fragmentos obtidos foram analisados em gel de agarose a 2% corado com brometo
14
de etídeo. De acordo com os genótipos, foram visualizados os seguintes fragmentos:
15
CC: fragmentos de 114 e 190 pb; CT: fragmentos de 114, 190 e 304 pb; TT: fragmentos
16
de 304 pb.
17
O polimorfismo bialélico da base na posição -31 a partir do sítio de início da
18
transcrição do gene que codifica a IL-1β humana foram determinados por PCR
19
utilizando dois pares de primers (PCR-CTPP; PCR with confronting two-pairs primers)
20
de acordo com HAMAJIMA et al. (2001). Os iniciadores (IL-1β-31F1, IL-1β-31R1, IL-
21
1β-31F2 e IL-1β-31R2) estão descritos na Tabela 2. Os produtos de PCR foram
22
analisados em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio. Os genótipos
23
foram estabelecidos com base no número e tamanho dos fragmentos obtidos: CC:
24
fragmentos de 574 e 345 pb; TC: fragmentos de 574, 345 e 266 pb; TT: fragmentos de
25
574 e 266 pb.
44
1
O polimorfismo pentalélico no gene IL-1RN (antagonista do receptor da IL-1β
2
foi determinado por PCR nas condições descritas por MANSFIELD et al. (1994). Os
3
iniciadores (IL-1RN-F e IL-1RN-R) estão descritos na Tabela 2. Os produtos de PCR
4
foram analisados em gel de agarose a 1,5% e corados com brometo de etídeo. Os alelos
5
foram classificados como: alelo 1, 4 repetições (410 pb); alelo 2, 2 repetições (210 pb);
6
alelo 3, 5 repetições (500 pb); alelo 4, 3 repetições (325 pb); alelo 5, 6 repetições (595
7
pb).
8
9
Tabela 2. Condições de amplificação de PCR para IL-1β e IL-1RN
Temperatura, tempo e
Polimorfismo
Iniciadores
ciclos de PCR
-511-IL1β
F 5'-TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3'
2 min à 95ºC, 35 ciclos
R 5'-GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3'
de 1 min à 95ºC, 53ºC, e
74ºC, e 4 min à 74ºC
-31-IL1β
F1 5'-AAT GTG GAC ATC AAC TGC A-3'
R1 5'-CTC CCT CGC TGT TTT TAT A-3'
F2 5'-ACT TCT GCT TTT GAA AGC C-3'
5 min à 94ºC, 30 ciclos
de 1 min à 94ºC, 54ºC,
e 72ºC, e 5 min à 72ºC
R2 5'-TCA GCT GTT AGA TAA GCA G-3'
IL-1RN
F 5'-CTC AGC AAC ACT CCT AT-3'
1 min à 96ºC, 30 ciclos
R 5'-TCC TGG TCT GCA GGT AA-3'
de 1 min à 94ºC, 60ºC, e
70ºC, e 4 min à 72ºC
10
45
1
4.9- Critérios de positividade e negatividade para o H. pylori
2
Os pacientes foram considerados H. pylori-positivos quando, pelo menos dois
3
testes (teste respiratório, histologia, ELISA ou PCR) forem positivos ou apenas a
4
cultura for positiva e H. pylori-negativos, quando todos os testes forem negativos.
5
Pacientes em uso de inibidor de bomba de prótons e/ou antibióticos que apresentaram
6
somente a sorologia positiva e com alterações histológicas gástricas presentes foram
7
considerados H. pylori-positivos.
8
9
4.10- Análise estatística
10
Os dados foram analisados utilizando o software SPSS (versão 16.0; SPSS Inc.,
11
Chicago, IL, Estados Unidos). A associação de cada variável com a doença de Chagas
12
foi verificada pelo teste do Qui-quadrado ou teste exato de Fischer quando apropriado.
13
O teste T de Student foi utilizado para determinar se houve diferença em relação à idade
14
dos pacientes. A intensidade e atividade da gastrite foram comparadas pelo teste de
15
Mann-Whitney. Os modelos de regressão logística foram construídos para ajuste dos
16
fatores de confusão como idade, sexo, uso do tabaco, consumo de álcool e uso de anti-
17
inflamatórios não esteróides, para avaliar a associação entre gastrite crônica ou gastrite
18
crônica ativa e doença de Chagas ou infecção por H. pylori. Variáveis com P≤0.25 na
19
análise univariada foram incluídas na análise multivariada. O odds ratios (OR) e
20
intervalo de confiança (CI) de 95% foram determinados. Foram consideradas
21
significativas as análises com P<0.05.
46
47
1
5. Resultados
2
3
Análise histopatológica e endoscópica gástrica
4
Entre agosto de 2009 a dezembro de 2011, foram estudados 184 pacientes adultos
5
submetidos à endoscopia digestiva alta no Serviço de Endoscopia do Ambulatório Maria da
6
Glória da UFTM. A faixa etária variou de 21 a 84 anos, com média de 52,7 e desvio padrão
7
(DP) de ± 14,6 anos. Setenta pacientes (38%) pertenciam ao gênero masculino e 114 (62%) ao
8
feminino.
9
Dentre os 184 pacientes estudados, 64 (34,8%) eram chagásicos e 120 (65,2%) não
10
chagásicos (Tabela 3). Dentre os pacientes com doença de Chagas, 40 (62,5%) apresentavam
11
a forma digestiva da doença, 8 (12,5%) a indeterminada, 3 (4,7%) a cardíaca e 13 (20,3%) a
12
cardiodigestiva. A faixa etária dos pacientes chagásicos variou de 42 a 80 anos, média de 62,4
13
± 9,3 enquanto que a faixa etária dos não chagásicos variou de 21 a 84 anos, média de 47,5 ±
14
14,3. Trinta e dois (50%) dos pacientes chagásicos pertenciam ao gênero feminino e 32 (50%)
15
ao masculino.
16
17
Tabela 3: Características da população de chagásicos e não-chagásicos
Número
Pacientes
Média de idade (anos) ± DP
Homens
Mulheres
Total
32
32
64
62,4 ± 9,3
Digestiva
24
16
40
62,1 ± 9,7
Cardíaca
2
1
3
59,6 ± 9,6
Cardiodigestiva
4
9
13
62,2 ± 8,5
Indeterminada
2
6
8
65,8 ± 9,9
38
82
120
47,5 ± 14,3
Chagásicos
Formas clínicas
Não Chagásicos
48
1
2
As características clínicas, gástricas endoscópicas e histológicas dos pacientes
3
chagásicos e não-chagásicos estão demonstradas na Tabela 4. Não foi observada diferença
4
significativa entre o grupo de chagásicos e não-chagásicos em relação ao status H. pylori-
5
positivo, gastrite crônica, gastrite ativa crônica, atrofia, metaplasia intestinal, esofagite e
6
úlcera gástrica, enquanto que a úlcera duodenal foi detectada somente entre os pacientes não-
7
chagásicos (p = 0,01). Todos os pacientes chagásicos com úlcera gástrica e a maioria dos não-
8
chagásicos com úlcera gástrica (8 of 10; 80%) e úlcera duodenal (10 of 11; 90,9%) eram H.
9
pylori-positivos.
10
Uma alta positividade da infecção pelo H. pylori entre os pacientes chagásicos e não-
11
chagásicos foi detectada por sorologia (67,2% e 75,8%, respectivamente) comparada com a
12
PCR para o gene 16S rRNA (62,5% e 61,7%, respectivamente), histologia (64,1% e 57,5%,
13
respectivamente) e teste respiratório com uréia marcada (52,7% e 62,1%, respectivamente).
14
Em 71,1% dos pacientes chagásicos e 57,0% dos não-chagásicos H. pylori-positivos, a
15
bactéria estava localizada em ambas regiões gástricas do antro e corpo, assim como a
16
localização da gastrite (57,8% e 51,2%, respectivamente).
17
49
1
2
Tabela 4: Características clínicas, gástricas histológicas e endoscópicas de pacientes
chagásicos e não-chagásicos
Número (%) de Pacientes
Características
Não-chagásicos (n = 120)
62,5 ± 9,4
47,6 ± 14,3
0,00
32 (50,0) / 32 (50,0)
82 (68,3) /38 (31,7)
0,01
Status H. pylori-positivo
45 (70,3)
86 (71,7)
0,85
Gastrite crônica
59 (92,2)
102 (85,0)
0,16
Gastrite crônica ativa
42 (65,6)
70 (58,3)
0,33
Atrofia no antro
7 (10,9)
13 (10,8)
0,98
Atrofia no corpo
8 (12,5)
6 (5,0)
0,07
Metaplasia intestinal no antro
7 (10,9)
6 (5,0)
0,13
Metaplasia intestinal no corpo
4 (6,2)
3 (2,5)
0,20
Úlcera gástrica
6 (9,4)
10 (8,3)
0,81
Úlcera duodenal
0
11 (9,2)
0,01
11 (17,2)
10 (8,3)
0,07
Média de idade ± DP (anos)
Gênero (Feminino/ Masculino)
Esofagite
3
P
Chagásicos (n = 64)
DP= desvio padrão
4
5
6
De acordo com a análise multivariada (Tabela 5), a gastrite crônica e gastrite ativa
7
crônica foram estatisticamente associadas à infecção pelo H. pylori (P<0,001) independente
8
da doença de Chagas e outras co-variáves avaliadas.
50
1
Tabela 5: Variáveis associadas à gastrite crônica e gastrite crônica ativa na análise multivariadaa
Gastrite crônica
Gastrite crônica ativa
Características
Univariada
P value
Multivariada
P value
OR (95% IC)b
Univariada
P value
Idade
0,577
0,547
Uso de AINEs
0,366
0,580
Doença de Chagas
0,160
0,157
0,334
Gênero
0,029
0,105
0,457
Status H. pylori
0,000
0,000
Fumo
0,444
100,9 (12,8-793,2)
2
a
3
multivariada, o valor de P value < 0,05 foi considerado significante.
4
b
0,000
Multivariada
P value
OR (95% IC)
0,000
26,5 (10,7-65,5)
0,342
Variáveis com valor de P ≤ 0,25 na análise univariada foram incluídas no modo complete de análise. Na análise
OR, odds ratio; IC, interval de confiança. AINES: anti-inflamatórios não-esteróides.
51
1
Entretanto, foi observada a presença de pacientes H. pylori-negativos com gastrite em
2
ambos os grupos de chagásicos e não-chagásicos como demonstrado na Tabela 6. Seis dos 19
3
(31,6%) pacientes chagásicos e um dos 34 (2,9%) não-chagásicos H. pylori-negativos
4
apresentaram infiltração de células polimorfonucleares – PMN (gastrite crônica ativa) no
5
antro e no corpo. Um número maior de pacientes chagásicos H. pylori-negativos (14 de 19;
6
73,7%) e não-chagásicos (17 de 34; 50,0%) apresentaram infiltrado de células mononucleares
7
(gastrite crônica). Entretanto, nenhum paciente H. pylori-negativo apresentou infiltrado de
8
células PMN classificado como moderado ou severo e também nenhum desses pacientes
9
apresentaram infiltrado de células mononucleares classificados como severo. Notavelmente, o
10
grupo de pacientes chagásicos H. pylori-negativos exibiu um grau superior de infiltração de
11
células mononucleares (P = 0,004) e PMN (P = 0,03) nas regiões do corpo e antro,
12
respectivamente, comparado com o grupo de não-chagásicos. Não foi observada diferença
13
significativa entre os grupo de pacientes H. pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos em
14
relação ao grau de infiltração de células na mucosa gástrica do antro e corpo.
52
1
2
Tabela 6. Classificação da infiltração de células mononucleares e polimorfonucleares nas regiões do antro e corpo gástrico de pacientes chagásicos e nãochagásicos de acordo com o status da infecção pelo H. pylori.
Pacientes e região
gástrica
Pacientes H. pylori-positivos
Infiltração de células mononuclearesa,c (%)
Infiltração de células polimorfonuclearesb,d (%)
Pacientes H. pylori- negativos
Infiltração de células mononuclearesa,e (%)
Infiltração de células polimorfonuclearesb,f (%)
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
Antro
0
15 (23.4)
25 (39.1)
5 (7.8)
11 (17.2)
17 (26.6)
13 (20.3)
4 (6.3)
8 (12.5)
6 (9.4)
5 (7.8)
0
15 (23.4)
4 (6.3)
0
0
Corpo
2 (3.1)
22 (34.4)
14 (21.9)
7 (10.9)
21 (32.8)
14 (21.9)
5 (7.8)
5 (7.8)
8 (12.5)
9 (14.1)
2 (3.1)
0
17 (26.6)
2 (3.1)
0
0
Antro
2 (1.7)
31 (25.8)
50 (41.7)
3 (2.5)
28 (23.3)
32 (26.7)
18 (15.0)
8 (6.7)
17 (14.2)
17 (14.2)
0
0
33 (27.5)
1 (0.8)
0
0
Corpo
14 (11.7)
34 (28.3)
32 (26.4)
6 (5.0)
36 (30.0)
33 (27.5)
14 (11.7)
3 (2.5)
27 (22.5)
7 (5.8)
0
0
34 (28.3)
0
0
0
Chagásicos
Não-chagásicos
P≤0.001 para pacientes H. pylori-positivos versus H. pylori-negativos nos grupos de chagásicos e não-chagásicos para a região do antro e corpo gástrico, de
3
a,b
4
acordo com o teste de Mann-Whitney U.
5
c,d
6
Mann-Whitney U.
7
e
8
com o teste de Mann-Whitney U .
9
f
10
P>0.05 para o grupo chagásicos versus não-chagásicos entre pacientes H. pylori-positivos para a região do antro e corpo gástrico, de acordo com o teste de
P<0.05 para o grupo chagásicos versus não-chagásicos entre pacientes H. pylori-negativos para a região do corpo e P>0.05 para a região do antro de acordo
P<0.05 para o grupo chagásicos versus não-chagásicos entre pacientes H. pylori-negativos para a região do antro e P>0.05 para a região do corpo de acordo com
o teste de Mann-Whitney U.
53
1
Entre os 64 pacientes com doença de Chagas, 40 (62,5%) tinham a forma
2
digestiva da doença, 13 (20,3%) tinham a forma cardiodigestiva, 8 (12,5%) tinham a
3
forma indeterminada e 3 (4,7%) tinham a forma cardíaca da doença. Os pacientes com a
4
forma digestiva apresentavam megaesôfago (n=33), megacólon (n=2) ou ambas as
5
alterações (n=5). Uma comparação das características clínicas, endoscópicas e
6
histológicas gástricas dos subgrupos de pacientes chagásicos com a forma digestiva
7
(n=40) e outras formas clínicas (n=24) estão demonstradas na Tabela 7. Não houve
8
diferença significativa entre os subgrupos de chagásicos em relação ao status H. pylori,
9
gastrite crônica, gastrite crônica ativa, úlcera gástrica e esofagite. A metaplasia intestinal
10
e a atrofia foram detectadas na região do antro em maior porcentagem nos pacientes
11
com a forma digestiva do que entre aqueles com as outras formas clínicas da doença de
12
Chagas, porém, diferença significativa foi observada somente para a metaplasia
13
intestinal (P = 0,03). Em contraste, a metaplasia intestinal e atrofia na mucosa do corpo
14
foram mais frequentes nos pacientes chagásicos com as outras formas clínicas da
15
doença do que entre aqueles com a forma digestiva, porém, diferença estatística foi
16
observada somente para atrofia (P = 0,02). Dentre 40 chagásicos com a forma digestiva
17
da doença, 17 (42,5%) estavam em uso de IBPs assim como sete (29,2%) dos 24
18
chagásicos com as outras formas clínicas (P=0,28).
19
54
1
2
Tabela 7: Características clínicas, histológicas gástricas e endoscópicas de pacientes
chagásicos com a forma digestiva e outras formas clínicas.
Número (%) de pacientes chagásicos
Características
P
Forma Digestiva
Outras formas
Média de idade ± DP (anos)
62,1 ± 9,7
(n = 40)
63,1 ± 9,0
(n = 24)
0,60
16 (40,0) / 24 (60,0)
16 (66,7) /8 (33,3)
0,04
Status H. pylori-positivo
28 (70,0)
17 (70,8)
0,94
Gastrite crônica
36 (90,0)
23 (95,8)
0,40
Gastrite crônica ativa
25 (62,5)
17 (70,8)
0,50
Atrofia no antro
6 (15,0)
1 (4,2)
0,18
Atrofia no corpo
2 (5,0)
6 (25,0)
0,02
Metaplasia intestinal no antro
7 (17,5)
0
0,03
Metaplasia intestinal no corpo
1 (2,5)
3 (12,5)
0,11
Úlcera gástrica
3 (7,5)
3 (12,5)
0,50
Esofagite
8 (20,0)
3 (12,5)
0,44
Gênero (Feminino / Masculino)
3
DP= desvio padrão
4
5
5.3 Polimorfismos da IL-1β, IL-1RN e pesquisa dos fatores de virulência
6
A detecção dos polimorfismos da IL-1β, IL-1RN e a pesquisa dos fatores de
7
virulência da bactéria foram realizadas em 162 pacientes sendo que 59 (36,4%) eram
8
chagásicos e 103 (63,6%) eram não-chagásicos. Destes, 114 (70,4%) pacientes eram H.
9
pylori-positivos e 48 (29,6%) eram H. pylori-negativos. A faixa etária dos pacientes
10
chagásicos variou de 42 a 80 anos, com média de 62,1 e desvio padrão (DP) de ± 9,4
11
anos, enquanto que a faixa etária dos não-chagásicos variou de 21 a 84 anos, com média
12
de 47,5 e DP ± 14,8 anos. Considerando os pacientes chagásicos, 35 (59,3%) tinham a
13
forma digestiva, 13 (22%) a forma cardiodigestiva, 8 (13,6%) a forma indeterminada e
14
3 (5,1%) tinham a forma cardíaca da doença.
55
1
5.2.1 Pesquisa dos polimorfismos
2
O genótipo heterozigoto (C/T para a posição -511 e T/C para a posição -31) da
3
IL-1β foi encontrado na maioria dos pacientes chagásicos e não-chagásicos. Em relação
4
ao polimorfismo do gene IL-1RN foi detectada uma maior prevalência do genótipo de
5
alelo longo tipo 1 (IL1RN1) quando comparado ao alelo curto (IL1RN*2) tanto no grupo
6
de chagásicos como nos não-chagásicos. A distribuição geral dos polimorfismos
7
avaliados está representada na tabela 8.
8
9
10
Tabela 8: Distribuição dos polimorfismos da IL1β-31, IL1β-511 e IL-1RN em pacientes
chagásicos e não-chagásicos.
Número (%) de pacientes
Genótipos
Chagásicos (n=59)
Não-chagásicos (n=103)
P
0,92
IL-1β-31
T/C
38 (64,4)
63 (61,2)
T/T
14 (23,7)
27 (26,2)
C/C
7 (11,9)
13 (12,6)
0,62
IL-1β-511
C/T
29 (49,2)
46 (44,7)
C/C
17 (28,8)
27 (26,2)
T/T
13 (22)
30 (29,1)
0,40
IL-1RN
1
43 (72,9)
84 (81,6)
2
3 (5,1)
5 (4,9)
3
1 (1,7)
0
1/2
11 (18,6)
11 (10,7)
1/3
1 (1,7)
3 (2,9)
11
12
A distribuição dos genótipos dos polimorfismos da IL1β-31, IL1β-511 e IL-1RN
13
foram avaliadas de acordo com as formas clínicas da doença de Chagas. Uma maior
14
prevalência do genótipo heterozigoto da IL1β-31 e da ILβ-511, e do genótipo IL-1RN1,
56
1
foi encontrada em todos os pacientes chagásicos independente da forma clínica da
2
doença (Tabela 9).
3
4
5
Tabela 9: Distribuição dos genótipos dos polimorfismos da IL1β-31, IL1β-511 e IL-1RN
em pacientes chagásicos de acordo com a forma clínica da doença.
Número (%) de pacientes chagásicos
Genótipos
Digestiva
Cardiodigestiva
Indeterminada
Cardíaca
(n=35)
(n=13)
(n=8)
(n=3)
P
0,54
IL1β-31
T/C
21 (60)
11 (84,6)
4 (50)
2 (66,7)
T/T
9 (25,7)
2 (15,4)
2 (25)
1 (33,3)
C/C
5 (14,3)
0
2 (25)
0
0,64
IL1β-511
C/T
18 (51,4)
5 (38,4)
5 (62,5)
1 (33,3)
C/C
10 (28,6)
4 (30,8)
1 (12,5)
2 (66,7)
T/T
7 (20)
4 (30,8)
2 (25)
0
0,99
IL-1RN
1
26 (74,3)
9 (69,2)
6 (75)
2 (66,7)
2
2 (5,7)
1 (7,7)
0
0
3
1 (2,9)
0
0
0
1/2
5 (14,3)
3 (23,1)
2 (25)
1 (33,3)
1/3
1 (2,9)
0
0
0
6
7
Também foi avaliado se os polimorfismos que codificam as citocinas IL-1 e
8
IL-1RN estão associados com a com a co-infecção H. pylori/T. cruzi. Em relação ao
9
polimorfismo na posição -31 da IL-1, o genótipo heterozigoto T/C foi predominante
57
1
tanto em pacientes co-infectados pelo H. pylori/T.cruzi (60%) quanto no grupo de
2
pacientes infectados apenas pelo H. pylori (63%) (Tabela 10).
3
4
5
Tabela 10: Distribuição dos genótipos da IL1L1e IL-1RN em pacientes
co-infectados pelo H. pylori/T.cruzi e em pacientes controles H. pylori-positivos.
Número (%) de pacientes
Genótipos
P
Co-infectados (n=40)
H. pylori-positivos (n=74)
0,95
IL1β-31
T/C
24 (60)
46 (62)
T/T
11 (27,5)
20 (27)
C/C
5 (12,5)
8 (11)
IL1
0,95
C/T
19 (47,5)
33 (44,6)
C/C
11 (27,5)
21 (28,4)
T/T
10 (25)
20 (27)
0,20
IL-1RN
1
27 (67,5)
63 (85,1)
2
3 (7,5)
2 (2,7)
3
1 (2,5)
0
1/2
8 (20)
8 (10,8)
1/3
1 (2,5)
1 (1,4)
6
7
Os genótipos da IL-1β-31, IL-1β-511 e IL-1RN foram avaliados em pacientes
8
chagásicos e não-chagásicos de acordo com diferentes alterações histopatológicas. Foi
9
observada uma maior prevalência do genótipo polimórfico da IL-1β-31 T>C e do
10
genótipo da IL-1β-511 C>T em pacientes chagásicos e não-chagásicos com gastrite,
11
enquanto que em relação ao polimorfismo da IL-1RN, houve predomínio do genótipo
12
IL1RN1 (Tabela 11).
13
58
1
2
Tabela 11: Distribuição dos genótipos da IL-1β em pacientes chagásicos e nãochagásicos com gastrite.
Polimorfismo
Número (%) de Pacientes com Gastrite
Chagásicos (n = 54)
P
Não-chagásicos (n = 90)
IL1β-31
0,67
T/C
36 (66,7)
54 (60)
T/T
11 (20,4)
24 (26,7)
C/C
7 (12,9)
12 (13,3)
IL1β-511
0,77
C/T
27 (50)
40 (44,4)
C/C
14 (28)
24 (26,7)
T/T
13 (24,1)
26 (28,9)
0,44
IL-1RN
1
39 (72,2)
75 (83,3)
2
3 (5,6)
4 (4,4)
3
1 (1,9)
0
1/2
10 (18,5)
10 (11,1)
1/3
1 (1,9)
1 (1,11)
3
4
A frequência da distribuição dos genótipos dos polimorfismos foram avaliados
5
entre o grupo de pacientes chagásicos e não-chagásicos que apresentaram atrofia do
6
antro e/ou do corpo (Tabela 12).
7
59
1
2
Tabela 12: Distribuição dos genótipos da IL1β-31 e IL1β-511 em pacientes chagásicos e
não-chagásicos com atrofia.
Número (%) de Pacientes com Atrofia
Polimorfismo
P
Chagásicos (n = 12)
Não-chagásicos (n = 15)
IL1β-31
0,93
T/C
6 (50)
7 (46,7)
T/T
4 (33,3)
6 (40)
C/C
2 (16,7)
2 (13,3)
IL1β-511
0,71
C/T
3 (25)
6 (40)
C/C
5 (41,7)
5 (33,3)
T/T
4 (33,3)
4 (26,7)
0,12
IL-1RN
1
8 (66,7)
13 (86,7)
2
1 (8,3)
2 (13,3)
1/2
3 (25)
0
3
4
Em relação à distribuição dos genótipos da IL1β-31 e IL1β-511 nos pacientes
5
com metaplasia intestinal, foi observado uma maior prevalência dos genótipos
6
heterozigotos em ambos os grupos de pacientes chagásicos e não-chagásicos, embora
7
esta diferença não tenha sido significativa (Tabela 13).
8
60
1
2
Tabela 13: Distribuição dos genótipos da IL-1β em pacientes chagásicos e nãochagásicos com metaplasia
Número (%) de Pacientes com Metaplasia
Polimorfismo
P
Chagásicos (n = 10)
Não-chagásicos (n = 6)
0,19
IL1β-31
T/C
7 (70)
2 (33,3)
T/T
2 (20)
1 (16,7)
C/C
1 (10)
3 (50)
IL1β-511
0,11
C/T
6 (60)
1 (16,7)
C/C
1 (10)
0
T/T
3 (30)
5 (83,3)
0,20
IL-1RN
1
6 (60)
6 (100)
2
2 (20)
0
1/2
2 (20)
0
3
4
A frequência dos alelos polimórficos da IL-1β em pacientes chagásicos e não-
5
chagásicos que apresentvama atrofia ou metaplasia intestinal também foi avaliada e está
6
demonstrada na Tabela 14. Em relação ao polimorfismo na posição -31 da IL-1β, o
7
alelo C foi detectado em 8 (66,7%) dos 12 pacientes chagásicos e em 9 (60%) dos 15
8
pacientes não-chagásicos com atrofia (P=0,72), enquanto no grupo de pacientes com
9
metaplasia, a desigualdade de frequência entre os alelos C em relação do alelo T foi
10
mais evidente (8/10, 80% dos chagásicos; e 5/6, 83,3% dos não-chagásicos com alelo
11
C), porém não foi observada diferença significativa entre o grupo de pacientes
12
chagásicos e não chagásicos (P=0,86). Em relação ao polimorfismo na posição -511 da
13
IL-1β, o alelo T foi detectado em 7 (58,3%) dos 12 pacientes chagásicos e em 10
61
1
(66,7%) dos 15 pacientes não-chagásicos com atrofia (P=0,65). Entre o grupo de
2
pacientes com metaplasia, o mesmo alelo foi encontrado em 9 (90%) dos 10 chagásicos
3
e em 6 (100%) dos não-chagásicos com esta alteração histopatológica (P=0,42).
4
5
6
Tabela 14: Frequência dos alelos polimórficos da IL-1β em pacientes chagásicos e nãochagásicos com atrofia e metaplasia intestinal.
Atrofia (%)
Metaplasia (%)
Frequência
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=12)
(n=15)
P
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=10)
(n=6)
P
dos alelos
IL1β-31
0,72
0,86
C
8 (66,7)
9 (60)
8 (80)
5 (83,3)
T
4 (33,3)
6 (40)
2 (20)
1 (16,7)
IL1β-511
0,65
0,42
T
7 (58,3)
10 (66,7)
9 (90)
6 (100)
C
5 (41,7)
5 (33,3)
1 (10)
0
7
8
5.2.2 Fatores de virulência cagA, vacA, babA2 e iceA.
9
As amostras de DNA extraídas dos fragmentos de mucosa gástrica dos
10
pacientes incluídos no estudo e que foram positivas à detecção do gene 16S rRNA por
11
PCR foram tipadas para os genes vacA, cagA, iceA e babA2. Considerando os
12
genótipos de vacA, os tipos s1 e m2 foram os mais frequentemente detectados nos
13
grupos de chagásicos e não-chagásicos (55% e 54,1%; 57,5% e 58,1%,
14
respectivamente). A presença do gene cagA foi detectada em 80% dos chagásicos e em
15
79,8% dos não-chagásicos. O genótipo iceA2 foi detectado em 72,5% dos chagásicos e
16
74,3% dos não-chagásicos. Somente 4 (10%) dos chagásicos e 9 (12,2%) dos não-
17
chagásicos foram positivos para o genótipo babA2 (Tabela 15).
18
62
1
2
Tabela 15: Frequência dos genótipos vacA, cagA, iceA e babA2 em pacientes H.
pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos
Número (%) de pacientes H. pylori-positivos
Genótipo
P
Chagásicos (n=40)
Não-chagásicos (n=74)
0,89
vacS
s1
22 (55)
40 (54,1)
s2
17 (42,5)
33 (44,6)
1 (2,5)
1 (1,4)
s1/s2
0.98
vacM
m1
14 (35)
26 (35,1)
m2
23 (57,5)
43 (58,1)
3 (7,5)
5 (6,8)
32 (80)
59 (79,7)
m1/m2
cagA
0,97
0,42
iceA
iceA1
1 (2,5)
6 (8,1)
iceA2
29 (72,5)
55 (74,3)
iceA1/A2
7 (17,5)
11 (14,9)
iceA -
3 (7,5)
2 (2,7)
babA2 +
4 (10)
9 (12,2)
babA2 -
36 (90)
65 (87,8)
0,72
3
4
A frequência dos alelos do gene vacA foi avaliada em pacientes chagásicos H.
5
pylori-positivos de acordo com a forma clínica da doença (Figura 2). O alelo s1 foi
6
encontrado em 13 (56,5%) dos 23 pacientes com a forma digestiva, em 4 (40%) dos 10
7
pacientes com a forma cardiodigestiva, em 4 (80%) dos 5 dentre aqueles com a forma
8
indeterminada e em um (50%) dos 2 pacientes com a forma cardíaca da doença; o alelo
63
1
s2 foi encontrado em 10 (43,5%) dos 23 pacientes com a forma digestiva, em 5 (50%)
2
dos 10 pacientes com a forma cardiodigestiva, em um (20%) dos 5 pacientes com a
3
forma indeterminada e em um (50%) dos 2 pacientes com a forma cardíaca. A presença
4
concomitante dos alelos s1/s2 foi detectada em apenas um (10%) dos 10 pacientes com
5
a forma cardiodigestiva (P=0,57).
6
O alelo m1 foi detectado em 7 (30,4%) dos 23 pacientes com a forma digestiva,
7
em 2 (20%) dos 10 pacientes com a forma cardiodigestiva, em 4 (80%) dentre os 5 com
8
a forma indeterminada e em um (50%) dos 2 pacientes com a forma cardíaca. O alelo
9
m2 foi detectado em 15 (65,2%) dos 23 pacientes com a forma digestiva, 7 (70%) dos
10
10 pacientes com a forma cardiodigestiva e em apenas um (20%) dentre os 5 pacientes
11
com a forma indeterminada. Os alelos m1/m2 foram detectados concomitantemente em
12
um (4,3%) paciente com a forma digestiva, um (10%) paciente com a forma
13
cardiodigestiva e em um (50%) com a forma cardíaca da doença (P=0,05) (Figura 1).
14
64
1
100
90
80
80
70
65,2
70
%
60
50
40
80
s1
56,5
50
50 50
50
50
s2
s1/s2
43,5
40
m1
30,4
m2
30
20
20
10
20
20
m1/m2
10
4,3
10
0
Digestiva
Cardiodigestiva
Indeterminada
Cardíaca
2
3
4
5
Figura 1. Distribuição da frequência dos alelos do gene vacA em pacientes chagásicos
H. pylori-positivos de acordo com as formas clínicas da doença de Chagas.
6
A frequência dos genótipos cagA, iceA e babA2 também foram avaliadas em
7
pacientes chagásicos H. pylori-positivos de acordo com a forma clínica da doença
8
(Tabela 16). Apesar de não haver diferença significativa, o gene cagA foi detectado na
9
maioria dos pacientes chagásicos independente da forma clínica apresentada (P=0,90).
10
O genótipo iceA2 foi encontrado em 16 dos 23 (69,6%) pacientes com a forma
11
digestiva, em 8 dos 10 (80%) com a forma cardiodigestiva e em 3 dos 5 (60%)
12
pacientes com a forma indeterminada. Os dois pacientes com a forma cardíaca também
13
apresentaram o genótipo iceA2. Somente em pacientes com as formas digestiva e
14
cardiodigestiva apresentaram o genótipo babA2.
15
65
1
2
Tabela 16: Frequência dos genótipos cagA, iceA e babA2 em pacientes chagásicos H.
pylori-positivos de acordo com a forma clínica da doença de Chagas.
Número (%) de pacientes chagásicos H. pylori-positivos de
acordo com a forma clínica da doença
Genótipo
P
Digestiva
Cardiodigestiva
Indeterminada
Cardíaca
(n=23)
(n=10)
(n=5)
(n=2)
cagA+
18 (78,3)
8 (80)
4 (80)
2 (100)
cagA-
5 (21,7)
2 (20)
1 (20)
0
iceA1
1 (4,3)
0
0
0
iceA2
16 (69,6)
8 (80)
3 (60)
2 (100)
iceA1/A2
5 (21,7)
2 (20)
0
0
iceA-
1 (4,3)
0
2 (40)
0
babA2+
2 (8,6)
2 (20)
0
0
babA2-
21 (91,3)
8 (80)
5 (100)
2 (100)
0.90
0.28
0.58
3
4
A presença de úlcera gástrica foi detectada em 11 (9,6%) dos 114 pacientes H.
5
pylori-positivos avaliados, sendo que cinco (45,5%) eram chagásicos e seis (54,5%)
6
não-chagásicos. A úlcera duodenal foi detectada somente em cinco (4,4%) pacientes H.
7
pylori-positivos, todos não-chagásicos. Os genótipos do gene vacA e cagA foram
8
avaliados de acordo com o tipo de úlcera nos pacientes chagásicos e não-chagásicos.
9
Dentre os cinco pacientes chagásicos com úlcera gástrica, 4 (80%) apresentaram o alelo
10
tipo s1, um (20%) apresentou o alelo tipo s2 e todos estavam infectados por amostras
11
de H. pylori cagA-positivas. O alelo tipo m1, assim como o alelo tipo m2 foi detectado
12
em dois (40%) pacientes chagásicos. Um pacientes chagásico com úlcera gástrica
13
apresentou o genótipo m1/m2. Dentre os seis pacientes não-chagásicos com úlcera
14
gástrica, 3 (50%) apresentaram o alelo s1 e os outros 3 (50%) apresentaram o alelo s2
15
(P=0,30); enquanto que 5 (83,3%) apresentaram o alelo m2 e o alelo m1 foi detectado
66
1
em apenas um (16,7%) paciente (P=0,28). A presença do gene cagA foi detectada em 5
2
(83,3%) dos 6 pacientes não-chagásicos com úlcera gástrica. Em relação aos cinco
3
pacientes não-chagásicos com úlcera duodenal, 4 (80%) apresentaram alelo tipo s1 e 1
4
(20%) apresentou o alelo s2. Destes, três (60%) tinham o alelo m1 e 2 (40%)
5
apresentavam o genótipo m1/m2. Quatro (80%) dos cinco pacientes com úlcera
6
duodenal estavam infectados por amostras de H. pylori cagA-positivas.
7
A prevalência dos genótipos cagA, vacA, iceA e babA2 foram avaliados no
8
grupo de pacientes chagásicos e não-chagásicos de acordo com a presença de gastrite
9
crônica ativa, atrofia e metaplasia intestinal. Amostras cagA-positivas foram detectadas
10
na maioria dos pacientes que apresentavam as lesões em ambos os grupos de
11
chagásicos e não-chagásicos (Tabela 17).
67
1
2
Tabela 17: Prevalência dos genótipos cagA, vacA, iceA e babA2 em pacientes H. pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos de acordo com
diferentes manifestações gástricas.
Gastrite crônica ativa (%)
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=36)
(n=66)
cagA+
29 (80,5)
52 (78,8)
cagA-
7 (19,5)
14 (21,2)
s1
20 (55,6)
35 (53)
s2
15 (41,7)
Atrofia (%)
Metaplasia intestinal (%)
Chagásicos
Não-chagásicos
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=8)
(n=8)
(n=7)
(n=5)
6 (75)
6 (75)
7 (100)
3 (60)
2 (25)
2 (25)
0
2 (40)
3 (37,5)
3 (37,5)
6 (85,7)
4 (80)
30 (45,5)
5 (62,5)
5 (62,5)
1 (14,3)
1 (20)
1 (2,8)
1 (1,5)
0
0
0
0
m1
14 (38,9)
25 (37,9)
4 (50)
2 (25)
5 (71,4)
2 (40)
m2
19 (52,8)
36 (54,5)
4 (50)
5 (62,5)
2 (28,6)
2 (40)
m1/m2
3 (8,3)
5 (7,6)
0
1 (12,5)
0
1 (20)
iceA2+
33 (91,7)
58 (87,9)
7 (87,5)
8 (100)
6 (85,7)
5 (100)
iceA2-
3 (8,3)
8 (12,1)
1 (12,5)
0
1 (14,3)
0
babA2+
4 (11,1)
8 (12,1)
1 (12,5)
0
0
1 (20)
babA2-
32 (88,9)
58 (87,9)
7 (87,5)
8 (100)
7 (100)
4 (80)
Genótipos
s1/s2
P
0,83
0,86
0,98
0,55
0,88
P
1,00
1,00
0,41
0,30
0,30
P
0,67
0,79
0,36
0,37
0,21
68
1
A região variável 3´do gene cagA (que contém as sequências EPIYA) também
2
foi avaliada nos pacientes H. pylori-positivos chagásicos (n=32) e não-chagásicos
3
(n=59) infectados por amostras H. pylori cagA-positivas. A Tabela 18 mostra a
4
distribuição geral dos genótipos de EPIYA entre os pacientes chagásicos e não-
5
chagásicos (P=0,126).
6
7
8
Tabela 18: Distribuição dos genótipos EPIYA de amostras cagA-positivas de pacientes
H. pylori-positivos chagásicos e não-chagásicos.
Número (%) de pacientes H. pyloriGenótipos EPIYA
positivos cagA-positivos
Produto
amplificado (pb)
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=32)
(n=59)
0
1 (1,7)
500
ABC
16 (50)
35 (59,3)
600
ABCC
5 (15,6)
3 (5,1)
700
ABCCC
3 (9,4)
2 (3,4)
800
AB+ABC
0
8 (13,6)
500, 600
AB+ABCC
1 (3,1)
0
500, 700
ABC+ABCC
4 (12,5)
6 (10,2)
600, 700
ABC+ABCCC
1 (3,1)
3 (5,1)
600, 800
ABCC+ABCCC
2 (6,2)
1 (1,7)
700, 800
AB
9
10
11
Uma eletroforese em gel de agarose 1,5% representando os diferentes tipos dos
12
sítios EPIYA da proteína Cag de amostras de H. pylori estão demonstrados na Figura 2.
13
69
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 2. Eletroforese de amostras representativas dos diferentes sítios EPIYA da
proteína CagA observados em pacientes H. pylori-positivos chagásicos e nãochagásicos. PM: Marcador de peso molecular de 100 pares de bases; Colunas 1 e 6:
EPIYA-ABC; Coluna 2: EPIYA-ABCC; Coluna 3: EPIYA-ABC+ABCCC; Coluna 4:
EPIYA-AB+ABCC; Coluna 5: ABC+ABCC.
9
O número de sítios de EPIYA-C foi avaliado entre pacientes H. pylori cagA-
10
positivos chagásicos e não-chagásicos (Tabela 19). Foi detectado um maior número de
11
amostras contendo dois ou mais sítios de EPIYA-C no grupo de pacientes chagásicos
12
(50%) do que nos pacientes não-chagásicos (25%) (P=0,01).
13
14
70
1
2
Tabela 19: Número de sítios EPIYA-C na proteína CagA em pacientes H. pyloripositivos chagásicos e não-chagásicos
Número (%) de pacientes H. pylori cagA+
Número de Sítios
P
Chagásicos
Não-chagásicos
EPIYA-C
(n=32)
(n=59)
0,01
Amostras cagA positivas
≥ 2 sítios EPIYA-C
16 (50)
15 (25)
< 2 sítios EPIYA-C
16 (50)
44 (75)
3
4
5
Pacientes chagásicos apresentaram significativamente maior número de EPIYA
6
contendo dois ou mais sítios C do que os pacientes não-chagásicos com gastrite,
7
gastrite crônica ativa e metaplasia (P<0,05). Em relação à atrofia, ambos os grupos de
8
pacientes apresentaram prevalências semelhantes em relação ao número de sítios
9
EPIYA-C da proteína CagA (Tabela 20).
71
1
Tabela 20: Distribuição do número de sítios de EPIYA-C em pacientes H. pylori-positivos de acordo com diferentes manifestações gástricas.
Número (%) de pacientes H. pylori-positivos de acordo com diferentes manifestações gástricas
Gastrite
Nº de Sítios
EPIYA-C
Gastrite ativa
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=32)
(n=59)
<2 EPIYA-C
16 (50)
44 (74,6)
≥2 EPIYA-C
16 (50)
15 (25,4)
P
0,01
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=29)
(n=52)
14 (48,3)
39 (75)
15 (51,7)
13 (25)
Atrofia
P
0,01
Metaplasia
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=6)
(n=6)
3 (50)
4 (66,7)
3 (50)
2 (33,3)
P
0,55
Chagásicos
Não-chagásicos
(n=7)
(n=3)
2 (57,1)
3
5 (71,4)
0
P
0,03
2
3
72
73
1
6. Discussão
2
Aproximadamente metade da população mundial se encontra infectada pelo H.
3
pylori, uma bactéria Gram-negativa que é considerada a principal causa de gastrite.
4
Todos os indivíduos infectados pelo H. pylori desenvolvem gastrite devido à resposta
5
imune local contra a bactéria, mas a maioria das pessoas permanece assintomática. Em
6
uma pequena porcentagem de indivíduos infectados, a gastrite crônica pode evoluir para
7
lesões mais graves, como a úlcera péptica, gastrite atrófica (alteração precursora do
8
carcinoma gástrico) e linfoma tipo MALT. Neste estudo, foi encontrado uma alta
9
prevalência de gastrite e de infecção por H. pylori em ambos os grupos de pacientes
10
chagásicos e não-chagásicos. Apesar de estudos anteriores terem relatado resultados
11
semelhantes ao avaliar um pequeno número de chagásicos (BARBOSA et al., 1993;
12
OLIVEIRA et al., 1997), o presente estudo é o primeiro com grupo controle a
13
demonstrar que a infecção por H. pylori é a principal causa de gastrite em pacientes
14
com doença de Chagas.
15
Além disso, encontramos alguns pacientes chagásicos e não-chagásicos com
16
gastrite que não estavam infectados pelo H. pylori. Este fenômeno de gastrite crônica
17
ativa sem a presença detectável de H. pylori parece estar em ascensão no ocidente e
18
algumas explicações possíveis para este fato incluem antibioticoterapia para o
19
tratamento de outras infecções, uso generalizado de IBPs, amostragem inadequada ou
20
técnicas de colorações abaixo do ideal, como foi anteriormente sugerido
21
(NORDENSTEDT et al., 2013; GENTA E LASH, 2010). De fato, neste estudo aproximadamente
22
47% dos pacientes não-chagásicos estavam em uso de IBPs, enquanto que no grupo dos chagásicos essa
23
taxa foi menor (~21%).
24
evitar resultados falsos-negativos, visto que não existe um único teste que é considerado
25
"padrão ouro" para o diagnóstico de infecção pelo H. pylori. Entre os ensaios, foi
26
incluído um teste sorológico comercial, que tem uma elevada sensibilidade e
No entanto, foram utilizados vários métodos de diagnóstico para
74
1
especificidade (GRANBERG et al., 1993) e não é influenciado por uma diminuição
2
temporária ou recente na carga bacteriana causada pelo uso de IBPs ou terapia
3
antibiótica inespecífica. Desta forma, acreditamos que a chance de ter pacientes falsos
4
H. pylori-negativos com gastrite na população do estudo é baixa. Portanto, outras causas
5
de gastrite devem ser consideradas nos pacientes H. pylori-negativos, especialmente
6
aqueles com doença de Chagas, visto que a intensidade (na mucosa do corpo) e a
7
atividade (na mucosa antral) da gastrite foram significativamente mais elevadas neste
8
grupo de pacientes do que no grupo de não-chagásicos. Com base nestes resultados,
9
especulamos que
fatores inerentes a infecção pelo T. cruzi podem induzir o
10
desenvolvimento de gastrite nos pacientes H. pylori-negativos; esta hipótese merece
11
maiores investigações.
12
A infecção crônica pelo H. pylori exerce efeitos profundos e diversificados na
13
secreção de ácido gástrico, que dependem do grau e localização da gastrite e estão
14
relacionados
15
predominantemente antral, H. pylori aumenta a secreção de ácido, o que predispõe à
16
úlcera duodenal, enquanto que nos outros com gastrite predominantemente no corpo ou
17
pangastrite, a secreção de ácido é prejudicada, resultando em atrofia gástrica e esses
18
indivíduos têm um risco aumentado de câncer gástrico (MCCOLL et al., 1998). Na
19
forma digestiva da doença de Chagas, uma desnervação parcial do estômago ao nível
20
dos plexos intramurais foi demonstrado, induzindo vários distúrbios gástricos motores e
21
de secreção, incluindo o atraso do esvaziamento gástrico de sólidos, hipergastrinemia e
22
reduzida secreção de ácido gástrico (OLIVEIRA et al., 1998; REZENDE et al., 1985;
23
ROCHA et al., 2009). No entanto, as alterações fisiológicas gástricas e os efeitos sobre
24
o resultado clínico, que poderiam ser causados pela co-infecção H. pylori/T. cruzi
25
crônica são desconhecidas. Em um estudo anterior, realizado antes da descoberta do H.
às
consequências
da
doença.
Em
indivíduos
com
gastrite
75
1
pylori, CENEVIVA et al. (1971) avaliaram pacientes com úlceras pépticas submetidos
2
a cirurgia e relataram uma maior prevalência de úlcera gástrica do que de úlceras
3
duodenais entre aqueles pacientes com doença de Chagas.
4
Além disso, em dois estudos adicionais sem grupo controle, de pacientes com
5
megaesôfago (REZENDE et al., 1985) e a forma clínica indeterminada (OLIVEIRA et
6
al., 1997) da doença de Chagas, uma prevalência similar de úlcera gástrica e úlcera
7
duodenal foi encontrada. No presente estudo, apesar de nenhum dos pacientes com
8
doença de Chagas ter sido diagnosticado com úlcera duodenal, encontramos uma
9
prevalência semelhante de úlcera gástrica entre os pacientes chagásicos e não-
10
chagásicos avaliados. Estes resultados conflitantes podem estar relacionados com o
11
desenho e a população do estudo, visto que as formas clínicas da doença de Chagas
12
assim como a média de idade entre os pacientes eram diferentes (GROENEN et al.,
13
2009). No entanto, todos os pacientes chagásicos com úlcera gástrica neste estudo eram
14
H. pylori-positivos, sugerindo que esta doença gástrica é realmente associada com a
15
infecção pela bactéria e não com a doença de Chagas como se acreditava antes da era H.
16
pylori.
17
Em geral, a prevalência de atrofia gástrica e metaplasia intestinal no antro e no
18
corpo foi semelhante entre pacientes chagásicos e não-chagásicos. No entanto, são
19
desconhecidas as razões pelas quais os pacientes com a forma digestiva da doença de
20
Chagas apresentaram uma prevalência significativamente maior de atrofia no corpo do
21
que aqueles com as outras formas clínicas, que apresentaram uma prevalência
22
significativamente maior de metaplasia intestinal na região do antro.
23
estudos também avaliaram as características histológicas gástricas de pacientes
24
chagásicos, embora apenas a mucosa antral foi examinada. BARBOSA et al. (1993)
25
relataram atrofia antro em 47% dos pacientes com a forma digestiva, uma prevalência
Dois outros
76
1
superior à encontrada em nosso estudo (15%). Em contraste, OLIVEIRA et al. (1997)
2
não encontraram atrofia ou metaplasia intestinal em pacientes com a forma
3
indeterminada da doença de Chagas.
4
A alta prevalência de co-infecção pelo T. cruzi e H. pylori encontrada no
5
presente estudo (~70%) e em outros, não é surpreendente uma vez que a transmissão de
6
ambos os patógenos está associada a precárias condições socioeconômicas (BARBOSA
7
et al., 1993; OLIVEIRA et al., 1997; PINAZO et al., 2010; NASCIMENTO et al.,
8
2002; FONSECA et al., 2012). Além disso, no Brasil, que é considerado um país em
9
desenvolvimento, a prevalência da infecção pelo H. pylori é alta e varia de 55% a 87%
10
de acordo com a região geográfica (ROCHA et al., 2003; PARENTE et al., 2006). Não
11
houve diferença significativa na prevalência da infecção pelo H. pylori entre as formas
12
clínicas da doença de Chagas no presente estudo e em outros estudos anteriores
13
(NASCIMENTO et al., 2002; FONSECA et al., 2012), demonstrando que os pacientes
14
com a forma digestiva não apresentam alto risco para a infecção por H. pylori, apesar da
15
hipocloridria demonstrada nesses pacientes (OLIVEIRA, 1972; PADOVAN et al.,
16
1982; TRONCON et al., 1984), uma condição que pode favorecer a colonização
17
gástrica pelo H. pylori (AMIEVA E EL-OMAR, 2008; SCHREIBER et al., 2005).
18
Os polimorfismos existentes em genes envolvidos na regulação da resposta
19
inflamatória, como naqueles que codificam a IL-1β e IL-1RN, aumentam o risco de
20
desenvolvimento de carcinoma gástrico. Na presença desses polimorfismos, com troca
21
dos alelos, há um aumento da produção de IL-1β que potencializa a resposta
22
inflamatória crônica à infecção pelo H. pylori, resultando em hipocloridria, atrofia no
23
corpo do estômago e aumento do risco de desenvolvimento do carcinoma gástrico (EL-
24
OMAR et al., 2000).
77
1
Neste estudo, observamos que o genótipo heterozigoto da IL-1β-31(T/C) e IL-
2
1β-511 (C/T) foi o mais prevalente entre pacientes chagásicos e não-chagásicos. Apesar
3
dos alelos polimórficos influenciarem a maior produção da IL-1β e consequentemente
4
criar um ambiente mais propício para o desenvolvimento da infecção crônica pelo H.
5
pylori, não houve associação desses polimorfismos com nenhuma das alterações
6
gástricas estudadas, incluindo a gastrite, atrofia e metaplasia intestinal.
7
BARBOSA et al. (2009) avaliaram um grupo de pacientes H. pylori-positivos
8
com gastrite, úlcera gástrica e úlcera duodenal do estado do Pará, na região norte do
9
país e encontraram maior prevalência dos alelos polimórficos da IL-1β nas posições -31
10
e -511, porém, não foi encontrada associação entre esses polimorfismos e o câncer
11
gástrico. Recentemente, alguns estudos encontraram predomínio do alelo T da IL-1β-
12
511 em pacientes infectados pelo H. pylori (QUEIROZ et al. 2004; SANTOS et al.
13
2012) e foi demonstrado uma associação entre o genótipo -511C/T e -511C/C com a
14
presença de gastrite crônica e câncer gátrico (SANTOS et al. 2012). Apesar de o Brasil
15
ser um país com uma alta diversidade étnica da população devido à miscigenação de
16
raças ocorrida no passado, é comum encontrar estudos que demonstram os mesmos
17
padrões de distribuição de alelos dos polimorfismos, uma vez que os brasileiros
18
compartilham um padrão genético comum (PARRA et al., 2003).
19
Em relação à doença de Chagas, não houve diferença significativa em relação
20
aos polimorfismos estudados e a co-infecção H.pylori/T.cruzi e nem com as formas
21
clínicas da doença de Chagas. Inicialmente, era esperado que os pacientes com doença
22
de Chagas apresentassem uma prevalência diferente em relação aos polimorfismos da
23
IL-1β e IL-1RN quando comparados ao grupo controle, uma vez que a hipocloridria é
24
uma condição frequente em pacientes chagásicos com a forma digestiva da doença.
78
1
Entretanto, no presente estudo foi demonstrado prevalências semelhantes dos alelos,
2
independente do polimorfismo avaliado.
3
Dados sobre polimorfismos da IL-1β em pacientes chagásicos ainda são
4
escassos. Em um estudo realizado na Colômbia para avaliar a possível associação entre
5
alguns polimorfismos (dentre eles a IL-1β-31, -511 e IL-1RN) em pacientes chagásicos
6
com a forma cardíaca e com a forma indeterminada, foi demonstrado que a distribuição
7
geral dos alelos e genótipos em pacientes com cardiomiopatia chagásica e
8
assintomáticos é similar (FLORÉZ et al., 2006). No México, foi demonstrado uma
9
associação entre o alelo G da IL-1β (+5810) e o risco de desenvolvimento da
10
cardiomiopatia chagásica crônica. Entretanto, em relação aos polimorfismos nas
11
posições -511(C/T) e -31 (T/C) nenhuma associação foi encontrada (CRUZ-ROBLES et
12
al., 2009).
13
Os polimorfismos da IL-1RN são associados à regulação da atividade da IL-1β e
14
estão relacionados ao desenvolvimento do câncer gástrico (EL-OMAR et al., 2000).
15
Tem sido demonstrado que indivíduos com o genótipo IL-1RN2 têm maiores níveis
16
circulantes de IL-1β. Entretanto, no presente estudo houve predomínio do alelo 1 da IL-
17
1RN e ainda, não foi encontrada nenhuma associação entre os polimorfismos da IL-1RN
18
com a doença de Chagas e nem com as doenças gástricas associadas à infecção por H.
19
pylori como a gastrite crônica, atrofia e metaplasia. SANTOS et al. (2012) também não
20
encontraram associação entre os genótipos da IL-1RN e os subgrupos de pacientes com
21
gastite crônica e câncer gástrico do estado de São Paulo, embora outros estudos
22
realizados no Brasil tenham demonstrado que o alelo IL-1RN2 está associado com o
23
desenvolvimento de câncer gástrico em diferentes populações (BARBOSA et al., 2009).
24
Alguns fatores de virulência têm sido associados com diferentes doenças
25
resultantes da infecção crônica pelo H. pylori. Estudos tem demonstrado diferenças
79
1
regionais na distribuição dos alelos vacA e da presença do gene cagA em amostras de
2
H. pylori e sua associação com o desenvolvimento de doenças gastrointestinais
3
(ZHENG et al., 2000; MARTINS et al., 2005). Os dados do presente estudo mostraram
4
que os alelos s1 e m2 foram os mais frequentemente detectados nos grupos de pacientes
5
chagásicos e não-chagásicos (~55%). A frequência de s1 encontrada foi semelhante
6
àquela encontrada em outros países como França, Canadá, Itália e Estados Unidos
7
(~60%) (YAMAOKA et al., 1999). No Brasil, ASHOUR et al. (2002) detectaram uma
8
maior prevalência (83,1%) do alelo s1 em amostras de H. pylori de pacientes adultos
9
com complicações gástricas e que foram submetidos à cirurgia para retirada de
10
carcinoma gástrico. Similarmente, YAMAOKA et al. (1999) também detectaram alta
11
prevalência (71,4%) do mesmo alelo em pacientes com distúrbios gastrointestinais
12
como gastrite, úlcera duodenal e carcinoma gástrico.
13
O alelo s1 tem sido associado à presença de úlcera péptica quando comparado ao
14
alelo s2, uma vez que o alelo s1 estaria relacionado a uma maior quantidade de
15
citotoxina ativa, sendo assim um tipo mais virulento (ATHERTON et al., 1995). Neste
16
estudo, foi demonstrado que a maioria dos pacientes chagásicos e não-chagásicos com
17
úlcera gástrica estavam infectados por amostras de H. pylori que possuíam o alelo s1,
18
porém, não foi encontrada associação entre os diferentes alelos e a presença de úlcera
19
nos pacientes chagásicos e não-chagásicos. Um estudo realizado em Fortaleza no Ceará,
20
onde foram avaliados pacientes adultos com câncer gástrico, úlcera péptica e gastrite, o
21
alelo s1 foi detectado em 83,3%, 71,4% e 72,4%, respectivamente. Esses autores
22
demonstraram uma associação com a presença do alelo s1 quando avaliados em
23
conjunto os pacientes com úlcera péptica e carcinoma gástrico e ainda, demonstraram
24
que o alelo mais virulento vacA s1 predominou entre as amostras de H. pylori mesmo
25
no grupo de pacientes sem doenças graves associadas a infecção pelo H. pylori
80
1
(CAVALCANTE et al., 2012). MARTINS et al. (2005) encontraram uma frequência de
2
79,6% do alelo s1 em pacientes com gastrite e úlcera péptica e ainda demonstraram
3
associação entre o genótipo s1 com o desenvolvimento de úlcera péptica. Em
4
contrapartida, assim como no presente estudo, MATTAR et al. (2005) não encontraram
5
associação entre a presença do gene cagA e os alelos de vacA com o desenvolvimento
6
de úlcera péptica na população estudada do estado de São Paulo.
7
Ao serem analisados os alelos da região m, a maioria dos pacientes chagásicos e
8
não-chagásicos estava infectada por amostras de H. pylori que possuíam o tipo m2. Os
9
alelos da região mediana (m1 e m2) estão associados com os níveis de citotoxina
10
produzidos, sendo que o alelo m1 está relacionado com maior produção de citotoxina e
11
o alelo m2 com pouca produção da mesma (ATHERTON et al., 1995). De maneira
12
geral, a distribuição dos alelos m é mais homogênea do que a dos alelos s (VAN
13
DOORN et al., 1999). Porém, resultados diferentes foram relatados por pesquisadores
14
brasileiros que observaram 61,8% e 36,4% respectivamente para os alelos m1 e m2
15
(ASHOUR et al., 2002). MARTINS et al. (2005) encontraram uma alta prevalência do
16
alelo m1 (75,4%) em pacientes com gastrite e úlcera péptica enquanto que o alelo m2
17
foi detectado em apenas 21,2%. Entretanto, outro estudo realizado na região sudeste do
18
Brasil, onde foram avaliados pacientes H. pylori-positivos com dispepsia, úlcera
19
péptica, gastrite erosiva e doença do refluxo gastroesofágico, o alelo m2 foi detectado
20
em 65% dos pacientes e foi associado à dispepsia (RIBEIRO et al., 2003).
21
Assim como o vacA, a prevalência de amostras cagA-positivas varia de uma
22
região geográfica para outra. Em países orientais como China e Japão, praticamente
23
todas as amostras de H. pylori são cagA-positivas enquanto que em países como
24
Estados Unidos e no Brasil, as amostras cagA tem sido mais frequentemente
25
encontradas em pacientes com úlcera ou câncer gástrico (ASHOUR et al., 2002). No
81
1
presente estudo, o gene cagA foi detectado na maioria dos pacientes chagásicos e não-
2
chagásicos. A prevalência do gene cagA também foi similar quando avaliamos os
3
pacientes chagásicos com as diferentes formas clínicas da doença. Recentemente,
4
estudos tem demonstrado uma alta positividade para o gene cagA em amostras de H.
5
pylori obtidas de pacientes com gastrite (CAVALCANTE et al., 2012; RAMIS et al.,
6
2010), úlcera péptica e câncer gástrico (CAVALCANTE et al., 2012).
7
No presente estudo, foi demonstrado que todos os pacientes chagásicos com
8
úlcera gástrica estavam infectados por amostras de H. pylori cagA-positivas assim
9
como a maioria dos pacientes não-chagásicos com úlcera gástrica e úlcera duodenal. A
10
presença do gene cagA em pacientes H. pylori-positivos chagásicos e não chagásicos
11
com atrofia e metaplasia intestinal foi avaliada e apesar da alta positividade encontrada,
12
não foi observada associação entre a presença do gene cagA com o desenvolvimento de
13
úlcera, atrofia e metaplasia intestinal, uma vez que o número de pacientes chagásicos e
14
não-chagásicos incluídos no estudo que apresentavam essas alterações foi pequeno.
15
No Brasil, a alta prevalência do gene cagA nas amostras de H. pylori tem sido
16
associada com o câncer gástrico (EVANS et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2003;
17
CAVALCANTE et al., 2012) e úlcera péptica (EVANS et al., 1998; OLIVEIRA et al.,
18
2003; MARTINS et al., 2005, GATTI et al., 2006). Estudos realizados em outros países
19
da América Latina também relataram alta prevalência (71%) do gene cagA na
20
população estudada, como demonstrado por ARÉVALO-GALVIS et al. (2012) na
21
Colômbia. Em contrapartida, uma baixa prevalência do gene cagA foi detectada em
22
uma população do sudeste Asiático, onde apenas 39,5% dos pacientes com úlcera
23
estavam infectados por amostras de H. pylori cagA-positivas e nenhuma associação foi
24
encontrada (AMJAD et al., 2010).
82
1
Recentemente foram descritos sítios de fosforilação na proteína CagA
2
denominados EPIYA (Glu-Pro-lle-Tyr-Ala) A, B, C e D de acordo com a sequência dos
3
aminoácidos. A proteína CagA quase sempre possui sítios EPIYA A e B que podem ou
4
não conter um, dois ou três sítios C, em amostras que circulam nos países ocidentais, ou
5
um sítio D, em países do Leste Asiático (HATAKEYAMA, 2011). O número
6
aumentado do sítio EPIYA-C tem sido associado com fenômenos celulares que
7
predispõem ao câncer gástrico no nosso país, como demonstrado por BATISTA et al.
8
(2011) que encontraram associação entre o número de repetições EPIYA-C com o
9
aumento do risco para desenvolvimento de câncer gástrico mesmo após ajuste de fatores
10
como idade e sexo. Esses autores ainda demonstraram que o aumento do número de
11
repetições EPIYA-C está associado à gastrite atrófica e metaplasia intestinal. De acordo
12
com os resultados do presente estudo, foi observado que os pacientes chagásicos e não-
13
chagásicos com maior número de sítios EPIYA-C tinham mais frequentemente gastrite,
14
gastrite ativa e metaplasia intestinal, porém não encontramos a mesma associação em
15
relação ao desenvolvimento de gastrite atrófica. QUEIROZ et al. (2012) demonstraram
16
associação entre um maior número de repetições de sítios EPIYA-C com o aumento da
17
inflamação gástrica na região do corpo do estômago, hiperplasia foveolar e atrofia.
18
Outro fator de virulência estudado, o gene iceA (induzido pelo contato com o
19
epitélio), possui dois alelos variantes, iceA1 e iceA2. Alguns autores demonstraram
20
associação do alelo iceA1 com o desenvolvimento da úlcera péptica nos Estados Unidos
21
(PEEK et al., 1998) e Holanda (VAN DOORN et al., 1998) enquanto que em outros
22
países esta associação não foi confirmada (YAMAOKA et al., 1999). Os dados do
23
presente estudo mostraram que apesar de não ter sido encontrada nenhuma associação
24
quando avaliado a presença gene iceA nos pacientes chagásicos e não-chagásicos com
25
gastrite, atrofia e metaplasia, o alelo iceA2 foi o mais prevalente em ambos os grupos.
83
1
Estes dados, estão de acordo com os descritos no estado de Minas Gerais por ASHOUR
2
et al. (2001), onde foi detectado uma alta prevalência do alelo iceA2 (90,1%) em
3
adultos e crianças. Resultados semelhantes foram descritos por YAMAOKA et al.
4
(1999) para amostras obtidas de pacientes da Colômbia e do Texas. Foi sugerido que a
5
atividade da resposta inflamatória seria maior em indivíduos infectados por amostras de
6
H. pylori carreadoras do alelo iceA1 (PEEK et al., 2000) entretanto, de acordo com os
7
dados encontrados neste estudo, assim como no estudo de ASHOUR et al., (2001) onde
8
a maioria dos pacientes com diferentes manifestações clínicas estavam infectados por
9
amostras carreadoras do alelo iceA2, podemos especular que outros fatores de
10
virulência ou fatores do hospedeiro sejam mais importantes do que os alelos de iceA no
11
desenvolvimento dessas lesões.
12
A presença do gene babA2, que codifica BabA (blood-group antigen-binding
13
adhesin A), tem sido associada à úlcera duodenal em adultos (OLIVEIRA et al., 2003).
14
Embora três alelos bab tenham sido identificados (babA1, babA2 e babB), somente
15
babA2 é necessário para que ocorra a ligação da bactéria aos antígenos de Lewis b
16
expressos na mucosa gástrica (PRIDE et al., 2001). Alguns autores tem demonstrado
17
associação entre o alelo babA2 e a presença de úlcera duodenal e câncer gástrico
18
(GERHARD et al., 1999). OLIVEIRA et al. (2003) detectaram o alelo babA2 em
19
46,15% das amostras de H. pylori e ainda encontraram associação do alelo com a
20
presença de úlcera duodenal e carcinoma gástrico.
21
A prevalência do gene bab também é variável de acordo com a população
22
estudada. No Brasil, GATTI et al. (2005) encontraram uma prevalência similar do alelo
23
babA2 (44%) àquela detectada por OLIVEIRA et al. (2003), porém esses autores
24
encontraram relação entre a presença do babA2 e a gastrite crônica, mas não com a
25
úlcera duodenal. Na Colômbia, o alelo babA2 foi detectado em 57% das amostras de H.
84
1
pylori provenientes de pacientes com dispepsia funcional (ARÉVALO-GALVIS et al.,
2
2012). Comparando os dados de prevalência do gene babA na população brasileira e
3
também de outras regiões geográficas, a prevalência deste gene foi bem menor no
4
presente estudo. Em outro estudo realizado por GATTI et al. (2006), o alelo babA2 foi
5
detectado em 40,4% das amostras isoladas da região sudeste do país e assim como no
6
nosso estudo, o alelo babA2 não foi associado com nenhuma doença gástrica decorrente
7
à infecção por H. pylori. Esta diferença regional em relação à prevalência do babA2
8
ainda é controversa e pode ser devido a uma diferença na frequência do gene das
9
amostras de H. pylori que circulam pelo Brasil.
10
Os resultados do presente estudo demonstraram que a co-infecção pelo H. pylori
11
e o T. cruzi é frequente, independentemente da forma clínica da doença de Chagas; e
12
que a gastrite crônica comum nestes pacientes se deve a infecção pelo H. pylori.
13
Adicionalmente, os fatores de virulência bacterianos não foram associados às
14
amostras que infectam esses pacientes e nenhum dos polimorfismos nos genes das
15
citocinas pesquisadas parece predispor a co-infecção.
16
Pelo exposto, acreditamos que a investigação e o tratamento da infecção por H.
17
pylori pode resultar em uma melhora de sintomas não específicos do trato
18
gastrointestinal superior dos pacientes com a doença Chagas, além de prevenir o
19
desenvolvimento de doenças gástricas mais graves associadas com o H. pylori.
85
86
1
7. Conclusões
2
3
 Não houve diferença significativa entre os subgrupos de chagásicos em relação
4
ao status H. pylori, gastrite crônica, gastrite crônica ativa, úlcera gástrica e
5
esofagite.
6
7
 A infecção por H. pylori é a principal causa de gastrite crônica ativa mesmo nos
8
pacientes com doença de Chagas.
9
10
 Não houve associação entre os polimorfismos da IL-1β e IL-1RN e a co-infecção
11
H. pylori/T. cruzi.
12
13
 Não houve diferença entre as amostras de H. pylori provenientes de pacientes
14
chagásicos e não-chagásicos com relação aos fatores de virulência cagA, vacA,
15
babA2 e iceA.
16
17

Não houve diferença significativa em relação à prevalência dos genótipos
18
EPIYA da proteína CagA de pacientes chagásicos e não-chagásicos infectados
19
por amostras de H. pylori cagA-positivas.
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